BR102015028254A2 - peptídeo sintético e seu uso como antimicrobiano - Google Patents

Abstract

resumo peptídeo sintético e seu uso como antimicrobiano a presente invenção refere-se à construção de um peptídeo derivado de peçonha de vespa, a partir do peptídeo mastoparano-l, o qual foi modificado para reduzir a sua atividade citotóxica. o peptídeo é capaz de agir como agente antimicrobiano, além de atuar como protetor em processos de infecção bacteriana sistêmica. 1 / 1

Description

PEPTÍDEO SINTÉTICO E SEU USO COMO ANTIMICROBIANO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à construção de peptídeos derivado da sequência do peptídeo mastoparano-L, sendo utilizados para emprego no controle da resistência bacteriana aos antibióticos. Mais especificamente o peptídeo é capaz de atuar como protetor em processos de infecção bacteriana sistêmica. A invenção pode ser aplicada na indústria farmacêutica.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] O corpo humano interage continuamente com diferentes tipos de micro-organismos, incluindo bactérias comensais e patogênicas que colonizam a pele e membranas mucosas (MURRAY, C. J. et al. Lancet 370: 109-10, 2007) . Em muitos casos o sistema imune pode efetivamente erradicar a invasão, impedindo assim o desenvolvimento de uma infecção (MURRAY, C. J. et al. Lancet 370: 109-10, 2007) . No entanto, em alguns casos, os patógenos podem superar as barreiras do sistema imune causando, assim, muitas vezes, infecções letais .

[003] Nos últimos anos, as infecções foram tratadas com sucesso após a descoberta de e posterior comercialização de antibióticos (KNOBLER, S. L. et al. Implicants for Human Health and strategies for Containment, 2003) . No entanto, logo após a introdução da penicilina no mercado, as cepas resistentes de Staphylococus aureus emergiram. Atualmente, várias bactérias são resistentes a múltiplos antibióticos disponíveis no mercado (FOSTER, T. J. et al. J Clin Invest 114: 1693-96, 2004; CHEN, L.F. Am J Infect Control 41: 44851, 2013). Tratar infecções causadas por essas bactérias é um desafio, especialmente se essa bactéria forma um biofilme, um tipo de organização que torna a bactéria mais tolerante a esses compostos (NAPARSTEK, L. et al. J Antimicrob Chemother 69: 1027-34, 2014).

[004] No hospital é maior a incidência de infecções sistêmicas entre pacientes que dependem de materiais médicos como cateteres, tubos endotraqueais e diferentes próteses. Essas infecções são associadas a formação de biofilmes nas superfícies desses materiais (CERI, H. et al. J Clin Microbiol 37: 1771-76, 1999).

[005] Em situações clínicas, os biofilmes são particularmente problemáticos, uma vez que eles tendem a se formar em materiais de longo prazo e causar infecções persistentes que podem levar a sepse (COSTERTON, J. W. et al. Science 284: 1318-22, 1999) . Além disso, como relatado em vários artigos, as infecções do biofilme são de difícil tratamento, em que os antibióticos sozinhos, mesmo em altas doses, não podem eliminar o biofilme (WU, H. et al. Int J Oral Sci 7: 1-7, 2015).

[006] A busca de novas terapias estratégias tem sido de grande importância e os peptídeos antimicrobianos (AMPs) são apresentados como excelentes candidatos, devido à sua atividade antimicrobiana e amplo espectro de ação (SILVA, O. N. et al. Front Microbial 2: 232, 2011) . Em nossa busca para encontrar uma terapia adequada para os biofilmes e infecções bacterianas sistêmicas, trabalhamos na modificação incremental do mastoparano-L. Esse peptídeo foi inicialmente isolada da vespa Vespula lewisii, mostrando aplicações farmacológicas importantes, tais como atividade antimicrobiana e anti-inflamatória.

[007] Contudo, ambos apresentam certos níveis de atividade citotóxica e hemolítica, promovendo a degranulação de mastócitos (HIGASHIJIMA, T. et al. Biol Chem 263: 649194, 1988), limitando seu uso farmacêutico. A presente tecnologia teve como foco aumentar o potencial das propriedades farmacêuticas do peptídeo mastoparano-L por meio da síntese de um peptídeo modificado. Dessa forma, reduzindo ou evitando a toxicidade contra células de mamíferos e aumentando a atividade antibacteriana contra bactérias patogênicas.

[008] Com a necessidade do desenvolvimento de novas moléculas capazes de controlar a resistência bacteriana aos antibióticos, novos estudos e estratégias vem sendo propostos utilizando os peptídeos da classe dos mastoparanos.

[009] O documento EP0502718 descreve um método de controle de micro-organismos em diversos hospedeiros como plantas, animais, incluindo humanos a partir de composições compreendendo peptídeos, dentre eles o mastoparano. A publicação internacional WO1993003749 revela o desenvolvimento de peptídeos racionalizados a partir da família dos mastoparanos para emprego como regulador da ação da proteína G. Adicionalmente, esta invenção também provê composições compreendendo tais peptídeos.

[010] O documento europeu EP0538942, também, revela a obtenção de peptídeos a partir de variações de aminoácidos na sequência do peptídeo natural mastoparano. Este desenvolvimento resultou na construção de 9 peptídeos para investigação das interações dos aminoácidos modificados com receptores associados às proteínas G.

[011] A publicação internacional WO9311784 apresenta desenvolvimentos relacionados a modulação da resposta inflamatória mediada por receptores químicos. Em uma de suas modalidades esta invenção descreve análogos do Mastoparano para utilização como inibidores em processos inflamatórios.

[012] O documento JP08198896 revela peptídeos curtos constituídos a partir da estrutura parcial do Mastoparano úteis na regulação da atividade das proteínas G e com potencial utilização em doenças como asma, alergias e doenças do sistema nervoso central.

[013] O pedido de patente americano US20020035061 descreve composições e métodos de tratamento de infecções empregando peptídeos catiônicos tais como análogos da indolicidina. Em uma de suas modalidades a invenção também está relacionada ao uso destes peptídeos catiônicos como os Mastoparanos.

[014] O documento US6583110 proporciona composições e métodos para tratamento e prevenção de choque séptico a partir da utilização de agente que se ligam a proteínas G, entres eles o Mastoparano. Adicionalmente, estas composições podem compreender também antibióticos e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[015] O pedido de patente americano US2010184698 descreve uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação dos peptídeos deslorelina e mastoparano. Além disso, a invenção prevê a utilização desta composição para tratamento de doenças como câncer, doenças auto-imune, doenças neurodegenerativas e doenças infecciosas.

[016] O documento WO2011038397 relata uma família de análogos do Mastoparano úteis na preparação de vacinas e formulações que induzem uma reposta imune em mamíferos para tratamento, por exemplo, de infecções microbianas.

[017] Yibin relata a síntese do Mastoparano-1, (MP-1, INLKAIAALAKKLL-NH2), bem como a sua utilização em testes relacionados à atividade frente a bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (YIBIN, G. et al. Biochem Pharmacol 70: 209-19, 2005) . Avram propõem novos análogos do Mastoparano, com potencial atividade antimicrobiana, gerados por mutagênese computacional a partir de estudos de relação quantitativa de estrutura e atividade (3D-QSAR)(AVRAM, S. et al. Int J Pept Res Ther 17: 7-17, 2011; AVRAM, S. et al. Mol Biosyst 8: 587-94, 2012; AVRAM, S. et al. Monatsh Chem 143: 535-43, 2012) .

[018] Nenhum dos documentos citados descreve o emprego de sequências peptídicas derivadas de Mastoparano-L, semelhantes às apresentadas na presente invenção.

[019] Com base nos problemas acima relatados e no propósito de superá-los, a presente invenção descreve peptídeos sintéticos, denominados de mastoparano-MO, os quais apresentam atividade antimicrobiana e 10x menos toxicidade a células de mamíferos que o mastoparano-L. Dessa forma, o peptídeo proposto é uma nova alternativa para o controle bacteriano e abre o mercado para o desenvolvimento de novos produtos.

DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS

[020] A Figura 1 apresenta o efeito dos peptídeos Mastoparano e Mastoparano-MO sobre os biofilmes pré-formados de KPC- K. pneummoniae 1825971, S. aureus MRSA e E. coli 0157. Os biofilmes cresceram no sistema de fluxo celular. Os tratamentos foram aplicados por 24h sobre os biofilmes de 2 dias de idade. Após esse tempo, as bactérias foram coradas em verde com o marcador Syto-9 e as bactérias mortas foram coradas em vermelho com iodeto de propídeo (a sobreposição aparece entre amarelo e vermelho) e, posteriormente, visualizadas em microscopia confocal. Cada painel mostra as reconstruções a partir do topo (painel maior) e os lados nos painéis direito e inferior (dimensões xy, yz e xz).

[021] A Figura 2 mostra a atividade protetora de mastoparano-L e mastoparano-MO em camundongos infectados. Os camundongos foram infectados com 2 x 107 UFC de E. coli ATCC 8739, E. coli KPC-positiva ID n° 1812446, 2 x 109 UFC de S. aureus ATCC 29213 e S. aureus (MRSA) ATCC 33591. Os camundongos foram tratados I.P. com uma única dose dos peptídeos (1, 5 e 10 mg.kg-1) 3 h após a infecção. As barras representam o desvio padrão. A significância estatística das diferenças entre os grupos experimentais dos animais foram determinados usando o teste Benferroni. A sobrevida dos camundongos foi avaliada ao longo do tempo durante 8 dias. Os dados de sobrevida foram comparados com o grupo PBS. **P,0.01; ***P,0.001.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[022] A presente invenção se refere a construção do peptídeo mast-MO (SEQ ID NO: 2) racionalizado a partir do peptídeo natural mastoparano-L (SEQ ID NO: 1), para emprego no controle da resistência bacteriana.

[023] Para melhor entendimento da invenção, segue a definição de alguns termos.

[024] O termo "mastoparano-L, mastoparan-L ou mastoparano" refere-se a uma classe de peptídeos encontrados na peçonha de algumas espécies de vespas, representado pela SEQ ID NO: 1.

[025] O termo "mast-MO, mastoparano-MO ou mastoparan-MO" refere-se a um peptídeo sintético modificado a partir de um peptídeo natural isolado de vespas, sendo representado preferencialmente pela SEQ ID NO: 2.

[026] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o peptídeo será administrado e que não produz uma reação adversa nociva.

[027] Uma das modalidades da presente invenção descreve um peptídeo sintético com atividade antimicrobiana sendo representado preferencialmente pela sequência: Phe-Leu-Pro-Ile-Ile-Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu (SEQ ID NO: 2) [028] A partir da sequência natural SEQ ID NO: 1, foi criado um novo peptídeo com modificações em sua sequência para reduzir a inerente atividade citotóxica de mastoparano-L, sendo adicionados cinco resíduos de aminoácidos na região C-terminal representado pela sequência Phe-Leu-Pro-Ile-Ile, denominado de SEQ ID NO: 3. Essa sequência curta foi obtida após comparação com peptídeos presentes na Base de dados AMP e r.

[029] O mast-MO foi sintetizado segundo o método de síntese em fase sólida através da estratégia F-moc. O peptídeo foi purificado por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RT-HPLC). A massa molecular dos peptídeos foi determinada pela técnica de MALDI-TOF MS/MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mas espectometry).

[030] Em uma outra forma de realização a presente invenção prevê a obtenção de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz do peptídeo Mast-MO e um excipiente farmaceuticamente aceitável tal como estearato de magnésio, amidoglicolato de sódio, sílica coloidaldra, anicelulose microcristalina, dióxido de titânio, hipromelose, polietilenoglicol, dimeticona, óleo mineral e petrolato branco. Diversas são as formas que a composição farmacêutica pode assumir. Entre estas podem ser citadas: comprimidos, cápsulas, emulsão, suspensão, solução, elixir, loção, granulado ou pó.

[031] A composição farmacêutica pode ainda ser empregada em associação com antibióticos comerciais β-lactâmicos. Os peptídeos da invenção podem ser formulados para uso farmacêutico ou veterinário.

[032] A invenção descreve, ainda, o uso do peptídeo para inibição da atividade de um micro-organismo resistente a agentes antimicrobianos. O peptídeo pode ser empregado individualmente ou em associação com outros agentes microbicidas e em conjunto com outros princípios ativos conhecidos da técnica como cefotaxima, ampicilina, penicilina entre outros, e ingredientes em geral como carreadores, diluentes, excipientes, etc.

[033] Um aspecto refere-se ao fato de que dentre os micro-organismos empregados para controle da resistência aos antibióticos, incluem-se bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, sendo preferencialmente Staphylococus aureus e Escherichia coli.

[034] Os dados mostram que o peptídeo SEQ ID NO: 2, é capaz de prevenir o crescimento de bactérias planctônicas, levando a erradicação do biofilme de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Além disso, o mast-MO é 10x menos tóxico que o mastoparano-L e a atividade antibacteriana é melhor que a apresentada pelo peptídeo natural. O mast-MO mostra ser um peptídeo promissor como agente terapêutico contra infecções sistêmicas e biofilmes originados por uma ampla variedade de bactérias.

EXEMPLOS

[035] Os exemplos a seguir são representados a fim de detalhar alguns aspectos da invenção. É importante destacar que a presente invenção não se limita aos exemplos citados, podendo ser utilizada em todas as aplicações descritas ou em quaisquer outras variações. / / EXEMPLO 1: SÍNTESE DOS PEPTIDEOS

[036] Os peptídeos (mastoparano-L, mastoparano-MO e catelecidina LL-37) foram sintetizados por Shanghai Hanhong Chemical (China) usando a fase sólida com o N-9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) e purificado por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (MAGGIORA, L. L. et al. J Med Chem 35: 3727-30, 1992) . A pureza do peptídeo usado nos ensaios biológicos foi maior que 95%.

EXEMPLO 2: QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-BIOFILMES

[037] Os biofilmes foram crescidos em meio glicose BM2 por 72h, a 37°C em câmaras de fluxo celular com canal nas dimensões de 1x4x40mm (FUENTE-NUNEZ, C. et al. Antimicrob Agents Chemother 56: 2696-2704, 2012). Para tratamento dos biofilmes pré-formados, as bactérias foram incubadas por 2 dias para desenvolver biofilmes estruturados antes do tratamento com os peptídeos pelas 24h seguintes. As células do biofilme foram então marcadas utilizando o Kit Live/Dead BacLight de viabilidade bacteriana (Molecular Probes, Eugene, OR) e subsequentemente analisadas utilizando um microscópio confocal a laser (Olympos, Fluoviem FV1000); foram geradas reconstruções tridimensionais usando o software Imaris package (Bitplane AG) apresentado na Figura 1.

EXEMPLO 3: ENSAIO DE CITOXICIDADE CELULAR

[038] Os fibroblastos murinos L929 (Banco de Células do Rio de Janeiro) e SPCs foram cultivadas em placas de cultura de 96 poços em uma concentração de 1.0x105 células por poço, em meio DMEM, suplementada com diferentes concentrações de peptídeos testados (1-600μΜ). Após 48h de incubação, o protocolo do ensaio de brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi aplicado. Brevemente, 60% do meio foi removido, e 10μL da solução de MTT (5mg.ml-1) (Sigma, USA) foi adicionado em cada poço e a placa foi incubada por 4h, em 5% de CO2, a 37°C. O azul de formazan gerado foi dissolvido pela adição de 100μL de 100% de DMSO (Mallinckrodt, Alemanha) em cada poço. As placas foram então gentilmente agitadas por 5min, em temperatura ambiente, para dissolver o precipitado.

[039] A absorbância foi medida em 575nm usando um espectofotômetro de microplacas (Bio-Tek, EUA). Os resultados foram expressos como uma porcentagem de cada amostra comparada ao controle negativo (Tampão PBS, pH 7.4) e a cultura de células foi incubada em um tampão de lise (10mM Tris, pH 7.4, 1mM de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e 0,15 de Triton X-100) (WIEGAND, I. et al. Nat Protoc 3: 163-75, 2008). A Tabela 1, a seguir, mostra a avaliação da atividade citotóxica do mast-MO.

[040] Nos ensaios de avaliação da atividade citotóxico do Mast-MO frente a células vermelhas do sangue humano (hRBCs) 0,1 % de Triton X-100 serviu como controle positivo (100% de hemólise). A liberação de hemoglobina foi mensurada a 550 nm e é expresso como % de hemólise. Nos ensaios de avaliação da atividade citotóxico dos peptídeos frente aos monócitos RAW 264.7, células foram incubadas durante 24 h, a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. Os dados representam a média de três experimentos realizados em triplicata, sendo expressos como média.

Tabela 1 EXEMPLO 4: DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA IN VIVO

[041] Para avaliar a atividade antibacteriana in vivo, quatro diferentes espécies bacterianas foram usadas: E. coli ATCC8739 e E. coli 1812446 ou S. aureus ATCC29213 e S. aureus (MRSA) ATCC33591 (KOKAI-KUN, J. F. et al. J Antimicrob Chemother 60: 1051-59, 2007; NANON-VENEZIA, S. et al.

Antimicrob Agents Chemother 46: 689-94, 2002) . O número mínimo de bactérias que que causam infecção letal de 100% (LD100) após injeção i.p é de ~2x104 para E.coli ATCC8739 e E. coli 1812446, e ~2x109 para S. aureus ATCC29213 e S. aureus (MRSA) ATCC33591 (dados não mostrados) . A LD100 bacteriana matou os camundongos em 20-24h. Os camundongos foram infectados com a LD100 de bactérias e tratadas três horas depois com o mastoparano-L e o peptídeo modificado mastoparano-MO por administração i.p.

[042] Após a infecção com E. coli ATCC8739 o mastoparano- MO, protegeu 80% dos animais contra sepse (8 dias de sobrevivência) quando administrado diariamente na concentração de 10 mg.kg-1 (Fig. 2B). Em seguida os camundongos foram infectados com um isolado clínico de E. coli 1812446, o peptídeo modificado mastoparano-MO administrado diariamente na concentração de 10 mg.kg-1 protegeu 80% dos animais (Figura 2D) . Os camundongos tratados com mastoparano-L (5 mg.kg-1) tiveram uma taxa de sobrevivência de 60% (Fig. 2C).

[043] O mastoparano-MO, administrado diariamente na concentração de 10 mg.kg-1, protegeu 100% dos camundongos infectados com S. aureus ATCC29213(Fig. 2F); camundongos tratados com mastoparano-L (5 mg.kg-1) tiveram uma de taxa de sobrevivência de 80% (Fig. 2E) . Finalmente, S. aureus (MRSA) ATCC33591 foi usada para desafiar os camundongos. O mastoparano-MO admistrado em doses diárias de nas concentrações de 10 mg.kg-1 protegeu 80% dos animais (Fig. 2H) . Os camundongos infectados com S. aureus (MRSA) ATCC33591 e tratados com mastoparano-L (5 mg.kg-1) mostrou 60% de sobrevivência (Fig. 2G).

REIVINDICAÇÕES

Claims (12)

1. PEPTÍDEO caracterizado por ser representado preferencialmente pela SEQ ID NO: 2.

2. PEPTÍDEO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender pelo menos cinco resíduos de aminoácidos na região C-terminal.

3. PEPTÍDEO de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência de aminoácidos da região C-terminal ser representada preferencialmente pela SEQ ID NO: 3.

4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender pelo menos um peptídeo, conforme definido em uma das reivindicações 1 e 2, e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.

5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por apresentar-se na forma farmacêutica selecionada dentre comprimido, cápsula, elixir, solução, suspensão, emulsão, loção, creme, pomada, granulado ou pó.

6. MÉTODO DE INIBIÇÃO DA ATIVIDADE DE MICRO-ORGANISMOS, caracterizado por compreender a administração do peptídeo, conforme definido em uma das reivindicações de 1 a 3, e um antibiótico lactâmico.

7. MÉTODO de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os antibióticos lactâmicos serem selecionados entre penicilina, ampicilina e cefotaxima.

8. MÉTODO de acordo com as reivindicações 6 e 7, caracterizado por os micro-organismos serem preferencialmente bactérias.

9. MÉTODO de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por as bactérias serem preferencialmente Staphylococcus aureus e Escherichia coli.

10. USO do peptídeo conforme definido em uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por ser na inibição de bactérias resistentes a antibióticos.

11. USO do peptídeo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser adicionalmente empregado em associação com antibióticos.

12. USO da composição farmacêutica conforme definido em uma das reivindicações 4 e 5, caracterizado por ser na inibição de bactérias resistentes a antibióticos.