JP2009509519A - ランチビオティックメルサシジンの変種およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ランチビオティック(lantibiotic)メルサシジン(mersacidin)の変種およびそれらの使用に関する。
メルサシジンは、ランチビオティックと呼ばれる殺菌性のペプチドの群に属する。その名称は、これらのペプチドがアミノ酸ランチオニンおよび/または3-メチルランチオニンを含むことを表す。メルサシジンは、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)に対する活性を有し、したがって医学上非常に関心が高い。
本発明者らは、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌(MRSA)の2つの系統を含む、様々な細菌に対して活性を有する多くのメルサシジン変種を同定した。したがって、Szekat et alによって記載された変種とは異なり、本発明の変種は、多くの場合メルサシジン自体に匹敵するかまたはよりよいレベルの抗菌活性を有する。したがって本発明は、新規な抗菌性化合物、そのような化合物をコードする遺伝子、そのような化合物を作製する方法、および特に抗菌療法を必要とする状態のヒトまたは動物対象の処置におけるそれらの使用を提供する。本発明のこれらのおよびその他の局面を、本明細書において以下に記載する。
メルサシジン変種
一つの局面において、本発明は、下記の表1に示すようなメルサシジンの3、5、6、7、8、9、10、11、14、または16位への改変を含むメルサシジン変種を提供する。
本発明のメルサシジン変種は、実質的に単離された形態、例えばメルサシジン変種の産生のために用いる宿主細胞内で、メルサシジン変種が結合している物質を含まないかまたは実質的に含まない形態で提供されてもよい。
本発明のメルサシジン変種の組成物はまた、本明細書に記載したものを含む異なるメルサシジン変種、異なる抗菌性剤、または処置すべき状態の第二の症状もしくは原因を処置することを意図した他の薬剤を含む第二の活性剤を含んでもよい。
β-ラクタム抗生物質:イミペネム、メロペネム、ビアペネム、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフィキシム、セフィネノキシム(cefinenoxime)、セフォジジム、セホニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフゾナム、セファセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セフィネタゾール(cefinetazole)、セフォキシチン、セフォテタン、アズトレオナム、カルモナム、フロモキセフ、モキサラクタム、アムジノシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、ベンジルペニシリン、カルフェシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンG、ピペラシリン、スルベニシリン、テモシリン、チカルシリン、セフジトレン、SC004、KY-020、セフジニル、セフチブテン、FK-312、S-1090、CP-0467、BK-218、FK-037、DQ-2556、FK-518、セフォゾプラン、ME1228、KP-736、CP-6232、Ro 09-1227、OPC-20000、およびLY206763。
マクロライド:アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、ロキタマイシン、ロサラマイシン(rosaramicin)、ロキシスロマイシン、およびトロレアンドマイシン。
ケトライド:ABT-773、テリスロマイシン(HMR 3647)、HMR3562、HMR3004、HMR3787、ABT-773、CP-654,743、C2フッ化ケトリド、A1957730、およびTE802。
キノロン:アミフロキサシン(amifloxacin)、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ロメフロキサシン、ナリジキシン酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、オキソリン酸、ペフロキサシン、ロソクサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、スパルフロキサシン、クリナフロキサシン(clinafloxacin)、PD131628、PD138312、PD140248、Q-35、AM-1155、NM394、T-3761、ルフロキサシン、OPC-17116、DU-6859a、およびDV-7751a。
テトラサイクリン:クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびテトラサイクリン。
グリコペプチド:バンコマイシンおよびその誘導体。
アミノグリコシド:アミカシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォルチマイシン(fortimicins)、ゲンタミシン、カナマイシン、メオマイシン(meomycin)、ネチルマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、クリンダマイシン、およびリンコマイシン。
リファマイシン:リファマイシンSV、リファマイシンO、リファブチン、リファンピシン、リファンピン、およびリファリジル(rifalizil)。
処置方法において、例えば細菌感染、特にMRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)感染の処置において、本発明のメルサシジン変種(上記のようなその組成物を含む)を、ヒトまたは動物対象に投与してもよい。そのような処置は、処置を必要とする対象に、有効量の該メルサシジン変種またはその組成物を投与する段階を含んでもよい。
別の局面において、本発明は、本発明のメルサシジン変種のペプチド前駆体をコードする核酸、一般にDNAを提供する。「前駆体」とは、mrsA遺伝子クラスターの他の要素によって翻訳後に修飾され、メルサシジンを産生する天然のアミノ酸をコードすることを意味する。したがって、例えばメルサシジンG10Dhaは、コドン10がセリンである配列によってコードされてもよい。
本発明の核酸は、宿主細胞、特にバチルス宿主細胞などの細菌宿主細胞(例えばバチルス種(Bacillus sp.)HIL Y-85,54728、またはその誘導体)内に存在してもよい。核酸がベクターの形態である場合、宿主細胞はmrsA遺伝子クラスターを含んでもよく、クラスター内では、例えば転写が起こらないような遺伝子配列の変異のため、または不活性な遺伝子産物をもたらす変異(例えばメルサシジンE17A)の存在のために、mrsA遺伝子は不活性である。
本発明はまた、培養培地で本発明の宿主細胞を培養する段階および培地からメルサシジン変種を回収する段階を含む、メルサシジン変種を作製する方法を提供する。
バチルス種HIL Y-85,54728は、2004年3月19日に、NCIMBにアクセッション番号NCIMB 41211で、Novacta Biosystems Limitedの名において寄託された。
メルサシジンF3W、メルサシジンG8A、およびメルサシジンF3W G8Aは、2005年3月21日に出願されたWO2005/093069(PCT/GB2005/001055)に記載され、2004年3月26日に出願された0406870.6の優先権を主張し、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。そのような化合物およびそれらの製造または使用に関する事項がPCT/GB2005/001055に記載され、かつそのような化合物および関連する事項が、本開示から派生する任意の出願に対して有効な技術の言明の一部を形成する範囲で、先願においてどちらが適用可能であっても、そのような化合物または関連する事項が特許請求されるかまたは開示され、かつそのような権利放棄が関連出願がなされた国の国内法令下で有効である範囲で、そのような化合物または関連する事項が権利放棄される。
生理活性メルサシジン変種
例えばSzekat et al,同書により開示される当技術分野において本来公知の方法を用いて、メルサシジンの部位特異的変異誘発を実施してもよい。指標となる株としてミクロコッカス ルテウスATCC 4698を含むアガープレートを用いるバイオアッセイにより決定されるような抗菌活性を有するメルサシジン変種を作製した。これらの変種を表1に提示する。
30℃で4日間インキュベートした後、各形質転換体から得た4つのランダムコロニーを、各メルサシジン変種の産生について試験した。クロラムフェニコール(25 mg/L)を添加した3 mlのトリプシンソイブロスを入れた15 ml遠心管(Falcon)内でコロニーを増殖させることによって、種培養を実施した。30℃、250 rpmで24時間インキュベートした後、0.5 mlの種培養物を用いて、50 mlコニカルフラスコ内でクロラムフェニコール(25 mg/L)を添加した10 mlの2×BPMに播種した。30℃、250 rpmで5日間インキュベートした後、メルサシジン変種産生を評価した。発酵試料を、15 ml遠心管中、4000 rpmで10分間スピンダウンした。100 mgの調整済樹脂Diaion HP-20(Supelco)を入れた50 ml遠心管に上清を移した。室温で6時間、振盪させながらインキュベートした後、上清を捨て、メルサシジン変種を含む樹脂を2×10 mlの水で洗浄した。二回目の洗浄工程は、2×10 mlのメタノール:水(1:1)で行った。1 mlの100%メタノールを用いて、メルサシジン変種を樹脂から溶出した。溶出物を蒸発させて乾燥させ、0.250 mlのメタノール:水(1:1)で再懸濁し、LC-MS、HPLC、およびバイオアッセイによって分析した。
上記実施例1で産生された変種の選択を、様々な細菌に対する活性についてさらに試験した。塩化カルシウム二水和物として50μg/mlのカルシウムを添加したミュラーヒントンブロス(MHB)内で、抗生物質による二倍段階希釈によって、肺炎連鎖球菌を除く全ての生物に対する最小阻止濃度(MIC)を決定した。塩化カルシウム二水和物として50μg/mlのカルシウムを添加したブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス内で、抗生物質による二倍段階希釈によって、肺炎連鎖球菌に対する最小阻止濃度(MIC)を決定した。抗菌剤保存液を調製し、NCCLSスタンダードM7-A6に従い保存した。
様々な他の生物に対して、実施例2の変種のいくつかでMIC試験を行った。結果を表9および10に示す(単位はμg/ml)。
G8H変種を実施例2に記載した通りに試験した。実施例2の株のうち8つに対するMIC(μg/ml)を表11に示した。
黄色ブドウ球菌のフシジン酸耐性株に対する3つの変種について、MIC(μg/ml)を実施例2に記載した通りに決定した。結果を表12に示す。
黄色ブドウ球菌のムピロシン耐性株に対する3つの変種について、MICを実施例2に記載した通りに決定した。結果をμg/mlで表13に示す。
化膿連鎖球菌の株に対する5つの変種について、MICを実施例2に記載した通りに決定した。結果をμg/mlで表14に示す。
緑色連鎖球菌の株に対する5つの変種について、MICを実施例2に記載した通りに決定した。結果をμg/mlで表15に示す。
フラゾリドン(1〜2μg/ml)を添加したWilkens-Chalgrenアガー(WCA)上での3〜7日間の増殖から、試験生物を選別した。新鮮なWilkens-Chalgrenブロス(WCB)に、P.アクネス(P.acnes)の単一コロニーを伴うコロニー懸濁液を直接播種し、密度をMcFarland 0.5スタンダード(1×108 CFU/ml)に相当するように調節し、次いで約105 CFU/mlの96ウェルマイクロタイタープレートにおける最後の接種のため、50μg/mlのCa2+(塩化カルシウム二水和物として)を添加した滅菌WCB中でさらに希釈した。NCCLSスタンダード(M11-A5, 2001)に従って調製し保存した保存液により、滅菌水中で、抗生物質による二倍段階希釈を実施した。品質管理のための参照抗生物質として用いるバンコマイシンおよびクリンダマイシンにより、アッセイを二回実施した。対照プレート上の増殖と比較して、試験プレート上の増殖の出現が顕著に減少した場合の薬物の濃度として定義されるMICで、プレートを嫌気的に48〜72時間37℃でインキュベートした。空気への短時間曝露のみによって予め還元した培地において周囲の大気中で、全ての操作を二回実施した。
C.ディフィシレに対する最小阻止濃度(MIC)を決定し、嫌気性菌に対するNCCLS基準アガー希釈法(M11-A5, 2001)に従い、抗菌剤保存液を調製し、保存した。Wilkens-Chalgrenアガー(WCA)中で、抗生物質による二倍段階希釈物を調製した。Braziers(C.C.E.Y.)アガー上での48時間の増殖から試験生物を選別し、McFarland 0.5スタンダード(1×108 CFU/ml)に相当する密度までSchaedlerブロスにおいて継代し、50μg/ml Ca2+(塩化カルシウム二水和物として)を添加したWCAプレート上に約105 CFU/スポットで最終接種した。バクテロイデス フラジリス(Bacteroides fragilis)ATCC 25285は、参照対照株として含まれ、メトロニダゾールを品質管理のための参照抗生物質として用いた。空気への短時間曝露のみによって予め還元した培地において周囲の大気中で、全ての操作を二回実施した。対照プレート上の増殖と比較して、試験プレート上の増殖の出現が顕著に減少した場合の薬物の濃度として定義されるMICで、プレートを嫌気的に48時間37℃でインキュベートした。
実施例2の株のうち8つに対して、実施例2の通りに二重変種のMICを決定した。それらのMICをμg/mlで表18に示す。
本明細書に記載する配列の概要は以下である。
Claims (17)
- F3W、G8A、G9A、G9H、V11I、V11L、L14I、L14M、L14V、Dha16G、およびDha16Dhbの群から選択される改変を含む、請求項1記載の変種。
- 表1に示すようなメルサシジンの3、5、6、7、8、9、10、11、14、または16位への改変からなる、請求項1記載の変種。
- 改変F3Wおよび表1に示す5、6、7、8、9、10、11、14、または16位のうちの1つでの第二の改変を含む、請求項1記載の変種。
- メルサシジンF3W G9A、メルサシジンF3W G9H、メルサシジンF3W V11I、メルサシジンF3W V11L、メルサシジンF3W L14I、メルサシジンF3W L14M、メルサシジンF3W L14V、メルサシジンF3W Dha16G、およびメルサシジンF3W Dha16Dhbの群から選択される、請求項4記載の変種。
- 請求項1〜5のいずれか一項記載の変種をコードする核酸。
- 請求項6記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項6記載の核酸または請求項7記載のベクターを含む宿主細胞。
- 宿主細胞がバチルス種(Bacillus sp.)HIL Y-85,54728またはその変種であり、そこにおいてmrsA遺伝子が請求項1〜5のいずれか一項記載の変種をコードする、請求項8記載の宿主細胞。
- 薬学的に許容される担体と共に、請求項1〜6のいずれか一項記載のメルサシジン変種を含む組成物。
- 担体が、水性、水性アルコール、または油性溶液、水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤または多重乳剤、水性ゲルまたは油性ゲル、液状、ペースト状、または固体状無水産物の、局所投与に適した形態である、請求項10記載の組成物。
- ヒトもしくは動物体の処置または予防の方法における使用のための、請求項1〜6のいずれか一項記載の変種、または請求項10もしくは11記載の組成物。
- 処置または予防が、全身性細菌感染症の処置;菌血症の全身性処置;肺炎の処置;皮膚および皮膚組織感染症の処置;心内膜炎の処置;骨髄炎の処置;アクネの処置;眼感染症の処置;腸の重複感染症の処置;創傷もしくは熱傷における皮膚感染症の処置または予防、から選択される、
ヒトもしくは動物体の処置または予防の方法における使用のための、請求項1〜6のいずれか一項記載の変種、または請求項10もしくは11記載の組成物。 - 処置が、クロストリジウム ディフィシレ(Clostridium difficile)、ストレプトコッカス種(Streptococcus spp.)、エンテロコッカス種(Enterococcus spp.)、スタフィロコッカス種(Staphylococcus spp.)、プロピオニバクテリウム アクネス(Propionibacterium acnes)、およびヘリコバクター ピロリ(Helicobacter pylori)によって引き起こされる感染症から選択される細菌感染症に対する処置である、
ヒトもしくは動物体の処置または予防の方法における使用のための、請求項1〜6のいずれか一項記載の変種、または請求項10もしくは11記載の組成物。 - スタフィロコッカス種が、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)を含むコアグラーゼ陰性ブドウ球菌であるか、またはスタフィロコッカス種が、黄色ブドウ球菌(S. aureus)またはMRSA、VISA、VRSA、GISA、LRSA、およびムピロシン耐性黄色ブドウ球菌から選択される薬物耐性種である、請求項14記載の使用のための変種または組成物。
- ストレプトコッカス種が、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、および肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の群から選択される、請求項14記載の使用のための変種または組成物。
- エンテロコッカス種が、E.フェシウム(E. faecium)またはE.フェカリス(E. faecalis)である、請求項14記載の使用のための変種または組成物。
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