JPH02270897A

JPH02270897A - 新規ペプチド及び抗菌剤

Info

Publication number: JPH02270897A
Application number: JP1089830A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nakajima; 浩中島; Isami Tsuboi; 五三美坪井; Takashi Kitagawa; 剛史北川; Seiji Kimura; 木村　省二
Original assignee: Taiyo Fishery Co Ltd
Current assignee: Maruha Nichiro Corp
Priority date: 1989-04-11
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1990-11-05
Anticipated expiration: 2012-08-20
Also published as: JP2641759B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野］本発明は、マレーシア産カブトガニ（堕薊汁１　ｅ　ｕ
　ｓｊ１狙）から抽出、単離した抗菌作用を有する新規
ペプチド及びその塩、並びにこれらを含有して成る抗菌
剤に関するものである。

［従来の技術］近年、有用な生理活性物質としてペプチド類が注目され
ている。プロティンエンジニアリングの発展に伴って、
従来の天然型のペプチド類のみならず、合成タイプのペ
プチド類の開発研究も積極的に進められており、有用な
ペプチド類の開発は、これまで医薬の分野を中心にかな
りの実績をあげている。

抗菌作用を有するペプチｌ”ｌの開発も、従来かなり積
極的に行われており、これまで、比較的低分子のオリゴ
ペプチド類を中心として数多くの報告がなされている。

例えば、グラＪ、陽性菌及びダラム陰性菌に対して抗菌
作用を有するホスホノトリペプチド類（特開昭５７−１
０６６８９号）、ボスボッジペプチド誘導体（特開昭５
８−１３５９４号）、環状ペプチド誘導体（特開昭５８
−２１３７４４号）、抗菌剤及び抗ウィルス剤として有
用な１０個のアミノ酸配列から成る新規ペプチド（特開
昭５９−５１２４７号）、酵母類に対する抗菌剤として
有用なポリペプチド（特開昭６０−１３０５９９号）、
ダラム陽性菌に対する抗菌剤として有用な糖ペプチド誘
導体（特開昭６０−１７２９９８号）、新規グリコペプ
チド誘導体（特開昭６１−２５１６９９号、特開昭６３
−４４５９８号）、ダラム陽性菌に対して有用なオリゴ
ペプチド（特開昭６２〜２２７９８号）、ペプチド系抗
生物質（特開昭６２−５１６９７号、特開昭６３−１７
８９７号）等、多数報告されている。

［発明が解決しようとし′ζいる課題］しかしながら、
従来技術の中には、必ずしも実用化に到らず、基礎研究
の域を出ないものも少なからず散見され、ペプチド系の
抗菌剤の開発がいまだ発展途上にあることが理解される
が、いずれにしても、優れた抗菌作用を有し、抗菌剤と
して実用化し得る新規ペプチド類を開発することは、ペ
プチド類の新しい応用５Ｍ域を確立する」二できわめて
重要なことと思われる。

〔課題を解決するだめの手段〕

このような見地から、本発明者らは、有用な新規ペプチ
ｌ′類を種々探索した結果、マレーシア産カブトガニ（
ｋ値Ｈ１ｅｕｓ　０１狙）の血球中より抽出、単離した
ペプチドが、強力な抗菌作用を有することを見い出して
本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２）に記載する
技術的事項を含有するものとして認識される。

１）次の構造式（１）（式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に結合してい
る。八ｒｇ−ＮＩ＋２は、アルギニンのカルボキシル基
がアミドであることを示す。）で表されるペプチド、及
びその塩。

２）次の構造式（ｒ）（式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に結合してい
る。八ｒＢ−Ｎｌｌｚは、アルギニンのカルボキシル基
がアミドであることを示す。）で表されるペプチド、及
びその塩を有効成分とする抗菌剤。

このように、本発明は、強力な抗菌作用を有する新規ペ
プチド、及びその塩を提供すると共に、それらを有効成
分とする抗菌剤を提供することを目的とするものである
。

なお、この明細書においてこの新規ペプチドをギガシン
ｌ　　（Ｇｉｇａｓｉｎ　Ｈ）と称する。また、この明
細書において、アミノ酸につき、ＩＩＪＰＡＣＩＵＢ　
ｃｏｍｍｉ−ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに基づく略号で表示する場
合があるが、それらを例示すると次の通りである。

Ａｒｇ：アルギニン、Ｔｒｐニトリブトファン、Ｃｙｓ
：１／２シスチン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｖａ　ｌ　
：　バリン、Ｔｙｒ　：チロシン、ＧＩＶニゲリシン、
Ｌｙｓ　：リジン本発明の新規ギガシン■は、１７個の
アミノ酸より構成され、その第３位と第１６位、及び第
７位と第１２位に存在する各システィン分子対間のジス
ルフィド結合により架橋された二環構造を有する。

また、Ｃ末端に存在するアルギニンは、そのカルボキシ
ル基がアミド化（Ｃ０ＮＨｚ）され、アルギニンアミド
として存在している。本発明のギガシン■は、塩の形を
とることができ、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土
類金属塩アンモニウム塩、有機アミン塩等の無機塩基、
有機塩基との塩、及び、トリフルオロ酢酸、メタンスル
ホン酸、塩酸、硫酸、硝酸、燐酸等の有機酸又は無機酸
の付加塩が含まれる。

本発明の新規ギガシン■及びその塩は、以下の方法によ
って製造することができる。

すなわち、マレーシア産カブトガニ（ＤＬｂ１皇吋Ｂ　
ｉ　Ｂ−ａ　ｓ　）の血球に、塩化ナトリウム及びヘン
スアミジン塩酸塩を含むトリス塩酸緩衝液を加え粉砕し
、これを遠心して沈澱物を得る。これに塩酸溶液を加え
粉砕し、遠心して上澄を得る。これを５ｅｐｈａｄｅ×
■Ｇ−５０に添加して、塩酸溶液で溶出する。２８０ｎ
ｍにおける吸光度を測定して集めた溶出区分を、コスモ
シール［Ｆ］５０１Ｂに添加しアセトニトリルの濃度を
変化させたトリフルオロ酢酸）８液で溶出することによ
り、目的のキガシン■画分を得る。

また、本発明のギガシン■は、固相法による合成も可能
である。この方法を本発明に適用する場合、α−アミン
基はいずれのアミノ酸についてもｔｅｒ　ｔ−ブチルオ
キシカルボニル基（Ｂｏｃｉ）で保護し、チロシンの水
酸基は、２．６−シクロロヘンジル基（ＣＩ。−Ｂｚｌ
基）で、アルギニンのグアニジノ基はトシル基（Ｔｏｓ
基）で、それぞれ保護するのが好適である。まず、Ｃ末
端アミノ酸のアルギニンの保護誘導体をクロロメチル樹
脂に導入し、以後順次アミノ酸鎖を延長し、保護ペプチ
ド樹脂を合成し、これをフッ化水素で処理することによ
り保護ペプチドを樹脂から切断し、同時に脱保護し、こ
れを還元し、以下、常法に従って合成ペプチドを得る。

得られた粗合成ペプチドは、ゲル濾過、逆相ＨＰＬＣ等
ペプチドの精製に常用される手段により精製し高純度の
ギガシン■を得る。なお、ペプチド合成に常用される固
相法については、例えば、日本生化学会編、「生化学実
験講座（Ｉ）」蛋白質の化学、４巻、２０８〜４９５頁
、（ｌａ東京化学同人発行（１９７７）、及び、泉屋信
夫ほか著、［ペプチド合成ｊ丸善■発行（１９７５）に
記載されているメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌ
ｄ）等の方法に準じて行うことができる。

本発明のギガシンＨの毒性は、極めて低いか又は非毒性
である。このギガシン■を医療用抗菌剤として投与する
場合は経口投与法又は非経口的投与方法、すなわち静脈
内投与、筋肉内投与、皮下投与等が好ましい。そして、
■投与単位当りのギガシンＨの使用量は１００〜１００
０ｎ＋ｇ程度である。更に、本発明のギガシン■は医療
用抗菌剤以外に防腐剤、抗生物質、塗料用防腐剤として
行動に使用することができる。

〔発明の効果〕

本発明のギガシン■は、後記参考例に示すように、例え
ば、グラム陽性細菌、ダラム陰性細菌及び真菌類に対し
て強い抗菌作用を示し、これら細菌の抑制剤として有用
である。具体的には、医療用抗菌剤、防腐剤、抗生物質
、塗料用防腐剤等、広汎な分野で利用することが可能で
あり、これらは、いずれも本発明の抗菌剤の範囲に包含
されることはいうまでもない。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を記載して、さらに本発明の詳細
な説明する。

実施例１（＋ｊ　　ギガシンＨの製造マレーシア産カブトガニ（ＴａｃＪ−ｐｌ’ｅｕｓ　ｇ
ｉ−８四の血球１．５ｇに５０１塩化ナトリウＪ、及び
５１ヘンズアミジン塩酸塩を含む２０ｍＭ　ト’）ス塩
酸緩衝液（ｐＨ８、０）　１００雁を加えわ）砕し、４
°Ｃで遠心（７５００ｒｐｍ　、４０分）して沈澱を得
た。さらにこの操作を２回くりかえし沈澱を得た。得ら
れた沈澱に２０ｍＭ塩酸溶液１００ｍρを加え粉砕する
。４°Ｃで遠心（７５００ｒｐｍ　４０分）して上澄を
得た。沈澱には２０ｍＭ塩酸溶液１００ｉｆｉを加え再
度粉砕し、４°Ｃで遠心（７５００ｒｐｍ　４０分）し
て上澄を得た。さらに２回同様の操作を行い上澄を得た
。得られた上澄は集め凍結乾燥した。

上記の凍結乾燥物を２０ｍＭ塩酸溶液に溶解し、４°Ｃ
で遠心（１２，ｏｏｏｒｐｍ　１５分）して上澄を得た
。

これを５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−５０（ファルマシア社製
）カラム（３Ｘ８５ｃｍ）に添加し、２０ｍＭ塩酸溶液
で溶出した。これを１０ｍ１づつ分画しながら同時に２
８０ｎｍにおける吸光度を測り、分画番号６９−８６の
両分を集め、これを凍結乾燥した。（第１図参照）。

この凍結乾燥物を２０ｍＭ塩酸溶液１０ｍ１に溶解しコ
スモシール０５ＣＩ、ｌ（牛丼化学薬品社製）カラム（
１０Ｘ２５０閂）に添加し、アセトニトリルの濃度を２
２〜３０χに変化させた０、１Ｘ＋−リフルオロ酢酸溶
液で溶出した。この溶出曲線を第２図に示ず。２８％ア
セトニトリルで溶出される区分を集め凍結乾燥するごと
により本発明のギガシン■を得た。収量は２ｍｇであっ
た。

（２）構造決定本物質の構造は以下の如くして決定された。

即ち、還元Ｓ−ビニルピリジンでピリジルエチル化した
サンプルを６Ｎ塩酸を用い加水分解しアミノ酸組成を決
定した。また、このサンプルを気相シークエンサーを用
いて１６回のエドマン分解に附し、Ｎ末端のリジンから
１６番目のシスティンに至るアミノ酸の種類と結合の順
序を決定した。また、アミノエチル化したサンプルをリ
シルエンドペプチダーゼ処理してＣ末端残基を遊離させ
て得られた生成物のフェニルチオカルバミル誘導体の逆
相高速液体クロマトグラフィー上での溶出時間は、別に
合成したフェニルチオカルバミルアルギニンアミドのそ
れと一致した。さらに質量分析結果もＣ末端をアルギニ
ンアミドとした質量数を示したのでＣ末端はアルギニン
アミドであると決定した。

実施例２ギガシン■の製剤化本発明のギガシン■活性成分を含む経口又は非経口投与
用の製剤例を以下に示す。

（］）　２２００ｍｇ錠剤ガシン■２００ｍｇコーンスターチ　　　　　　　　４０ｍｇラクトース　
　　　　　　　　　９８ｍｇステアリン酸マグネシウム
　　　８ｍｇタルク　　　　　　　　　　　　　４　ｍ
ｇ（２）　１００ｍｇ注射用アンプル（ｑ、ｓ、ｐアン
プル）ギガシフＨ１００ｍｇ注射用蒸留水　　　　　　　　　適量（３）　５００ｍｇカプセルギガシンＩＩ　　　　　　　　　　５００　ｍｇラクト
ース　　　　　　　　　　５０ｍｇステアリン酸マグネ
シウム　　　５ｍｇ（４）　５００■錠剤ギガシンＵ　　　　　　　　　　５００ｍｇコーンスタ
ーチ　　　　　　　　”１０ｍｇポリビニルピロリドン
　　　　　３．５　ｍｇラクトース　　　　　　　　　
　　７４Ｍｇステアリン酸マグネシウム　　　１４ｍｇ
タルク　　　　　　　　　　　　７ｍｇ以下に、本発明
のペプチドギガシンＨの抗菌活性について検討した結果
を参考例として示す。

参考例（１）グラム陽性細菌、ダラム陰性細菌に対する抗菌性
試験 ■実験材料供試菌：　［１ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴ
ＣＣ１１７７５Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　　ｂ過山哄吐叩
Ｓｔａ　　ｈ　　Ｉｏｃｏｃｃｕｓ　　　ａｕｒｅｕｓ
　　ＡＴＣＣ２５Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ　　ＪＡＭ　　１０６９培地　：牛心臓侵出液　　
　２５０ｇカザミノ酸　　　　　１５ｇＬ−）リプ］・ファン　０．０５ｇ精製水　　　　　　１０１００Ｏ ■実験方法各画をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ■　（Ｄｉｆｉｃ
ｏ社製）培地で２０時時間表う培養後、菌の濃度を６６
０ｎｍの吸光度が約０．３になるように調整し、その０
．１ｍｊ！を上記培地に加えたものを供試菌液とした。

本物質凍結乾燥品３００μｇを精製水１２ｍｆｌに溶解
し２５０　μｇ／ｍＲの溶液を得る。これを原液として
２倍階段希釈を行い１２．５．６．２５．３．１３．１
．５６ｇｇ／滅の試料液を得た。

滅菌した試験管に各濃度の試料液をｌ　ｍＲずつ分注し
これに各菌液１　ｍｌずつを加え混合し３７°Ｃで２０
時間培養し、６６０ｎｍの吸光度を測定した。対照は試
料液のかわりに精製水を用い、本物質の各画に対する最
小性成育阻害濃度を決定した。その結果を第１表に示す
。

（本頁以下余白）第　　１　　表旦各９Ｗ生ｒｉｃ丸１ａ−ｃｏｌｉ−八ＴＣＣ１１７７
５０，７８Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　□ｉｍｕｒｉｕｍ　
　　　　３．１３Ｓｔａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎ
ｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ２５９２３３，１３（２）真菌類に
対する抗菌性試験 ■実験利料供試菌二旦圏Ｉ…用　恒■」Ｐｓｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　　ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ培
地　：ポリペプトン　　１ｇ麦芽エキス　　　２０ｇブドウ糖　　　　２０ｇ寒天　　　　　　２０ｇ精製水　　　　１０１００Ｏ ■実験方法本物質の凍結乾燥品５００μｇを２ｍβの精製水に熔き
２５０　μｇ／ｍｌの試料液を得た。これを二倍階段希
釈し１２５．６２．５．３１．３μｇ／ｒｄの試料液を
作成した。

上記培地９　ｍｌに各濃度の試料液を１　ｒｒｄｔずつ
加え、これを５　ｍｌずつ滅菌した試験管に分注し斜面
培地を作成した。この斜面培地上に上記菌の分生子を付
着させた白金耳で直線をひき、３０°Ｃで４８時間培養
し、その生育を調べた。その結果を第２表に示す。

第２表菌　　　　株　　　　　　最小生育濃度μｇ７ｍＲハＰ
」匡肚竪恒上顧　　　　　　　　１２，５上記の結果が
示す様に、本物質は、ダラム陽性菌、ダラム陰性菌及び
真菌類までに至る広範囲の微生物に対して強い抗菌活性
を示す特異な物質であることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、５ｅｐｈａｄｅｘ　”　Ｇ−５０カラムにお
ける２０ｍＭ塩酸溶液抽出物の溶出曲線を示す図、第２
図はコスモシール■５Ｃ３８カラムにおりる０、１％Ｉ
・リフルオロ酢酸溶液の溶出曲線を示す図、第３図はギ
ガシン■の紫外吸収スペクトルを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１）次の構造式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、（１）と（２）、（３）と（４）は、それぞれ
直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
のカルボキシル基がアミドであることを示す。）で表されるペプチド及びその塩。２）次の構造式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、（１）と（２）、（３）と（４）は、それぞれ
直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
のカルボキシル基がアミドであることを示す。）で表されるペプチド又はその塩を有効成分とする抗菌剤
。