JPH0556793A - ミラクリンの製造方法 - Google Patents
ミラクリンの製造方法Info
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- JPH0556793A JPH0556793A JP3245049A JP24504991A JPH0556793A JP H0556793 A JPH0556793 A JP H0556793A JP 3245049 A JP3245049 A JP 3245049A JP 24504991 A JP24504991 A JP 24504991A JP H0556793 A JPH0556793 A JP H0556793A
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- Japan
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- miraculin
- protein
- acid sequence
- amino acid
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 味覚変革作用を有するミラクリンを遺伝子工
学的手法により大量に生産する方法を提供すること。 【構成】 遺伝子の核酸配列が未知であるミラクリンの
アミノ酸配列をもとにミラクリン遺伝子を設計し、この
遺伝子を約３０〜６０塩基から成るＤＮＡフラグメント
に分割して化学合成し、それぞれをサブクローニング
後、大腸菌トリプトファンプロモーターをもつ発現ベク
ターに順次クローニングし、ミラクリンの化学合成遺伝
子を含む発現用ベクターを得、これにより大腸菌を形質
転換し、形質転換された大腸菌を培養し、その培養物か
らミラクリンを回収することによるミラクリンの生産方
法。
学的手法により大量に生産する方法を提供すること。 【構成】 遺伝子の核酸配列が未知であるミラクリンの
アミノ酸配列をもとにミラクリン遺伝子を設計し、この
遺伝子を約３０〜６０塩基から成るＤＮＡフラグメント
に分割して化学合成し、それぞれをサブクローニング
後、大腸菌トリプトファンプロモーターをもつ発現ベク
ターに順次クローニングし、ミラクリンの化学合成遺伝
子を含む発現用ベクターを得、これにより大腸菌を形質
転換し、形質転換された大腸菌を培養し、その培養物か
らミラクリンを回収することによるミラクリンの生産方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、味覚変革作用を有する
ポリペプチドであるミラクリン及びその関連ペプチドの
製造方法に関する。
ポリペプチドであるミラクリン及びその関連ペプチドの
製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ミラクリンは西アフリカ原産の植物 Ric
hadella dulcifica （アカテツ科）の実、通称ミラクル
フルーツに含まれる、すっぱい味を甘く感じさせる作用
を有する糖タンパク質である。栗原らは、ミラクルフル
ーツの果肉よりミラクリンを単離・精製し、その一次構
造を決定した（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６３、１１５
３６- １１５３９（１９８８））。さらにシステイン残
基の３つのジスルフィド結合の位置および糖鎖構造を決
定した（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６４、６６５５- ６
６５９（１９８９））。
hadella dulcifica （アカテツ科）の実、通称ミラクル
フルーツに含まれる、すっぱい味を甘く感じさせる作用
を有する糖タンパク質である。栗原らは、ミラクルフル
ーツの果肉よりミラクリンを単離・精製し、その一次構
造を決定した（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６３、１１５
３６- １１５３９（１９８８））。さらにシステイン残
基の３つのジスルフィド結合の位置および糖鎖構造を決
定した（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６４、６６５５- ６
６５９（１９８９））。
【０００３】これらの結果から、ミラクリンは１９１個
のアミノ酸残基よりなる、１本のポリペプチド鎖から構
成されており、４２番目および１８６番目のアスパラギ
ン残基には、キシロースを含む複合型糖鎖がＮ- グリコ
シド結合していることが示された。アミノ酸配列及び糖
含量から、ミラクリン単量体の分子量は２４，６００と
計算された。
のアミノ酸残基よりなる、１本のポリペプチド鎖から構
成されており、４２番目および１８６番目のアスパラギ
ン残基には、キシロースを含む複合型糖鎖がＮ- グリコ
シド結合していることが示された。アミノ酸配列及び糖
含量から、ミラクリン単量体の分子量は２４，６００と
計算された。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ミラクリンは、すっぱ
い味を甘く感じさせるというユニークな味覚変革作用に
より、甘味受容機構の分子レベルでの研究に利用できる
物質として注目される。また砂糖を使用せずに甘味を誘
導できることから、全く新しいタイプの甘味剤としての
応用が期待されている。
い味を甘く感じさせるというユニークな味覚変革作用に
より、甘味受容機構の分子レベルでの研究に利用できる
物質として注目される。また砂糖を使用せずに甘味を誘
導できることから、全く新しいタイプの甘味剤としての
応用が期待されている。
【０００５】しかし、ミラクリンは原料となるミラクル
フルーツの木が少なく、果実１個あたりのミラクリン含
量も２５０μｇと微量であるため、その生物学的研究、
物理化学的研究およびタンパク質工学的研究を行う上
で、これを大量生産させる系の確立が望まれている。さ
らに、現在までミラクルフルーツよりミラクリン遺伝子
配列がクローニングされたという報告はない。
フルーツの木が少なく、果実１個あたりのミラクリン含
量も２５０μｇと微量であるため、その生物学的研究、
物理化学的研究およびタンパク質工学的研究を行う上
で、これを大量生産させる系の確立が望まれている。さ
らに、現在までミラクルフルーツよりミラクリン遺伝子
配列がクローニングされたという報告はない。
【０００６】また、一般には、例えば、アプライドバイ
オシステムズ社のモデル３１０ＤＮＡシンセサイザーを
用いてのＦmoc 法によるポリペプチドの化学的合成法も
あるが、化学合成により製造する方法はアミノ酸の数が
４０以下の場合には便利であっても、アミノ酸数が４０
を超えると困難であり、また、大量生産への応用にも困
難がある。
オシステムズ社のモデル３１０ＤＮＡシンセサイザーを
用いてのＦmoc 法によるポリペプチドの化学的合成法も
あるが、化学合成により製造する方法はアミノ酸の数が
４０以下の場合には便利であっても、アミノ酸数が４０
を超えると困難であり、また、大量生産への応用にも困
難がある。
【０００７】従って、本発明の目的は、味覚変革作用を
有するミラクリンを遺伝子工学的手法により大量に生産
する方法を提供することである。
有するミラクリンを遺伝子工学的手法により大量に生産
する方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記した従
来技術の欠点に鑑み鋭意検討した結果、化学合成して得
られたＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法によりミラクリ
ン及びその関連ペプチドを得ることに成功し、本発明を
完成するに至った。
来技術の欠点に鑑み鋭意検討した結果、化学合成して得
られたＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法によりミラクリ
ン及びその関連ペプチドを得ることに成功し、本発明を
完成するに至った。
【０００９】ここで、「関連ペプチド」とは、ミラクリ
ンのアミノ酸配列の一部を有し、味覚変革作用を有する
タンパク質である。
ンのアミノ酸配列の一部を有し、味覚変革作用を有する
タンパク質である。
【００１０】すなわち、本発明は、ミラクリンのアミノ
酸配列の全部又は一部を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を化学合成し、該ＤＮＡ配列を発現用ベクタ
ーにクローニングし、得られた発現ベクターで細胞を形
質転換し、該形質転換された細胞を培養し、その培養物
から該タンパク質を回収することを含む遺伝子工学的手
法による製造方法を提供する。
酸配列の全部又は一部を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を化学合成し、該ＤＮＡ配列を発現用ベクタ
ーにクローニングし、得られた発現ベクターで細胞を形
質転換し、該形質転換された細胞を培養し、その培養物
から該タンパク質を回収することを含む遺伝子工学的手
法による製造方法を提供する。
【００１１】本発明で使用できる細胞の例としては酵母
菌、動物細胞、大腸菌が挙げられる。
菌、動物細胞、大腸菌が挙げられる。
【００１２】以下、大腸菌を使用する場合を例として本
発明をより具体的に説明する。
発明をより具体的に説明する。
【００１３】ミラクリンのアミノ酸配列の全部又は一部
をコードするＤＮＡ配列は、ミラクリンのアミノ酸配列
の全部又は一部をコードするものであればいかなる塩基
配列を有していてもよいが、発現がスムーズになるよう
宿主細胞で使用頻度の高いコドンを使い、パリンドロー
ム等の配列を避けることが望ましい。好ましくは、配列
番号２の塩基配列が挙げられる。
をコードするＤＮＡ配列は、ミラクリンのアミノ酸配列
の全部又は一部をコードするものであればいかなる塩基
配列を有していてもよいが、発現がスムーズになるよう
宿主細胞で使用頻度の高いコドンを使い、パリンドロー
ム等の配列を避けることが望ましい。好ましくは、配列
番号２の塩基配列が挙げられる。
【００１４】ミラクリンのアミノ酸配列の全部又は一部
をコードするＤＮＡ配列（ミラクリンコード領域）の上
流には大腸菌内での転写効率を高めるプロモーターが存
在する。プロモーターは大腸菌由来のものが好ましく、
トリプトファンプロモーター、ラクトースプロモーター
等が挙げられる。特にトリプトファンプロモーターが好
ましい。プロモーターの直下流にミラクリンコード領域
が位置してもよい。一方、大腸菌のタンパク質をコード
する領域の下流にミラクリンコード領域が位置してもよ
く、この場合には、ミラクリンのアミノ酸配列の全部又
は一部を有し、かつ、そのＮ末端に大腸菌のタンパク質
のアミノ酸配列の全部又は一部を有する融合タンパク質
が得られる。この大腸菌のタンパク質としては、ｌａｃ
Ｚタンパク質、ｍａｌＥタンパク質及びＴｒｐＥタンパ
ク質が挙げられる。好ましくはＴｒｐＥタンパク質であ
り、特には配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする
領域である。
をコードするＤＮＡ配列（ミラクリンコード領域）の上
流には大腸菌内での転写効率を高めるプロモーターが存
在する。プロモーターは大腸菌由来のものが好ましく、
トリプトファンプロモーター、ラクトースプロモーター
等が挙げられる。特にトリプトファンプロモーターが好
ましい。プロモーターの直下流にミラクリンコード領域
が位置してもよい。一方、大腸菌のタンパク質をコード
する領域の下流にミラクリンコード領域が位置してもよ
く、この場合には、ミラクリンのアミノ酸配列の全部又
は一部を有し、かつ、そのＮ末端に大腸菌のタンパク質
のアミノ酸配列の全部又は一部を有する融合タンパク質
が得られる。この大腸菌のタンパク質としては、ｌａｃ
Ｚタンパク質、ｍａｌＥタンパク質及びＴｒｐＥタンパ
ク質が挙げられる。好ましくはＴｒｐＥタンパク質であ
り、特には配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする
領域である。
【００１５】本発明の発現ベクターはミラクリン又はそ
の関連ペプチドを発現することのできるものであって、
通常の発現ベクターと同様に、抗生物質耐性、例えばテ
トラサイクリン耐性およびアンピシリン耐性のような適
当な選択マーカー及び大腸菌内で複製するための複製開
始点を有する。さらに、上記本発明のミラクリンコード
領域の下流には転写終結コドンが存在する。発現用ベク
ターとしては、例えばｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２その他の
市販の大腸菌用ベクターをそのまま利用することができ
る。あるいは、当業者であれば容易にかかる発現用ベク
ターを構築することもできる。
の関連ペプチドを発現することのできるものであって、
通常の発現ベクターと同様に、抗生物質耐性、例えばテ
トラサイクリン耐性およびアンピシリン耐性のような適
当な選択マーカー及び大腸菌内で複製するための複製開
始点を有する。さらに、上記本発明のミラクリンコード
領域の下流には転写終結コドンが存在する。発現用ベク
ターとしては、例えばｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２その他の
市販の大腸菌用ベクターをそのまま利用することができ
る。あるいは、当業者であれば容易にかかる発現用ベク
ターを構築することもできる。
【００１６】上記発現ベクターは、本発明のミラクリン
コード領域を例えばホスホアミダイド法等の公知の方法
により合成し、これを大腸菌用の市販のベクター又は大
腸菌内で発現する公知の発現用ベクターにクローニング
することにより容易に作製することができる。例えば、
大腸菌トリプトファンプロモーターを有し、大腸菌中で
ＴｒｐＥを発現するｐＡＴ- ＴｒｐＥにミラクリンコー
ド領域をクローニングすることができる。
コード領域を例えばホスホアミダイド法等の公知の方法
により合成し、これを大腸菌用の市販のベクター又は大
腸菌内で発現する公知の発現用ベクターにクローニング
することにより容易に作製することができる。例えば、
大腸菌トリプトファンプロモーターを有し、大腸菌中で
ＴｒｐＥを発現するｐＡＴ- ＴｒｐＥにミラクリンコー
ド領域をクローニングすることができる。
【００１７】上記発現ベクターを用いた形質転換は従来
の大腸菌用ベクターによる形質転換と全く同様に行なう
ことができる。また、大腸菌の培養条件も従来と同様に
行なうことができる。これらの条件は当業者が適宜選択
し得るものである。
の大腸菌用ベクターによる形質転換と全く同様に行なう
ことができる。また、大腸菌の培養条件も従来と同様に
行なうことができる。これらの条件は当業者が適宜選択
し得るものである。
【００１８】上記ベクターで形質転換された大腸菌によ
り産生された本発明のミラクリン又はその関連ペプチド
の回収も従来方法で行なうことができる。即ち、例え
ば、菌体を遠心分離等で集め、周知のリゾチーム処理及
び／又は超音波処理等で菌体を破壊し、これを公知の方
法（特開昭６３- １８５３４９）により分離精製するこ
とにより行なうことができる。
り産生された本発明のミラクリン又はその関連ペプチド
の回収も従来方法で行なうことができる。即ち、例え
ば、菌体を遠心分離等で集め、周知のリゾチーム処理及
び／又は超音波処理等で菌体を破壊し、これを公知の方
法（特開昭６３- １８５３４９）により分離精製するこ
とにより行なうことができる。
【００１９】
【実施例】以下、本発明の好ましい一態様の一実施例を
図面に言及しながら説明するが、この発明は下記の実施
例に限定されるものではない。
図面に言及しながら説明するが、この発明は下記の実施
例に限定されるものではない。
【００２０】尚、下記の実施例において、それぞれの操
作は特に断りがない限り、Ｔ. Ｍａｎｉａｔｉｓ、”Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８２）, Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ記載の方法により行なっ
た。
作は特に断りがない限り、Ｔ. Ｍａｎｉａｔｉｓ、”Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８２）, Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ記載の方法により行なっ
た。
【００２１】実施例１ （１）クローニングベクターの構築 図２、３、４に示す通り、ミラクリン遺伝子をブロック
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に分割し、それぞれ約３０〜６
０塩基から成るＤＮＡフラグメントをアプライドバイオ
システムズ社の全自動ＤＮＡシンセサイザー、モデルＡ
３１０を用いてホスホアミダイド法により合成した。合
成した各フラグメントを電気泳動に供し目的鎖長のバン
ドをゲルから切り出すことにより分離、精製を行ない、
図５に示した通り、ブロック（Ａ）についてライゲーシ
ョン反応を行ない、約１５０塩基対から成る（Ａ）の部
分的ペプチドに対応する遺伝子ブロックを得た。さらに
ブロック（Ｂ）、（Ｃ）についても同様な操作を行なっ
た。
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に分割し、それぞれ約３０〜６
０塩基から成るＤＮＡフラグメントをアプライドバイオ
システムズ社の全自動ＤＮＡシンセサイザー、モデルＡ
３１０を用いてホスホアミダイド法により合成した。合
成した各フラグメントを電気泳動に供し目的鎖長のバン
ドをゲルから切り出すことにより分離、精製を行ない、
図５に示した通り、ブロック（Ａ）についてライゲーシ
ョン反応を行ない、約１５０塩基対から成る（Ａ）の部
分的ペプチドに対応する遺伝子ブロックを得た。さらに
ブロック（Ｂ）、（Ｃ）についても同様な操作を行なっ
た。
【００２２】得られた遺伝子ブロック（Ａ）、（Ｂ）、
（Ｃ）の５’及び３’末端はそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ部位- ＫｐｎＩ部位、ＫｐｎＩ部位-ＳａｌＩ部位及
びＥｃｏＲＩ部位- ＳａｌＩ部位を持ち、それぞれ独立
に上記の制限酵素で消化したクローニングベクターｐＵ
Ｃ１１９に挿入した（図６）。
（Ｃ）の５’及び３’末端はそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ部位- ＫｐｎＩ部位、ＫｐｎＩ部位-ＳａｌＩ部位及
びＥｃｏＲＩ部位- ＳａｌＩ部位を持ち、それぞれ独立
に上記の制限酵素で消化したクローニングベクターｐＵ
Ｃ１１９に挿入した（図６）。
【００２３】これを用いて大腸菌ＭＶ１１８４及びＭＶ
１１９０株を形質転換し、５０μｇ／mlのアンピシリ
ン、イソプロピル- β- Ｄ-チオ- ガラクトピレノシド
（以下ＩＰＴＧ）及び５- ブロモ- ４- クロロ- ３- イ
ンドリル- β- Ｄ-ガラクトシド（以下Ｘ- ｇａｌ）存
在下、ＬＢ培地にて一晩培養し、候補株を得た。
１１９０株を形質転換し、５０μｇ／mlのアンピシリ
ン、イソプロピル- β- Ｄ-チオ- ガラクトピレノシド
（以下ＩＰＴＧ）及び５- ブロモ- ４- クロロ- ３- イ
ンドリル- β- Ｄ-ガラクトシド（以下Ｘ- ｇａｌ）存
在下、ＬＢ培地にて一晩培養し、候補株を得た。
【００２４】得られた候補株よりプラスミドを抽出した
後、ジデオキシ法により挿入遺伝子断片の塩基配列を調
べ、設計した通りの配列を持つことを確認した。この目
的とするブロック（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）を含むクロー
ニングベクターを持つ菌株をそれぞれｐＵＣ- Ｍｉｒ
（Ａ）、ｐＵＣ- Ｍｉｒ（Ｂ）、ｐＵＣ- Ｍｉｒ（Ｃ）
と命名した。
後、ジデオキシ法により挿入遺伝子断片の塩基配列を調
べ、設計した通りの配列を持つことを確認した。この目
的とするブロック（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）を含むクロー
ニングベクターを持つ菌株をそれぞれｐＵＣ- Ｍｉｒ
（Ａ）、ｐＵＣ- Ｍｉｒ（Ｂ）、ｐＵＣ- Ｍｉｒ（Ｃ）
と命名した。
【００２５】さらに、上記ブロック（Ｂ）及び（Ｃ）の
間でライゲーション反応を行ない、ＫｐｎＩ及びＢａｍ
ＨＩにより消化してブロック（ＢＣ）を得た。該ブロッ
ク（ＢＣ）を上記制限酵素で消化したクローニングベク
ターｐＵＣ１１８に挿入した後、大腸菌ＭＶ１１８４株
を形質転換し、目的とするブロック（ＢＣ）を含むクロ
ーニングベクターを持つ菌株を得た（ｐＵＣ- Ｍｉｒ
（ＢＣ））。
間でライゲーション反応を行ない、ＫｐｎＩ及びＢａｍ
ＨＩにより消化してブロック（ＢＣ）を得た。該ブロッ
ク（ＢＣ）を上記制限酵素で消化したクローニングベク
ターｐＵＣ１１８に挿入した後、大腸菌ＭＶ１１８４株
を形質転換し、目的とするブロック（ＢＣ）を含むクロ
ーニングベクターを持つ菌株を得た（ｐＵＣ- Ｍｉｒ
（ＢＣ））。
【００２６】（２）融合タンパク質の発現ベクターの構
築 ｐＵＣ- ＭｉｒＡのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ
、ＫｐｎＩで消化し、約１５０塩基対のＭｉｒ（Ａ）
遺伝子断片を抽出し、精製した。また、ｐＵＣ-Ｍｉｒ
（ＢＣ）のプラスミドを制限酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ
で消化し、約４６０塩基対のＭｉｒ（ＢＣ）遺伝子断片
を抽出し、精製を行なった。
築 ｐＵＣ- ＭｉｒＡのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ
、ＫｐｎＩで消化し、約１５０塩基対のＭｉｒ（Ａ）
遺伝子断片を抽出し、精製した。また、ｐＵＣ-Ｍｉｒ
（ＢＣ）のプラスミドを制限酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ
で消化し、約４６０塩基対のＭｉｒ（ＢＣ）遺伝子断片
を抽出し、精製を行なった。
【００２７】これらＭｉｒ（Ａ）及びＭｉｒ（ＢＣ）遺
伝子断片を、別途、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで
消化した発現ベクターｐＡＴ- ＴｒｐＥ- ＴＧＦα（特
願昭６３- ２８９０８号記載）由来のラージフラグメン
トとＴ４ライゲースを用いて結合した。これを用い大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換し、５０μｇ／mlのアンピシ
リン存在下、ＬＢ培地にて一晩培養し、候補株を得た。
得られた候補株よりプラスミドを抽出し、制限酵素によ
り目的とする挿入遺伝子を持つ株を選択し、これをｐＡ
Ｔ- ＴｒｐＥ- Ｍｉｒ／ＨＢ１０１株とした（図７）。
伝子断片を、別途、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで
消化した発現ベクターｐＡＴ- ＴｒｐＥ- ＴＧＦα（特
願昭６３- ２８９０８号記載）由来のラージフラグメン
トとＴ４ライゲースを用いて結合した。これを用い大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換し、５０μｇ／mlのアンピシ
リン存在下、ＬＢ培地にて一晩培養し、候補株を得た。
得られた候補株よりプラスミドを抽出し、制限酵素によ
り目的とする挿入遺伝子を持つ株を選択し、これをｐＡ
Ｔ- ＴｒｐＥ- Ｍｉｒ／ＨＢ１０１株とした（図７）。
【００２８】（３）融合タンパク質の発現 構築した発現ベクターを含む上記ｐＡＴ- ＴｒｐＥ- Ｍ
ｉｒ／ＨＢ１０１株について以下の条件下で培養を行な
い組換えタンパク質の発現を調べた。すなわち、ｐＡＴ
- ＴｒｐＥ- Ｍｉｒ／ＨＢ１０１株を５０μｇ／mlのア
ンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で１
８時間培養した後、この菌液３０μｌを５０μｇ／mlの
アンピシリン、３０μｇ／mlの３- インドールアクリル
酸及び０. ５％カザミノ酸を含むＭ９培地３mlに移植
し、３７℃で１８時間培養した。培養後の菌液を遠心分
離して得られた菌体に１００ｍＭジチオスレイトールを
含むＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の試料
溶解用緩衝液を加え懸濁し、１００℃で５分間加熱する
ことにより菌体内のタンパク質を溶出させた。
ｉｒ／ＨＢ１０１株について以下の条件下で培養を行な
い組換えタンパク質の発現を調べた。すなわち、ｐＡＴ
- ＴｒｐＥ- Ｍｉｒ／ＨＢ１０１株を５０μｇ／mlのア
ンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で１
８時間培養した後、この菌液３０μｌを５０μｇ／mlの
アンピシリン、３０μｇ／mlの３- インドールアクリル
酸及び０. ５％カザミノ酸を含むＭ９培地３mlに移植
し、３７℃で１８時間培養した。培養後の菌液を遠心分
離して得られた菌体に１００ｍＭジチオスレイトールを
含むＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の試料
溶解用緩衝液を加え懸濁し、１００℃で５分間加熱する
ことにより菌体内のタンパク質を溶出させた。
【００２９】得られたタンパク質溶液の１５％ＳＤＳ-
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、クーマシー
ブリリアントブルーＲ- ２５０で染色したところ、分子
量２７, ０００付近に目的とするタンパク質の発現を確
認した。さらに、ミラクリンの抗血清を用いたイムノブ
ロット法により発現を調べたところ、３０μｇ／ｌ以上
のミラクリンの発現量が免疫学的活性として得られた。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、クーマシー
ブリリアントブルーＲ- ２５０で染色したところ、分子
量２７, ０００付近に目的とするタンパク質の発現を確
認した。さらに、ミラクリンの抗血清を用いたイムノブ
ロット法により発現を調べたところ、３０μｇ／ｌ以上
のミラクリンの発現量が免疫学的活性として得られた。
【００３０】発現したタンパク質は公知の方法により分
離精製した。
離精製した。
【００３１】実施例２ （１）直接発現ベクターの構築 前記ｐＡＴ- ＴｒｐＥ- Ｍｉｒ／ＨＢ１０１株を制限酵
素ＣｌａＩで消化することにより大腸菌ｔｒｐＥタンパ
ク質をコードする遺伝子断片を除いた。これを実施例１
の方法に従い培養し、候補株を得た。得られた候補株よ
りプラスミドを抽出し、制限酵素により目的とする挿入
遺伝子を持つ株を選択し、これをｐＡＴ- Ｍｉｒ／ＨＢ
１０１株とした。
素ＣｌａＩで消化することにより大腸菌ｔｒｐＥタンパ
ク質をコードする遺伝子断片を除いた。これを実施例１
の方法に従い培養し、候補株を得た。得られた候補株よ
りプラスミドを抽出し、制限酵素により目的とする挿入
遺伝子を持つ株を選択し、これをｐＡＴ- Ｍｉｒ／ＨＢ
１０１株とした。
【００３２】（２）直接発現ベクターの発現 構築した発現ベクターを含む上記ｐＡＴ- Ｍｉｒ／ＨＢ
１０１株について実施例１と同様の条件下で培養を行な
い組換えタンパク質の発現を調べた。発現して得られた
タンパク質溶液の１５％ＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行ない、クーマシーブリリアントブルーＲ
- ２５０で染色したところ、分子量２２, ０００付近に
目的とするタンパク質の発現を確認した。さらに、ミラ
クリンの抗血清を用いたイムノブロット法により発現を
調べたところ、３０μｇ／ｌ以上のミラクリンの発現量
が免疫学的活性として得られた。
１０１株について実施例１と同様の条件下で培養を行な
い組換えタンパク質の発現を調べた。発現して得られた
タンパク質溶液の１５％ＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行ない、クーマシーブリリアントブルーＲ
- ２５０で染色したところ、分子量２２, ０００付近に
目的とするタンパク質の発現を確認した。さらに、ミラ
クリンの抗血清を用いたイムノブロット法により発現を
調べたところ、３０μｇ／ｌ以上のミラクリンの発現量
が免疫学的活性として得られた。
【００３３】発現したタンパク質は公知の方法により分
離精製した。
離精製した。
【００３４】
【発明の効果】本発明により、味覚変革作用を有するミ
ラクリン及びその関連ペプチドの製造方法が提供され
た。本発明によると、従来のミラクルフルーツの果肉か
ら抽出する方法に比べ、短期間で安定的に、しかも大量
にミラクリン及びその関連ペプチドを製造することがで
きる。
ラクリン及びその関連ペプチドの製造方法が提供され
た。本発明によると、従来のミラクルフルーツの果肉か
ら抽出する方法に比べ、短期間で安定的に、しかも大量
にミラクリン及びその関連ペプチドを製造することがで
きる。
【００３５】
配列番号：1 配列の長さ：51 配列の型：核酸 配列 ATG AAA GCT ATC TTC GTT CTG AAA GGT TCT CTG GAC CGT GAC CCA GAA 48 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp Pro Glu 1 5 10 15 ＴＴＣ
51 Ｐｈｅ 配列番号：2 配列の長さ：588 配列の型：核酸 配列 GTC GAC TCT GCT CCA AAC CCA GTC TTG GAC ATT GAC GGT GAA AAG TTG 48 Asp Ser Ala Pro Asn Pro Val Leu Asp Ile Asp Gly Glu Lys Leu 1 5 10 15 ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＡＣ ＡＴＣ ＧＴＣ
ＣＣＡ ＧＴＴ ＴＴＧ ＡＧＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＧＧＴ 96 Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｇｌｙ 20 25 30 ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＴＡ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＧＣＴ ＡＣＣ ＡＣＴ
ＣＣＡ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＧＴ 144 Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ 35 40 45 ＣＣＡ ＣＣＴ ＡＧＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＡＡ ＡＣＣ ＡＧＡ ＡＡＧ
ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＧＡＣ ＡＧＡ ＣＣＡ 192 Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｒｏ 50 55 60 ＴＴＧ ＧＣＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＣＡ ＡＡＧ
ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＴ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＣＴ 240 Leu Ala Phe Phe Pro Glu Asn Pro Lys Glu Asp Val Val Arg Val Ser 65 70 75 ACC GAC TTG AAC ATC AAC TTC TCT GCT TTC ATG CCA TGT AGA TGG ACC 288 Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｔｈｒ ８０ 85 90 95 ＴＣＴ ＴＣＴ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＡＧ
ＴＡＣ ＧＡＣ ＧＡＡ ＴＣＴ ＡＣＴ ＧＧＴ ＣＡＡ 336 Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ 100 105 110 ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＡＣＣ ＡＴＣ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＡＡＧ
ＧＧＴ ＡＡＣ ＣＣＡ ＧＧＴ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＣＣ 384 Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ 115 120 125 ＡＴＣ ＴＣＴ ＴＣＴ ＴＧＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡ
ＴＴＣ ＴＧＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＴＴＣ ＴＡＣ 432 Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ 130 135 140 ＡＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＣＡ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＧＴ
ＧＧＴ ＴＣＴ ＴＧＴ ＡＡＧ ＧＴＴ ＡＡＧ ＴＧＴ 480 Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｃｙｓ 145 150 155 ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＴＡＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＣＡＡ
ＡＡＧ ＧＧＴ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＣＴ 528 Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｎ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ １６０ 165 170 175 ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＴＴＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＧＡＡ
ＴＴＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＡＣ ＴＴＣ 576 Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ 180 185 190 ＴＡＡＴＡＡＧＧＡＴ ＣＣ
588
51 Ｐｈｅ 配列番号：2 配列の長さ：588 配列の型：核酸 配列 GTC GAC TCT GCT CCA AAC CCA GTC TTG GAC ATT GAC GGT GAA AAG TTG 48 Asp Ser Ala Pro Asn Pro Val Leu Asp Ile Asp Gly Glu Lys Leu 1 5 10 15 ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＡＣ ＡＴＣ ＧＴＣ
ＣＣＡ ＧＴＴ ＴＴＧ ＡＧＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＧＧＴ 96 Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｇｌｙ 20 25 30 ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＴＡ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＧＣＴ ＡＣＣ ＡＣＴ
ＣＣＡ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＧＴ 144 Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ 35 40 45 ＣＣＡ ＣＣＴ ＡＧＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＡＡ ＡＣＣ ＡＧＡ ＡＡＧ
ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＧＡＣ ＡＧＡ ＣＣＡ 192 Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｒｏ 50 55 60 ＴＴＧ ＧＣＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＣＡ ＡＡＧ
ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＴ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＣＴ 240 Leu Ala Phe Phe Pro Glu Asn Pro Lys Glu Asp Val Val Arg Val Ser 65 70 75 ACC GAC TTG AAC ATC AAC TTC TCT GCT TTC ATG CCA TGT AGA TGG ACC 288 Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｔｈｒ ８０ 85 90 95 ＴＣＴ ＴＣＴ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＡＧ
ＴＡＣ ＧＡＣ ＧＡＡ ＴＣＴ ＡＣＴ ＧＧＴ ＣＡＡ 336 Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ 100 105 110 ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＡＣＣ ＡＴＣ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＡＡＧ
ＧＧＴ ＡＡＣ ＣＣＡ ＧＧＴ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＣＣ 384 Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ 115 120 125 ＡＴＣ ＴＣＴ ＴＣＴ ＴＧＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡ
ＴＴＣ ＴＧＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＴＴＣ ＴＡＣ 432 Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ 130 135 140 ＡＡＧ ＴＴＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＣＡ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＧＴ
ＧＧＴ ＴＣＴ ＴＧＴ ＡＡＧ ＧＴＴ ＡＡＧ ＴＧＴ 480 Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｃｙｓ 145 150 155 ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＴＡＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＣＡＡ
ＡＡＧ ＧＧＴ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＣＴ 528 Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｎ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ １６０ 165 170 175 ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＴＴＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＧＡＡ
ＴＴＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＡＣ ＴＴＣ 576 Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ 180 185 190 ＴＡＡＴＡＡＧＧＡＴ ＣＣ
588
【図１】本発明の発現ベクターにおけるミラクリンコー
ド領域付近の制限酵素地図。
ド領域付近の制限酵素地図。
【図２】ミラクリン遺伝子の一部であるブロック（Ａ）
をコードする遺伝子の塩基配列を示す図。
をコードする遺伝子の塩基配列を示す図。
【図３】ミラクリン遺伝子の一部であるブロック（Ｂ）
をコードする遺伝子の塩基配列を示す図。
をコードする遺伝子の塩基配列を示す図。
【図４】ミラクリン遺伝子の一部であるブロック（Ｃ）
をコードする遺伝子の塩基配列を示す図。
をコードする遺伝子の塩基配列を示す図。
【図５】本発明の発現ベクターの構築の操作を説明する
ための図。
ための図。
【図６】本発明の発現ベクターの構築の操作を説明する
ための図。
ための図。
【図７】本発明の発現ベクターの構築の操作を説明する
ための図。
ための図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 阪本 一央 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 三木 敬三郎 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 栗原 良枝 東京都世田谷区奥沢七丁目４番７号
Claims (7)
- 【請求項１】 ミラクリンのアミノ酸配列の全部又は一
部を有するタンパク質の遺伝子工学的手法による製造方
法。 - 【請求項２】 ミラクリンのアミノ酸配列の全部又は一
部を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を化学合
成し、該ＤＮＡ配列を発現用ベクターにクローニング
し、得られた発現ベクターで細胞を形質転換し、該形質
転換された細胞を培養し、その培養物から該タンパク質
を回収することを含む請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項３】 前記細胞が大腸菌である請求項２に記載
の製造方法。 - 【請求項４】 前記発現ベクターが、前記ＤＮＡ配列の
５′末端に大腸菌のタンパク質のアミノ酸配列の全部又
は一部をコードするＤＮＡ配列を更に含む請求項３に記
載の製造方法。 - 【請求項５】 前記の大腸菌のタンパク質が、トリプト
ファンオペロンのＴｒｐＥタンパク質である請求項４に
記載の製造方法。 - 【請求項６】 前記ＴｒｐＥタンパク質が、配列番号１
のアミノ酸配列を有する請求項５に記載の製造方法。 - 【請求項７】 前記ＤＮＡ配列が配列番号２の核酸配列
を有する請求項５又は６に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3245049A JPH0556793A (ja) | 1991-08-30 | 1991-08-30 | ミラクリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3245049A JPH0556793A (ja) | 1991-08-30 | 1991-08-30 | ミラクリンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0556793A true JPH0556793A (ja) | 1993-03-09 |
Family
ID=17127822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3245049A Pending JPH0556793A (ja) | 1991-08-30 | 1991-08-30 | ミラクリンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0556793A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112300256A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-02-02 | 珠海中科先进技术研究院有限公司 | 一种神秘果素重组蛋白及其表达与纯化方法 |
-
1991
- 1991-08-30 JP JP3245049A patent/JPH0556793A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112300256A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-02-02 | 珠海中科先进技术研究院有限公司 | 一种神秘果素重组蛋白及其表达与纯化方法 |
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