BR102017000309A2 - peptídeos antimicrobianos sintéticos derivados de l-amino ácido oxidase terapeuticamente úteis, composição, uso e método de inibição de microorganismos - Google Patents

Abstract

peptídeos antimicrobianos sintéticos derivados de l-amino ácido oxidase terapeuticamente úteis, composição, uso e método de inibição de microorganismos. a presente invenção se refere à composição e métodos para utilização de novos peptídeos sintéticos derivados de l-amino ácido oxidase isolada do veneno de b. matogrossensis, utilizados como agentes antibacterianos. também se refere a um método para inibir o crescimento bacteriano por administração de uma quantidade eficaz de um peptídeo derivado de acordo com a presente invenção.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS SINTÉTICOS DERIVADOS DE L-AMINO ÁCIDO OXIDASE TERAPEUTICAMENTE ÚTEIS, COMPOSIÇÃO, USO E MÉTODO DE INIBIÇÃO DE MICROORGANISMOS

Campo da Invenção [0001] A presente invenção inclui composição e métodos para utilização de novos peptídeos sintéticos derivados de L-amino ácido oxidase isolada do veneno de Bothropoides matogrossensis, utilizados como agentes antimicrobianos.

Antecedentes da Invenção [0002] Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são moléculas conhecidas como antibióticos naturais, devido a sua capacidade em eliminar um amplo espectro de microorganismos, incluindo estirpes resistentes aos antibióticos convencionais. Os PAMs possuem atividade antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiparasitária e antitumoral. Muitos dos PAMs são moléculas efetoras importantes do sistema imune inato, aumentando a fagocitose de leucócitos, estimulam a liberação de prostaglandina, neutralizam LPS, promovem o recrutamento de leucócitos, estimulam a liberação de citocinas em sítios inflamatórios, promovem a angiogênese e induzem o reparo tecidual.

[0003] A atividade dos PAMs depende de vários parâmetros, incluindo a sequência, o tamanho, o grau de formação da estrutura, a cationicidade, a hidrofobicidade e a anfipaticidade na modulação da seletividade da atividade biológica. Uma das características que torna os PAMs moléculas atraentes, quando se pensa no uso terapêutico, é a seletividade apresentada por muitos desses peptídeos, os quais são inativos a células de mamíferos.

Sumário da Invenção [0004] Em uma das possíveis formas de realização, refere-se à descoberta de novos peptídeos antimicrobianos obtidos a partir da fragmentação da L-amino ácido oxidase isolada do veneno de Bothropoides matogrossensis. Verificou-se que os peptídeos aqui obtidos mostram atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Os peptídeos são eficazes na formulação de várias composições antimicrobianas e na prevenção e redução da incidência de infecções causadas por organismos resistentes a formulações já conhecidas.

Descrição Detalhada da Invenção [0005] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

Realização Preferencial [0006] Na purificação da L-amino oxidase, o extrato protéico total do veneno de Bothropoides matogrossensis (30 mg) foi diluído em 1 mL de tampão Tris-HCI 0,05 M (pH 7.5) e centrifugado a 13.400 rpm por 5 minutos e filtrado (22 pm). Posteriormente, o extrato foi aplicado em uma coluna Sephacryl S-100 (1,6X70 15 cm) (Pharmacia®), previamente equilibrada no mesmo tampão. O sistema foi acoplado a uma bomba peristáltica (Amersham Biosciences®) com um fluxo constante de 1,8 mL.min'1. O eluato foi coletado (3 mL/tubo). O tempo de fracionamento foi de 3 horas e 15 min. Dois miligramas da fração 51, obtida no passo anterior foi dissolvida em 950 pL de ácido trifluoracético (TFA) a 0,1 % TFA/ddH20. O sobrenadante foi aplicado em uma coluna C-18 semi-preparativa (Vydac®), acoplada a um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) (Varian®). A eluição foi feita em um sistema de gradiente linear de 5-95 % de acetonitrila em TFA 0,1 %, com fluxo constante de 1,0 mL.min'1, durante 70 min e monitorado a 216 nm. As frações obtidas foram liofilizadas e armazenadas a -20 °C.

[0007] Na espectrometria de massa e seqüenciamento De novo, a determinação da massa molecular dos peptídeos foi realizada utilizando um espectrômetro de massa MALDI-TOF/TOF UltraFlex II (Bruker Daltonics®). As frações com atividade foram dissolvidas em matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico e acondicionadas nos poços da placa de MALDI (Bruker Daltonics®), secando a temperatura ambiente durante 15 min. A massa monoisotópica dos peptídeos foi obtida no modo refletor, utilizando a solução padrão Peptide Mix (Bruker Daltonics®). As frações foram então tratadas com ditioltreitol (DTT) e iodoacetamida, e, posteriormente, elas foram digeridas com tripsina em tampão bicarbonato de amónio 25 mM, e o seqüenciamento dos peptídeos obtidos foi feito por meio de seqüenciamento De novo a partir de espectros MS/MS adquiridos no modo de fragmentação de íon precursor LIFT/CID do MALDI-TOF/TOF.

[0008] Na síntese dos peptídeos, os mesmos foram sintetizados manualmente pela técnica da fase sólida, através da estratégia química Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila). Os acoplamentos foram conduzidos com tetrafluoroborato de [benzotriazol-1-il oxi(dimetillamino)metilideno]-dimetilazanium (TBTU) e Ν,Ν'-diisopropiletilamina (DIPEA) em N,N-dimetilformamida (DMF), durante 1 h, utilizando-se como solvente DMF. Durante a síntese, a desproteção do grupo Fmoc foi realizada com uma solução de piperidina 20 % em DMF durante 30 min (2 ciclos de 15 min). A divagem e a desproteção final foram conduzidas com ácido TFA 90 % na presença de seqüestradores de carbocátions (etanoditiol-2.5 % e triisopropilsilano-1 %, em proporções variáveis dependendo da composição em aminoácidos dos peptídeos). A solução contendo o peptídeo foi liofilizada imediatamente após a divagem da resina.

[0009] Os peptídeos foram quantificados pela absorção UV a 215 e 220 nm, utilizando a seguinte fórmula de concentração em mg.mL'1: (A 215-A 225)X0,144.

[0010] A avaliação da atividade antibacteriana in vitro dos compostos antimicrobianos foi avaliada pelo ensaio modificado de inibição do crescimento por microdiluição em caldo, de acordo com o National Committee for Clinicai Laboratory Standards (NCCLS). A concentração inibitória mínima (MIC) foi determinada para as bactérias Gram-negativas Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium e Gram-positivas Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. Cinquenta microlitros de meio Mueller-Hinton (Himedia®), contendo 105 células/mL na metade da fase logarítmica de crescimento, foram adicionados aos poços de uma placa contendo 50 μΙ_ de diluições seriadas dos peptídeos. Após 24 h de incubação, a 37 °C, em um leitor de microplaca com incubação, o crescimento bacteriano foi avaliado pela determinação da absorbância a 600 nm.

[0011] Para avaliação da atividade hemolítica, as células foram separadas do plasma por sedimentação e a suspensão de eritrócitos (1 %) de sangue humano foi lavada três vezes com solução salina (NaCI 0,15 M, Tris-HCI 0,01 M, pH 7,4). As frações foram ressuspensas em 50 μΙ_ do tampão salino e adicionadas a tubos de 1,5 mL, com 50 μΙ_ da solução de eritrócitos. Após 60 min de incubação à temperatura ambiente, os tubos foram centrifugados a 3.000 rpm por 2 min. Uma porção de 100 μΙ_ de cada sobrenadante foi transferida para uma placa multi-poços, e realizada a leitura em 550 nm em um leitor de microplacas.

[0012] Para avaliar a viabilidade celular da linhagem de monócitos RAW 264.7, nos tempos 24, 48 e 72 horas após tratamento com os ditos peptídeos, foi utilizado ensaio colorimétrico MTT. As células foram plaqueadas na concentração de 1x105 células.mL'1 em meio DMEM-s, as mesmas foram incubadas por 24, 48 e 72 horas. Após cada período, 155 pL do sobrenadante foi removido, e acrescentado 10 pL de MTT (5 mg.mL' 1)/poço. As placas foram incubadas por 3 horas. Após esse período, a reação foi bloqueada com 60 pL/poço de 25 solução isopropanol-HCI 0,04 M, homogeneizadas para completa solubilização do conteúdo celular e a absorbância determinada em leitor de microplacas a 575 nm.

[0013] Com o intuito de identificar o componente antibacteriano, o extrato protéico total foi aplicado numa cromatografia de filtração em gel (Figura 1A). E posteriormente a atividade antibacteriana de todas as frações foi avaliada. As frações que apresentaram maior atividade antibacteriana foram: F-44, F-51 e F- 68 (Tabela 1), as quais inibiram o crescimento de bactérias Gram-positivas e negativas. Posteriormente essas frações tiveram sua massa molecular analisadas por SDS-PAGE, onde foi possível observar que estas apresentavam uma proteína principal com aproximadamente 60 kDa (Figura 1B).

Tabela 1: Atividade antibacteriana do extrato protéico total, das frações obtidas por filtração em gel, da LAO purificada, das frações obtidas por cromatografia HPLC e dos fragmentos obtidos após sequenciamento de novo.

[0014] A fração 51 mostrou maior atividade antibacteriana e foi aplicada em uma cromatografia de fase reversa, gerando 17 frações (Figura 1C). A fração 7 (LAO) apresentou maior atividade antibacteriana, em comparação com as outras avaliadas (Tabela 1). Esta fração foi capaz de inibir eficientemente o desenvolvimento de K. pneumoniae e P. mirabilis, sendo posteriormente submetida a espectro de massa MALDI TOF/TOF, para sequenciamento dos peptídeos obtidos. A sequência parcial da enzima isolada apresentou 100% de identidade com LAO, previamente isolado a partir do veneno de B. pauloensis (Figura 1 D).

[0015] A citotoxicidade in vitro do extrato protéico, F-44, F-51, F-68, LAO, SEQ ID 1, SEQ ID 2 e SEQ ID 3 foi avaliada em cultura de células RAW264.7 e eritrócitos humanos (Tabela 2). Os estudos de citotoxicidade in vitro mostraram que as SEQ ID 1, SEQ ID 2 e SEQ ID 3 apresentaram menos de 25 % de hemólise e mais de 78 % de viabilidade celular, mesmo em concentrações elevadas.

Tabela 2: Atividade citotóxica da LAO, frações 7, 44, 51, 68 dos fragmentos 1,2 e 3 contra células RAW264.7 e eritrócitos humanos.

[0016] Amostras (512 pg.mL-1) foram incubadas com as células durante 24 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT e atividade hemolítica. Os valores são expressos em média ± desvio padrão de três experimentos independentes. * P <0,05, em comparação com controlo negativo (tampão 5 PBS, pH 7,4).

Breve descrição das figuras [0017] Figura 1: Passos de purificação da LAO com atividade antibacteriana. (A) Cromatograma de exclusão molecular. (B) SDS-PAGE do extrato protéico total e das frações 44, 51 e 68. (C) Cromatograma de fase reversa da fração 51 do passo anterior. (D) SDS-PAGE da fração 7.

Reivindicações da Patente de Invenção

Claims (5)

1. Moléculas dos peptídeos caracterizada por apresentar sequências de aminoácidos idênticas às SEQ ID 1, SEQ ID 2 e SEQ ID 3.

2. Peptídeos lineares caracterizados por apresentar pelo menos 80 % de similaridade com as sequências SEQ ID 1, SEQ ID 2 e SEQ ID 3.

3. Uso das moléculas, de acordo com as reivindicações 1e 2, caracterizada por ser utilizada para o desenvolvimento de fármacos.

4. Uso das moléculas, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser utilizado na preparação de formulações com atividade antimicrobiana.

5. Uso das moléculas, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser utilizado na preparação de conjugados com atividade antimicrobiana.