CN107810682B - 针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，包括：小麦种子表面消毒及育苗；纹枯病菌菌株活化、培养后打取菌碟；将待测药剂配制成系列浓度的稀溶液；将发芽小麦种子分成供试组及对照组；将菌碟套至发芽小麦种子的芽根部，并以灭菌无纺布包裹；将供试组放入稀溶液，将对照组放入自来水，进行吸收；供试组及对照组分别浇溉自来水进行培养，并在培养结束时量病斑长度；经统计、计算得出待测药剂的EC50值。本发明通过无菌无纺布包裹接种纹枯病菌的发芽小麦种子，然后施加药剂，从而在病原菌‑寄主植物‑杀菌剂三者共同存在的环境下评价或筛选防治药剂，更符合田间试验效果，具有更好的参考价值。

Description

针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法
技术领域
本发明涉及一种针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，可用于筛选防治小麦纹枯病的有效药剂，同时也可用于评价此类药剂的防治效果，属于药剂筛选及评价技术领域。
背景技术
由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染小麦引起的纹枯病是一种世界性病害，几乎遍布世界各温带小麦种植区。在我国，小麦生产中氮肥的大量使用、免(少)耕等精简化耕作措施的推广和感病品种的大面积应用，导致土壤中纹枯病菌大量积累，小麦纹枯病逐年加重，已成为长江中下游和黄淮麦区小麦增产的重要制约因素。
目前尚未发现高抗纹枯病的小麦品种，施用化学杀菌剂仍然是防治小麦纹枯病的主要措施。在杀菌剂的研发推广应用过程中，室内生测法是发现新化合物的生物活性、优化杀菌剂剂型配方、评价杀菌剂活性的基本方法。
现有针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测法均在PDA平板上进行，即在PDA培养基中添加不同浓度的药剂，然后接种纹枯病菌，培养5-7天后量取菌落直径，并与对照平板相比较，计算抑菌率，由此来评价药剂活性。然而，该方法脱离了小麦这一寄主植物，不利于评价病原菌-寄主植物-杀菌剂三者共同存在时杀菌剂的防治效果。
经检索发现，专利号CN200810196380.5，授权公告号CN101348825B，名称《小麦纹枯病抗性苗期鉴定的方法》的中国发明专利，其方法是将小麦纹枯病菌菌种活化培养，获得菌丝；通过培养基使菌丝长满牙签后形成有菌牙签；将待鉴定的小麦品种或品系的种子在培养皿中于25℃下萌发后播种于20cm营养钵中生长，播种后30天，将有菌牙签嵌入麦苗茎杆与叶鞘内，接种处缠绕浸湿的医用脱脂棉球，并用双层遮阳网覆盖，通过弥雾器使接种幼苗在近100％饱和的相对湿度下48h，然后去除遮阳网，幼苗正常生长管理，每天喷水一次；接种后30d，对苗期单株小麦材料进行纹枯病病害等级鉴定；根据病害评价等级计算病情指数。
专利号CN201510227051.2，授权公告号CN104823553B，名称《一种测试小麦品种抗病性的方法及其应用》的中国发明专利，其方法包括以下步骤：1)菌液处理：先将测试小麦抗病性的菌液添加到发芽盒内，加少量水做成菌床；再将待测麦粒放置于发芽盒中，并用水将盒内的菌液补齐至能平浸待测麦粒的胚部；2)水对照处理：将待测麦粒放置于发芽盒中纸床上，添加水至与菌液处理中液体的总体积相同；3)计算病菌为害率；4)抗病性判定：通过病菌为害率，对应国家或省区规定的标准判定小麦的抗病性。
虽然上述技术方案都给出了将病原菌与小麦进行接触的技术手段，但是由于它们都是小麦抗病性的测试/鉴定方法，不需要考虑对药剂防治效果的评价，并不能从中获知该如何处理病原菌-寄主植物-杀菌剂三者共同存在时的情况，也不能从中获知具体的药剂防治效果评价方法。因此，亟待研发出能解决这些问题的技术手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，能在病原菌-寄主植物-杀菌剂三者共同存在的环境下评价或筛选防治药剂，更符合田间试验效果，具有更好的参考价值。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取若干小麦种子，对其表面进行消毒并洗涤干净；采用无菌水湿润的滤纸，将小麦种子放在以无菌水湿润的滤纸上，于培养箱中避光培养使小麦种子发芽，当芽长度为0.6-0.8cm时，取出备用；
第二步、取纹枯病菌菌株并接种至新鲜的平板培养基上活化；将活化后的纹枯病菌再接种至新鲜的平板培养基上继续培养，当菌落半径达到平板半径的2/3～3/4时，用打孔器在菌落边缘打取菌碟，备用；所述菌碟为带有纹枯病菌的培养基，且呈环状；
第三步、取待测药剂，先配制成预定浓度的母液，再按预定梯度稀释成系列浓度的稀溶液，备用；
第四步、将第一步所得的发芽小麦种子分成若干供试组以及一个对照组，各供试组以及对照组中的发芽小麦种子数量相同；所述供试组的数量为第三步所得稀溶液浓度个数的正整数倍，各浓度稀溶液对应的供试组数量相同；
第五步、先将第二步所得菌碟分别套至各发芽小麦种子的芽根部，再将同一供试组或同一对照组的发芽小麦种子的芽根部包入或卷入同一灭菌无纺布中，并在灭菌无纺布外绑扎固定；
第六步、将各供试组放入盛有对应浓度第三步所得稀溶液的器皿中，将对照组放入盛有自来水的器皿中，放置时间为预定的吸收时间；各器皿与供试组或对照组一一对应；各器皿中稀溶液或自来水的体积相同；各供试组或对照组的发芽小麦种子按芽朝上根朝下的方式放置；
第七步、按预定时间间隔向各器皿中分别浇溉等体积的自来水，当达到预定的培养时间时，取出各供试组或对照组的发芽小麦种子，量取其上的病斑长度并记录；
第八步、将与同一浓度稀溶液对应的所有供试组中发芽小麦种子的病斑长度统计在一起并计算平均值，作为与该浓度稀溶液对应的检测值；计算对照组中发芽小麦种子的病斑长度平均值，作为对照值；根据检测值和对照值计算各浓度稀溶液的抑制率；根据抑制率按预定函数计算各浓度稀溶液的几率值Y，所述预定函数的作用为根据指定正态分布的概率值、指定平均值以及指定标准偏差返回正态累积分布函数的反函数值，其中，以抑制率为指定正态分布的概率值，指定平均值为属于实数的预设常数，指定标准偏差为大于零且属于实数的预设常数；按各稀溶液的浓度计算对数浓度值X；先采用回归法算得对数浓度值X与几率值Y的线性回归方程，再根据该线性回归方程算得待测药剂的EC50值；测定结束。
发明人在实践研究中发现，当病原菌-寄主植物-杀菌剂三者共同存在时，很难定量评价药剂的防治效果。发明人通过深入地反复实践研究终于得出了以上技术方案，设置了特定的小麦种子消毒和育芽步骤(即第一步)，特定的纹枯病菌菌株活化培养步骤(即第二步)，特定的纹枯病菌-发芽小麦种子-待测药剂共存培养步骤(即第四步至第七步)，以及特定的统计计算步骤(即第八步)，将这四者按上述技术方案相结合，即能有效实现对小麦纹枯病防治药剂的室内生测，且所得结果具有统计学意义。而且，发明人在实践研究中发现，不但这四者缺一不可，而且前三者不能随意替换或改变，前三者的严格执行是对第四者能获得有意义结果的保障。
本发明进一步完善的技术方案如下：
优选地，第一步中，消毒的具体过程为：
S1、将小麦种子放入有效氯浓度为1±0.5％的次氯酸钠溶液，并于摇床中震荡；转至S2；
S2、将小麦种子放入无菌水，并于摇床中震荡；
S2步重复至少一次。
更优选地，S1中，震荡时间为5-20分钟；S2中，震荡时间为至少10分钟；S1、S2中，摇床转速为120±10rpm。
优选地，第一步中，培养时，先将小麦种子平铺在铺有滤纸的玻璃平板中，再加入无菌水湿润滤纸；培养箱温度为25℃±2℃，培养时间为2-3天。
优选地，第二步的具体过程为：
先将纹枯病菌菌株从冻存柜中取出，再接种至新鲜的平板培养基上活化，于25℃±2℃下培养至少3天；用打孔器在菌落边缘打取菌碟，将该菌碟转接至新鲜的平板培养基上继续培养5-7天，当菌落半径达到平板半径的2/3～3/4时，用打孔器在菌落边缘打取菌碟，备用。
更优选地，所述平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
优选地，第五步中，先将套好菌碟的发芽小麦种子等距离摆放在灭菌无纺布上，且发芽小麦种子的芽根部位于距灭菌无纺布下沿1/4～1/3处，再将灭菌无纺布卷起，并以皮筋捆绑固定。
优选地，第八步中，抑制率按下式计算：
Figure BDA0001422516430000051
几率值Y按下式计算：几率值Y＝NORMINV(probability,mean,standard_dev)，NORMINV函数即为所述预定函数，其中，probability为指定正态分布的概率值，mean为指定平均值，standard_dev为指定标准偏差；
对数浓度值X按下式计算：对数浓度值X＝LN(稀溶液浓度)；
所述线性回归方程为：Y＝a+bX；
EC50值按下式计算：
Figure BDA0001422516430000052
其中，e为自然常数，mean为NORMINV函数中的指定平均值，a和b为线性回归方程中的相应参数。
更优选地，所述线性回归方程的相关系数R大于0.75。
优选地，第三步中，所述预定浓度为1mg/ml，所述预定梯度为2倍；第六步中，所述器皿为一次性塑料杯或纸杯，所述预定的吸收时间为24小时；第七步中，所述预定时间间隔为24小时，所述预定的培养时间为一星期；第八步中，指定平均值为5，指定标准偏差为1。
与现有技术相比，本发明通过无菌无纺布包裹接种纹枯病菌的发芽小麦种子，然后施加药剂，从而在病原菌-寄主植物-杀菌剂三者共同存在的环境下评价或筛选防治药剂，更符合田间试验效果，在评价药剂对纹枯病菌的抑制效果及对小麦生长的影响方面具有更好的参考价值。
附图说明
图1为本发明实施例的结果图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
本发明具体实施的针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，包括：
第一步、取若干小麦种子，对其表面进行消毒并洗涤干净；采用无菌水湿润的滤纸，将小麦种子放在以无菌水湿润的滤纸上，于培养箱中避光培养使小麦种子发芽，当芽长度为0.6-0.8cm时，取出备用；培养时，先将小麦种子平铺在铺有滤纸的玻璃平板中，再加入无菌水湿润滤纸；培养箱温度为25℃±2℃，培养时间为2-3天。
消毒的具体过程为：
S1、将小麦种子放入有效氯浓度为1±0.5％的次氯酸钠溶液，并于摇床中震荡；转至S2；(如本领域技术人员所知，有效氯浓度的％是指g/100ml)
S2、将小麦种子放入无菌水，并于摇床中震荡；
S2步重复至少一次。
S1中，S1中，震荡时间为5-20分钟；S2中，震荡时间为至少10分钟；S1、S2中，摇床转速为120±10rpm。
第二步、取纹枯病菌菌株并接种至新鲜的平板培养基上活化；将活化后的纹枯病菌再接种至新鲜的平板培养基上继续培养，当菌落半径达到平板半径的2/3～3/4时，用打孔器在菌落边缘打取菌碟，备用；所述菌碟为带有纹枯病菌的培养基，且呈环状；
具体过程为：
先将纹枯病菌菌株从冻存柜中取出，再接种至新鲜的平板培养基上活化，于25℃±2℃下培养至少3天；用打孔器在菌落边缘打取菌碟，将该菌碟转接至新鲜的平板培养基上继续培养5-7天，当菌落半径达到平板半径的2/3～3/4时，用打孔器在菌落边缘打取菌碟，备用。平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(即PDA培养基)。
第三步、取待测药剂，先配制成预定浓度(例如1mg/ml)的母液，再按预定梯度(例如2倍)稀释成系列浓度的稀溶液，备用。
第四步、将第一步所得的发芽小麦种子分成若干供试组以及一个对照组，各供试组以及对照组中的发芽小麦种子数量相同；所述供试组的数量为第三步所得稀溶液浓度个数的正整数倍，各浓度稀溶液对应的供试组数量相同。
第五步、先将第二步所得菌碟分别套至各发芽小麦种子的芽根部，再将同一供试组或同一对照组的发芽小麦种子的芽根部包入或卷入同一灭菌无纺布中，并在灭菌无纺布外绑扎固定。
具体而言，先将套好菌碟的发芽小麦种子等距离摆放在灭菌无纺布上，且发芽小麦种子的芽根部位于距灭菌无纺布下沿1/4～1/3处，再将灭菌无纺布卷起，并以皮筋捆绑固定。
第六步、将各供试组放入盛有对应浓度第三步所得稀溶液的器皿中，将对照组放入盛有自来水的器皿中，放置时间为预定的吸收时间(例如24小时)；各器皿与供试组或对照组一一对应；各器皿(例如一次性塑料杯或纸杯)中稀溶液或自来水的体积相同；各供试组或对照组的发芽小麦种子按芽朝上根朝下的方式放置；
第七步、按预定时间间隔(例如24小时)向各器皿中分别浇溉等体积的自来水，当达到预定的培养时间(例如一星期)时，取出各供试组或对照组的发芽小麦种子，量取其上的病斑长度并记录；
第八步、将与同一浓度稀溶液对应的所有供试组中发芽小麦种子的病斑长度统计在一起并计算平均值，作为与该浓度稀溶液对应的检测值；计算对照组中发芽小麦种子的病斑长度平均值，作为对照值；根据检测值和对照值计算各浓度稀溶液的抑制率；
根据抑制率按预定函数计算各浓度稀溶液的几率值Y，所述预定函数的作用为根据指定正态分布的概率值、指定平均值以及指定标准偏差返回正态累积分布函数的反函数值，其中，以抑制率为指定正态分布的概率值，指定平均值为属于实数的预设常数(例如5)，指定标准偏差为大于零且属于实数的预设常数(例如1)；
按各稀溶液的浓度计算对数浓度值X；先采用回归法算得对数浓度值X与几率值Y的线性回归方程，再根据该线性回归方程算得待测药剂的EC50值。
其中，
抑制率按下式计算：
Figure BDA0001422516430000071
几率值Y按下式计算：几率值Y＝NORMINV(probability,mean,standard_dev)，NORMINV函数即为所述预定函数，其中，probability为指定正态分布的概率值，mean为指定平均值，standard_dev为指定标准偏差；
对数浓度值X按下式计算：对数浓度值X＝LN(稀溶液浓度)；
所述线性回归方程为：Y＝a+bX；所述线性回归方程的相关系数R大于0.75；
EC50值按下式计算：
Figure BDA0001422516430000081
其中，e为自然常数，mean为NORMINV函数中的指定平均值，a和b为线性回归方程中的相应参数。
测定结束。
实施例
采用上述针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，具体参数如下：
第一步中，小麦种子采用中感纹枯病的小麦品种扬麦158；次氯酸钠溶液的有效氯浓度为1％，购自西陇化工股份有限公司；S2步重复两次。
第二步中，纹枯病菌菌株采用致病力较强的禾谷丝核菌菌株R0301；打孔器直径5mm。
第三步中，待测药剂为噻呋酰胺；母液的预定浓度为1mg/ml，预定梯度为2倍，稀释6个梯度的稀溶液，即1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.0625μg/ml，0.03125μg/ml。
第四步中，各供试组以及对照组中有5个发芽小麦种子；各浓度稀溶液分别对应两个供试组，也即各浓度稀溶液分别对应10个发芽小麦种子。
第五步中，无纺布购自广东爱柔无纺布制品有限公司，高压蒸汽灭菌后使用；皮筋捆绑固定后，在无纺布外侧贴好药剂浓度标签。
第六步中，稀溶液或自来水的体积均为35ml；预定的吸收时间为24小时。
第七步中，预定时间间隔为24小时；预定的培养时间为一星期。
第八步中，预定函数的指定平均值为5，指定标准偏差为1。
如图1所示，从各发芽小麦种子的试验结果可以看出，不同药剂浓度下的病斑长度有明显不同。其中，1至6号分别与由高到低6个浓度的稀溶液相对应，空白即为对照组。
具体检测数据如以下Excel表所示：
A B C D E F
1 编号 平均病斑长度cm 抑制率％ 几率值 药剂浓度(μg/ml) 浓度对数
2 1 0.36 88.75 6.2133 1 0.0000
3 2 0.56 82.5 5.9346 0.5 -0.6931
4 3 1.45 54.69 5.1178 0.25 -1.3863
5 4 1.68 47.5 4.9373 0.125 -2.0794
6 5 1.82 43.13 4.8269 0.0625 -2.7726
7 6 2.36 26.25 4.3643 0.03125 -3.4657
8 对照 3.2 — — — —
9
10 回归方程 Y＝a+bX
11 相关参数 a b R EC<sub>50</sub>
12 6.1430 0.5255 0.97 0.114
该表中具体采用如下EXCEL函数：
几率值＝NORMINV(C/100,5,1)，浓度对数＝LN(E)；
a＝INTERCEPT(D2:D7,F2:F7)，b＝SLOPE(D2:D7,F2:F7)；
R＝CORREL(D2:D7,F2:F7)；
EC50＝EXP((5-B12)/C12)。
由此可得噻呋酰胺的具体评价结果：
Figure BDA0001422516430000091
本实施例利用无纺布为培养环境，在刚萌发的麦苗上接种纹枯病菌，然后施以不同浓度待测药剂，一周后观察记录病斑长度，并对药剂进行评价。该方法周期短、操作方便，与传统的平板测定相比该方法更具有参考价值。
具体实施时还可同时以多种药剂进行实验并记录数据，从而进行比对，以评估不同药剂之间的效果。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取若干小麦种子，对其表面进行消毒并洗涤干净；采用无菌水湿润的滤纸，将小麦种子放在以无菌水湿润的滤纸上，于培养箱中避光培养使小麦种子发芽，当芽长度为0.6-0.8cm时，取出备用；
第一步中，消毒的具体过程为：S1、将小麦种子放入有效氯浓度为1±0.5％的次氯酸钠溶液，并于摇床中震荡；转至S2；
S2、将小麦种子放入无菌水，并于摇床中震荡；
S2步重复至少一次；S1中，震荡时间为5-20分钟；S2中，震荡时间为至少10分钟；S1、S2中，摇床转速为120±10rpm；
第二步、取纹枯病菌菌株并接种至新鲜的平板培养基上活化；将活化后的纹枯病菌再接种至新鲜的平板培养基上继续培养，当菌落半径达到平板半径的2/3～3/4时，用打孔器在菌落边缘打取菌碟，备用；所述菌碟为带有纹枯病菌的培养基，且呈环状；
第二步的具体过程为：先将纹枯病菌菌株从冻存柜中取出，再接种至新鲜的平板培养基上活化，于25℃±2℃下培养至少3天；用打孔器在菌落边缘打取菌碟，将该菌碟转接至新鲜的平板培养基上继续培养5-7天，当菌落半径达到平板半径的2/3～3/4时，用打孔器在菌落边缘打取菌碟，备用；
第三步、取待测药剂，先配制成预定浓度的母液，再按预定梯度稀释成系列浓度的稀溶液，备用；
第四步、将第一步所得的发芽小麦种子分成若干供试组以及一个对照组，各供试组以及对照组中的发芽小麦种子数量相同；所述供试组的数量为第三步所得稀溶液浓度个数的正整数倍，各浓度稀溶液对应的供试组数量相同；
第五步、先将第二步所得菌碟分别套至各发芽小麦种子的芽根部，再将同一供试组或同一对照组的发芽小麦种子的芽根部包入或卷入同一灭菌无纺布中，并在灭菌无纺布外绑扎固定；
第六步、将各供试组放入盛有对应浓度第三步所得稀溶液的器皿中，将对照组放入盛有自来水的器皿中，放置时间为预定的吸收时间；各器皿与供试组或对照组一一对应；各器皿中稀溶液或自来水的体积相同；各供试组或对照组的发芽小麦种子按芽朝上根朝下的方式放置；
第七步、按预定时间间隔向各器皿中分别浇溉等体积的自来水，当达到预定的培养时间时，取出各供试组或对照组的发芽小麦种子，量取其上的病斑长度并记录；
第八步、将与同一浓度稀溶液对应的所有供试组中发芽小麦种子的病斑长度统计在一起并计算平均值，作为与该浓度稀溶液对应的检测值；计算对照组中发芽小麦种子的病斑长度平均值，作为对照值；根据检测值和对照值计算各浓度稀溶液的抑制率；根据抑制率按预定函数计算各浓度稀溶液的几率值Y，所述预定函数的作用为根据指定正态分布的概率值、指定平均值以及指定标准偏差返回正态累积分布函数的反函数值，其中，以抑制率为指定正态分布的概率值，指定平均值为属于实数的预设常数，指定标准偏差为大于零且属于实数的预设常数；按各稀溶液的浓度计算对数浓度值X；先采用回归法算得对数浓度值X与几率值Y的线性回归方程，再根据该线性回归方程算得待测药剂的EC50值；测定结束；其中，
抑制率按下式计算：
Figure FDA0002695363020000021
几率值Y按下式计算：几率值Y＝NORMINV(probability,mean,standard_dev)，NORMINV函数即为所述预定函数，其中，probability为指定正态分布的概率值，mean为指定平均值，standard_dev为指定标准偏差；
对数浓度值X按下式计算：对数浓度值X＝LN(稀溶液浓度)；
所述线性回归方程为：Y＝a+bX；
EC50值按下式计算：
Figure FDA0002695363020000031
其中，e为自然常数，mean为NORMINV函数中的指定平均值，a和b为线性回归方程中的相应参数；
所述线性回归方程的相关系数R大于0.75。
2.根据权利要求1所述针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，其特征是，第一步中，培养时，先将小麦种子平铺在铺有滤纸的玻璃平板中，再加入无菌水湿润滤纸；培养箱温度为25℃±2℃，培养时间为2-3天。
3.根据权利要求1所述针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，其特征是，所述平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
4.根据权利要求1所述针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，其特征是，第五步中，先将套好菌碟的发芽小麦种子等距离摆放在灭菌无纺布上，且发芽小麦种子的芽根部位于距灭菌无纺布下沿1/4～1/3处，再将灭菌无纺布卷起，并以皮筋捆绑固定。
5.根据权利要求1至4任一项所述针对小麦纹枯病防治药剂的室内生测方法，其特征是，第三步中，所述预定浓度为1mg/ml，所述预定梯度为2倍；第六步中，所述器皿为一次性塑料杯或纸杯，所述预定的吸收时间为24小时；第七步中，所述预定时间间隔为24小时，所述预定的培养时间为一星期；第八步中，指定平均值为5，指定标准偏差为1。
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