JPH08504585A

JPH08504585A - Ｄｎａ増幅

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Publication number: JPH08504585A
Application number: JP6514706A
Authority: JP
Inventors: トレールスヨルゲンセン，ステーン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-22
Publication date: 1996-05-21
Anticipated expiration: 2022-09-26
Also published as: JP3983798B2; EP0675959B1; NO952496L; DE69334006T2; CA2152371C; WO1994014968A1; ATE323167T1; DE69334006D1; AU5694494A; FI953079A; FI953079A0; CA2152371A1; FI120741B; AU679707B2; EP0675959A1; CN1114355A; DK0675959T3; CN1063488C; NO952496D0; DK153992D0

Abstract

(57)【要約】親細胞のゲノム内に存在するDNA配列Bをインビボにおいて増幅する方法であって、ａ）構造C-M-A-D｛ここで、A及びCが、増幅されるべきDNA配列Bに隣接するか又はそれと重複するかあるいはその配列Bの末端の中の１を構成するDNA配列Bのサブ配列であるかのいずれかであるゲノムDNA断片と相同であるDNA配列であって、その配列Cが、Aと比べたとき配列Bの反対の末端内に位置するものを表し、Dが、Bと比べたときCについて遠くに位置するゲノムDNA断片と相同であるDNA配列を表し、そしてＭが、選択マーカーをエンコードしているDNA配列を表す。｝を含んで成るDNA構築物をその細胞のゲノム内に組み込み、ｂ）上記DNA配列Mが、そのゲノム内に組み込まれている細胞であって、いずれかの方向において、構造A-B-C-M-A-Dを含んで成る細胞について選択し、そしてｃ）上記DNA配列B及びMのゲノム組み込みコピーの増加した数を得ている細胞を得るために、増加した選択圧の下で段階ｂ）において選択された細胞を増幅させる、を含んで成る方法。

Description

【発明の詳細な説明】 DNA 増幅発明の分野本発明は、細胞のゲノム内に存在するDNA配列をインビボにおいて増幅する方法であって、細胞がその増幅されたDNA配列の多コピーをゲノム内に宿し、そしてベクターが本法において使用されるべきDNA配列を宿すような方法に関する。さらに、本発明は、先に記載したような細胞を培養することによりポリペプチドを生産する方法にも関する。本発明の背景多数の天然の生物が有用な製品を生産することが発見されており、その大規模生産が研究及び商業目的のために望ましい。一旦このような製品が同定されれば、その製品の高生産に繋がる生産方法を開発するための努力がされる。組換えDN A技術に基く１つの広く使用される方法は、その製品をエンコードしている遺伝子をクローン化し、その遺伝子をその製品の発現を許容する好適な発現系に挿入し、そしてその製品の発現を導く条件下で染色体内に組み込まれるか又は染色体外の存在としてのいずれかにおいてその発現系を含んで成る好適な宿主を培養することである。しかしながら、このような方法を使用するための先行条件は、問題の遺伝子が同定され且つクローン化されることができ、そしてさらにその製品に好適な発現系及び宿主細胞が利用可能であることである。このような製品の生産に使用されることができる他のアプローチは、好適な条件下で天然にこの製品を生産する細胞又はこのような細胞の誘導体を培養することである。しかしながら、このような方法のしばしば認められる欠点は、その細胞が好適な生産生物ではないことであり、１つの理由は、このような細胞により生産される製品の量があまりに低く商業的に魅力的ではないということである。いずれの生産方法が使用されても、所定のタンパク質の生産レベルを増加させることができることが正常には望ましい。従って、例えば、強い発現シグナルの制御下にその製品をエンコードしている遺伝子を挿入することにより、又は問題の生産生物内にその遺伝子のコピーの数を増加させることにより、その生産を増加させることが行われている。この後者のアプローチは、マルチコピー・プラスミド中にその遺伝子を挿入することにより、しかしながら、これは一般的に問題の宿主細胞内で不安定である傾向があり、又はその遺伝子の多数のコピーをその生産生物の染色体に組み込むこと、一般的により魅力的であると考えられるアプローチ、により達成されることができる。なぜなら、その構築物の安定性が、その遺伝子がその生産生物内で安定して維持されることをより高く可能にする傾向があるからである。 EP 0 284 126及びEP 166 628は、その遺伝子の１以上のコピーをその染色体内に問題の遺伝子の少なくとも１のコピーを既に宿している原核生物細胞の染色体内に安定して組み込むための方法について開示している。EP 0 284 126に従えば、上記遺伝子を含んで成る宿主細胞は、その遺伝子の他のコピーを含んで成るDN A構築物により形質転換され、それにより、好適な選択手順の後に、その染色体内にその宿主細胞に致命的な内因性染色体配列により分けられた遺伝子の２コピーを含んで成り、それによりその組み込まれた遺伝子の安定的な維持を確保する細胞が得られる。 EP 166 628は、バチルス（Bacillus）株の染色体内で特定の遺伝子を増幅し、それにより、その遺伝子、その遺伝子の発現要素、及び”２倍化配列 ”と言われる２つの正に反復する配列の間に挿入された選択マーカーをエンコードしている遺伝子を含んで成るいわゆる”増幅性単位”を宿している細胞を得るための方法に関する。この遺伝子は、そのバチルスの染色体内に組み込まれ、そしてマーカー遺伝子、増幅されるべき遺伝子、及びその２倍化配列の中の１を、他方をそのバチルス細胞の染色体上に存在させながら、宿すプラスミド組み込みベクターにより、その細胞内に導入される。先に記載した方法の両方が、増幅されるべき遺伝子全体がその増幅方法において使用されるべきベクター内に挿入されることができるということを要求し、そしてそれ故、増幅されるべき遺伝子が単離され、そしてその方法において使用されるべきベクター上で利用可能である時にだけ、利用されることができる。本発明の簡単な開示本発明は、一般的に、細胞のゲノム上に存在するDNA配列を増幅する新規の方法であって、先に記載した方法と比べたとき、増幅されるべきDNA配列がその全体において利用可能であるという要求が全く存在しないという利点をもつような方法に関する。より特に、第一態様においては、本発明は、親細胞のゲノム内に存在するDNA 配列Bをインビボにおいて増幅する方法であって、ａ）構造C-M-A-D｛ここで、 Aが、増幅されるべきDNA配列Bに隣接するか又はそれを重複するかあるいはその配列Bの末端の中の１を構成するDNA配列Bの配列であるかのいずれかであるゲノムDNA断片と相同であるDNA配列を表し、 Cが、増幅されるべきDNA配列Bに隣接するか又はそれを重複するかあるいはその配列Bの末端の中の１を構成するDNA配列Bの配列であるかのいずれかであるゲノムDNA断片と相同であるDNA配列であって、Aと比べたとき配列B の反対の末端内に位置するものを表し Dが、Bと比べたときCについて遠くに位置するゲノムDNA断片と相同であるDNA 配列を表し、そして Mが、選択マーカーをエンコードしているDNA配列を表す。｝を含んで成るDNA構築物をその細胞のゲノム内に組み込み、ｂ）上記DNA配列Ｍが、上記配列Aと一緒に上記DNA配列Bの上流又は下流のいずれかでそのゲノム内に組み込まれている細胞であって、その細胞がいずれかの方向において、構造A-B-C-M-A-Dを含んで成るものについて選択し、そしてｃ）その親細胞に比べて上記DNA配列B及びMのゲノム組み込みコピーの増加した数を得ている細胞を得るために、上記DNA配列Mによりエンコードされた選択マーカーについての増加した選択圧の下で段階ｂ）において選択された細胞を増幅させる、を含んで成る方法に関する。親細胞のゲノム内への構造C-M-A-Dを含んで成るDNA構築物の組み込みは、好適な選択マーカーと一緒のDNA配列Bが２つの正反復DNA配列Aであってその中の１が問題のゲノム及びそのDNA構築物からの１から生じているものの間に位置するようなゲノム構造をもたらす。このような構造を含んで成る株がマーカーのための増加選択圧下から増幅されるとき、そのカルチャーは、その２つの正反復配列の間の遺伝子の２倍体、３倍体、及びより高い増幅を含む細胞について強化される。従って、問題のDNA配列のコピー数が、その細胞にとってあまりに重荷になるコピーの数である20、50、100以上の上限を構成することがもくろまれる。本発明の方法の使用により、その増幅されたDNAがマーカーMのための選択の非存在において全く安定であることが発見されている。本発明の増幅方法が、増幅されるべきDNA配列の全体が行われるべき方法のために利用可能であることが必要とされないという従来技術の方法を超える重要な利点をもつことが理解されよう。そのDNA配列の一部又はそのフランキング領域だけが知られることが必要である。これは、DNA単離及び配列決定法がここ十年間実質的に改善されてきたけれども、問題のDNA配列を単離し且つ配列決定することが未だ骨が折れ、そして実際、常に可能ではないということにおいて有利である。本文脈中、用語”ゲノム”は、正常には、親細胞の染色体を示すことを意図される。しかしながら、この用語は、その親細胞内に存在するいずれかの他のゲノムであってその中の例がプラスミド、例えば、その細胞内に存在する大きな安定したプラスミドを示すことも意図される。 DNA配列A、C及びDについて使用されるとき用語”相同な”は、これらの配列のいずれかとそのゲノムの対応部分との間の同一性の程度であって相同的組換えが起こるのに十分なものを示すことを意図される。好ましくは、DNA配列は、そのゲノムの対応部分と少なくとも８の連続塩基対についての同一性又は実質的同一性を示す。しかしながら、DNA配列は、より長い、例えば、数千ヌクレオチドまでを含むことができる。用語”フランキング”は、DNA配列A又はCがDNA配列Bまでに位置するがそれに延びていないゲノム配列と相同であることを示すことを意図される。用語”重複 ”は、DNA配列A又はCがDNA配列Bの端の中の１及びこの配列の直外の配列により構成されるゲノム配列の一部と相同であることを示すことを意図される。 DNA配列Dについて使用されるとき用語”Cについて遠くに位置する”は、その慣用の意味、すなわち、DNA配列Dが増幅されるべきDNA配列Bの位置に対して向かい合うDNA配列Cに相同なゲノム配列の側上に位置するゲノム配列に相同であることの内において理解されることを意図される。DNA配列CとDに相同なゲノム配列の間の距離は、CとDが数千塩基対の分離物に同一又は部分的に重複しているという状況から変化することができる。しかしながら、CとDの間のDNA配列は、本発明に係る方法が行われるとき、そのゲノムから最終的に消耗されるようになるであろう。他の態様においては、本発明は、そのゲノム内に構造M-BであってMが選択マーカーをエンコードしているDNA配列を表し、そしてBが所望のポリペプチドをエンコードしているDNA配列を表すものを含んで成るDNA配列の多コピーを含んで成る細胞であって、その構造M-Bの多コピーが２つの正反復配列間に位置するような細胞に関する。さらなる態様においては、構造C-M-A-Dを含んで成り、そしてゲノムDNA配列B の増幅における使用について意図されるDNA構築物であって、A、C、M、Dが先に示した意味をもつもの、並びにそのDNA構築物を宿すベクターに関する。最後に、本発明は、DNA配列Bによりエンコードされたポリペプチドを生産するための方法であって、ポリペプチドの生産を導く条件下でDNA配列Bの多コピーを組み込まれた先に定義したような細胞を培養し、そしてそのカルチャーから得られたポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関する。発明の詳細な説明本発明に係る組み込み段階ａ）は、いずれかの好適な方法により達成されることができ、その性質は、問題の生物及びDNA構築物に依存する。最初に、DNA構築物が細胞内に導入されなければならない。DNA構築物は、DNAの直接的導入のために本分野において公知の技術、例えば、エレクトロポレーション、コンピテント細胞の形質転換、プロトプラスト形質転換、又は弾道形質転換の使用により、そのまま導入されることができるが、好適には、細胞のゲノム内への DNA構築物の組み込みを与えることができるベクター上で行われる。ベクターは、有利には、問題のベクター及び親細胞に適したいずれかの技術であって上記のような形質転換、プロトプラスト融合、トランスフェクション、形質導入及び接合を含むものによりその親細胞内に導入されることができるプラスミド又はバクテリオファージである。親細胞内への導入の間、場合によりベクター誘導DNAとの組み合わせにおけるD NA構築物がその相同配列間に生じる相同的組換えによりゲノム内に組み込まれる。添付の図１中、ゲノムとDNA構築物との間の２つの組換え事件がどのようにそのゲノム内に構造A-B-C-M-A-Dを含む本発明に記載の細胞に生じることができるかが説明される。ベクターがDNA構築物の組み込みのために使用されるとき、そのベクターを受容した細胞についての選択は、本発明に係る方法の選択段階ｂ）に先立って行われることができ、それにより、そのDNA構築物の組み込みが生じるところの効率を改善する。この目的のために、特定の（許容）条件下で複製することができ、そして他の（非許容）条件下で複製することができないベクターを使用することができる。このベクターは、例えば、複製について温度感受性であるものであることができる。従って、このベクターは、上昇温度において複製することができないが未だその親細胞の成長を許容するものであることができる。細胞は、プラスミド複製を許容する温度において最初に培養され、そしてその後バクテリアのゲノム内への組み込みが生じた後、そのベクターがそのゲノム内に組み込まれない場合にその細胞から失われるようにプラスミドの複製を許容しない温度において培養される。さらにベクターは、選択マーカーを含んで成ることができる。この場合においては、非許容温度における培養は、DNA構築物及び選択マーカーを含む組み込みベクターを含む細胞だけが生存することを確保するための選択的条件下で、行われることができる。選択マーカーは、本分野において知られたいずれかのマーカー、例えば、その細胞に抗生物質耐性を付与し、独立栄養株に原栄養要求性付与し、又はその宿主の欠陥を補填する生成物をコーディングする遺伝子であることができる（例えば、dal ^-株内に導入されたdal遺伝子；B．Diderichsen（1986）参照）。これらの条件下で生存する細胞は、上記ベクターを含む細胞又は本発明に係るDNA構築物を含んで成るベクターが組み込まれている細胞でであろう。選択マーカーは、例えば、公知の源から切除され又はベクター、例えば、本発明に係る方法において使用されるべきDNA構築物の構築のために使用されるプラスミド上に存在することができる。本発明に係る方法の選択段階ｂ）においては、いずれかの方向において構造A- B-C-M-A-Dを含んで成る細胞についての選択が行われる。このような細胞は、ベクターがそのゲノム内に未だ存在する場合における単一の組み換え事件の結果であることができるであろうし、又は有利には、そのベクターがそのゲノム内に存在しない場合における２つの組換え事件の結果であることができるであろう。この２つの組換え事件は、２つの逐次的な単一の組換え事件、すなわち、第一が構造C-M-A-Dを含むベクターのゲノム内への組み込みからなり、第二がそのゲノムからのそのベクターの切除からなる、の結果であることができる。この法は、図２中に図示される。これから、断片Cを介しての組み込みその後の断片Dを介しての切除、又はこの反対は、本発明の構造A-B-C-M-A-Dを含むゲノムを与えるであろうことは明らかである。この選択は、DNA配列Mによりエンコードされた選択マーカーについての選択圧の下で細胞を成長させ、そして例えば、それにより選択された細胞を、制限酵素消化及びサザン・ブロッティングと組み合わされたゲル分析を含む慣用のDNA分析技術の使用により、又は構造A-B-C-M-A-Dの特徴的な部分に対応する好適なプライマーを使用したPCRの使用により、構造A-B-C-M-Dの存在について、分析することにより、達成されることができる。本発明の１の特定の態様においては、構造C-M-A-Dに加えて他の選択マーカー、Yを担持する温度感受性ベクターが使用される。このベクターは、許容温度においてその親細胞内に導入され、M又はYのいずれか又は両方について選択される。次に増殖が非許容温度において続けられ、そしてM又はYのいずれか又は両方についての選択が維持される。これらの条件下で成長する細胞は、（３つの断片C 、A又はDのいずれかにより）ゲノム内に組み込まれたベクターをもつであろう。その後、細胞は、選択圧の非存在中で許容温度において培養される。これは、プラスミドの複製、（再び３つの断片C、A又はDのいずれかによる）そのゲノムからの組み込まれたプラスミドの切除、及びその細胞からのプラスミドの最終的な損失、を許容するであろう。選択マーカーMを未だ含む細胞がここで選択され、そしてこのような細胞が、選択マーカーYの存在について、例えば、レプリカ・プレーティングによりスクリーンされる。このような細胞だけが、断片Cを介しての組み込みその後の断片Dを介しての切除、又はその反対により生ずることができ、そしてそのゲノム内に構造 A-B-C-M-A-Dを含む。本発明により組み込まれるべきDNA構築物内に存在するDNA配列Mは、例えば、本発明に係る方法において使用されるべきベクターにより場合により担持されるマーカーと接続した先に記載したようないずれかのタイプのいずれかの選択マーカーをエンコードすることができる。従って、DNA配列Ｍは、抗生物質耐性、例えば、カナマイシン、テトラマイシン、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールへの耐性、又は様々な重金属、例えば、セレン酸塩、アンチモン又は砒素塩に対する耐性をエンコードすることができる。本発明に係る方法の増幅段階ｃ）において得られるDNA配列B及びMのゲノムに組み込まれたコピーの増加数が、そのDNA配列BとMの周囲の（正反復）DNA配列A の最初の２つのコピーの間の連続する組換え事件の結果であるということが理解されよう。そのDNA配列Bの増幅を制御し、そしてそれ故、使用される選択マーカー及びその増幅段階ｃ）において使用される選択圧の強さに関して所定数のコピーに達することができる。この段階において得られるべきDNA配列B及びMのコピーの数についての理論的上限は全くないが、実施においては、コピー数はその宿主細胞に課される重荷により限定されるであろう。一旦、DNA構築物がその親細胞のゲノム内に組み込まれると、これがその細胞からのDNA構築物又はその部分の実質的な損失を伴わずに選択圧の非存在中で培養されることができるということに注目すべきである。これは、その組み込まれたDNAが自己複製することができず、そしてそれが組み込まれた宿主と一緒に複製されるという事実に帰されると信じられている。本発明に係る新規の方法が一般的に細胞又はゲノムのタイプに係わらずゲノム内に存在するDNA配列の増幅に利用可能であるということが理解されよう。その細胞の性質に関する唯一の制限は、その細胞が形質転換されることができ又は他の方法で外来DNAの導入を許容することができるものであるということである。細胞は、例えば、プラスミド又は染色体の形態において、１以上のゲノムを含んで成ることができる。例えば、親細胞は、微生物細胞、昆虫細胞、植物細胞、脊椎動物細胞、又は哺乳動物細胞であることができる。親細胞が微生物細胞であるとき、それは、原核生物又は真核生物細胞、例えば、バクテリア又は（酵母を含む）菌細胞であることができる。細胞がバクテリア細胞であるとき、それは、グラム陽性バクテリア、例えば、バチルス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）及びシュードモナス（Pseudomonas）の細胞、例えば、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュラント（Bacillus coagu lans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringien sis）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）の細胞、又はグラム陰性バクテリア、例えば、エシェリキア（Escherichia）及びシュードモナス（Pseudomonas）の細胞であることができる。バクテリア細胞の他の例は、古細菌（archaebacteria）、例えば、ピロコッカス（Pyrococcus）の細胞を含む。細胞が菌細胞であるとき、それは、酵母細胞、例えば、サッカロミセス（Sacc haromyces ）又はシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）の細胞、糸状菌の細胞、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、例えば、アスペルギルス・ニガー（A．niger）、アスペルギルス・ニジュランス（A．nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（A．oryzae）の細胞であることができる。増幅されるべきDNA配列Bが親細胞に生来のものであることができ又はあるいは親細胞に生来のものではないが（例えば、先に記載したタイプの）他の生物からクローン化されたもの、あるいは合成され、そしてその後本発明のDNA構造物の組み込みに先立っていずれかの便利な方法、例えば、交差により宿主染色体又は他の宿主担持ゲノム内に導入されたものであることができる。DNA配列Bは、それが全体として導入され、又は例えば、配列Bの構成的配列のその後の導入により問題の宿主ゲノム内で組み立てられることができる。この後者のアプローチは、そのDNA配列Bがそれが全体としてクローン化されることができない時に特定の用途を有する。 DNA配列Bは、いずれかの機能をもち又はエンコードしているものであることができる。例えば、DNA配列Bは、例えば、構成的又は調節的タンパク質又はポリペプチドをエンコードしているオープン・リーディング・フレームを含んで成ることができ、そして単一の遺伝子、遺伝子のクラスター又はオペロンであることができる。このDNA配列Bは、さらにそのオープン・リーディング・フレームからの発現に関連する１以上の調節シグナル、例えば、転写又は翻訳終止又は開始配列を含んで成ることができる。好ましくは、このDNA配列Bは、すべての必要な調節配列、例えば、プロモーター、ターモネーター、リボソーム結合部位、等を含むことができる発現可能遺伝子を含んで成る。正常には、増幅されるべきDNA配列Bは、所望の生成物、例えば、酵素、ホルモン、抗原性成分、免疫活性タンパク質又はペプチド、成長因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、血液タンパク質、等、言い換えれば、いずれかの種類の工業的に有用な製品であってその生産が望まれているものをエンコードしているものである。問題の酵素の例は、澱粉分解、脂質分解及びタンパク質分解の酵素、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、等を含む。特に、そのDNA配列Bがプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ガラクトシダーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルコース・イソメラーゼ、タンパク質ジスルフィド・イソメラーゼ、CGT’ase（シクロデキストリン・グルコノトランスフェラーゼ）、グルコース・オキシダーゼ、グルコジル・トランスフェラーゼ、又はキシラナーゼをエンコードしていることが好ましい。他の有用な製品の例は、インシュリン-様成長因子、インシュリン、ヒト又はウシ成長ホルモン、ヒト血液凝集因子、インターロイキン、tPA、等を含む。あるいは、このDNA配列Bは、生合成経路をエンコードしている１以上の遺伝子、細胞の転写、翻訳又はタンパク質分泌装置の要素、細胞内の調節因子又は金属耐性をエンコードしている１以上の遺伝子（例えば、シグマ因子又は原核生物細胞のsec遺伝子）を含んで成ることができ、又はDNA配列Bは、その親細胞の独立栄養突然を補填することができる。先の開示から、DNA配列A及びCがDNA配列Bと重複し又は隣接するいずれかのゲノム配列と相同であることができるということが理解されよう。DNA配列Bが遺伝子であるとき、DNA配列A又はC は、有利には、そのDNA配列Bのコーディング部分の上流の完全又は部分的プロモーター配列と相同であることができる。このような構築物の例を以下の実施例１中に示す。本発明に係る方法において使用されるDNA構築物は、本分野において公知方法及び酵素を使用する一連の遺伝子操作を通じて合成されることができる。典型的には、DNA配列A、C及びDがそれと相同であるゲノム配列のそれぞれが、慣用のDN A分析法により同定される。例えば、cDNA又はゲノム・ライブラリーを、問題の生物から調製し、そして増幅されるべきDNA配列Bをその中で同定することができる。DNA配列Bの少なくとも１部が既知であるとき、そのDNA配列Bを、例えば、標準的な技術（Sambrook et al.，1989参照）に従ってそのDNA配列Bの一部に対して合成されたオリゴヌクレオチド・プローブを使用する慣用のハイブリダイゼーション手順により、又はより好ましくは、そのDNA配列Bの既知部分に基づいて調製した変性オリゴヌクレオチド・プローブを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用により、陽性クローンについてのスクリーニングにより、同定することができる。例えば、この PCRは、米国特許第4,683,202号中に又はR.K．Saiki et al．（1988）により記載された技術を使用して行われることができる。 DNA配列Bのヌクレオチド配列が未知であり、そしてその発現生成物が既知であるとき、ある者は、その製品の活性についてcDNA又はゲノム・クローンをスクリーンし、そしてそれにより、その活性がそこから発現されることろのクローンを同定することができる。その後、そのクローンのDNAの一部を単離し、そして配列決定し、そしてそのDNA配列B又はその部分の位置を同定する。増幅されるべきDNA配列は、突然変異の方法により、例えば、B の生成物を生産するためのその細胞の能力を破壊するトランスポゾン挿入により、同定されることができ、そしてDNA配列Bの一部は、例えば、そのトランスポゾン配列に対応するプライマーを使用する逆PCRにより、決定されることができる。この方法において、Bの末端及びフランキング領域を含んで成るDNA配列が、B が部分的又はその全体としてのいずれかにおいてクローン化されることがきない場合でさえ、決定されることができる。 DNA配列A、C及びDを調製することができるためには、（プローブ又はPCRプライマーの特異的結合を許容するのに少なくとも十分な配列データ、例えば、12ヌクレオチドを含む）Bの少なくとも５’と３’末端が既知でなければならない。一旦、これらの末端の配列が同定されれば、DNA配列Bの両末端に隣接し又はこれと重複するDNAが、例えば、ハイブリダイゼーション又はPCR分析により同定され、そしてその後配列決定されることができる。これらの配列に基づき、DNA配列A 、C及びDが調製される。 DNA A、C、D及びMは、合成的に調製されることができ、又は例えば、先に記載した方法の使用によりゲノム又はcDNAライブラリーから単離されたcDNA又はゲノム起源を有することができる。あるいは、本発明に係るDNA構築物のDNA配列は、確立された標準的な方法、例えば、Beaucage and Caruthers（1981）により記載されたホスホアミジット法、又はMatthes et al．（1984）により記載された方法により合成的に調製されることができる。このホスホアミジット法に従って、オリゴヌクレオチドが、例えば、自動DNAシンセサイザー内で合成さて、精製され、アニールされ、リゲートされ、そして適当なベクター内でクローン化される。最後に、このDNA構築物は、ゲノムと合成の混合の、合成とcDNAの混合の、又はゲノムとcDNAの混合の起源であって、（適宜）合成の、ゲノムの又はcDNAの起源の断片、完全な組換えDNA分子の様々な部分に対応する断片を、標準的な技術に従ってリゲートすることにより調製されたものを有することができる。先に示したように、DNA配列Bは、有利には、問題のポリペプチドをコードしているものであり、そしてそれ故、本発明は、さらに、問題のポリペプチドの製造方法であって、その中でBが問題のポリペプチドをエンコードしているところのゲノム内に構造M-Bを含んで成るDNA配列の多コピーを含む本発明に係る細胞を、そのポリペプチドの製造を誘導する条件下で培養し、そしてそのカルチャーから得られたポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関する。本法により製造されたポリペプチドは、先に列記した製品の中のいずれか、例えば、酵素、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ又はリパーゼであることができる。本発明を、さらに添付図面中に説明する。ここで、図１は、ゲノムと本発明に係るDNA構築物との間の２つの組換え事件であってそのゲノム内に構築物A-B-C-M-Dを含む細胞をもたらすものについて説明している。図２は、２つの逐次的な単一の組換え事件の結果である２つの組換え事件であって、第一が構造物C-M-A-Dを含むベクターのゲノム内への組み込みから成り、第二が本発明に係る構造物A-B-C-M-A-Dを含むゲノムをもたらすそのゲノムからのそのベクターの切除から成るものを説明している。図３は、プラスミドpDN1981の制限マップであり、図４は、プラスミドpSJ1985の制限マップであり、図５は、プラスミドpSJ2024の制限マップであり、図６は、プラスミドpSJ980の制限マップであり、図７は、プラスミドpSJ1926の制限マップであり、図８は、プラスミドpSJ2059の制限マップであり、そして図９は、実施例１中に言及したゲノム・マップ及び組み込み事件を説明しており、ここで、 Aが、B．licheniformis染色体内のamyL遺伝子を表し、 Bが、プロモーター断片（ooooooo）を介しての組み込みを表し、 Cが、’amyL断片（コーディング配列**********の５’部分）を介しての組み込みを表し、 Dが、（コーディング配列xxxxの下流）下流amyL断片を介しての組み込みを表し、 Eが、コーディング配列（xxx）の下流の相同性を介しての組み込み体タイプC からのプラスミドの切除を表し、 Fが、（２つのプロモーター領域ooooooを最初に介しての）P-amyL-kanB領域の増幅を表す。本発明を、さらに以下の実施例中に説明する。本実施例は、いずれの方法によるかを問わず、請求されるものとして本発明の範囲を限定することを意図していない。材料及び方法株：バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）SJ1904は、WO 93/10 249（その内容を引用により本明細書中に取り込む。）の実施例６中に記載されているようにプラスミドpSJ1755の組み込み/切除により株SJ1707から誘導された α−アミラーゼ生産株である。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）DN1885：B．subtilis168のamy E 、amy R2、spo ⁺、Pro⁺誘導体、（Diderichsen et al.，1990）。培地： TY： Trypticase 20 g/l 酵母エキス 5 g/l FeCl₂・４H₂O 6 mg/l MnCl₂・４H₂O 1 mg/l MgSO₄・７H₂O 15 mg/l pH 7.3 BPX：ポテト澱粉 100 g/l 大麦粉 50 g/l BAN 5000 SKB 0.1 g/l ナトリウム・カゼイネート 10 g/l 大豆粉 20 g/l Na₂HPO₄・12H₂O 9 g/l Pluronic 0.l g/l LB寒天：バクト-トリプトン 10 g/l バクト酵母エキス 5 g/l NaCl 10 g/l バクト寒天 15 g/l NaOHによりpH7.5に調整一般的方法プラスミドを構築するために使用した実験技術は、組換えDNA技術の分野における標準的な技術であった。Sambrook et al．（1989）参照。制限エンドヌクレーゼをNew England Biolabs及びBoehringer Mannheimから購入し、そして製造者により推奨されるように使用した。T4 DNAリガーゼをNew E ngland Biolabsから購入し、そして製造者により推奨されるように使用した。すべての株からのプラスミドDNAの調製をKieser，1984により記載された方法により行った。バチルス・サブチリス（B．subtilis）の形質転換コンピテント細胞をYasbin et al.，1975により記載されたように調製し、そして形質転換した。バチルス・リケニフォルミス（B．licheniformis）の形質転換プラスミドをAkamatzu，1984により記載されたようにポリエチレン・グリコール-仲介プロトプラスト形質転換によりバチルス・リケニフォルミス（B．lichen iformis）内に導入した。アミラーゼ活性を、供給者により記載されたようにPharmacia Di 実施例実施例１アミラーゼ・コーディング遺伝子の増幅本実施例は、バチルス・リケニフォルミス（B．licheniformis）株SJ1904の染色体中に存在するアミラーゼ・コーディング遺伝子の増幅について説明する。本実施例に従って構築した株は、その染色体内に以下の順番で：１）アミラーゼ・プロモーター、２）アミラーゼ構成遺伝子、３）カナマイシン耐性遺伝子、及び４）アミラーゼ・プロモーターの他のコピー、を含むものである。この場合におけるアミラーゼ・プロモーターの２つのコピーは、正に反復したDNA配列Aとして働く。カナマイシンの増加レベルにおける成長のための選択は、（プロモーターを含む）アミラーゼーコーディング遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子の増幅を導くことが示されている。プラスミド構築すべてのプラスミドを、カナマイシン耐性（10μg/ml）について選択して、バチルス・サブチリス（B．subtilis）DN1885内で構築した。 pDN1981（図３）は、バチルス・リケニフォルミス（B．licheniformis）α− アミラーゼ（amyL）遺伝子を含み、そしてJorgensen et al.，1990により記載されている。 pSJ1985（図４）は、amyLプロモーター（P_amyL）、以降の、そのamyLターミネーター配列の直下流に元々位置した210塩基対の断片を含む。この断片は、プライマーLWN3226+LWN3223によりpDN1981からPCR増幅され（表１）、NdeI及びHindI IIにより消化され、そしてpDN1981からの4kb NdeI-HindIII断片にリゲートされた。 pSJ2024（図５）は、pE194（Horinouchi and Weisblum，1982b）に基く温度感受性プラスミド上にプロモーターと下流断片の上記組み合わせを含む。これは、 pSJ980の4.9 kb BglII-HindIII断片へのpSJ1985からの1.7 kb BglII-HindIII断片のリゲーションにより構築された（図６）。pSJ980は、WO 93/10249中に記載されている。 pSJ1926（図７）は、そのターミネーター配列を含むamyL遺伝子を含むが、そのターミネーターの下流の配列を欠失している（pSJ1985上に含まれる下流210塩基対断片はそれ故pSJ1926上に存在しない。）。pDN1981からの0.5kb断片を、プライマーLWN3224+LWN3227によりPCR増幅し（表１）、SalI及びHindIIIにより消化し、そしてpDN1981からの5.2 kb SalI-HindIII断片にリートしてpSJ1926を得る。PCR増幅により得たpSJ1926のSalI-HindIII断片は配列決定されており、そしてPCR誘導突然変異を全く含んでいない。 pSJ2059（図８）は、ターミネーター配列、カナマイシン耐性遺伝子、amyLプロモーター、及び最後にそのamyLターミネーターから下流の断片であって全て温度感受性起点上にあるものをちょうど含むamyL遺伝子の１kb 断片を含む。pSJ1926をEcoRI及びKpnIにより消化し、そして上記１kb断片をpSJ2 024内のEcoRIとKpnIの間に挿入してpSJ2059を得た。バチルス・リケニフォルミス（B．licheniformis）の形質転換 pSJ2059を、プロトプラスト形質転換によりバチルス・リケニフォルミス（B．licheniformis）SJ1904内に導入して、エリスロマイシン耐性（５ μg/ml）について選択した。このようにして得た１つの形質転換体は株SJ2127であった。組み込み SJ2127を10μg/mlカナマイシンを含むLBプレート上に塗抹し、そして50℃においてインキュベートした。pSJ2059が複製について温度感受性であるので、このプラスミドの染色体組み込みコピーを含む細胞だけがコロニーを生じるであろう。 pSJ2059は、SJ1904内の染色体amyL領域に相同な３つの異なる領域を含み、そして組み込みはこれらの３つの領域のいずれかにおける組換えにより可能である。これは、その染色体が図９、B、C又はD中に示すように見られるであろう株を与えるであろう。図９B中におけるように組み込まれたプラスミドは、所望の株を与えるように切除されることができないであろう。図９C中におけるように組み込まれたプラスミドは、切除が下流断片における組換えにより生じる場合に所望の株を与えることができるであろう。図９D中におけるように組み込まれたプラスミドは、切除がamyL構成的遺伝子断片における組換えにより生じる場合に所望の株を与えることができるであろう。 50℃プレートからの８コロニーを、プライマーLWN3208+LWN3554を使用してPCR 増幅によりチェックした（表１）。反応を、TY培地中に細胞を再懸濁し、そして煮沸することにより得た材料上で直接的に行った。プライマーの位置を図９、B 、D及びE上に示す。 PCR増幅された断片は、B-タイプ組み込み体からは全く得られるはずがない。一方、C-タイプは、2.7kb断片を与えるはずであり、そしてD-タイプは、7.5kb断片を与えるはずである。８コロニーの中の５から、2.7kb断片を観察した。これは、これらの場合における組み込みがamyL構成的遺伝子断片を介して生じてC-タイプの組み込み体を与えたということを示している。次に、これらをTY培地中で30℃において増殖させ、そのプラスミドの切除及び損失を許容した。TY培地中での３回移した後、Kana^R Erm^Sコロニーをレプリカ・プレーティングにより発見した。エリスロマイシン感受性がそのプラスミドの損失を示している。2.7kb断片は、図９E中に示す結果を与える、切除がその下流断片における組換えにより生じた場合に予想されるように、これらのコロニーからのPCR増幅により、未だ生産されることができるであろう。５つの個々の50℃コロニーのそれぞれから得た１つの株を、SJ2147-215 1として保存した。増幅株SJ2148及びSJ2150内のα-アミラーゼ（amyL）+カナマイシン耐性遺伝子を以下の手順により増幅した：上記株を、10ml TY培地+10μg/mlカナマイシン中でインキュベートし、そして 37℃において一夜振とうした。20、50、100、及び200μg/mlカナマイシンを含む新たな10mlカルチャーを、100μｌの10μg/mlカルチャーにより接種し、そして3 7℃において一夜振とうした。500、1000、1500、2000及び2500μg/mlカナマイシンを含む10mlカルチャーを、100μｌの200μg/mlカルチャーにより接種した。その2000及び2500μg/mlのカルチャーを、４日間インキュベートし、その他を一夜培養した後収穫した。すべてのカルチャーのアリコットを15％グリセロール中で冷凍し、そして細胞を、染色体DNAの調製のために収穫した。先の株からの染色体DNAをBglIIにより消化し、これは、増幅されたDNAから誘導された4.1kb断片を与えるはずである（図９F参照）。この断片は、10μg/mlカナマイシンにおいて選択された株においてさえEtBr-染色されたゲル内で可視であり、20及び50μg/mlにおいてだんだん顕著になり、そして株の休止において高いレベルにおいて留まる。増幅の収量効果 BPX培地を入れた振とうフラスコを上記グリセロール-冷凍カルチャーから直接的に接種し、そして300rpmにおいて37℃において振とうした。増幅された株により得られたα-アミラーゼ収量を、株SJ1904により得られた収量と比較した。増幅された株のすべてがその親株が生産するよりも多くのα-アミラーゼを生産することは明らかである。実施例２ CGTaseコーディング遺伝子の増幅本実施例は、サイクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼをコーディングしている遺伝子（cgtA）の増幅について説明する。この遺伝子は、元々サーモアナエロバクター（thermoanaerobacter）種からクローン化され、そしてバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）株の染色体内の１つのコピー内に挿入され、その株の内因性アルファーアミラーゼ遺伝子（amyL）を置き換える。このCGTase遺伝子は、本法において使用されたプラスミド上のアルファ -アミラーゼ・プロモーター及びアルファーアミラーゼ・シグナル・ペプチドの有効な突然変異体バージョンと組み合わせられ、そしてこの組換え構築物によるバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）の形質転換は、自発的組換え事件が野性型amyLプロモーターの制御下でそのamyL-cgtA遺伝子をその染色体に移すときにだけ成功した。次に、その後の組換え段階を、その染色体amyL -cgtA遺伝子の前に突然変異体プロモーターを導入するために使用した。とりわけ本実施例中に使用された株SJ1707をもたらしたこの研究は、WO 93/10249及びW O 93/10248中に記載されている。本発明者は、突然変異体プロモーターから発現されたamyL-cgtA遺伝子を含むプラスミドによりバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）の形質転換体を得ることができなかったので、その染色体内のこの発現カセットの増幅は、１段階におけるカセット全体の導入を必要とする方法により不可能であったが、本発明において記載された方法により可能であった。本実施例に従って構築された株は、その染色体内に以下の順番で：１）突然変異体amyLプロモーター、２）amyL-cgtA遺伝子、３）カナマイシン耐性遺伝子、及び４）突然変異体amyLプロモーターの他のコピー、を含むものである。この場合におけるamyLプロモーターの２つのコピーは、正に反復されたDN A配列Aとして働く。カナマイシンの増加レベルにおける成長のについての選択は、その突然変異体プロモーター、及びそのカナマイシン耐性遺伝子を含むamyL-cgtA遺伝子の増幅を導くことが示された。 SJ1707の染色体は、そのamyL-cgtA構築物に対し遠くのamyL遺伝子の断片を含む（WO 93/10249参照）。それ故、プラスミドpSJ2059は、それが実施例１中にいてバチルス・リケニフォルミス（B．licheniformis）のアミラーゼ遺伝子の増幅のために使用されたのと同一のやり方で株SJ1707の増幅可能な誘導体を構築するための道具として使用されることができた。形質転換： pSJ2059をバチルス・リケニフォルミス（B．licheniformis）SJ1707内にプロトプラスト形質転換により導入し、30℃においてエリスロマイシン耐性（５μg/ ml）について選択した。得られた１つの形質転換体をSJ2285として保存した。組み込み： SJ2285を、10μg/mlカナマイシンによりLBプレート上に塗抹し、そして50℃において一夜インキュベートした。 50℃において形成した10コロニーを、30℃においてTY培地中で増殖させて組み込まれたプラスミドの切除及び損失を許容した。TY培地中で１回移した後、Kana^R erm^Sコロニーが、10組み込み体コロニーの中の７から得られたカルチャーのレプリカ・プレーティングにより発見された。（実施例１中のものと同じ）増幅は、これらの株の中の４により達成され、20 00μg/mlカナマイシン中で最終的に成長する単離物がこれらの４の中の３から得られた。１つの増幅されたシリーズを保存した：カナマイシン濃度 μg/ml 株 10 SJ2322 20 SJ2323 50 SJ2324 100 SJ2325 200 SJ2326 500 SJ2327 1000 SJ2328 1500 SJ2329 2000 SJ2330 SJ2323-SJ2326を、SJ2322から接種し（10ml中100μl）、そしてSJ2327-SJ2330 をSJ2326から接種した。すべてのカルチャーのアリコットを15%グリセロール中で冷凍し、そして細胞を染色体DNAの調製のために収穫した。 EcoRIにより消化された株SJ2324及びSJ2328からの染色体DNAのサザン分析は、 amyL-cgtA+カナマイシン耐性遺伝子の増幅から予想されるような5.5kb断片を現した。株SJ2328からの5.5kb断片は、そのEtBr-染色されたアガロース・ゲル中に既に非常に顕著であった。増幅の収量効果 BPX培地を含む振とうフラスコを、グリセロール-冷凍カルチャアーから直接的に接種し、そして37℃において300rpmにおいて振とうした。増幅された株により得られたCGTase収量を、株SJ1707により得られた収量と比較した。増幅された株がその親株が生産するよりも多くのCGTaseを生産することは明らかである。カナマイシンを含まない振とうフラスコからの幾つかの株の安定性を、澱粉を含むLBプレート上へのプレーティングによりチェックし、そして環（halo）形成について等級付けした。遺伝子の不安定性の最終的な効果は、澱粉プレート上に環を作り出すことができないであろうCGTase陰性の分離物をもたらすCGTase遺伝子のまさに最後のコピーの損失であろう。 SJ2322：100/100positive（exp．A） 300/300positive（exp．B） SJ2324：100/100positive（exp．A） 300/300positive（exp．B） 120/120positive（exp．C） SJ2328：200/200positive（exp．A） 500/500positive（exp．B） 120/120positive（exp．C）調査された株のいずれも、テストされた条件下でCGTase遺伝子の最後のコピーを失っていなかった。文献 Jorgensen et al．（1990）．In vivo genetic engineering：homologous recom bination as a tool for plasmid construction．Gene 96，37-41． Horinouchi，S．and Weisblum，B．（1982b）．Nucleotide sequence and func tional map of pE194，a plasmid that specifies inducible resistance to ma crolide，lincosamide，and streptogramin type B antibiotics．J．Bacterio l.，150，804-814． B．Diderichsen，（1986），Bacillus：Molecular Genetics and Biotechnology Applications， A．T．Ganesan and J．A．Hoch，Eds.，Academic Press，pp．3 5-46． Sambrook et al．（1989）Molecular cloning：a laboratory manual．2nd edit ion Beaucage et al.，Tetrahedron Letters 22，1981，pp．1859-1869，Matthes et al.，EMBO Journal 3，1984，pp．801-805 Saiki et al．（1988)，Science 239，1988，pp．487-491． Diderichsen et al．（1990）．Cloning of aldB，which encodes α acetolact ate decarboxylase，an exoenzyme from Bacillus brevis．J．Bacteriol.，172 ，4315-4321． Kieser，T．（1984），Factors affecting the isolation of CCC DNA from Str eptomyces lividans and Escherichia coli．Plasmid 12，19-36． Akamatzu et al．（1984），An improved method of protoplast regeneration for Bacillus Species and its application to protop last fusion and trans formation．Agric．Biol．Chem．48，651-655． Yasbin et al．（1975），J．Bacteriol．121，296-304．配列リスト（１）一般情報：（i）出願人：（A）名称：ノボノルディスクA/S （B）街： Novo Alle （C）市： Bagsvaerd （E）国：デンマーク（F）郵便番号（ZIP）：DK-2880 （G）電話：+45 44448888 （H）ファックス：+45 4449 3256 （I）テレックス：37304 （ii）発明の名称：DNA増幅（iii）配列の数：６（iv）コンピュータ読み込み形態：（A）媒質タイプ：フロッピー・ディスク（B）コンピュータ：IBM PC互換性（C）オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25 （EPO）（２）配列番号１ついての情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：20塩基対（B）タイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：DNA（ゲノム）（iii）ハイポセティカル：無し（iii）アンチ−ンス：無し（v）断片タイプ：内部（xi）配列：配列番号１（２）配列番号２についての情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：36塩基対（B）タイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：DNA（ゲノム）（iii）ハイポセティカル：無し（iii）アンチ−センス：無し（v）断片タイプ：内部（xi）配列：配列番号２：（２）配列番号３についての情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：36塩基対（B）タイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：DNA（ゲノム）（iii）ハイポセティカル：無し（iii）アンチ−センス：無し（v）断片タイプ：内部（xi）配列：配列番号３：（２）配列番号４についての情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：20塩基対（B）タイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：DNA（ゲノム）（iii）ハイポセティカル：無し（iii）アンチ−センス：無し（v）断片タイプ：内部（xi）配列：配列番号４：（２）配列番号５についての情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：17塩基対（B）タイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：DNA（ゲノム）（iii）ハイポセティカル：無し（iii）アンチ−センス：無し（v）断片タイプ：内部（xi）配列：配列番号５：（２）配列番号６についての情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：47塩基対（B）タイプ：核酸（C）鎖：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子タイプ：DNA（ゲノム）（iii）ハイポセティカル：無し（iii）アンチ−センス：無し（v）断片タイプ：内部（xi）配列：配列番号６：

Claims

【特許請求の範囲】１．親細胞のゲノム内に存在するDNA配列Bをインビボにおいて増幅する方法であって、ａ）構造C-M-A-D｛ここで、 Aが、増幅されるべきDNA配列Bに隣接するか又はそれと重複するかあるいはその配列Bの末端の中の１を構成するDNA配列Bのサブ配列であるかのいずれかであるゲノムDNA断片と相同であるDNA配列を表し、 Cが、増幅されるべきDNA配列Bに隣接するか又はそれを重複するかあるいはその配列Bの末端の中の１を構成するDNA配列Bのサブ配列であるかのいずれかであるゲノムDNA断片と相同であるDNA配列であって、Aと比べたとき配列Bの反対の端内に位置するものを表し Dが、Bと比べたときCについて遠くに位置するゲノムDNA断片と相同であるDNA 配列を表し、そして Mが、選択マーカーをエンコードしているDNA配列を表す。｝を含んで成るDNA構築物をその細胞のゲノム内に組み込み、ｂ）上記DNA配列Ｍが、上記配列Aと一緒に上記DNA配列Bの上流又は下流のいずれかでそのゲノム内に組み込まれている細胞であって、いずれかの方向において、構造A-B-C-M-A-Dを含んで成る細胞について選択し、そしてｃ）その親細胞に比べて上記DNA配列B及びMのゲノム組み込みコピーの増加した数を得ている細胞を得るために、上記DNA配列Mによりエンコードされている選択マーカーについての増加した選択圧の下で段階ｂ）において選択された細胞を増幅させる、を含んで成る方法。２．DNA構築物が好適なベクター上で行われる、請求項１に記載の方法。３．ベクターがプラスミド又はファージである、請求項２に記載の方法。４．ベクターが複製について温度感受性である、請求項２又は３に記載の方法。５．ベクターが選択マーカーをエンコードしているDNA配列をさらに担持している、請求項４に記載の方法。６．親細胞が微生物細胞、植物細胞、昆虫細胞、脊椎動物細胞、又は哺乳動物細胞である、先の請求項のいずれかに記載の方法。７．親細胞がバクテリア又は菌の細胞である、請求項６に記載の方法。８．バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア、例えば、バチルス（Bacillus）又はストレプトミセス（Streptomyces）の細胞又はグラム陰性バクテリア、例えば、エシェリキア（Escherichia）の細胞であり、菌細胞が酵母細胞、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）の細胞、又は糸状菌の細胞、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）の細胞である、請求項７に記載の方法。９．DNA配列Bがオープン・リーディング・フレームを含んで成る、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。１０．DNA配列Bがさらに１以上の調節シグナルを含んで成る、請求項９に記載の方法。１１．DNA配列Bが単一遺伝子、遺伝子のクラスター又はオペロンである、請求項９又は10に記載の方法。１２．DNA配列Bが親細胞に対し異種であり、そして微生物、植物、昆虫、脊椎動物又は哺乳動物から得られる、請求項８〜11のいずれかに記載の方法。１３．DNA配列Bがバクテリア又は菌から得られる、請求項12に記載の方法。１４．DNA配列Bが酵素、ホルモン、抗原性成分、免疫活性タンパク質又はペプチド、成長因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、血液タンパク質をエンコードしている、請求項８〜13のいずれかに記載の方法。１５．DNA配列Bが生合成経路をエンコードしている１以上の遺伝子、細胞の転写、翻訳又はタンパク質分泌装置の要素、細胞内の調節因子作用又は金属耐性をエンコードしている１以上の遺伝子を含んで成り、あるいはBがその宿主細胞の独立栄養突然変異を補填する、請求項８〜14のいずれかに記載の方法。１６．DNA配列Bが遺伝子であり、そしてDNA配列AがそのDNA配列Bのコーディング部分の上流の完全な又は部分的なプロモーター配列に相同である、請求項１に記載の方法。１７．DNA配列Mがその親細胞に抗生物質耐性を付与する製品であって、独立栄養細胞に原栄養性を付与し、又はその親細胞の欠陥を補填する製品をエンコードしている、先に請求項のいずれかに記載の方法。１８．抗生物質耐性がカナマイシン、テトラマイシン、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールに対する耐性である、請求項17に記載の方法。１９．DNA配列Mが重金属、例えば、セレン酸塩、アンチモン又は砒素塩に対する耐性を付与する製品をエンコードしている、請求項17に記載の方法。２０．そのゲノム内に構造M-BであってMが選択マーカーをエンコードしている DNA配列を表し、そしてBが所望のポリペプチドをエンコードしているDNA配列を表すものを含んで成るDNA配列の多コピーを含んで成る細胞であって、その構造M-Bの多コピーが２つの正反復配列間に位置するような細胞。２１．微生物、植物、昆虫、脊椎動物又は哺乳動物に起源を有する、請求項20 に記載の細胞。２２．請求項１〜19のいずれかに記載の方法により生産された細胞。２３．構造C-M-A-D｛ここで、 Aが、増幅されるべきDNA配列Bに隣接するか又はそれと重複するかあるいはその配列Bの末端の中の１を構成するDNA配列Bのサブ配列であるかのいずれかであるゲノムDNA断片と相同であるDNA配列を表し、 Cが、増幅されるべきDNA配列Ｂに隣接するか又はそれを重複するかあるいはその配列Bの末端の中の１を構成するDNA配列Bのサブ配列であるかのいずれかであるゲノムDNA断片と相同であるDNA配列であって、Aと比べたとき配列Bの反対の端内に位置するものを表し Dが、Bと比べたときCについて遠くに位置するゲノムDNA断片と相同であるDNA 配列を表し、そして Mが、選択マーカーをエンコードしているDNA配列を表す。｝を含んで成り、そしてゲノムDNA配列Bの増幅における使用について意図されるDN A構築物を宿すベクター。２４．プラスミド又はバクテリオファージである、請求項23に記載のベクター。２５．複製の温度感受性起点をさらに含んで成る、請求項24に記載のベクター。２６．ゲノムDNA配列Bの増幅における使用について意図された構造C-M-A-D｛ここで、 Aが、増幅されるべきDNA配列Bに隣接するか又はそれと重複するかあるいはその配列Bの末端の中の１を構成するDNA配列Bのサブ配列であるかのいずれかであるゲノムDNA断片と相同であるDNA配列を表し、 Cが、増幅されるべきDNA配列Bに隣接するか又はそれを重複するかあるいはその配列Bの末端の中の１を構成するDNA配列Bのサブ配列であるかのいずれかであるゲノムDNA断片と相同であるDNA配列であって、Aと比べたとき配列Bの反対の端内に位置するものを表し Dが、Bと比べたときCについて遠くに位置するゲノムDNA断片と相同であるDNA 配列を表し、そして Mが、選択マーカーをエンコードしているDNA配列を表す。｝を含んで成るDNA構築物。２７．DNA配列Bによりエンコードされたポリペプチドを生産するための方法であって、ポリペプチドの生産を導く条件下でDNA配列Bの多コピーを組み込まれた請求項20〜22のいずれかに記載の細胞を培養し、そしてそのカルチャーから得られたポリペプチドを回収することを含んで成る方法。