BRPI0710846A2 - composto de peptìdeo com atividade biológica, sua preparação e suas aplicações - Google Patents

Abstract

COMPOSTO DE PEPTìDEO COM ATIVIDADE BIOLóGICA, SUA PREPARAçãO E SUAS APLICAçõES. A presente invenção refere-se a um composto de peptídeo com atividade biológica que em particular possui propriedades antimicrobianas, sua preparação e suas aplicações.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSTODE PEPTÍDEO COM ATIVIDADE BIOLÓGICA, SUA PREPARAÇÃO ESUAS APLICAÇÕES"

A presente invenção refere-se a um composto de peptídeo comatividade biológica, em particular possuindo propriedades antimicrobianas,para sua preparação e suas aplicações.

É conhecido que certos microorganismos, quando administradosvivos em seres humanos ou animais, são capazes de exercer um efeito be-néfico na saúde do hospedeiro, em particular produzindo substâncias antimi-crobianas.

Tais organismos são em geral chamados organismos probióticos.

Numerosos estudos mostraram os efeitos benéficos, para sereshumanos ou para animais, destes organismos probióticos, em particular notratamento de distúrbios gastrintestinais, tais como diarréia, diarréia aguda, ediarréia associada ao uso de fármacos medicinais.

Os organismos probióticos mais estudados até agora são asbactérias de láctico-ácido, mas também tem sido relatado que outros orga-nismos vivos podem ter um efeito benéfico na saúde.

Estes outros organismos incluem por exemplo Bacillus subtilis,Bacillus lieheniformis, Bacillus eoagulans, Bacillus eereus, Bacillus elausii,Bacillus polyfermentans subtilis.

Entre estes, Bacillus elausii foi por muitos anos usados em umacomposição farmacêutica comercializada sob o nome comercial Enteroger-mina®.

Esta composição farmacêutica é em particular intencionada paracombater distúrbios gastrintestinais e compreende uma mistura de quatrocepas de Bacillus elausii.

A atividade biológica antimicrobiana destes organismos probióti-cos é em geral ligada à produção natural de compostos com atividade anti-microbiana, tais como os !antibióticos. Desse modo, cepas de Bacillus elausii,Streptomyees mutans, Lactoeoceus Iaetis produzem subtilina, mutacinas enisinas, respectivamente.Numerosos antibióticos são hoje em dia usados como substân-cias terapêuticas para o tratamento de doenças infecciosas, mas os patóge-nos estão ficando mais resistentes aos farmacêuticos que são usados. Al-guns deles já são conhecidos ser "multi-resistentes" e às vezes são extre-mamente difíceis de tratar as infecções que eles causam.

Portanto, moléculas novas tendo propriedades antibióticas estãosendo constantemente buscadas.

O propósito da invenção é satisfazer esta demanda, propondoum composto com atividade antimicrobiana obtido de Bacillus clausii.

Um primeiro objetivo da invenção refere-se a um composto comatividade antimicrobiana.

Um segundo objetivo da invenção refere-se a um método para apreparação do composto com atividade antimicrobiana da invenção.

Um terceiro objetivo da invenção refere-se a uma composiçãofarmacêutica contendo o composto com atividade antimicrobiana da invenção.

Um quarto objetivo da invenção refere-se aos usos do compostocom atividade antimicrobiana da invenção.

De acordo com um primeiro aspecto, a invenção refere-se a umcomposto com atividade antimicrobiana. Desse modo, uma molécula produ-zida por Bacillus clausii, e que exibe atividade antimicrobiana, foi isolada ecaracterizada.

O composto da invenção com atividade antimicrobiana é de umanatureza de peptídeo e pode ser obtido de uma cultura de Bacillus clausii em25 um meio adequado até esporulação, coletânea do sobrenadante da culturaapós centrifugação e filtração, e extração da fração com atividade antimicro-biana.

O composto da invenção, que é principalmente ativo contra bac-térias gram-positivas, pode ser obtido de Bacillus clausii, e tem um peso mo-lecular de 2107,5 Da, determinado por espectrometria de massa pelo méto-do de MALDI TOF e ESI.

De acordo com outra característica, o composto da invenção éum !antibiótico, e tem ligações em ponte de Iantionina e aminoácidos modifi-cados em sua seqüência de peptídeo.

De acordo com uma de suas características, o composto da in-venção compreende a seqüência a seguir de aminoácidos e derivados deaminoácido: Phe - Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala -Gly - Glu - Dhb - Gly - Ala - Phe - Asn - Ala - Phe - Alaem que

Dhb representa um dideidroaminobutirato;

Dha representa um dideidroalanina;

Abu representa um aminobutirato.

O composto da invenção possui duas ligações em ponte de lan-tionina, uma entre a alanina na posição 3 e a alanina na posição 7, e a outraentre a alanina na posição 16 e a alanina na posição 21.

Uma ligação em ponte de metil-lantionina está, além disso, pre-sente entre o resíduo de aminobutirato na posição 8 e a alanina na posição11. Uma quarta ponte está presente entre o grupo amino-vinil-cisteína C-terminal e o resíduo de alanina na posição 19.

Representado com as pontes existentes, o composto da inven-ção tem a seqüência a seguir:

<formula>formula see original document page 4</formula>

em que Dha, Dhb e Abu são definidos acima.

De acordo com um segundo aspecto, a invenção refere-se a ummétodo para a preparação do composto da invenção.

De acordo com a invenção, o composto da invenção pode serextraído de Bacillus clausii de acordo com o método a seguir.

O método de preparação do composto da invenção compreendeos estágios de:

- cultura de cepas de Bacillus clausii em um meio adequado atéesporulação das cepas;

- coletânea do sobrenadante da cultura após centrifugação efiltração;

- extração da fase sólida da fração obtida e elução.

Se necessário, a fração obtida que corresponde à molécula dainvenção pode ser purificada através de cromatografia líquida de desempe-nho alto (HPLC).

De acordo com outra modalidade, o composto da invenção podeser preparado por síntese química convencional, de acordo com os métodosconhecidos a uma pessoa versada na técnica.

O composto da invenção exibe atividade antimicrobiana contrabactérias gram-positivas. Em particular este exibiu atividade antimicrobianacontra S. aureus, Enterococcus faecium, Micrococcus sp, Lactoeoceus laetis,Clostridium diffieile, Clostridium perfringens, Listeria monoeytogenes e asbactérias gram-positivas da cavidade oral.

Devido a seu caráter !antibiótico, o composto da invenção podeexibir um espectro de atividade biológica mais amplo, por exemplo atividadeantiviral, antiparasitária ou imunomoduladora.

O composto da invenção pode ser usado portanto para a prepa-ração de produtos medicinais.

Desse modo, de acordo com outros de seus aspectos, a inven-ção refere-se aos produtos medicinais que contêm o composto da invenção.

Estes produtos medicinais encontram aplicação em terapia, emparticular no tratamento e prevenção de doenças infecciosas.

Estes produtos medicinais também encontram aplicação no tra-tamento e/ou prevenção de distúrbios intestinais, por exemplo no tratamentoe prevenção de disbiose intestinal e distúrbio de vitamina endógena, comotambém em tratamento adjunto no restabelecimento da flora microbiana in-testinal que foi alterada como resultado de tratamento com antibiótico ouquimioterapia.

Eles também encontram aplicação na prevenção e tratamentode diarréia, em particular diarréia aguda e diarréia associada ao uso de pro-dutos medicinais.

De acordo com outros de seus aspectos, a invenção refere-se àscomposições farmacêuticas compreendendo, como princípio ativo, o com-posto de acordo com a invenção, para o tratamento e/ou prevenção das pa-tologias descritas acima. Estas composições farmacêuticas contêm uma do-se eficaz do composto de acordo com a invenção, como também pelo me-nos um excipiente farmaceuticamente eficaz.

Os ditos excipientes são selecionados, de acordo com a formafarmacêutica e a rota desejada de administração, dos excipientes usuais quesão conhecidos a uma pessoa versada na técnica.

Nas composições farmacêuticas da presente invenção para ad-ministração oral, sublingual, subcutânea, intramuscular, intravenosa, tópica,local, intratraqueana, nasal, transdérmica ou retal, o composto pode ser ad-ministrado em unidades de dosagem, misturado com excipientes farmacêuti-cos convencionais, em animais e seres humanos para a prevenção ou parao tratamento dos distúrbios ou doenças mencionadas acima.

Unidades de dosagem apropriadas compreendem formas para arota oral tais como tabletes, cápsulas macias ou duras, pós, grânulos e solu-ções ou suspensões orais; forma de administração sublingual, bucal, intra-traqueana, intraocular, nasal, e inalação; formas tópicas, transdérmicas,subcutâneas, intramusculares ou intravenosas de administração; formas re-tais de administração, e implantes. Para aplicação tópica, os compostos deacordo com a invenção podem ser usados em cremes, géis, ungüentos ouloções.

A composição da invenção pode ser administrada pela rota maisadequada e a uma dose dependendo em particular da natureza da infecção,do tipo de hospedeiro em questão, da idade do hospedeiro, peso e condiçãogeral, em tratamentos concomitantes que são recebidos, como também daresposta do hospedeiro ao tratamento e à razão terapêutica.

Em geral, para administração em seres humanos, a composiçãoé administrada pela rota oral na forma de uma composição farmacêutica deesporos. Por exemplo, a dose pode ser de cerca de 10 χ 109 esporos diari-amente, por exemplo de 1 a 8 χ 109 esporos diariamente, em particular 2, 4ou 6 χ 109 esporos diariamente, em uma dose simples ou em várias doses.Pode haver casos especiais em que doses mais altas ou maisbaixas sejam apropriadas; tais doses ainda estão dentro do escopo da in-venção.

De acordo com outros de seus aspectos, a invenção refere-seao uso do composto da invenção para a preparação de um produto medici-nal intencionado para a prevenção e/ou tratamento das patologias descritasacima.

De acordo com outros de seus aspectos, a invenção tambémrefere-se a um método de tratamento das patologias declaradas acima quecompreende a administração, a um paciente, de uma dose eficaz do com-posto da invenção.

De acordo com outros de seus aspectos, o composto da inven-ção pode também ser usado como um aditivo em composições cosméticasou comestíveis. De acordo com este uso, o composto da invenção é adicio-nado em uma quantidade suficiente para inibir o aumento no crescimentobacteriano em composições cosméticas ou comestíveis e desse modo per-mitir sua preservação.

Os exemplos dados abaixo ilustram a invenção entretanto semlimitá-la.

1. PRODUÇÃO DA MOLÉCULAPRODUÇÃO DO SOBRENADANTE.

Uma cepa de O/C de Bacillus clausii (obtida da composição far-macêutica comercializada com o nome comercial Enterogermina®) é cultiva-da por três dias em meio de Mueller Hinton a 37°C e 180 rev/min até esporu-lação da cepa ocorrer.

A cultura é depois centrifugada e o sobrenadante é filtrado comuma membrana com tamanho de poro de 0,45 μιη para remover qualquercélula residual.EXTRAÇÃO

O composto com atividade antimicrobiana é extraído na fase só-lida em um cartucho de C18 de Sep Pak plus (Waters). A este, 150 ml de so-brenadante obtido no estágio precedente são depositados em um cartucho eelução é executada com 100% de metanol, após três lavagens sucessivascom NH4HCO3 25 mM, pH 8; NH4HCO3 25 mM, pH 8 + 10% metanol eNH4HCO3 25 mM, pH 8 + 50% metanol.

Todas as frações ativas eluídas com 100% de metanol foramcombinadas e concentradas por evaporação a vácuo até um fator de redu-ção de volume de 10 ser obtido.

O concentrado é armazenada a -20-C. Nenhuma perda de ativi-dade foi observada após 6 meses de armazenamento nestas condições.

PURIFICAÇÃO

Purificação até homogeneização da substância extraída na fasesólida é executada por HPLC.

Um primeiro estágio semipreparativo é realizado em uma colunaC4 de Synchropack 100 χ 8 mm. As frações do eluato que exibem atividadeaníimicrobiana são colhidas e combinadas. A pureza do composto obtido notérmino deste estágio é maior que 80% e o rendimento em extração - purifi-cação é cerca de 6 rng-l"1 de sobrenadante. Um segundo estágio analítico éexecutado em uma coluna C1 de Bischoff 150 χ 4,6 mm. As frações do elua-to que exibem atividade antimicrobiana são colhidas e combinadas. A purezado composto obtido no término deste estágio é maior que 90%.

2. INVESTIGAÇÃO ESTRUTURAL

DETERMINAÇÃO DO PESO MOLECULAR

O composto purificado obtido acima no Exemplo 1 tem um pesomolecular de 2107,5 Da determinado por espectrometria de massa usando ométodo de MALD TOF e confirmado através de espectrometria de massausando o método de ESI.

ESPECTRO ABSORÇÃO UV/VISÍVEL

O composto da invenção absorve-se no ultravioleta e tem umpico em particular a 265 nm compatível com a presença de aminoácidos a-romátícos em sua estrutura.

COMPOSIÇÃO DOS AMINOÁCIDOS

Após hidrólise total com HCl 5,7 N, sob vácuo, durante 16 horasa 115°C a presença de vários aminoácidos é detectada na estrutura docomposto purificado.

INVESTIGAÇÃO DAS VÁRIAS FORMAS ENANTIOMÉRICAS DOS AMI-NOÁCIDOS

As formas enantioméricas LeD dos aminoácidos de acordo coma seqüência do composto com atividade antimicrobiana foram investigadasapós hidrólise de ácido total, por derivação com amida de Na-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-alanina (reagente de Marfey) de acordo com o método descritopor Szokan (J. Chromato., 1988, 444, páginas 115-122). Os resultados indi-cam que todos os resíduos dos aminoácidos que compõem a molécula anti-biótica são enantiômeros da forma L.

EFEITOS DE TRATAMENTOS ENZIMÁTICOS OU QUÍMICOS NA ESTRUTURA

A perda completa da atividade seguindo tratamento enzimáticocom Pronase confirma o caráter peptídico do composto antibiótico novo.

Ligações em pontes de dissulfeto são governadas uma vez queum ensaio cisterna-específico deu negativo. Em contraste, a presença deligações em ponte de lantionina, sensíveis a tratamento de redução em ummeio alcalino (Meyer, Anal. Biochem, 223, páginas 185-190, 1994) podemexplicar a perda da atividade observada na presença de β mercaptoetanolseguindo modificação estrutural, detectado por HPLC de fase reversa. Aqueda, apenas parcial, na atividade medida ao término do tratamento menosdrástico tal como incubação em pH neutro na presença de DTT 25 mM podeser o resultado da redução específica dos dideidroaminoácidos presentes naestrutura. Estas observações tornam possível formular a hipótese de acordocom a qual molécula antimicrobiana produzida através de Bacillus clausii éum lantibiótico. Esta família de antibióticos é normalmente caracterizada pelapresença de ligações em pontes de lantionina e aminoácidos modificadosem sua estrutura.

SEQÜENCIAÇÃO DA MOLÉCULA NATIVA

Seqüenciação é executada usando um seqüenciador automáticoProcise 492 A (Applied Biosystem) por degradação recorrente de Edman apartir da terminação N-terminal. Os aminoácidos de PTH formados são ana-lisados através de HPLC de fase reversa em uma coluna de C18 de mícro-perfuração. A seqüenciação da molécula antibiótica, no estado nativo, é blo-queada no término da primeira etapa da degradação química de Edman. Oúnico resíduo identificado corresponde a uma fenilalanina que ocupa a posi-ção N-terminal.

SEQÜENCIAÇÃO DA MOLÉCULA APÓS MODIFICAÇÃO QUÍMICA

A informação relativa à seqüência potencial da substância anti-microbiana nova produzida por Bacillus clausii, deduzida da seqüência dogene de codificação, combinada com a informação obtida da análise dacomposição de aminoácido e do comportamento no meio redutor revele apresença de característica de modificações pós-translacionais dos !antibióti-cos.

A presença de dideidro-aminoácidos e ligações em ponte de Ian-tionina na estrutura está na origem do bloqueio de seqüenciação da molécu-la no estado nativo. Os deidro-aminoácidos tais como Dha (dideidroalanina)e Dhb (dideidroaminobutirato) são desaminados durante degradação quími-ca de Edman e desse modo bloqueiam o progresso da seqüenciação. Estesmesmos resíduos Dha e Dhb não são detectáveis por análise da composi-ção de aminoácido após hidrólise de ácido total pelas mesmas razões, e suadesaminação torna ineficaz a reação de derivatização com carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxissuccinimidila ou com AQC (Waters), específica dasfunções da amina primária. Com a meta de superar os problemas relaciona-dos com a presença de aminoácidos modificados e ligações em ponte delantionina, uma reação química dupla foi aplicada ao antibiótico de peptídeoantes de sua seqüenciação. O método empregado foi adaptado do trabalhode Smith, Eur. J. Biochem. 2000, 267, página, 6810-6816. Para este propósi-to, 50 nmol do peptídeo purificado são absorvidos em 10 μΙ de H2O + 4 mgde NaBH4. 190 μΙ de uma solução desnaturante e antioxidante (570 mg decloreto de guanidina + 0,1 ml de N-etilmorfolina, ajustados em pH 8,5 e a umvolume final de 1 ml com H2O) são adicionados, depois a mistura de reaçãoé incubada em um fluxo de N2 durante 72 horas a 37°C.

Este tratamento especificamente reduz os dideidro-aminoácidossem afetar as ligações em ponte de lantionina.

O peptídeo desse modo reduzido se restabelece em uma colunade Prosorb (Perkin Elmer) equipada com uma membrana de PVDF. Apóslavar a membrana com 200 μΙ de 0,1% de TFA, o peptídeo, absorvido nestesuporte é submetido a uma segunda redução na presença de etanotiol (adi-ção de 20 μl de uma solução compreendendo 280 μΙ de metanol + 200 μΙ deH2O + 65 ml de NaOH + 60 μΙ de etanotiol) durante uma hora a 50°SC.

ESTRUTURA COVALENTE DA MOLÉCULA ANTIBIÓTICA PRODUZIUCOM Bacillus clausii

A estrutura covalente é de acordo com todos os dados obtidos.O peso molecular calculado em base das massas dos resíduos mono-isotópicos é 2107,5 Da. A molécula antimicrobiana segregada por Bacillusclausii é um !antibiótico que possui 4 ligações em ponte de lantionina e metil-iantionina, como também 3 resíduos de dideidro-aminoácido em sua estrutu-ra. A estrutura é de acordo com a massa encontrada, 2107,5 Da, com osresultados obtidos após executar modificações químicas na molécula, e coma seqüência de aminoácido deduzida em base do gene que codifica parasua produção, encontrado em B. clausii. A estrutura foi confirmada por análi-se de RMN.

As outras três cepas (N/R, SlN, T) de Bacillus clausii presentesna composição farmacêutica Enterogermina® exibiram o mesmo perfil daatividade antimicrobiana que a cepa O/C.

Claims (12)

1. Composto de peptídeo que exibe atividade antimicrobiana epode ser obtido de uma cultura de Bacillus clausii em um meio adequado atéesporulação, coletânea do sobrenadante da cultura após centrifugação efiltração, e extração da fração com atividade antimicrobiana.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado emque tem um peso molecular de 2107,5 Da.

3. Composto de acordo com as Reivindicações 1 ou 2, caracteri-zado em que é um !antibiótico e tem ligações em ponte de Iantionina e ami-noácidos modificados.

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, caracterizado em que compreende a seqüência de aminoácido a seguir:Phe - Dhb - Ala - Val - Dha - Phe - Ala - Abu - Pro - Gly - Ala - Gly - Glu -Dhb - Gly - Ala - Phe - Asn - Ala - Phe - Alaem que Dhb representa um dideidroaminobutirato;Dha representa um dideidroalanina;Abu representa um aminobutirato.

5. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado emque tem duas ligações em ponte de lantionina, uma entre a alanina na posi-ção 3 e a alanina na posição 7, e a outro entre a alanina na posição 16 e aalanina na posição 21; uma ligação em ponte de metil-lantionina entre o re-síduo de aminobutirato na posição 8 e a alanina na posição 11 e uma quartaligação em ponte entre o grupo de amino-vinil-cisteína C-terminal e o resíduoda alanina na posição 19.

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 5, caracterizado em que os resíduos de aminoácido são enantiômeros daforma L.

7. Método para a preparação de um composto como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 6, que compreende os estágios de- cultura das cepas de Bacillus clausii em um meio adequado atéesporulação das cepas;- coletânea do sobrenadante da cultura após centrifugação efiltração;- extração de fase sólida da fração obtida e elução;- se necessário, purificação da fração obtida por cromatografialíquida de desempenho alto (HPLC).

8. Produto medicinal caracterizado em que compreende umcomposto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

9. Composição farmacêutica, caracterizada em que compreendeum composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

10. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, para a preparação de um produto medicinal intenciona-do para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios intestinais ou de doençasinfecciosas.

11. Uso de um composto de acordo com a reivindicação 10, parao tratamento e/ou prevenção de disbiose intestinal e distúrbio de vitaminaendógena, para o restabelecimento da flora microbiana intestinal alteradacomo resultado de tratamento antibiótico ou quimioterapia, para o tratamentoe prevenção de diarréia, em particular diarréia aguda ou diarréia associadaao uso de produtos medicinais.

12. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, como um aditivo em composições cosméticas ou co-mestíveis.