KR0137961B1 - 박테리아에서 폴리펩티드의 번역 후 수식을 유도하는 리더 서열 및 그의 유전자 - Google Patents

박테리아에서 폴리펩티드의 번역 후 수식을 유도하는 리더 서열 및 그의 유전자

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웨인 이. 스완
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Abstract

내용없음

Description

[발명의 명칭]
박테리아에서 폴리펩티드의 번역 후 수식을 유도하는 리더 서열 및 그의 유전자
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 숙성한 형태가 되기 전에 아미노산 서열의 번역 후 수식(Post-translational modification)을 필요로 하는 단백질의 발현에 관한 것이다. 이러한 단백질은 통상적인 핵산에 의하여 코딩된 20개의 일반 아미노산 이외의 아미노산을 갖는다. 특히, 전구체 폴리펩티드와 결합되어 발현되는 경우에 특정 아미노산의 번역 후 수식을 유도할 수 있는 리더 펩티드 서열이 동정되었다. 또한, 이러한 리더 서열을 사용하여 개선된 조성물을 형성하는 방법이 발견되었다.
[선행 기술의 배경]
천연의 항생 물질 활성을 가진 폴리펩티드를 포함하여 박테리아 및 다른 생물체의 발현 생성물로서 유전암호에 의하여 생성된 20개의 일반 아미노산 이외의 아미노산으로 되어 있는 폴리펩티드가 동정되었다. 다수의 중요한 것들 중에서, 니신 및 서브틸린, 2종류가 구조가 본 발명의 제1도에 기재되어 있다.
이러한 폴리펩티드 및 다른 종류의 폴리펩티드에 있어서, 특수한 아미노산인 란티오닌, β-메탈란티오닌, D-알라닌, 다히드로알라닌 및 디히드로부티린의 존재는 유전 암호에 의하여 지시되는 통상적인 단백질 생합성 이외의 다른 것이 이러한 천연 폴리펩티드의 숙성 형태의 발현에 관여한다는 것을 명백하게 제시한다.
그럼에도 불구하고, 연구 결과 이러한 폴리펩티드의 출현은 단백질 생합성 억제제에 의하여 차단될 수 있다는 것이 밝혀졌다[허르스트(Hurst) 등, Canadian Journal of Microbiology, 제17호, 제1379페이지-제1384페이지(1971년) 참조]. 또한 숙성 형태의 전구체 펩티드는 숙성 펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다는 것이 밝혀졌다.[니시오(Nishio) 등, Biochemistry Biophysics Research Community, 제116호, 제751페이지(1983) 참조]. 이러한 결과는 니신, 서브틸린 및 관련 단백질에서의 결과와 더불어, 리보좀 기작을 통한 1차적인 전구체의 생합성 및 후속의 번역 후 수식을 포함하는 기작을 제시한다.
외래 DNA 단편을 포함하고 단백질의 생성을 위해 코딩하는 변이 미생물 분야에서 실질적인 활성을 나타내기 때문에 이러한 단백질의 활성, 및 그들의 중요한 돌연변이에 많은 상업적인 관심이 집중되고 있다. 곤잘레스(Gonzalez)등에 의하여 발표된 미합중국 특허 제4,716,115호에는 바로 그와 같은 변이 미생물에 관하여 기재되어 있다. 그러나, 숙성 단백질을 직접 코딩하는 유전자 서열을 얻는 것이 불가능하고 숙성 형태로 도달하는데 필요한 번역 후 수식의 기작에 관한 정보가 부족하기 때문에 이러한 단백질을 코딩하는 특정 유전자를 함유하는 미생물의 클로닝이 어렵고, 더욱 중요하게는 고도의 활성 또는 다른 향상된 특성을 갖게 될 수 있는 무작위 변형체 및 부위 특이적 변형 단백질을 제조하려는 시도는 실패하였다.
이와 같이, 이러한 특수한 아미노산 함유 폴리펩티드의 숙성 형태가 제조되는 기작을 완전히 이해하고, 이러한 펩티드의 생성을 특이적으로 코딩하고, 통상적으로 입수 가능한 박테리아의 형질 전환에 적합한 유전자를 삽입하기 위한 발현 매체(Expression Vehicle)를 개발하는 것이 생물 공학 분야의 목표로 남아 있다.
[발명의 설명]
본 발명자는 폴리펩티드의 전구체를 코딩하는 유전자와 결합되는 경우에, 숙성 형태를 얻기 위한 전구체의 번역 후 수식을 유도하거나 또는 그에 관여하는 유전자의 리더 서열을 동정하였다. 추정적 리보좀 결합부위를 포함한 전체 유전자의 구조는 이러한 폴리펩티드의 제조를 위한 번역 후 수식 모델을 확실하게 한다.
궁극적으로 숙성 단백질의 발현을 위한 서브틸린의 전구체 유전체를 제2도에 나타내었다. 특히 니신 등과 같이 특수한 아미노산을 함유하는 다른 단백질의 번역 후 수식을 촉진시키는데 사용될 수 있는 리더 서열은 특별하게 제3도에 나타내었다. 또한 서브틸린의 리더 서열과 뚜렷한 유사성을 나타내는 별도의 리더서열이 또한 동정되고 그것의 전체 유전자 서열은 제3도에 나타내었다.
[발명을 수행하는 최상의 방법]
관심있는 단백질의 폴리펩티드 전구체 및 그 단백질의 숙성 형태의 최종 발현을 위한 유전자를 얻기 위하여, 문제의 단백질의 추정되는 아미노산 전구체 서열에 근거한 유전자 탐침을 개발하는 것이 필요하다. 하기에서 숙성 형태 주에 마찬가지로 특수한 아미노산을 함유한 단백질을 코딩하는 부가적인 유전자에 적용될 수 있는 동일한 방법이 니신의 전구체의 전체 유전자자를 결정하기 위하여 사용되지만, 설명을 용이하게 하기 위하여, 여기에서는 먼저 서브틸린 유전자 및 전구체를 중심으로 설명한다.
[서브틸린]
[미생물 및 배양 조건]
서브틸린 생성 균주인 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 6633는 ATCC(American Type Culture Collection, 록크빌, 매릴랜드주 소재)로부터 얻었다. 이 미생물은 원래 페네이[페네이(Fceney) 등(1948) 참조]에 의하여 설명된 니시오[니시오(Nishio) 등(1983년) 참조]의 고농도-수크로오스 배지 A에서 배양되었다. 이 배치는 11당 수크로오스 100g, 시트르산 11.7g, Na2SO44g, (NH4)2HPO44.2g, 효모 추출물 5g[디프코(Difco) 제품], 염 혼합물 용액(물 100ml중 KCl 7.62g, MgCl2-6H2O 4.18g, MnCl2-4H2O 0.543g, FeCl3-6H2O 0.49g 및 ZnCl20.208g을 용해) 100ml 및 pH 6.8 내지 6.9로 조절하기 위하여 사용되는 충분량의 NH4OH를 함유한다. 균주는 1.5％ 한천을 함유하는 LB 고체 배지(11당 트립톤 10g, 효모 추출물 5g 및 NaCl 10g 함유)상에서 보관하였다.
[클론 단리 및 혼성화 방법]
서브틸린 유전자 탐침은 서브틸린의 추정되는 아미노산 전구체 서열에 근거하여 설계하였다.
숙성 서브틸린 분자는 단지 32개의 아미노산을 함유하고, 코돈 축퇴성(degeneracy)이 낮은 부위를 함유하지 않는다. 이런 이유로, 서브틸린 전구체중의 아미노산의 짧은 길이를 암호화하는 모든 가능한 서열을 함유하는 탐침 혼합물을 제조하는 대신에, 라데(Lathe)의 방법에 따라 하나의 긴 탐침을 합성하였다(Journal of Molecular Biology, 제183호 제1페이지-제12페이지(1985) 참조). 코돈 안에 있는 모호한 부위는 α-아밀라제[양(Yang) 등, Nucleic Acids Research, 제11호, 제237페이지-제249페이지(1983년) 참조]를 코딩하는 공지의 바실루스 서브틸리스 유전자로부터 구성한 코돈 이용 빈도표에 따라서 경험에 기초한 추정에 의하여 선별하였다. 탐침 및 표적 유전자 서열 사이의 유사성을 예측할 수 없기 때문에, 혼성화 및 세척 조건은 실험적으로 최적화하여야 한다. 누클레오티드키나제를 사용하여 96-mer guessmer을 표지화하고 디술피드 가교BAC겔상에서 정제하고, [Hansen 등(1982) 참조], 6×표준 염수 시트레이트 용액[Standand Saline Citrate(SSC)을 사용하여 37 내지 60℃에서 7℃ 간격으로 EcoR1 ATCC 6633 염색체 DNA와 혼성화시켰다. 분리 띠는 4℃씩 증가된 온도에서 2×SSC중에서 세척하였다. 신호 강도 및 특이성을 최적화하는 혼성화 및 세척 조건을 후속적으로 람다 J1에 제조한 ATCC 6633 DNA의 부분적 MboⅠ라이브러리 스크리닝에 사용하였다. 탐침 및 표적이 매우 유사한 혼성화는 상기와 같은 혼성화 완충액에서 수행하였으나, 혼성화 온도는 70 ℃이고 세척은 0.1×SSC중에서 52℃에서 수행하였다. DNA 서열 분석은 변형 T7폴리머라제시쿼나제 시스템[Biochemical사 제품, 미합중국 소재]을 사용하여 수행하였다.
[RNA 단리 및 S1-지도화]
전체의 RNA는 울마넨[울마넨(Ulmanen) 등(1985) 참조]의 방법을 사용하여 단리하였다. S-1 지도화는 데이비스[데이비스(Davis) 등(1986) 참조]의 방법으로 수행되었는데, 합성 올리고누클레오티드는 클론된 유전자를 함유하는 외가닥 M13 DNA를 주형으로 사용하여 제2가닥의 합성을 개시하는데 사용된다. 표지는 [알파-32P-dATP]로부터32P로서 함입되었다. 단시간 표지화한 후, 과량의 비표지화 dATP를 첨가하고, 제2가닥의 합성을 계속하여 완료하였다. 겹가닥 생성물을 적절한 제한 효소로 절단하고, 변성 아가로스 겔상에서 전기 영동시키고, 방사선 자동 사진법으로, 단편의 위치를 알아내어 겔을 잘라내어 DNA를 전기 용출하여 표지화된 가닥을 얻었다. 전기 용출 후에, 클로로포름 : 페닐(1 : 1)을 사용하여 DNA를 추출하고, 에탄올을 사용하여 침전시켰다. 표지화 단편은 수개의 다른 온도에서 전체 mRNA에 혼성화하고, 비혼성화 외가닥 핵산은 누클레아제-S1을 사용하여 분해하였다. 생성물은 변성 서열화 겔상에서 개시체(primer)로서 동일한 합성 올리고누클레오티드를 사용하여 반응된 1조의 디데옥시 서열화 반응물 옆에서 전기 영동하였다. 서열화 열에 대응하는 보호된 표지화 DNA 단편의 위치를 mRNA의 말단으로 동정하였다.
[RNA 및 단백질 분석]
노던(northern)분석은 제타-탐침 나일론 막[바이오라드(Biorad)사 제품]상에 RNA 준비물의 아크릴아미드 겔을 전기 블롯팅(electroblotting)하여 수행하였다. 단백질은 스왕크 등[스왕크 및 문크레(Swank and Munkres) (1971) 참조]의 폴리아크릴아미드 겔 시스템상에서 전기 영동에 의하여 분석하고 바이오라드 시약을 사용하여 온(silver)-염색하였다. 서브틸린 활성은 모리스[모리스(morris) 등(1984) 참조]에 의하여 설명된 니신의 활성 측정과 같은 방법으로 측정하였다.
상기 재료 및 방법을 사용하여, guessmer와 혼성화한 서열을 함유한 단편을 M13 내로 클로닝하고 서열화하였다. 서열은 서브틸린 유전자 탐침에 대한 유사성의 탐구에 사용되고, 또한 모든 읽기틀(reading frame)에 대하여 컴퓨터를 사용하여 번역하였다. 이러한 것들을 추정되는 서브틸린 전구체 서열에 대한 탐구에 사용하였다. 32개 잔기의 정확한 서열을 함유하는 완전히 일치하는 서열을 발견하였다. 이 서열을 제3도에 나타내었다.
지적한 것과 같이, 이러한 서열은 지적한 특수한 아미노산을 가진 숙성 단백질에 도달하기 위한, 번역 후 수식이 수행되는 세린, 트레오닌 및 시스테인을 함유하는 전구체 폴리펩티드의 암호화 부분을 포함한다. (-10) 부위는 다른 박테리아에서 관찰되는 것과 같은 원핵 생물의 프로모터(promoter)와 거의 일치한다[시벤리스트(Siebenlist) 등, Cell, 제20호, 제269페이지-제281페이지 참조]. 추정되는 리보좀 결합 부위는 RBS로서 표시되고, 바실루스 서브틸리스에서 관찰되는 전형적인 염기쌍인 12개의 염기쌍 서열을 갖고 있다[밴드(Band)등, DNA, 제3호, 제17페이지-제21페이지(1984) 참조]. 본 발명의 리더 서열을 개시하는 Met 코돈의 바로 아래쪽에서 번역이 개시된다는 것이 지적되어야 한다. 세포 밖으로의 서브틸린의 운반에 역할을 하는 서브틸린 전구체의 펩티드 리더 부위는 다른 원핵 생물의 방출 단백질의 서열과 비교하여 특수하다.
[니신]
상기의 접근은 항상 물질 활성을 가진 니신에 대하여 동일하게 적용되고, 전구체를 코딩하는 얻어진 유전자 서열은 본 발명에 첨부된 제3도에 나타내었다.
[박테리아 균주, 클로닝 벡터 및 배양조건]
니신-생성 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis) ATCC 11454는 ATCC(록크빌, 매릴랜드주 소재)로부터 구입하였다. 균주는 25% 글리세롤을 함유하는 ATCC 배지 17(전지 분유 100g, 토마토 쥬스 100g 및 효모 추출물 5g으로 되어 있는 pH-7.0의 배지)에서 -20℃에서 저장하였다. 사용 균주는 1.2% LB한천 고체 배지(11) 중에 박토-트립톤 10g, 박토-효모 추출물 5g 및 NaCl 10g을 함유함)상에서 보관하였다. 11중에 박토-펩톤(디프코) 5g, 박토소이톤(디프코) 5g, 효모 추출물(디프코) 2.5g, 쇠고기-추출물(디프코) 5g, 아스코르부산 0.5g, 락토오스(또는 글루코오스) 5g, 베타-디소듐 글리세로포스페이트[이스트만 (Eastman)] 19g 및 무수 MaSO40.12g을 용해시킨 M17 배양 배지(8)는 나신 생성, 유전자의 라이브러리 제조 및 전체의 RNA 단리를 위하여 사용되는 스트렙토코커스 락티스의 배양에 사용하였다. 적절한 부위의 M17 배지에 미생물 2%를 접종하여 통기없이 32℃에서 배양하였다.
니신 생성을 측정하는데 사용되는 바실루스 세리우스(Bacillus cereus) T포자는 선행 기술에 따라서 제조하여 저장하였다. 항생 물질 활성 측정은 상기한 바와 같이 스트렙토코거스 락티스 배양 상등액의 부분을 사용하여 수행하였다.
[DNA 단리 방법]
스트렙토코거스 락티스 ATCC 11454는 M17 배지 500ml에서 통기없이 32℃에서 30시간 동안 배양하였다. 세포를 원심 분리에 의하여 수거하고, PBS(11중에 NaCl 8g, Na2HPO41.4g 및 1N HCl 1.2ml을 함유) 25ml를 사용하여 세척하였다. 세포를 50mM 트리스-HCl(pH 7.6) 15ml에 재현탁시키고, 후속적으로 부드럽게 교반하면서 37℃에서 15분 동안 무타놀리신[시그마(sigma)] 33mg/ml를 사용하여 분해하였다. 이어서 STEP 용액(13)(0.5% SDS, 0.4M EDTA중의 50mM 트리스-HCl, 및 프로테이나제 K 1mg/ml 함유) 5ml를 첨가하고, 가끔씩 교반하면서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 혼합물을 CHCl31배 부피, 1배 부피의 페놀 : CHCl3(50 : 50), 및 마지막으로 1배 부피의 CHCl3를 사용하여 추출하였다. 3M 소듐 아세테이트 1/10배 부피와 에탄올 2배 부피를 첨가하여 DNA를 감아 올려서, 췌정 RNA 분해 효소(RNase)[시그마(sigma)제품] 50㎍/ml을 함유하는 50mM 트리스-HCl 및 4mM EDTA 용액 20ml에 재현탁시켰다. 혼합액을 50mM 트리스-HCl 및 4mM EDTA 의 완충 용액에 대하여 완충액을 1회 교체하며 4℃에서 16시간 동안 투석시켰다. DNA를 2.5M 암모늄 아세테이트의 존재하에 에탄올을 사용하여 2회 침전시키고, 최종적으로 pH7.6인 10mM 트리스-HCl 2ml에 용해시켰다.
[탐침 제조, 방사능 표지화, 및 혼성화 방법]
스트렙토코커스 락티스 ATCC 11454 DNA중의 니신 유전자를 찾기 위하여 여러 종류의 다른 탐침을 사용하였다. 혼성화 조건을 상기한 바와 같이 최적화하였다. 2종의 올리고머 탐침을 DNA 합성기(Biosearch Model 8700)를 사용하여 화학적 합성에 의하여 제조하였다. 하나는 추정되는 니신 전구체 서열 중의 코톤 축퇴성이 낮은 부위에 대하여 고안된 20-mer 혼합 탐침이다. 두 번째는 라데의 방법을 사용하여 고안된 단일 서열인 103-mer 올리고누클레오티드 탐침이다. 또한 이전에 바실루스 서브틸리스 ATCC 6633으로부터 클로닝되었던 서브틸린 유전자를 함유하는 1.1kb의 제한 효소 절단 단편인 천연 DNA 탐침을 사용하였다.
[라이브러리 제조 및 니신 유전자의 단리]
람다 J1중에 제조한 스트렙토코커스 락티스 ATCC 11454의 전체 유전자 라이브러리를 제조하여 상기한 바와 같이 스크리닝하였다. 양성 클론은 제한 효소 분석에 의하여 지도화하고, 보다 상세히 분석하기 위해 pUC9 및 pTZ19U 플라스미드 벡터로, 또한 서열화를 위하여 M13mp18 및 M13mp18로 서브클로닝하였다.
서열 결정은 변형된 T7 폴리머라제 및 시쿼나제 키트(Sequenase kit)[바이오케미칼 캄파니(Biochemical company) 제품, 미합중국 소재] 중의 방법을 사용하여 디데옥시 종결법에 의하여 수행하였다.
[RNA 단리 및 노던 블롯 분석]
전체의 RNA 단리는 울마넨 등의 방법에 따라 수행하였다. 변성 아크릴아미드 겔상에서 RNA 분획화를 수행하고, 제타 탐침(바이오라드) 나일론 막상에 전기 블롯팅하여, 상기와 같이 혼성화시켰다.
[단백질 분석]
스왕크 및 스크레의 폴리아크릴아미드 겔 시스템상에서 단백질을 전기 영동하여 분석하고, 바이오라드 시약을 사용하여 은-염색하였다. 니신 활성은 모리스 등의 방법으로 측정하였다.
[정리]
이와 같이, 서브틸린, 니신 및 다른 단백질이 유전 암호에 의하여 코딩되지 않는 특수한 아미노산을 함유하는 기작이 밝혀졌다. 상기한 특수한 아미노산으로 전환되는 전구체 잔기인 Ser, Thr 및 Cys를 포함한 특정 아미노산의 번역 후 수식에 필요한 제2도 및 제3도에 나타낸 서브틸린 및 니신의 유전자 내에 코딩되는 특정 리더 서열은 탈수 및 티오에테르 가교 및 D-아미노산의 생성을 위한 입체 전환(stereoinversion)을 포함하는 잠재적 전기친화성 부가 반응을 포함하는 반응에 관여한다. 리더 서열을 포함하여 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 통상적인 기술에 의해 임의의 발현 매체 내로 삽입될 수 있는데, 예를 들면 니신의 경우, 천연 생산자로서의 스트렙토코커스 락티스가 사용되며, 미합중국 특허 제4,716,115호에 발현 박테리아가 개시되어 있다. 유사한 발현 매체가 다른 단백질을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명에 이어서, 또 다른 란티오닌-함유 폴리펩티드 항생 물질은 에피데르민의 유전자 서열이 공지되었다[쉬넬(Schnell) 등, Nature 제333호, 제276페이지-제278페이지(1988) 참조]. 3종의 항생 물질의 리더서열의 아미노산 잔기가 공통된 진화 기원을 나타내기에 충분한 유사성을 반영한다고 하더라도, 이 경우에는 각각의 아미노산 서열 및 그에 대응하는 유전자 서열 내에 뚜렷한 차이점이 있는 것은 분명하다. 그러나, 표 1에 나타낸 바와 같이, 3종의 리더 아미노산 서열의 수치료 지수는 놀랍게도 유사하다. 특히, 구조적 영역과 인접하여, 고도의 친수성 영역이 있고, 그 뒤로 구조 영역과 원거리에 평균적으로 중성이나 친수성 및 소수성 잔기가 교대되는 경향이 있는 영역이 있다. 실제로, 같은 그래프 상에서 보면 이러한 잔기들 간에는 놀란만한 상관 관계가 있다. 이러한 상관 관계는 각각의 리더 영역이 각각의 경우에 정확하게 동일한 위치에서 친수성 잔기들이 하나의 소수성 잔기에 의해 중단된다는 사실로 이어진다. 따라서, 본 발명은 구조적 영역 내의 수식을 지시하거나 보조하는 리더 영역을 코딩하는 것에 의하여 수식이 이루어진다는 사실 뿐만아니라, 일반적으로 리더 영역은 구조적 영역에 인접한 천연적으로 친수성인 특성화된 부분을 갖고, 전체적인 중성값을 유지하도록 친수성 및 소수성 잔기가 교대되는 원거리의 영역에 의하여 보완될 수 있다는 것을 포함한다. 본 발명에 기재된 3개의 예는 모두 구조적 영역에 인접한 친수성 영역 내에 하나의 소수성 잔기가 존재한다. 본 발명의 출원시에는, 그러한 잔기의 존재가 번역 후 수식에 필수적인지는 밝혀지지 않았다. 그러나, 당업계의 기술에서 사용되는 통상적인 실험을 통하여 상기 잔기의 필요성과 수식 효율을 개선할 수 있는 다양한 변형들을 밝힐 수 있었다.
또한, 가용 기술에 의해 대개의 경우에서 비교적 용이한 방법, 즉, 혼성화 및 서열화 분석에 후속하는 아미노산 서열에 근거한 추정에 의하여 결정될 수 있는 구조가 영역만의 유전자로부터 숙성 단백질을 코딩하는 유전자의 제조가 가능하다. 또한 특수 아미노산에 대한 본 발명의 리더 서열의 영향은 DNA 변형에 의존하지 않고, 부위-특위적 돌연변이를 얻기 위한 신규의 방법을 제공한다. 따라서, 다양한 잔기들 예를 들면, 시스테인 등의 탈리 또는 치환은 생물학적 활성을 개선할 수 있다는 것이 보고되었다(미합중국 특허 제4,518,584호 참조). 추가적으로, 천연 펩티드의 신규 변이체는 보다 고도의 활성을 나타내거나, 또는 특정한 생물학적 기능에 있어서 보다 향상된 특이성을 나타낼 수 있는 가능성이 상당히 높다. 이들은 천연 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 앞에 본 발명의 리더 서열의 유전 암호를 삽입하여 제조할 수 있으며, 여기에서 리더 서열에 의한 번역 후 수식, 관심있는 잔기의 제거 또는 변형이 진행된다.
[표 1]
물론, 펩티드-그 자체가 아닌 전구체의 실질적인 발현을 막는 것이 요구되는 경우에는, 펩티드 전구체를 코딩하는 유전자로부터 리더 단편을 특수하게 제거하여 이를 달성할 수 있다는 것이 지적되어야 한다. 본 발명의 리더 서열의 부재 하에서는, 전구체는 번역 후 수식없이 발현된다.
본 발명의 다른 특징은 특수한 아미노산인 데히드로알라닌 및 데히드로부티린의 존재에 의하여 표적에 공유 결합될 수 있는 표적화 단백질 또는 단백질을 설계할 수 있는 가능성이 있다는 것이다. 따라서, 특허 표적을 인지하고 선별할 수 있는 구조 변이체를 사용할 경우, 리더 단편을 공유 결합 항체를 개발하고, 특이독소를 중화하고, 특이 물질을 선별해 내기 위한 결합 부위를 유도하는데 사용할 수 있다. 이러한 모든 변형은 당업자의 기술 및 확장된 생물공학 기술 내에서 가능하며, 이는 본 발명의 리더 서열의 즉각적인 응용성을 의미한다.
본 발명은 현존하는 단백질의 변형에 국한되지 않는다. 현재, DNA 서열을 합성할 수 있기 때문에, 인공클론에 의하여 특정 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 특정 용도를 위하여 표적화할 수 있다. 예를 들면 본 발명을 통하여 생성된 특수한 아미노산은 가교 활성이 있으므로, 주어진 기질에 특이적인 접착제를 제조할 수 있다. 예를 들면, 탄소 섬유는 공유 결합을 형성하기 위한 변형에 의해 생성된 특수한 아미노산의 활성 때문에 기질에 견고하게 결합할 수 있다. 아미노산의 가용성 때문에 에폭시와 같이 현재 사용되는 접착제의 문제점을 극복하기 위하여, 고안자는 접착제로서 임의의 바람직한 양의 소수성 및 친수성 성분을 도입할 수 있다.
물론, 특정 응용을 위하여 본 발명의 리더 서열이 돌연변이, 및 다른 특정 변이제를 제조할 수 있다. 이러한 변이체가 번역 후 수식에서 유도 또는 보조하는 필수적인 생물학적 기능을 유지하는 한, 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명자에 의한 리더 서열의 동정의 세부화는 공지[샤르밀라 바네르제(Sharmila Banerjee), Journal of Biological chemistry, 제263호, 1988년 7월 5일]되어 있다는 것을 밝혀둔다.
번역 후 수식이 유도되는 정확한 기작은 불분명하다. 이론적으로 정리되지 않지만, 서브틸린 전구체는 먼저 고도의 친수성 및 소수성이 교대되는 리더 서열의 잔기가 나타나고, 대조적으로 매우 소수성인 구조 영역 근처에서 고도로 친수성인 잔기를 갖는다. 이것은 일반적으로 매우 소수성인 부위를 갖고, 본 발명의 산성 잔기를 함유하지 않고 염기성 잔기를 함유하는 원핵 생물의 방출 단백질의 특수한 리더 영역과 대조적이다. 이것은 특수한 리더 서열이 전구체를 표적화하거나 지시하는데 보조하는 구획 부위에서 번역 후 수식이 일어난다는 것을 암시한다. 다른 단백질이 수식 기작에 관여하는 것을 추정된다. 필수적인 화학 반응의 수행에 필요한 효소가 세포막 또는 세포막 근처에 위치하는 것이 밝혀졌다.
본 발명은 단백질, 물질 및 방법에 관하여 특히 세부적으로 설명하였다. 본 발명을 수행하는데 필요한 경우를 제외하고, 이러한 특정 물질에 대한 어떤 제한도 의도되지 않으며, 본 발명에 첨부된 청구 범위를 제한하지 않는 범위에서 이해된다. 특히, 실제적으로 임의의 원핵 생물 발현 매체, 특히 박테리아와 관련된 본 발명의 리더 서열의 사용이 의도된다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 항상 물질 활성을 가진 소(小) 단백질인 니신 및 서브틸린의 형태적인 구조를 나타낸다[그로스(Gross) 등, Protein Cross-linking, 제131페이지-제153페이지(1977년) 참조].
제2도는 번역 후 수식을 유도하는 역할을 하는 리더 단편을 포함하여 서브틸린 전구체 펩티드의 암호화 유전자를 함유하는 전체적으로 절단된 단편에 대한 유전자의 염기쌍 서열을 나타낸다. 추정되는 리보좀 결합 부위는 R.B.S로 표시되고, 리더 단편은 그것의 위에 별표로 표시되며, 수식이 이루어지는 전구체의 아미노산은 획이 굵은 활자로 나타내었다.
제3도는 제2도와 같은 유형의 표시 및 의미로 표시된 니신 및 니신에 대응하는 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 서열을 나타낸다.

Claims (7)

  1. ATG TCA AAG TTC GAT GAT TTC GAT TTG GAT GTT GTG AAA GTC TCT AAA CAA GAC TCA AAA ATC ACT CCG CAA의 서열을 가진 것이 특징인, Cys, Ser, Thr 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산의 번역 후 수식(post-translational modification)을 유도하는 펩티드 리더 서열을 코딩하는 유전자 리더 단편.
  2. Met Ser Lys Phe Asp Asp Phe Asp Leu Asp Val Val Lys Val Ser Lys Gln Asp Ser Lys Ile Thr Pro Gln의 아미노산 서열의 생물학적 기능을 가진 폴리펩티드로 이루어진 것이 특징인, 번역 후 수식을 거치게 되는 단백질 전구체에 리더로서 결합된 경우에 상기 수식의 유도를 보조하는 폴리펩티드 서열.
  3. 제1항에 따른 유전자 리더단편의 하단에 TGG AAA AGT GAA TCA CTT TGT ACA CCA GGA TGT GTA ACT GGT GCA TTG CAA ACT TGC TTC CTT CAA ACA CTA ACT TGT AAC TGC AAA ATC TCT AAA의 서열을 가진 것이 특징인, 박테리아에서 서브틸린의 폴리펩티드 전구체를 코딩하는 유전자 서열.
  4. 제2항에 따른 폴리펩티드 서열의 하단에 Trp Lys Ser Glu Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Val Thr Gly Ala Leu Gln Thr Cys Phe Leu Gln Thr Leu Thr Cys Ans Cys Lys Ile Ser Lys의 잔기 서열을 가진 것이 특징인 박테리아에서 발현되는 경우에 번역후 서브틸린 단백질로 전환되는 전구체 폴리펩티드.
  5. ATG AGT ACA AAA GAT TTT AAC TTG GAT TTG GTA TCT GTT TCG AAG AAA GAT TCA GGT GCA TCA CCA CGC의 서열을 가진 것이 특징인, Cys, Ser, Thr 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산의 번역 후 수식을 유도하는 펩티드 리더 서열을 코딩하는 유전자 리더 단편.
  6. Met Ser Thr Lys Asp Phe Asn Leu Asp Leu Val Ser Val Ser Lys Lys Asp Ser Gly Ala Ser Pro Arg의 아미노산 서열의 생물학적 기능을 가진 폴리펩티드로 되어 있는 것이 특징인, 번역 후 수식을 거치는 단백질 전구체에 리더로서 결합된 경우에 상기 수식의 유도를 보조하는 폴리펩티드 서열.
  7. 제6항에 따른 폴리펩티드 서열의 하단에 Ile Thr Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys His Cys Ser Ile His Val Ser Lys의 잔기 서열을 가진 것이 특징인, 박테리아에서 발현되는 경우에 번역 후 니신 단백질로 전환되는 전구체 폴리펩티드.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5516682A (en) * 1988-07-05 1996-05-14 University Of Maryland Subtilin variant of enhanced stability and activity
US5348881A (en) * 1990-03-13 1994-09-20 Quest International Flavors & Good Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. Multiple bacteriocin producing lactococcus and compositions
NL9000753A (nl) * 1990-03-30 1991-10-16 Nl Zuivelonderzoek Inst Dna-fragment, ten minste coderend voor een deel van het extracellulaire eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 60 kda van lactococcus lactis stammen zoals de lactococcus lactis ssp. lactis stam mg1363, combinaties hiervan met voor homologe of heterologe eiwitten coderende dna-sequenties alsmede de hiermee verkregen homologe en heterologe eiwitten.
WO1992018633A1 (en) * 1991-04-11 1992-10-29 Stichting Nederlands Instituut Voor Zuivelonderzoek (Nizo) Lantibiotics similar to nisin a, lactic acid bacteria which produce such lantibiotics, method for constructing such lactic acid bacteria and method for preserving foodstuffs with the aid of these lantibiotics and these lactic acid bacteria producing lantibiotics
US5861376A (en) * 1991-07-01 1999-01-19 Quest International Flavors & Food Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. Synthetically derived peptide
GB9207267D0 (en) * 1992-04-02 1992-05-13 Agricultural & Food Res Nisins
ATE255165T1 (de) * 1994-09-12 2003-12-15 Aventis Pharma Gmbh Rekombinantes mersacidin und verfahren zu seiner herstellung
US5919695A (en) * 1997-04-22 1999-07-06 Quest International, B.V. Method and culture for inhibiting undesired microorganisms with culture of Bacillus subtilis
WO1999003352A1 (en) * 1997-07-18 1999-01-28 University Of Maryland Sublancin lantibiotic produced by bacillus subtilis 168
US6953683B2 (en) * 1997-07-18 2005-10-11 University Of Maryland Compositions and methods of inhibiting bacterial spore germination
WO2000039152A1 (en) * 1998-12-24 2000-07-06 University Of Maryland Stable subtilin and methods of manufacture
US7033766B2 (en) * 2000-06-29 2006-04-25 University Of Maryland Office Of Technology Commercialization Construction and screening of lantibody display libraries
US6846804B2 (en) * 2000-06-29 2005-01-25 University Of Maryland, College Park Office Of Technology Commercialization Construction of a structural variant of sublancin to facilitate its isolation and use in bioremediation of environmental contamination by gram-positive spore formers such as bacillus anthrasis
US6759205B2 (en) 2000-06-29 2004-07-06 University Of Maryland Construction of a strain of Bacillus subtilis 168 that displays the sublancin lantibiotic on the surface of the cell
WO2003063887A1 (en) * 2002-01-14 2003-08-07 University Of Maryland, College Park Compositions and method of inhibiting bacterial spore germination
US6861236B2 (en) * 2002-05-24 2005-03-01 Applied Nanosystems B.V. Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way
CN101115838B (zh) * 2004-12-07 2015-08-12 莫菲西斯公司 产生和分泌修饰的肽的方法
WO2007093548A1 (en) * 2006-02-13 2007-08-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method for the manufacture of lantibiotics
US7993873B2 (en) * 2006-06-29 2011-08-09 The Invention Science Fund I, Llc Apparatus for arbitrary peptide synthesis
US7910695B2 (en) * 2006-06-29 2011-03-22 The Invention Science Fund I, Llc Methods for arbitrary peptide synthesis
US7923533B2 (en) * 2006-06-29 2011-04-12 The Invention Science Fund I, Llc Methods for arbitrary peptide synthesis
US7879975B2 (en) * 2006-06-29 2011-02-01 The Invention Science Fund I, Llc Methods for arbitrary peptide synthesis

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4716115A (en) * 1983-09-06 1987-12-29 Microlife Technics, Inc. Derived nisin producing microorganisms, method of production and use and products obtained thereby

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Publication number Publication date
JPH03505670A (ja) 1991-12-12
NO309200B1 (no) 2000-12-27
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ATE175417T1 (de) 1999-01-15
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DE68928899T2 (de) 1999-08-12
DK191D0 (da) 1991-01-02
DE68928899T4 (de) 1999-11-25
IL90832A (en) 1995-06-29
IL90832A0 (en) 1990-01-18
NO905638D0 (no) 1990-12-28
ZA894721B (en) 1990-03-28
DE68928899D1 (de) 1999-02-18
JP3418388B2 (ja) 2003-06-23

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