JPH10114793A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規ペプチドの提供。 【解決手段】 下記のアミノ酸配列を有するペプチド。
Phe-Lys-Asp-Cys-His-Leu-Ala-Argこのペプチドは、フ
ァゴサイトーシス促進活性、回腸収縮活性及びＴＮＦ産
生促進活性を有する。免疫増強剤、感染症の予防及び／
又は治療剤などの医薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、優れたファゴサイ
トーシス促進活性、回腸収縮活性、及び腫瘍細胞壊死因
子（ＴＮＦ）産生促進活性を有する新規ペプチドに関す
る。本発明ペプチドは、その活性より免疫増強剤、感染
症の予防及び／又は治療剤などとして有用である。

【０００２】

【従来の技術】従来より、食品タンパク質の酵素分解物
が生理活性を示す例がいくつか見出され、食品タンパク
質のもつ潜在的な生体調節機能として注目されている。
例えば、カゼインやグルテン由来のオピオイドペプチド
（V.Brantl et al., Physiol.Chem., 360, 1211, 1217
(1979); S.Loukas et al., Biochemistry, 22, 4567 (1
983); C.Zioudrou et al., J. Biol. Chem., 254, 2446
(1979); M.Yoshikawaand T.Yoshimura, Agric. Biol.
Chem., 48, 3185 (1984); M.Yoshikawa et al., Agric.
Biol. Chem., 50, 2419 (1986))、カゼイン由来の免疫
賦活ペプチド（F.Parker et al., J. Biochem., 145, 6
77 (1984))、あるいはアンジオテンシン転換酵素（S.Ma
ruyama and H.Suzuki, Agric. Biol. Chem., 46, 1393
(1982);S.Maruyama et al., Agric. Biol. Chem., 49,
1405 (1985)）などが知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述し
たような生理活性を示す物質を自然界に広く求め鋭意研
究の結果、ヒトラクトフェリンの 242−249 番目に当た
るアミノ酸配列を有するペプチドに、優れたファゴサイ
トーシス促進活性、回腸収縮活性、及び腫瘍細胞壊死因
子（ＴＮＦ）産生促進活性があることを見いだした。従
って本発明は、優れたファゴサイトーシス促進活性、回
腸収縮活性、及びＴＮＦ産生促進活性を有する新規ペプ
チドを提供することを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記のアミノ
酸配列で示される新規ペプチドに関する。 Phe-Lys-Asp-Cys-His-Leu-Ala-Arg 本発明の新規ペプチドは、優れたファゴサイトーシス促
進活性、回腸収縮活性、及びＴＮＦ産生促進活性を有す
る。このペプチドは、ヒトラクトフェリンの242-249 番
目のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を示す。本発
明のペプチドは、その活性より免疫増強剤、感染症の予
防及び／又は治療剤などとして有用である。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明のペプチドは、ヒトラクト
フェリンをトリプシン処理し、高速液体クロマトグラフ
ィーで分画を行うことにより得ることができる。又、市
販のペプチド合成装置を用いて容易に合成することもで
きる。例えば、合成装置としてＰＳ３型ペプチド合成機
（Protein Technologies社）を用いてペプチドの合成を
行う。即ち、樹脂に活性基を保護したアミノ酸を吸着さ
せ、これにデブロッキング液を注入して保護基を除去
し、活性基を保護したアミノ酸を注入し、両者を反応さ
せ、ジペプチドを合成する。この操作を繰り返すことに
より、目的とする配列を有するペプチドを合成する。ペ
プチドの保護基は、５％チオアニソール、３％エタンジ
オール、２％エチルメチルサルファイド、３％フェノー
ル、５％水、82％トリフルオロ酢酸を含む脱保護液中で
４時間反応することにより除去され、得たろ液に冷エー
テルを添加することにより、ペプチドを沈澱として回収
できる。この粗ペプチドを0.1 ％トリフルオロ酢酸に溶
解した後、オクタデシルシリカ（ＯＤＳ）カラムを接続
した高速液体クロマトグラフにより、0.1 ％のトリフル
オロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展
開、精製する。目的とするペプチドは、特有の溶出位置
を示す。又、このようにして得られたペプチドのアミノ
酸配列はプロテインシーケンサーによる配列分析、アミ
ノ酸分析計によるアミノ酸分析により特定できる。

【０００６】本発明のペプチドはヒト及び動物に対し、
医薬組成物として経口的及び非経口的に安全に投与され
る。好適な投与量は、症状、性別、年令によって多少相
違するが、通常は一日約10〜1000mgを１日１回ないし数
回に分けて経口あるいは非経口的に投与することが好ま
しい。製剤として、例えば注射剤、錠剤、散剤、顆粒剤
及びカプセル剤等が挙げられる。これらの製剤は公知の
製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に許容され得
る担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤及び着色剤等と共に医
薬組成物として投与される。これらの製剤に用いる担体
や賦形剤として例えば乳糖、ブドウ糖等の糖類、デンプ
ン類、炭酸カルシウム等の無機物、カンゾウ末等の植物
及び結晶セルロース等が用いられる。賦形剤として例え
ばデンプン糊液、アラビアゴム、トラガントゴム、ゼラ
チン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエ
ーテル、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、メ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ
Ｃ）、エチルセルロース及び結晶セルロース等、崩壊剤
として例えばデンプン、寒天、ゼラチン末、ＣＭＣ−Ｎ
ａ、ＣＭＣ−Ｃａ、結晶セルロース、炭酸カルシウム及
び炭酸水素ナトリウム等、滑沢剤として例えばステアリ
ン酸マグネシウム及びタルク等、着色剤として例えば医
薬品に添加することが許容されている周知着色料を、各
々適宜用いることができる。錠剤、顆粒剤及びカプセル
剤は矯味及び除放化製剤として、糖類、ヒドロキシメチ
ルセルロースフタレート及び酢酸フタル酸セルロース等
適当なコーティング物質を用いてコーティングしても良
い。又、注射剤を調製する場合には、主薬の必要に応じ
適当なｐＨ調整剤、緩衝剤、安定剤、可溶化剤等を用い
て、常法により各注射剤とする。

【０００７】

【実施例】以下の実施例をもって本発明をより詳細に説
明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明は
これらによって何ら限定されるのではない。

【０００８】

【実施例１】本発明ペプチドの酵素分解による調製 ヒトラクトフェリン（シグマ社）50mgを５mlの水に溶解
しpH８に調整した後、トリプシン 0.5mg（TYPE XIII 、
シグマ社）を添加し、37℃３時間消化後、分解物をＯＤ
Ｓカラム(Cosmosil 5C₁₈-AR 、20x250mm、ナカライテス
ク社）を装着したＨＰＬＣを用いて、 0.1％トリフルオ
ロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（0-40％
／40分、10ml／分）により展開した。目的のペプチド
は、アセトニトリル濃度23％にて溶出された。得られた
ペプチドをプロテインシーケンサー(477A、アプライド
バイオシステムズ社）でその配列を分析したところ、Ph
e-Lys-Asp-Cys-His-Leu-Ala-Arg という構造を持つペプ
チドであることが確認された。

【０００９】

【実施例２】本発明ペプチドの合成 １ｇのFmoc-Arg(Pmc)-Alko-resin(0.5mmol/g) をＰＳ３
型ペプチド合成機（Protein Technologies社）にセット
し、同機の標準プロトコールに従って20％ピペリジン／
80％ジメチルフォルムアミド中で10分間デブロックし、
ジメチルフォルムアミドにより６回洗浄した。これに0.
4M N-エチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミ
ド５mlに溶解したFmoc-Ala 1mmol及びHBTU 1mmolを添加
し、20分反応させた。以下、同様にしてFmoc-Leu、Fmoc
-His(Trt) 、Fmoc-Cys(Trt) 、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-L
ys(Boc) 及びFmoc-Pheを順次カップルさせ、Fmoc-Phe-L
ys(Boc)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-His(Trt)-Leu-Ala-Arg(Pm
c)-Alko-Resin を得た。本resin を５％チオアニソー
ル、３％エタンジオール、２％エチルメチルサルファイ
ド、３％フェノール、５％水、82％トリフルオロ酢酸を
含む脱保護液中で４時間反応させた。得られた液に冷エ
ーテルを添加し、ペプチドを沈澱として回収した。本ペ
プチドをＯＤＳカラム(Cosmosil 5C₁₈-AR 、20x250mm、
ナカライテスク社）を装着したＨＰＬＣを用いて、0.1
％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度
勾配（0-40％/40min、10ml/min）にて展開した。目的の
ペプチドは、濃度勾配開始後23分に溶出された。得られ
たペプチドをプロテインシーケンサー（477A、アプライ
ドバイオシステムズ社）でその配列を分析したところ、
目的とするペプチドが得られていることが確認された。

【００１０】

【実施例３】ファゴサイトーシス促進活性の測定 ヒト末梢血にリン酸緩衝液を含む生理食塩水（ＰＢＳ）
を加え、1000rpm ５分の遠心分離で血球の懸濁液を調製
した。この溶液 100μl を採り、実施例２で得られたペ
プチドをＰＢＳに溶解させたペプチド溶液10μl を加え
37℃で10分インキュベートを行い、ついでヒト末梢血で
オプソニン化した４×10⁸ 個／mlの蛍光標識ラテックス
ビーズ液（Fluoresbrite Carboxy YG 2μm 、ポリサイ
エンス社）10μl を加え、さらに５分インキュベートを
行った。ＥＤＴＡを含むＰＢＳで反応を停止させ、遠心
により血球を分離し、これに塩化アンモニウム溶血剤を
加えて溶血させ、白血球を得た。これをＥＤＴＡを含む
ＰＢＳに懸濁後、フローサイメトリーにて測定した。結
果を図１に示す。この結果、本発明ペプチドは10^-6Ｍ以
上の濃度で強いファゴサイトーシス促進活性を示した。

【００１１】

【実施例４】回腸収縮活性の測定 300〜350gの雄モルモットから回腸縦走筋を摘出し、37
℃のKrebs-Ringer液を満たしたマグナス管中で0.5gの張
力下で懸垂した。そこに実施例２で得られた本発明ペプ
チドを添加し、ＦＤピックアップ(TB-G12T、日本光電
社）を介して収縮を記録した。結果を図２に示す。この
結果、本発明ペプチドは、強い回腸収縮活性を示した。

【００１２】

【実施例５】ＴＮＦ産生促進活性の測定 (A) ペプチドによるＲＡＷのＴＮＦ産生誘導 マウスマクロファージ系細胞であるＲＡＷ 264.7細胞(A
TCC TIB-71) を、ＤＭＥＭ培地を入れた96穴プレートに
播き、37℃、５％二酸化炭素下で培養した。48時間後、
培地交換し実施例２で得られたペプチドと１ng/ml のリ
ポポリサッカライド（E. coli serptype 055:B5 、シグ
マ社）を同時に加えた。さらに20時間培養後、その培養
上清を回収した。

【００１３】(B) 産生されたＴＮＦのＬ９２９細胞障害
性試験を用いた定量化 繊維芽細胞であるＬ９２９細胞(ATCC CCL-1)を、ＭＥＭ
培地を入れた96穴プレートに播き、37℃、５％二酸化炭
素下で培養した。４時間後、培地にＲＮＡ合成阻害剤で
あるアクチノマイシンＤ（シグマ社）を加えた。つい
で、(A) で回収した培養上清50μl を添加し、さらに培
養した。16.5時間後、ＴＮＦの作用による細胞死を検索
するため、生細胞を染めるクリスタルバイオレットで染
色した。これをＳＤＳに溶解後、600nm における吸光度
を測定した。既知濃度の標準ＴＮＦとの比較により定量
化し、培養上清中のＴＮＦ量を求めた。結果を表１に示
す。この結果、本発明ペプチドは、濃度依存的にＴＮＦ
産生を強く促進した。

【００１４】

【発明の効果】本発明により、優れたファゴサイトーシ
ス促進活性、オピオイド促進活性、及びＴＮＦ産生促進
活性を有する新規ペプチドが提供される。本発明ペプチ
ドは、その活性より免疫増強剤、あるいは感染症の予防
及び／又は治療剤として有用である。

【００１５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の型：アミノ酸 配列の長さ：８ 配列の種類：ペプチド トポロジー：直鎖状 配列： Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３における、本発明ペプチドのファゴサ
イトーシス促進活性を示す。

【図２】実施例４における、本発明ペプチドの回腸収縮
活性を示す。

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のアミノ酸配列で示されるペプチ
   ド。 Phe-Lys-Asp-Cys-His-Leu-Ala-Arg