BR102018071914A2

BR102018071914A2 - Processo de obtenção dos peptídeos dímericos des-cys11, lys12, lys13-(pbthtx-i) k, [trp3,5] des-cys11, lys12, lys13-(pbthtx-i)k e [trp3,5,10] des-cys11, lys12, lys13- (pbthtx-i)k e seus usos como antimicrobiano

Info

Publication number: BR102018071914A2
Application number: BR102018071914-9A
Authority: BR
Inventors: Eduardo Maffud Cilli; Norival Alves Santos Filho; Ilana Lopes Baratella Da Cunha Camargo; Gabriela Marinho Righetto; Thaina Cristina Leal
Original assignee: Universidade Estadual Paulista Julio De Mesquita Filho
Priority date: 2018-10-24
Filing date: 2018-10-24
Publication date: 2021-11-16
Also published as: BR102018071914A8

Abstract

Trata-se de um processo de obtenção de peptídeos antibacterianos pela dimerização e modificações pontuais no peptídeo p-BthTX-I que, por sua vez, é derivado da região Cterminal da Lys49 PLA2s homóloga bothropstoxina I (BthTX-1); os peptídeos díméricos propostos apresentam uma capacidade de inibição do crescimento antimicrobiano maior do que a sua forma monomérica ou dimérica por meio do resíduo de cisteína; ainda, a presente invenção provê ao uso dos dímeros como agentes antimicrobianos.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DOS PEPTÍDEOS DÍMERICOS DES-CYS11, LYS12, LYS13-(PBTHTX-I) K, [TRP3,5] DES-CYS11, LYS12, LYS13-(PBTHTX-I)K E [TRP3,5,10] DES-CYS11, LYS12, LYS13- (PBTHTX-I)K E SEUS USOS COMO ANTIMICROBIANO

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente patente de invenção descreve o processo de obtenção de peptídeos antibacterianos pela dimerização do peptídeo p-BthTX-I que, por sua vez, é derivado da região C-terminal da Lys49 PLA2s homóloga bothropstoxina I (BthTX-1). Os peptídeos antibacterianos apresentam a capacidade de inibição do crescimento de várias linhagens celulares, incluindo isolados multirresistentes. Em relação ao peptídeo pBthTX-I, o peptídeo des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K sofreu a deleção das Lisinas 12 e 13 e Cisteína 11; no peptídeo [Trp3,5] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K, além das deleções acima mencionadas, foi realizada a substituição dos resídos Tyr nas posições 3 e 5 por Trp, e o peptídeo [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K sofreu a deleção das Lisinas 12 e 13 e Cisteína 11, além da substituição dos resídos Tyr nas posições 3 e 5 e Phe na posicão 10 por Trp.; a presente invenção provê a dimerização dos peptídeos obtidos através da região C-terminal, por um resíduo de aminoácido Lisina (Lys) e prevê a utilização desses peptídeos de forma tópica ou sistêmica como agente antimicrobiano.

HISTÓRICO DA TÉCNICA

[002] É sabido que peçonhas e venenos animais constituem uma vasta fonte de moléculas bioativas, as quais, de forma eficiente, interferem nos processos fisiológicos essenciais da presa.

[003] Devido à sua toxicidade e os efeitos biológicos gerais, esses recursos naturais têm, há muito, atraído o interesse científico.

[004] Aproximadamente 90% do peso seco das peçonhas de serpente são constituídos por proteínas, compreendendo uma variedade de enzimas, tais como fosfolipases A2, proteases, L-aminoácido oxidases e hialuronidases, dentre outras.

[005] As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas envolvidas no metabolismo de fosfolipídeos e apresentam um importante papel em várias funções celulares, incluindo manutenção dos fosfolipídeos celulares, geração de prostaglandinas (PG) e leucotrienos, transdução de sinais, proliferação celular e contração muscular. Além disso, sabe-se que estas enzimas estão envolvidas em processos inflamatórios humanos.

[006] As PLA2s de peçonhas de serpentes (svPLA2s) fazem parte do grupo das PLA2s secretadas. Essas foram divididas em subgrupos, dos quais se destacam:

(i) PLA2s Asp49, enzimas que usualmente apresentam alta atividade catalítica, e
(ii) PLA2s homólogas (ou PLA2s símile, do inglês PLA2-like), mais especificamente as PLA2s Lys49, as quais não possuem atividade enzimática.

[007] Apesar de não apresentarem atividade catalítica, as PLA2s Lys49 apresentam uma atividade tóxica, tais como miotoxicidade, citotoxicidade, atividade bactericida e fungicida, dentre outras.

[008] Um exemplo dessa classe de macromoléculas é a bothropstoxina I (BthTX-I), a principal PLA2 Lys49 oriunda da peçonha da serpente B. jararacussu.

[009] Estudos mostraram o efeito microbicida da BthTX-I, o qual aumentou a permeabilidade da membrana de alguns microrganismos. A ação microbicida das toxinas Lys49 pode evitar infecções nas glândulas veneníferas das serpentes ou controlar a decomposição da presa pelos microrganismos, sendo essas adaptações vantajosas para as serpentes.

[010] Em busca de elucidar qual a região dessas PLA2 Lys49 seria a responsável pela atividade tóxica dessas moléculas, já que elas não possuem atividade catalítica, segmentos foram sintetizados e analisados.

[011] Assim, foi demostrado que um sítio de ligação de heparina, na porção C-terminal dessas proteínas (região correspondente entre os resíduos de aminoácidos 115-129), poderia ser o responsável por essa toxicidade.

[012] Apesar da variabilidade evidenciada na região C-terminal das PLA2 Lys49, um elevado número de aminoácidos catiônicos, hidrofóbicos e aromáticos podem ser observados, proporcionando um caráter anfifílico, comumente encontrado em muitos tipos de peptídeos e proteínas com propriedades antimicrobianas.

[013] As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo, especialmente nos países menos desenvolvidos.

[014] Além disso, é flagrante o aumento da resistência de várias linhagens de microrganismos em relação aos medicamentos usualmente administrados, o que salienta a importância da busca por novos compostos microbicidas.

[015] Neste contexto, o estudo de moléculas baseadas em fontes naturais, pode gerar novos peptídeos ativos com aplicações na clínica médica e na indústria biotecnológica.

ANÁLISE DO ESTADO DA TÉCNICA

[016] Alguns documentos do estado da técnica descrevem diferentes peptídeos obtidos a partir de serpentes, tal como, o documento de nº. CN102311492 que descreve as sequências do peptídeo antibacteriano catelicidina, o qual é isolado a partir do veneno de cobra (sem especificá-la) e apresenta atividades antibacteriana e antifúngica comprovadas, em especial sobre bactérias resistentes a drogas clínicas. Ainda, o peptídeo é denominado como “aminoácido tipo D totalmente não natural”.

[017] Outro documento de nº. DE102004008417 descreve peptídeos com ação anticâncer (atuando no fígado, no cólon e nos rins) e antibacteriana obtidos a partir do veneno da Crotalus durissus durissus.

[018] Em vista desses documentos, a matéria desta invenção é considerada nova e inventiva.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[019] O objetivo desta invenção visa descrever o processo de obtenção de peptídeos antibacterianos diméricos denominados des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K, [Trp3,5] desCys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K e [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K a partir do peptídeo p-BthTX-I e dimerizados por um resíduo Lys C-terminal, bem como o uso tópico ou sistêmico quanto a inibição do crescimento de microrganismos como Escherichia coli e Staphylococcus aureus.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[020] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue:

[021] A Figura 1 representa a sequência e a dimerização de des-Cys11, Lys12, Lys13- (pBthTX-I)K;

[022] A Figura 2A representa a sequência e a dimerização de [Trp3,5] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K; e

[023] A Figura 2B representa a sequência e a dimerização de e [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO OBJETO

[024] Com referência aos desenhos ilustrados, a presente patente de invenção se refere à “PROCESSO DE OBTENÇÃO DOS PEPTÍDEOS DÍMERICOS des-Cys11, Lys12, Lys13- (pBthTX-I)K, [Trp3,5] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K E [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13- (pBthTX-I)K E SEUS USOS COMO ANTIMICROBIANO”, mais precisamente, a presente invenção provê o processo de obtenção de peptídeos antibacterianos, os quais são baseados na sequência da região c-terminal da Lys49 PLA2 homóloga bothropstoxina I (BthTX-I) e seus usos como antibacterianos.

[025] As sínteses dos peptídeos foram realizadas em fase sólida (SPFS), utilizando o protocolo da química fluorenilmetiloxicarboxila (Fmoc). Este método baseia-se no crescimento da cadeia peptídica, através do acoplamento dos aminoácidos na sequência desejada, a partir da sua região C-terminal. O acoplamento dos aminoácidos é realizado em um suporte polimérico, o qual deve ser permeável e facilmente solvatado pelos solventes selecionados.

[026] O suporte polimérico utilizado neste processo é selecionado dentre qualquer resina utilizada para síntese de peptídeos em fase sólida, podendo ser obtido na forma de carboxila livre ou carboxiamida.

[027] Os solventes são selecionados dentre os solventes utilizados para síntese de peptídeos em fase sólida, preferencialmente dimetilformamida, diclorometano, Nmetilpirrolidona e dimetilsulfóxido.

[028] Os peptídeos são sintetizados e dimerizados utilizando como primeiro resíduo a Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (Lisina (Lys) com o grupo protetor Fmoc na cadeia lateral), e apresentam as sequências KKYRYHLKPF(α)K(ε)FPKLHYRYKK para des-Cys11, Lys12, Lys13- (pBthTX-I)K, representada pela SEQ. ID. N° 1, KKWRWHLKPF(α)K(ε)FPKLHWRWKK para[Trp3,5] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K, representada pela SEQ. ID. n° 2. e KKWRWHLKPW(α)K(ε)WPKLHWRWKK para [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K, representada pela SEQ. ID. n° 3.

[029] Os dímeros apresentam vantagens farmacotécnicas frente aos monômeros, como maior atividade antimicrobiana, aumento da solubilidade e resistência frente a proteases.

[030] Tanto o peptídeo sintético quanto os seus dímeros possuem atividade específica sobre bactérias (tanto Gram positivas quanto Gram negativas), não mostrando toxicidade contra eritrócitos.

[031] Ainda, os peptídeos antimicrobianos da presente invenção apresentam a vantagem de não gerar resistência bacteriana, devido aos seus mecanismos de ação.

[032] Em vista disso, os peptídeos podem ser utilizados como princípio ativo de formulações de uso tópico ou sistêmico para o tratamento de infecções causadas por bactérias, associados ou não a outros antibióticos, bem como formulações odontológicas para a prevenção da cárie.

[033] Ainda, os peptídeos podem ser utilizados como conservante de alimentos ou utilitários médicos, na forma de imersão ou incorporados na embalagem.

TESTES REALIZADOS - Atividade antimicrobiana:

[034] A atividade antimicrobiana foi avaliada em termos de concentração inibitória mínima (MIC), utilizando o método de microdiluição em placa.

[035] Para a determinação da MIC, bactérias S. aureus ATCC 25923, S. aureus SA16, S. aureus MU50, S. aureus SA33, S. aureus SA88, S. aureus SA90, E. faecalis VRE109 VanA, E. faecalis VRE 109 Rc, E. faecalis VRE80, E. faecalis V583, E. faecalis ATCC 29212, E. faecium VRE16, E. faecium HSJRP8, K. pneumoniae ATCC 700603, K. pneumoniae ATCC BAA1705, K. pneumoniae NDM -1, E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, S. epidermidis ATCC 35984 e E. coli CA4 foram incubadas com diluição seriada do peptídeo em microplacas esterilizadas de 96 poços em um volume final de 100 μL, compostos de 50 μL da cultura bacteriana e 50 μL de peptídeo dissolvido em água.

[036] A quantidade inicial de bactéria foi de 1 x 107 UFC/mL, aproximadamente. Como controle da ausência de proliferação bacteriana, ampicilina foi incubada com a suspensão bacteriana. Controles de meio de cultura (Muller-Hinton) e do solvente (água) também foram realizados.

[037] A inibição do crescimento foi determinada visualmente com ajuda de resazurina, após incubação por 24h a 37 °C. O ensaio foi realizado em triplicata.

- Atividade hemolítica:

[038] A atividade hemolítica foi avaliada em termos de concentração hemolítica 50 (HC50, ou seja, concentração de peptídeo que produz 50% de hemólise), utilizando o método de microdiluição em placa.

[039] Hemácias de sangue humano foram separadas do plasma por centrifugação e lavadas 3 vezes com tampão PBS. Uma suspensão celular a 2% (v/v) e diluições seriadas dos peptídeos foram usadas (100 μL da solução diluída do peptídeo para 100 μL da suspensão celular).

[040] Depois da incubação a 37 ºC por 1 h, os tubos foram centrifugados a 3000 rpm por 5 min e alíquotas de 100 μL do sobrenadante foram pipetadas em microplacas de 96 poços. A absorbância a 405 nm foi determinada usando um leitor de microplaca.

[041] O valor de 100% de hemólise foi determinado utilizando 100 μL da suspensão celular misturada com 100 μL de Triton X-100 1% (v/v), enquanto que o valor de 0% de hemólise foi obtido utilizando 100 μL da suspensão celular com 100 μL de tampão PBS. O valor de HC50 foi determinado seguindo a seguinte equação:
% Hemólise = 100 x [(Absamostra - Absbranco)/(Abstriton - Absbranco)]

[042] O ensaio foi realizado em duplicata.

[043] Após a síntese, os peptídeos foram purificados e caracterizados.

[044] A técnica de espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI) foi utilizada para a caracterização. Nestas análises, foram confirmadas as massas moleculares dos peptídeos, o qual apresentaram valores de 2869,37 Da, 2961,61 Da e 3039,69 Da.

[045] Os peptídeos foram obtidos com elevado grau de pureza (acima de 95%), em alto rendimento e as identidades destas moléculas foram confirmadas por espectrometria de massa com ionização por electrospray.

[046] Tabela 1: Dados da síntese dos peptídeos

[047] A atividade antimicrobiana dos peptídeos em relação a uma grande variedade de bactérias foi avaliada (tabela 2).

[048] Tabela 2: Atividades biológicas dos peptídeos sintéticos

[049] Em que:

• N.D: A atividade do peptídeo para essa linhagem não foi determinada.

[050] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

REFERÊNCIAS

[051] No estudo descrito em “Characterization of an antibacterial peptide from indian cobra (Naja naja) venom”, são descritos peptídeos antibacterianos obtidos a partir de cobras Naja. Os peptídeos purificados mostraram uma potente atividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas (como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Vibrio cholerae) e bactérias Gram-positivas (como Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Bacillus subtilis).

[052] Nos artigos “Purification and characterization of a novel peptide with antifungal activity from Bothrops jararaca venom” e “Purificação e caracterização biológica (estrutural, antibacteriana, antiparasitária, hemolítica e antigênica) de componentes do veneno da serpente Bothrops jararaca” são descritos processo de isolamento e processos de caracterização de peptídeos oriundos do veneno da jararaca, porém, os peptídeos da presente invenção não são abordados.

[053] Nos artigos “Comparative study of synthetic peptides corresponding to region 115–129 in Lys49 myotoxic phospholipases A2 from snake venoms” (Lomonte et al., 2003) e “Antitumor effects of snake venom chemically modified Lys49 phospholipase A2- like BthTX-I and a synthetic peptide derived from its C-terminal region” (Gebrim et al., 2009), o peptídeo p-BthTX-I foi sintetizado. Contudo, a forma dimérica não é citada e não foram realizados estudos das atividades antimicrobianas desse peptídeo.

[054] Nos artigos “Antibacterial Activity of the Non-Cytotoxic Peptide (p-BthTX-I)2 and Its Serum Degradation Product against Multidrug-Resistant Bacteria” e “Synthesis and characterization of an antibacterial and non-toxic dimeric peptide derived from the C-terminal region of Bothropstoxin-I” (Santo Filho et al., 2015 e 2017) o peptídeo dimérico é citado, mas não por meio do uso de lisina, mas sim por resíduos de cisteína. Desta forma, a forma dimérica proposta não é citada.

Claims

“PROCESSO DE OBTENÇÃO DOS PEPTÍDEOS DÍMERICOS des-Cys11, Lys12, Lys13- (pBthTX-I)K, [Trp3,5] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K E [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K E SEUS USOS COMO ANTIMICROBIANO”, caracterizado por síntese realizada em fase sólida e a dimerização ser realizada através da região C-terminal pelo resíduo Lys.
“PROCESSO DE OBTENÇÃO DOS PEPTÍDEOS DÍMERICOS des-Cys11, Lys12, Lys13- (pBthTX-I)K, [Trp3,5] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K E [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K E SEUS USOS COMO ANTIMICROBIANO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por síntese dos aminoácidos a serem acoplados em um suporte polimérico permeável e solvatado por solventes.
“PROCESSO DE OBTENÇÃO DOS PEPTÍDEOS DÍMERICOS des-Cys11, Lys12, Lys13- (pBthTX-I)K, [Trp3,5] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K E [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K E SEUS USOS COMO ANTIMICROBIANO”, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por uso de suporte polimérico utilizado para síntese de peptídeos em fase sólida.
“PROCESSO DE OBTENÇÃO DOS PEPTÍDEOS DÍMERICOS des-Cys11, Lys12, Lys13- (pBthTX-I)K, [Trp3,5] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K E [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K E SEUS USOS COMO ANTIMICROBIANO”, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por uso dos solventes selecionados, dentre dimetilformamida, diclorometano, N-metilpirrolidona e dimetilsulfóxido.
“PEPTÍDEOS DÍMERICOS”, caracterizado por peptídeos dímericos serem baseados na sequência da região c-terminal da Lys49 PLA2s homóloga bothropstoxina I (BthTX-1) representadas pela sequência ID. n° 1, KKYRYHLKPF(α)K(ε)FPKLHYRYKK para des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K; sequencia ID. n° 2, KKWRWHLKPF(α)K(ε)FPKLHWRWKK para [Trp3,5] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K e; sequência ID. n° 3, KKWRWHLKPW(α)K(ε)WPKLHWRWKK para [Trp3,5,10] des-Cys11, Lys12, Lys13-(pBthTX-I)K.
“PEPTÍDEOS DÍMERICOS”, de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por peptídeos apresentarem atividade sobre bactérias.
“PEPTÍDEOS DÍMERICOS”, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado por serem atóxicos contra eritrócitos.
“PEPTÍDEOS DÍMERICOS”, caracterizado por peptídeos diméricos serem utilizados no preparo de formulações de uso tópico ou sistêmico para o tratamento de infecções causadas por bactérias, associados ou não a outros antibióticos, bem como formulações odontológicas para a prevenção da cárie.
“PEPTÍDEOS DÍMERICOS, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por peptídeos diméricos serem utilizados como conservante de alimentos ou utilitários médicos, na forma de imersão ou incorporados na embalagem.