NO341813B1

NO341813B1 - Peptidforbindelse med biologisk aktivitet, dets fremstilling, farmasøytiske sammensetninger inneholdende slike og deres anvendelser

Info

Publication number: NO341813B1
Application number: NO20084671A
Authority: NO
Inventors: Philippe Bressollier; Maria Attilia Brugo; Pascale Robineau; Jean Marie Schmitter; Maurice Soffeir; Maria Camino Urdaci; Bernard Verneuil
Original assignee: Sanofi Aventis Spa
Priority date: 2006-04-06
Filing date: 2008-11-05
Publication date: 2018-01-29
Also published as: ATE535540T1; NZ571477A; CA2646892C; WO2007113691A2; JP5196407B2; CN101415725A; JO2739B1; DOP2007000065A; IL194325A0; EA200870414A1; ITMI20060678A1; EP2013234B1; BRPI0710846A2; AR060350A1; UA92793C2; ME00194B; GEP20115282B; NI200800265A; US20090312262A1; TW200806688A

Abstract

Oppfinnelsen vedrører en peptidforbindelse med biologisk aktivitet som spesielt innehar antimikrobielle egenskaper, dets tillaging og dets anvendelser.

Description

341813

1

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører peptidforbindelser med biologisk aktivitet, som spesielt innehar antimikrobielle egenskaper, dets fremstilling, farmasøytiske sammensetninger inneholdende slike og deres anvendelser.

5

Det er kjent at visse mikroorganismer når det gis til mennesker eller dyr, er i stand til å utøve en gunstig effekt på helsen til verten, spesielt ved å produsere antimikrobielle substanser.

<10>Slike organismer kalles generelt probiotiske organismer.

Flere studier har vist de gunstige effektene av disse probiotiske organismer for mennesker og for dyr, spesielt i behandlingen av gastrointestinale lidelser slik som diaré, akutt diaré og diaré forbundet med anvendelsen av medisinske medikamenter.

15

De probiotiske organismene som er mest studert frem til i dag er melkesyrebakteriene, men det er også blitt rapportert at andre levende organismer kan ha en gunstig effekt på helsen.

<20>Disse andre organismene inkluderer for eksempel Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus polyfermentans.

Blant disse så er Bacillus clausii blitt anvendt i mange år i en farmasøytisk

<25>sammensetning som markedsføres under varemerket Enterogermina®.

Denne farmasøytiske sammensetningen er spesielt ment for å bekjempe gastrointestinale lidelser og omfatter en blanding av fire stammer av Bacillus clausii.

<30>Den antimikrobielle biologiske aktiviteten til disse probiotiske organismer er generelt koplet til den naturlige produksjonen av forbindelser med antimikrobiell aktivitet slik som lantibiotika. Dermed så produserer stammer av Bacillus clausii, Streptomyces mutans, Lactococcus lactis henholdsvis subtilin, mutakiner som beskrevet i WO9856411 og nisiner som beskrevet i WO2004026334.

35

Videre beskriver Sahl H-G et al., i Annual Review of Microbiology, 1998, Vol.52, page 41-79 ”Lantibiotics: Biosynthesis and biological activities of uniquely modified

341813

2

peptides from gram-positive bacteria“

Flere antibiotika blir i dag anvendt som terapeutiske substanser for behandlingen av infeksiøse sykdommer, men patogener blir mer og mer resistente mot farmasøytiske

<5>preparater som blir anvendt. Noen av dem er allerede kjent for å være "multi-resistente" og det er noen ganger ekstremt vanskelig å behandle infeksjonene som de forårsaker.

Nye molekyler som har antibiotiske egenskaper blir derfor konstant søkt etter.

<10>Formålet med oppfinnelsen er å møte dette krav, ved å foreslå en forbindelse med antimikrobiell aktivitet skaffet tilveie fra Bacillus clausii.

En første hensikt ifølge oppfinnelsen vedrører en forbindelse med antimikrobiell aktivitet.

15

En andre hensikt ifølge oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen med antimikrobiell aktivitet ifølge oppfinnelsen.

En tredje hensikt ifølge oppfinnelsen vedrører en farmasøytisk sammensetning som

<20>inneholder forbindelsen med antimikrobiell aktivitet ifølge oppfinnelsen.

En fjerde hensikt ifølge oppfinnelsen vedrører anvendelsen av forbindelsen med antimikrobiell aktivitet ifølge oppfinnelsen.

<25>I henhold til et første aspekt vedrører oppfinnelsen en forbindelse med antimikrobiell aktivitet.

Et molekyl produsert av Bacillus clausii, og som utviser antimikrobiell aktivitet er dermed blitt isolert og karakterisert.

30

Foreliggende oppfinnelse vedrører således en peptidforbindelse som utviser antimikrobiell aktivitet og kan skaffes tilveie fra en kultur av Bacillus clausii i et passende medium frem til sporulering, oppsamling av supernatanten fra kulturen etter sentrifugering og filtrering og ekstrahering av fraksjonen med antimikrobiell aktivitet,

<35>omfattende den følgende aminosyresekvensen:

Phe – Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala - Gly - Glu - Dhb - Gly -Ala - Phe - Asn - Ala - Phe – Ala

341813

3

hvor

Dhb representerer et didehydroaminobutyrat;

Dha representerer et didehydroalanin;

Abu representerer et aminobutyrat.

5

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen med antimikrobiell aktivitet er av peptid natur og kan skaffes tilveie fra en kultur av Bacillus clausii i et passende medium frem til sporulering, samling av supernatanten fra kulturen etter sentrifugering og filtrering, og ekstraksjon av fraksjonen med antimikrobiell aktivitet.

10

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen, som hovedsakelig er aktiv mot Gram-positive bakterier, kan skaffes tilveie fra Bacillus clausii, og har en molekylvekt på 2107,5 Da, bestemt ved hjelp av massespektrometri med MALDI TOF og ESI fremgangsmåten.

<15>I henhold til andre karakteristika så er forbindelsen ifølge oppfinnelsen et lantibiotika og har lantioninbroer og modifiserte aminosyrer i dets peptidsekvens.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen innehar to lantioninbroer, en mellom alaninet i

<20>posisjon 3 og alaninet i posisjon 7, og den andre mellom alaninet i posisjon 16 og alaninet i posisjon 21; en metyl-lantioninbro er videre representert mellom aminobutyratresidiet i posisjon 8 og alaninet i posisjon 11. En fjerde bro er tilstede mellom den C-terminale amino-vinyl-cysteingruppen og alaninresidiet i posisjon 19.

<25>Representert med de eksisterende broene så har forbindelsen ifølge oppfinnelsen den følgende sekvensen:

S

Phe - Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala - Gly - Glu - Dhb - Gly - Ala - Phe - Asn - Ala - Phe - Ala - NH - CH=CH-

SS S

hvor Dha, Dhb og Abu er som definert over.

30

I en utførelsesform kjennetegnes forbindelsen ifølge oppfinnelsen ved at aminosyreresidiene er enantiomerer av L-formen.

Ifølge et andre aspekt så vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av

<35>forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

341813

4

Ifølge oppfinnelsen så kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen ekstraheres fra Bacillus clausii i henhold til den følgende fremgangsmåten.

<5>Fremgangsmåten for tillaging av forbindelsen ifølge oppfinnelsen omfatter trinnene:

- å dyrke stammer av Bacillus clausii i et passende medium frem til sporulering av stammene;

- samling av supernatanten fra kulturen etter sentrifugering og filtrering;

<10>- fast-fase ekstraksjon av fraksjonen skaffet tilveie og eluering.

Hvis det er nødvendig så kan fraksjonen som skaffes tilveie, som samsvarer med molekylet ifølge oppfinnelsen, renses ved hjelp av høy-ytelses væske kromatografi (HPLC).

15

Ifølge en annen utførelsesform så kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen lages ved hjelp av konvensjonell kjemisk syntese i henhold til fremgangsmåtene som er kjent for fagpersonen.

<20>Forbindelsen ifølge oppfinnelsen viser antimikrobiell aktivitet mot Gram-positive bakterier. Spesielt så har den vist antimikrobiell aktivitet mot S. aureus, Enterococcus faecium, Micrococcus sp, Lactococcus lactis, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes og de Gram-positive bakteriene i munnhulen.

<25>På grunn av den lantibiotiske karakter, så kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen utvise et videre spekter av biologisk aktivitet, for eksempel antiviral, antiparasittisk eller immunmodulerende aktivitet.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan derfor anvendes for fremstilling av medisinske

<30>produkter.

I henhold til en annen av dets aspekter så vedrører oppfinnelsen dermed medisinske produkter som inneholder forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

<35>Disse medisinske produktene finner anvendelse innen terapi, spesielt i behandlingen og forebyggingen av infeksiøse sykdommer.

341813

5

Disse medisinske produkter finner også anvendelse i behandlingen og/eller forebyggingen av tarmlidelser, for eksempel i behandlingen eller forebyggingen av intestinal dysbiose og endogen vitaminforstyrrelse, så vel som i adjuvansbehandling for gjenoppretting av den intestinale mikrobielle flora som er blitt forandret som et resultat

<5>av antibiotikabehandling eller kjemoterapi.

De finner også anvendelse i forebyggingen og behandlingen av diaré, spesielt akutt diaré og diaré forbundet med anvendelsen av medisinske produkter.

<10>I henhold til et annet av dets aspekter så vedrører oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger som omfatter som aktivt prinsipp, forbindelsen i henhold til oppfinnelsen, behandlingen og/eller forebyggingen av patologiene som er beskrevet over. Disse farmasøytiske sammensetningene inneholder en effektiv dose av forbindelsen i henhold til oppfinnelsen så vel som minst et farmasøytisk effektivt

<15>hjelpestoff.

Nevnte hjelpestoffer er valgt, i henhold til den farmasøytiske formen og den ønskede administreringsruten, fra de vanlige hjelpestoffene som er kjent for en fagperson. I de farmasøytiske sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen for oral,

<20>sublingual, subkutan, intramuskulær, intravenøs, topikal, lokal, intratrakeal, nasal, transdermal eller rektal administrering, så kan forbindelsen administreres i doseenheter, blandet med konvensjonelle farmasøytiske hjelpestoffer, til dyr og til mennesker for forebygging eller behandlingen av lidelsene eller sykdommene som er nevnt over.

<25>Passende doseenheter omfatter former for den orale ruten slik som tabletter, myke eller harde kapsler, pulvere, granulater og orale løsninger eller suspensjoner; sublinguale, bukkale, intratrakeale, intraokkulære, nasale og inhaleringsformer for administrering; topikale, transdermale, subkutane, intramuskulære eller intravenøse former for administrering; rektale former for administrering og implantater. For topikal

<30>anvendelse så kan forbindelser ifølge oppfinnelsen anvendes i kremer, geler, salver eller lotioner.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan administreres via den mest hensiktsmessige ruten og ved en dose som avhenger spesielt av egenskapene til infeksjonen, typen av

<35>vert det er snakk om, vertens alder, vekt og generell tilstand, samtidig behandling som mottas, så vel som på vertens respons på behandlingen og på det terapeutiske rasjonale.

341813

6

For administrering til mennesker, så blir sammensetningen generelt administrert via den orale ruten i form av en farmasøytisk sammensetning av sporer. For eksempel så kan dosen være ca.10 x 10<9>sporer daglig, for eksempel fra 1 til 8 x 10<9>sporer daglig, spesielt 2, 4 eller 6 x 10<9>sporer daglig, i en enkel dose eller i flere doser.

5

Det kan være spesielle tilfeller hvor høyere eller lavere doser er hensiktsmessig.

I henhold til et annet av dets aspekter så vedrører oppfinnelsen anvendelsen av forbindelsen ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medisinsk produkt som er ment

<10>for forebygging og/eller behandlingen av patologiene som er beskrevet over.

I henhold til et annet av dets aspekter, så kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen også anvendes som et additiv i kosmetiske eller matvaresammensetninger.

15

Ifølge denne anvendelse så blir forbindelsen ifølge oppfinnelsen tilsatt i en mengde som er tilstrekkelig for å hemme økning i bakteriell vekst i kosmetiske sammensetninger eller matvaresammensetninger og dermed tillate deres konservering.

<20>Eksemplene gitt under illustrerer oppfinnelsen.

1. Produksjon av molekylet

Produksjon av supernatanten.

<25>En O/C-stamme av Bacillus clausii (skaffet tilveie fra den farmasøytiske sammensetningen som er markedsført med varenavnet Enterogermina®) dyrkes i tre dager på Mueller Hinton medium ved 37°C og 180 omdreininger pr. minutt inntil sporulering i stammen finner sted.

<30>Kulturen blir så sentrifugert og supernatanten blir filtrert med en membran med porestørrelse på 0,45�m for å fjerne de gjenværende cellene.

Ekstraksjon

Forbindelsen med antimikrobiell aktivitet ekstraheres i den faste fasen på en Sep Pak

<35>plus C18patron (Waters). For dette så blir 150 ml av supernatant skaffet tilveie i det foregående trinnet deponert på en patron og eluering utføres med 100% metanol, etter tre etterfølgende vaskinger med NH4HCO325 mM, pH 8; NH4HCO325 mM, pH 8

341813

7

10% metanol og NH4HCO325 mM, pH 8 50% metanol.

Alle de aktive fraksjonene eluert med 100% metanol kombineres og konsentreres ved vakuumevaporering inntil en volumreduksjonsfaktor på 10 oppnås.

5

Konsentratet oppbevares ved –20°C. Ingen tap av aktivitet ble observert etter 6 måneder ved lagring ved disse betingelser.

Rensing

<10>Rensing så langt som til homogenisering av substansen ekstrahert i den faste fasen utføres ved hjelp av HPLC.

Et første semi-preparativt trinn utføres på en kolonne C4Synchropack 100 x 8 mm. Fraksjonene av eluat som viser antimikrobiell aktivitet samles og kombineres.

<15>Renheten av forbindelsen skaffet tilveie ved slutten av dette trinn er høyere enn 80% og utbytte i ekstraksjon – rensing er ca.6 mg-l<-1>av supernatant.

Et andre analytisk trinn utføres på en kolonne C1Bischoff 150 x 4.6 mm. Fraksjonene av eluat som viser antimikrobiell aktivitet samles og kombineres. Renheten av

<20>forbindelsen skaffet tilveie på slutten av dette trinn er høyere enn 90%.

2. Strukturell undersøkelse

Bestemmelse av molekylvekt

<25>Den rensede forbindelsen skaffet tilveie i eksempel 1 over har en molekylvekt på 2107,5 Da bestemt ved hjelp av massespektrometri ved å anvende MALD TOF fremgangsmåten og bekreftet ved massespektrometri ved å anvende ESI

fremgangsmåten.

<30>UV/synlig absorpsjonsspektra

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen absorberer i det ultrafiolette området og har spesielt en topp ved 265 nm som samsvarer med tilstedeværelsen av aromatiske aminosyrer i dens struktur.

<35>Sammensetning av aminosyrene

Etter fullstendig hydrolyse med HCl 5,7 N, under vakuum, i 16 timer ved 115°C så blir nærværet av forskjellige aminosyrer detektert i strukturen til den rensede forbindelsen.

341813

8

Undersøkelse av de forskjellige enantiomere formene av aminosyrene

De enantiomere formene L og D av aminosyrene som utgjør sekvensen til forbindelsen med antimikrobiell aktivitet ble undersøkt etter fullstendig sur hydrolyse, ved

<5>derivatisering med N�-(2,4-dinitro-5-fluorfenyl)-L-alaninamid (Marfey's reagens) i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Szokan (J. Chromato., 1988, 444, s.115-122). Resultatene indikerer at alle residiene i aminosyrene som utgjør antibiotikamolekylet er enantiomerer med L-formen.

<10>Effekter av enzymatiske eller kjemiske behandlinger på struktur

Det fullstendige tap av aktivitet etter enzymatisk behandling med Pronase bekrefter peptidkarakteren til den nye antibiotikaforbindelsen.

Disulfidbroer er utelukket fordi en cistern-spesifikk analyse viste seg å være negativ. I

<15>motsetning til dette så kan tilstedeværelsen av lantioninbroer, som er sensitive for reduserende behandling i alkalisk medium (Meyer, Anal. Biochem, 223, s 185-190, 1994) forklare tapet av aktivitet observert i nærværet av��mercaptoetanol etter strukturell modifisering, detektert ved revers-fase HPLC.Den delvise reduksjonen i aktivitet målt på slutten av mindre drastisk behandling slik som inkubering med nøytral

<20>pH i nærværet av DTT 25 mM kan være resultatet av spesifikk reduksjon av didehydroaminosyrene som er tilstede i strukturen. Disse observasjoner gjør det mulig å formulere hypotesen hvor ifølge denne det antimikrobielle molekylet produsert ved Bacillus clausii er et lantibiotika. Denne familie av antibiotika karakteriseres normalt av tilstedeværelsen av lantioninbroer og modifiserte aminosyrer i deres struktur.

25

Sekvensering av det native molekylet

Sekvensering utføres ved å anvende en Procise 492 A automatisk sekvensator (Applied Biosystem) ved hjelp av Edman tilbakevendende degradering som starter i den N-terminale enden. PTH aminosyrene som dannes analyseres ved revers-fase HPLC på en

<30>mikrobor C18 kolonne. Sekvenseringen av antibiotikamolekylet, i sin native tilstand, blokkeres ved enden av det første trinnet av Edman kjemisk degradering. Det eneste residiet som identifiseres korresponderer med et fenylalanin som okkuperer den N-terminale posisjonen.

<35>Sekvensering av molekylet etter kjemisk modifikasjon

Informasjonen som vedrører den potensielle sekvensen til den nye antimikrobielle substansen produsert ved Bacillus clausii, utledet fra sekvensen til det kodende genet,

341813

9

kombinert med informasjonen skaffet tilveie ved analyse av aminosyresammensetningen og fra oppførselen i det reduserende mediet, avslører tilstedeværelsen av posttranslasjonelle modifikasjoner som er karakteristisk for lantibiotika.

<5>Tilstedeværelsen av didehydro-aminosyrer og av lantioninbroer i strukturen befinner seg ved opprinnelsen av blokkeringen av sekvensering av molekylet i den naturlige tilstand. Dehydro-aminosyrene slik som Dha (didehydroalanin) og Dhb (didehydroamino-butyrat) deamineres under Edman kjemisk degradering og blokkerer dermed progresjonen av sekvenseringen. Disse samme residier Dha og Dhb er ikke

<10>detekterbare ved analyse av aminosyresammensetningen etter fullstendig sur hydrolyse av samme årsaker og deres deaminering gjør at reaksjonen med derivatisering med 6-aminoquinolyl-N-hydroksysuccinimidylkarbamat eller med AQC (Waters), er ineffektiv, spesifikk for de primære aminfunksjonene.

<15>Med den hensikt å overvinne problemene som er forbundet med tilstedeværelsen av modifiserte aminosyrer og lantioninbroer, så ble en dobbel kjemisk reaksjon brukt på peptidantibiotika før dets sekvensering. Fremgangsmåten som ble benyttet var tilpasset etter arbeidet til Smith, Eur. J. Biochem.2000, 267, s.6810-6816. For dette formål så blir 50 nmol av det rensede peptidet tatt opp i 10�l H2O 4 mg NaBH4.190�l av en

<20>denaturerende og antioksidantløsning (570 mg guanidinklorid 0,1 ml N-etylmorfolin, justert til pH 8,5 og til et sluttvolum på 1 ml med H2O) blir tilsatt og deretter inkuberer reaksjonsblandingen i en strøm av N2i 72 timer ved 37°C.

Denne behandling reduserer spesifikt didehydro-aminosyrene uten å påvirke

<25>lantioninbroene.

Peptidet som dermed blir redusert gjenvinnes på en Prosorb kolonne (Perkin Elmer) utstyrt med en PVDF membran. Etter vasking av membranen med 200�l 0,1% TFA, så blir peptidet absorbert på dette støttemateriale avgitt til en andre reduksjon i nærvær av

<30>etantiol (tilsetning av 20�l av en løsning som omfatter 280�l av metanol 200�l H2O 65 ml NaOH 60�l etantiol) i en time ved 50°C.

Kovalentstruktur av antibiotikamolekylet produsert med Bacillus clausii Den kovalente strukturen er i overensstemmelse med alle dataene som er skaffet tilveie.

<35>Molekylvekten beregnet på basis av massene til de monoisotope residiene er 2107.5 Da.

Det antimikrobielle molekylet utskilt av Bacillus clausii er et lantibiotika som innehar 4 lantioninbroer og metyllantionin så vel som 3 didehydro-aminosyreresidier i sin

341813

10

struktur. Strukturen er i overensstemmelse med massen som er funnet, 2107.5 Da, med resultatet skaffet tilveie etter å ha utført kjemiske modifikasjoner på molekylet og med aminosyresekvensen utledet på basisen av genet som kode for dets produksjon, funnet i B. clausii. Strukturen ble bekreftet med NMR analyse.

5

De andre tre stammene (N/R, SIN, T) av Bacillus clausii tilstede i den farmasøytiske sammensetningen Enterogermina® viste den samme profilen for antimikrobiell aktivitet som O/C-stammen.

Claims

341813

11

P a t e n t k r a v

1.

<5>Peptidforbindelse som utviser antimikrobiell aktivitet og kan skaffes tilveie fra en kultur av Bacillus clausii i et passende medium frem til sporulering, samling av supernatanten fra kulturen etter sentrifugering og filtrering og ekstrahering av fraksjonen med antimikrobiell aktivitet, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter den følgende aminosyresekvensen:

<10>Phe – Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala - Gly - Glu - Dhb - Gly -Ala - Phe - Asn - Ala - Phe – Ala

hvor

Dhb representerer et didehydroaminobutyrat;

Dha representerer et didehydroalanin;

<15>Abu representerer et aminobutyrat.

2.

Forbindelse ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at den har en molekylvekt på 2107.5 Da.

20

3.

Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, k a r a k t e r i s e r t v e d at den er lantibiotisk og har lantioninbroer og modifiserte aminosyrer.

<25>4.

Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, k a r a k -t e r i s e r t v e d at den har to lantioninbroer, en mellom alaninet i posisjon 3 og alaninet i posisjon 7, og den andre mellom alaninet i posisjon 16 og alaninet i posisjon 21; en metyl-lantioninbro mellom aminobutyratresidiet i posisjon 8

<30>og alaninet i posisjon 11 og en fjerde bro mellom den C-terminale amino-vinylcysteingruppen og residiet alaninet i posisjon 19.

5.

Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, k a r a k -

<35>t e r i s e r t v e d at aminosyreresidiene er enantiomerer av L-formen.

341813

12

6.

Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 5, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter trinnene

- å dyrke stammene av Bacillus clausii i et passende medium frem til

<5>sporulering av stammene;

- å samle supernatanten fra kulturen etter sentrifugering og filtrering; - fast-fase ekstraksjon av fraksjonen skaffet tilveie og eluering;

- hvis nødvendig rensing av fraksjonen skaffet tilveie ved høy-ytelses væske kromatografi (HPLC).

10

7.

Medisinsk produkt, k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 5.

<15>8.

Farmasøytisk sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter en forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 5, og minst et farmasøytisk akseptabelt hjelpemiddel.

<20>9.

Forbindelse ifølge ethvert av kravene 1 til 5 for anvendelse som et medisinsk produkt for behandling og/eller forebygging av tarmlidelser eller av infeksiøse sykdommer.

10.

<25>Forbindelse ifølge krav 9 for behandling og/eller forebygging av tarmdysbiose og endogen vitaminforstyrrelse, for gjenoppretting av den mikrobielle floraen i tarmen som er forandret som et resultat av antibiotikabehandling eller kjemoterapi, for behandlingen og forebyggingen av diaré, spesielt akutt diaré eller diaré forbundet med anvendelsen av medisinske produkter.

30

11.

Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvert av kravene 1 til 5 som et additiv i kosmetiske sammensetninger eller matvaresammensetninger.