MX2008012730A - Compuesto peptidico con actividad biologica, su preparación y sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un compuesto peptídico con actividad biológica, el cual posee, en particular, propiedades antimicrobianas, su preparación y sus aplicaciones.

Description

COMPUESTO PEPTÍPICO CON ACTIVI DAD BIOLÓGICA. SU PREPARACIÓN Y SUS APLICACION ES La presente invención se refiere a un compuesto peptídico con actividad biológica, que posee en particular propiedades antimicrobianas, a su preparación y a sus aplicaciones. Se sabe que ciertos microorganismos, cuando se sumi ni stran vivos a humanos o a ani males, son capaces de ejercer un efecto benéfico sobre la salud del huésped, en particular mediante la producción de sustancias antimicrobianas. Tales organismos se denomi nan generalmente organismos probióticos. Numerosos estudios han mostrado los efectos benéficos , para humanos o para animales, de estos organismos probióticos , en particular en el tratamiento de los trastornos gastroi ntestinales , tales como diarrea, diarrea aguda, diarrea asociada a la ingestión de medicamentos. Los organismos probióticos más estudiados hasta hoy en día son las bacterias lácticas, pero también se ha reportado que otros organismos vivos pueden presentar un efecto benéfico sobre la sal ud. Estos otros organismos comprenden por ejemplo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus polyfermentans. Entre éstos, el Bacillus clausii se ha utilizado desde hace muchos años en una composición farmacéutica comercializada bajo la marca Enterogermi na®. Esta composición farmacéutica está destinada en particular a combatir los trastornos gastroi ntesti nales y comprende una mezcla de cuatro cepas de Bacillus clausii. La actividad biológica antimicrobiana de estos organismos probióticos está unida generalmente a la producción natural de compuestos con actividad antimicrobiana, tales como los lanti bi óticos. De esta manera, l as cepas de Bacillus clausii, Streptomyces mutans, Lactococcus lactis producen respectivamente la sublitina, mutaci nas y nisinas. Hoy en día se usan numerosos anti bióticos como sustancias terapéuticas para el tratami ento de las enfermedades i nfecciosas pero los agentes patógenos se hacen cada vez más y más resistentes a los farmacéuticos utilizados. Ya se conocen algunos de ellos por ser "multi-resistentes" y algunas veces es extremadamente difícil tratar las i nfecciones que ellos ori gi nan . Por tanto siempre se buscan nuevas moléculas que tengan propiedades anti bióticas. El objetivo de esta invención es responder a esta demanda, proponiendo un compuesto con actividad anti microbiana obtenido a parti r de Bacillus clausii. Un primer objeto de la i nvención se refiere a un compuesto con actividad anti microbiana. Un segundo objeto de la invención se refiere a un método para la preparación del compuesto con actividad anti microbiana de la invención. Un tercer objeto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene el compuesto con actividad anti microbiana de la i nvención. Un cuarto objeto de la invención se refiere a los usos del compuesto con actividad antimicrobiana de la invención. De acuerdo a un pri mero aspecto, la invención se refiere a un compuesto con actividad anti microbiana. De esta manera, una molécula producida por el Bacillus clausii, y que presenta una actividad antimicrobiana, ha sido ai slada y caracterizada. El compuesto de la invención con actividad antimicrobiana es de una naturaleza peptídica y puede obtenerse a partir de un cultivo de Bacillus clausii en un medio apropiado hasta la esporuiación, colección del sobrenadante del cultivo después de la centrifugación y filtración, y extracción de la fracción con actividad anti microbiana. El compuesto de la invención, el cual es activo pri nci palmente contra las bacterias Gram positivas, podrá obtenerse de Bacillus clausii, y tiene un peso molecular de 2107.5 Da, determi nada por espectrometría de masas por el método MALDI TOF y ES I . De acuerdo a otra característica, el compuesto de la invención es un lanti biótico, y tiene puentes de lantionina y aminoácidos modificados en su secuencia peptídica. De acuerdo a una de sus características, el compuesto de la invención comprende la siguiente secuencia de aminoácidos y derivados de aminoácidos: Phe - Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala -Gly - Glu - Dhb - Gly - Ala - Phe - Asn - Ala - Phe - Ala en la que Dhb representa un dideshidroaminobutirato; Dha representa una dideshidroalanina; Abu representa un aminobutirato. El compuesto de la invención posee dos puentes de lantionina, uno entre la alanina en la posición 3 y la alanina en la posición 7, y el otro entre la alanina en la posición 16 y la alanina en la posición 21 . Además está presente un puente de metil-lantionina entre el residuo aminobutirato en la posición 8 y la alanina en la posición 1 1. Se encuentra presente un cuarto puente entre el grupo amino-vinil-cisteínico de terminal C y el residuo de la alanina en la posición 19. Representado con los puentes existentes, el compuesto de la invención tiene la siguiente secuencia: Phe - Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala - Gly - Glu - Dhb - Gly - Ala - Phe - Asn - A i —la - Phe - Ala s - — NH - CH=CH- I I g_ 1 I— s— J I s- —J en la que Dha, Dhb y Abu son según se define anteriormente. De acuerdo a un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para la preparación del compuesto de la invención. De acuerdo a la invención, el compuesto de la invención puede extraerse de Bacillus clausii de acuerdo al siguiente método. El método de preparación del compuesto de la invención comprende las fases de: - cultivo de las cepas de Bacillus clausii en un medio apropiado hasta la esporulación de las cepas; - colección del sobrenadante del cultivo después de la centrifugación y filtración; - extracción en fase sóli da de la fracción obtenida y elución. Si fuere necesario, la fracción obtenida, que corresponde a la molécula de la invención, puede purificarse por cromatografía líquida de alto rendi miento ( H PLC) . De acuerdo a otra modalidad, el compuesto de la i nvención puede prepararse mediante síntesis química convencional , de acuerdo a los métodos conocidos por un experto en la materia. El compuesto de la invención presenta actividad antimicrobiana contra las bacterias Gram positivas. En particular ha mostrado una actividad antimicrobiana contra S. aureus, Enterococcus faecium, Mocrococcus sp, Lactococcus lactis, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes y las bacterias Gram positivas de la cavidad oral .

Debido a su carácter lantibiótico, el compuesto de l a invención puede presentar un espectro de actividad biológica más amplio, por ejemplo actividad antiviral , antiparasitaria o inmunomoduladora. El compuesto de la invención puede por tanto utilizarse para la preparación de medicamentos. De esta manera, de acuerdo a otro de sus aspectos, l a invención se refiere a productos medici nales que contienen el compuesto de la invención. Estos productos medicinales encuentran su aplicación en terapia, en particular en el tratamiento y en la prevención de las enfermedades i nfecciosas. Estos productos medicinales encuentran también aplicación en el tratamiento y/o en la prevención de los trastornos intestinales, por ejemplo en el tratamiento y en la prevención del disbiosis intestinal y la disbiosis de vitami na endógena, asi como también en el tratamiento coadyuvante en la recuperación de la flora microbiana intestinal que ha sido alterada como resultado de un tratamiento anti biótico o de una quimioterapia. Éstos encuentran también aplicación en la prevención y en el tratamiento de la diarrea, en particular en la diarrea aguda y en la diarrea asociada con el uso de productos medicinales. De acuerdo a otro de sus aspectos, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden, como pri nci pio activo, el compuesto de acuerdo a la invención, para el tratamiento y/o para la prevención de las patologías descritas anteriormente. Estas composiciones farmacéuticas contienen una dosis eficaz del compuesto de acuerdo a la invención, así como también al menos un excipiente farmacéuticamente eficaz. Dichos exci pientes se eligen, de acuerdo a la forma farmacéutica y la vía de administración deseada, de los exci pientes habituales que se conocen por el experto en la materia. En las composiciones farmacéuticas de la presente invención para la admi nistración oral , sublingual , subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica, local , i ntratraqueal , nasal, transdérmica o rectal , el compuesto puede administrarse en unidades de dosifi cación, mezclado con excipientes farmacéuticos convencionales, a los ani males y a los humanos, para la prevención o para el tratamiento de los trastornos o enfermedades anteriores. Las unidades de dosificación apropiadas comprenden las formas por vía oral tales como los comprimidos, cápsulas blandas o duras, los polvos, los granulados y las sol uciones o suspensiones orales, las formas de administración subli ngual , bucal , intratraqueal , intraocular, nasal, por inhalación, las formas de administración tópica, transdérmica, subcutánea, intramuscular o intravenosa, las formas de administración rectal y los implantes. Para la aplicación tópica, pueden utilizarse los compuestos de acuerdo a la invención en cremas, geles, ungüentos o lociones . La composición de la invención puede administrarse de acuerdo a la vía más apropiada y a una dosis que depende en particular de la naturaleza de la infección, del tipo de huésped en cuestión, de la edad, peso, estado general del huésped, de los tratamientos concomitantes que recibe, así como también de la respuesta del huésped al tratamiento y al régimen terapéutico. En general , para la administración a humanos, la composición se admi nistra por vía oral en forma de una composición farmacéutica de las esporas. Por ejemplo, la dosis puede ser de aproximadamente 10x1 09 esporas al día, por ejemplo de 1 a 8 x109 esporas al día, en particular 2 , 4 ó 6 x109 esporas al día, en una dosis única o en varias dosis. Puede haber casos especiales en los que sean apropiadas dosificaciones más elevadas o más bajas; tales dosificaciones no se encuentran dentro del alcance de la invención . De acuerdo a otro de sus aspectos, la invención se refiere al uso del compuesto de la i nvención para la preparación de un producto medicinal destinado para la prevención y/o tratamiento de las patologías descritas anteriormente. La invención de acuerdo a otro de sus aspectos se refiere también a un método de tratamiento de las patologías indicadas anteriormente que comprende la administración, a un paciente, de una dosis eficaz del compuesto de la i nvención. De acuerdo a otro de sus aspectos, el compuesto de la invención puede utilizarse también como un aditivo en las composiciones cosméticas o alimenticias. De acuerdo a su uso, el compuesto de la invención se añade en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento bacteriano en las composiciones cosméticas o alimenticias y permitir de esta manera su conservación. Los ejemplos dados abajo ilustran la invención, no obstante sin limitarla. 1. Producción de la molécula Producción del sobrenadante. Se realiza un cultivo de una cepa O/C de Bacillus clausii (obtenida de la composición farmacéutica comercializada con la marca Enterogermina®) durante 3 días sobre un medio de Mueller Hinton a 37°C y 180 revoluciones por minuto hasta que se presente la esporulación de la cepa. Por tanto, se centrifuga el cultivo, luego se filtra el sobrenadante con una membrana de 0.45 µ?? para eliminar todo el residuo de células.

Extracción El compuesto con actividad antimicrobiana se extrae en la fase sólida sobre cartucho Sep Pak plus C18 (Waters). Para esto, se depositan 150 mi de sobrenadante obtenido en la fase anterior sobre un cartucho y se realiza la elución con 100% de metanol, después de tres lavados sucesivos con N H4 HCO3 25 mM , pH 8; N H4HCO3 25 mM , pH 8 + 1 0% de metanol y N H4HCO3 25 m M , pH 8 + 50% de metanol . Todo lo de las fracciones activas eluidas con 1 00% de metanol se combi nan y se concentran por evaporación al vacio hasta que se obtiene un factor de reducción volumétrico de 1 0. Se almacena el concentrado a -20°C. No se ha observado ni nguna pérdida de actividad después de 6 meses de almacenamiento en tales condiciones.

Purificación Se realiza la purificación mediante HPLC hasta l a homogeneización de la sustancia extraída en fase sólida. Se realiza una primera fase semipreparativa sobre columna C4 Synchropack 100 x 8 mm . Se recolectan y reúnen las fracciones de eluato que presentan la actividad antimicrobiana. La pureza del compuesto obtenida al fi nal de esta fase es superior al 80% y la producción en la extracción - purificación es de aproxi madamente 6 mg 1 de sobrenadante. Se realiza una segunda fase analítica sobre columna C1 Bischoff 1 50 x 4,6 mm. Se recolectan y reúnen las fracciones de el uato que presentan una actividad antimicrobiana. La pureza del compuesto obtenida al final de esta fase es superior al 90%. 2. Estudio estructural Determinación del peso molecular El compuesto purificado obtenido en el Ejemplo 1 anterior tiene un peso molecular de 2107.5 Da determi nada mediante espectrometría de masa utilizando el método MALD TOF y confi rmada mediante espectrometría de masa utilizando el método ES I .

Espectro de absorción UV/visible El compuesto de la invención absorbe en el ultravioleta y tiene en particular un valor máxi mo a 265 nm compati ble con la presencia de ami noácidos aromáticos en su estructura.

Composiciones de los aminoácidos Después de la hidrólisis total con HCI 5.7 N , bajo vacío, durante 16 horas a 1 1 5°C se detecta la presencia de diversos ami noácidos en las estructura del compuesto purificado.

Investigación de las diferentes formas enantioméricas de Sos aminoácidos Se i nvestigaron las formas enantioméricas L y D de los aminoácidos que componen la secuencia del compuesto con actividad antimicrobiana después de la hidrólisis ácida total , por derivatización con N -(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-alani namida (reactivo de M arfey) de acuerdo al método descrito por Szokan (J . Chromato. , 1 988, 444, páginas 1 1 5-122). Los resultados i ndican que todos los residuos de los aminoácidos que constituyen la molécula anti biótica son enantiómeros en forma L.

Efectos de los tratamientos enzimático o químico sobre 8a estructura La pérdida completa de la actividad siguiente al tratamiento enzimático con Pronase confirma el carácter peptídico del nuevo compuesto anti biótico. Se excluyen los puentes disulfuro, ya que se ha revelado negati vo un ensayo específico de cisterna. En contraste, la presencia de los puentes de lantionina, sensi bles al tratamiento reductor en medio alcalino (Meyer, Anal . Biochem , 223, pági nas 185-190, 1994) puede justificar la pérdida de actividad observada en presencia del ß-mercaptoetanol siguiente a la modificación estructural, detectado por HPLC de fase inversa. La disminución , solamente parcial , de la actividad medida al final del tratamiento menos drástico tal como una i ncubación a pH neutral en presenci a de DTT 25 mM puede ser el resultado de la reducción específica de los dideshidroaminoácidos presentes en la estructura. Estas observaciones hacen posible formular la hipótesis de acuerdo a la cual la molécula antimicrobiana producida por el Bacillus clausii es un lanti biótico. Esta familia de anti bióticos se caracteriza normal mente por la presencia de puentes de lantionina y de aminoácidos modificados en su estructura.

Secuenciación de la molécula nativa Se realiza la secuenciación utilizando un secuenciador automático Procise 492 A (Applied Biosystem) por degradación recurrente de Edman a partir del extremo de terminal N . Se analizan mediante HPLC de fase inversa sobre columna microbore C1 8 los aminoácidos de PTH formados. Se bloquea la secuenciación de la molécula antibiótica, en el estado nativo, al final del primer paso de degradación química de Edman. El único residuo identificado corresponde a una fenilalani na que ocupa la posición de termi nal N .

Secuenciación de la molécula después del cambio químico La información en relación a la secuencia potencial de l a nueva sustancia anti microbiana producida por el Bacillus clausii, deducida de la secuencia del gen codificante, combinada con la información obtenida del análisis de la composición de ami noácido y del comportamiento en el medio reductor revelan la presencia de modificaciones post-translacionales características de los lanti bióticos. La presencia de dideshidroami noácidos y de los puentes de lantionina en la estructura está en el origen del bloqueo de la secuenciación de la molécula en el estado nativo. Los deshidroami noácidos tales como los Dha (dideshidroalanina) y Dhb (dideshidroaminobutirato) se desaminan durante la degradación química de Edman y bloquean de esta manera el avance de la secuenciación. Estos mismos residuos Dha y Dhb no son detectables por el análisis de la composición de aminoácido después de la hidrólisis ácida total por las mismas razones, y su desami nación hace ineficaz la reacción de la derivatización con carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccini midilo o con AQC (Waters), especifica de las funciones de aminas primarias . Con el fi n de superar los problemas conectados con l a presencia de aminoácidos modificados y de los puentes de lantioni na, se aplicó una doble reacción química al péptido antibiótico antes de su secuenciación. El método empleado se adaptó del trabajo de Smith, Eur. J . Biochem. 2000, 267, páginas 6810-6816. Para este propósito, se recuperan 50 mmol del péptido purificado con 1 0 µ? de H20 + 4 mg de NaBH4. Se añaden 190 µ? de una sol ución desnaturalizante y antioxidante (570 mg de cloruro de guanidina + 0. 1 mi de N-etilmorfolina, regulada a pH 8.5 y a un vol umen fi nal de 1 mi con H20) l uego se i ncuba el medio de reacción en una corriente de N2 durante 72 horas a 37°C. Este tratamiento reduce específicamente los dideshidroaminoácidos sin afectar a los puentes de lantioni na. Se recupera el péptido reducido de esta manera sobre una col umna Prosorb (Perkin Elmer) equipada con una membrana PVDF. Después del lavado de la membrana con 200 µ? de 0. 1 % de TFA, el péptido absorbido sobre este soporte se somete a una segunda reducción en presencia de etanotiol (adición de 20 µ? de una sol ución que comprende 280 µ? de metanol + 200 µ? de H20 + 65 mi de NaO H + 60 µ? de etanotiol ) durante una hora a 50°C.

Estructura covalente de la molécula antibiótica producida con Bacillus clausii La estructura covalente está de acuerdo con todo lo de los datos obtenidos. El peso molecular calculado sobre la base de las masas de los residuos monoisotópicos es de 21 07.5 Da. La molécula antimicrobiana secretada por el Bacillus clausii es un lantibiótico que posee 4 puentes de lantioni na y metil-lantioni na así como también 3 residuos dideshidroaminoácidos en su estructura. La estructura está de acuerdo con la masa encontrada, 21 07.5 Da, con los resultados obtenidos después de realizar las modificaciones químicas sobre la molécul a, y con l a secuencia de ami noácidos deducida sobre la base del gen que se codifica para su producción, encontrado en el B. clausii. Se confi rmó la estructura mediante análisis RM N. Las otras tres cepas ( N/R, S I N , T) de Bacillus clausii presentes en la composición farmacéutica Enterogermina® mostraron el mismo perfil de actividad antimicrobiana como la cepa O/C.

Claims (1)

1. REIVIN DICACION ES 1 . Compuesto peptidico que presenta actividad anti microbiana y puede obtenerse de un cultivo de Bacillus clausii en un medio apropiado hasta la esporulación, colección del sobrenadante del cultivo después de la centrifugación y filtración, y extracción de la fracción con actividad antimicrobiana. 2. Compuesto de acuerdo a la reivi ndicación 1 , caracterizado porque tiene un peso molecular de 21 07.5 Da. 3. Compuesto de acuerdo a las reivi ndicaciones 1 o 2, caracterizado porque es un lantibiótico y tiene puentes de lantionina y aminoácidos modificados. 4. Compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende l a siguiente secuencia de aminoácidos: Phe - Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala -Gly - Glu - Dhb - Gly - Ala - Phe - Asn - Ala - Phe - Ala en la que Dhb representa un dideshidroaminobutirato; Dha representa una dideshidroalanina; Abu representa un aminobutirato. 5. Compuesto de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizado porque presenta dos puentes de lantioni na, uno entre la alanina en la posición 3 y la alani na en la posición 7, y el otro entre la alanina en la posición 16 y la alanina en la posición 21 ; un puente de metil-l antioni na entre el residuo ami nobutirato en la posición 8 y la alanina en la posición 1 1 y un cuarto puente entre el grupo amino-vinil-cisteínico de terminal C y el residuo de la alanina en la posición 1 9. 6. Compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivi ndicaciones 1 a 5, caracterizado porque los residuos de ami noácidos son enantiómeros en forma L. 7. Método para la preparación de un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las fases de - cultivo de las cepas de Bacillus clausii en un medio apropiado hasta la esporulación de las cepas; - colección del sobrenadante del cultivo después de la centrifugación y filtración; - extracción de fase sólida de la fracción obtenida después de la centrifugación y filtración; - si es necesario, purificación de la fracción obtenida por cromatografía l íquida de alto rendimiento ( H PLC) . 8. Producto medici nal caracterizado porque comprende un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 9. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. 10. Uso de un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivi ndicaciones 1 a 6 para la preparación de un producto medicinal pretendido para el tratamiento y/o la prevención de trastornos intestinales o de enfermedades infecciosas . 1 1 . Uso de un compuesto de acuerdo a la reivi ndicación 1 0 para el tratamiento y/o la prevención de la disbiosis i ntesti nal y el trastorno de vitami na endógena, para la recuperación de la flora microbiana intestinal alterada como resultado de un tratamiento antibiótico o de una qui mioterapia, para el tratamiento y la prevención de diarrea, en particular la diarrea aguda o la diarrea asociada con el uso de productos medici nales . 12. Uso de un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como un aditivo en composiciones cosméticas o alimenticias.