KR20240109932A - 2차 대사산물 증가를 위한 유전자 조작된 Cas9 시스템과 이를 이용한 2차 대사산물 증진 방법 - Google Patents

2차 대사산물 증가를 위한 유전자 조작된 Cas9 시스템과 이를 이용한 2차 대사산물 증진 방법 Download PDF

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cas9
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cas9 system
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오민규
김덕균
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 2차 대사산물 증가를 위한 유전자 조작된 Cas9 시스템과 이를 이용한 2차 대사산물 증진 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 새로운 Cas9 시스템을 이용하면, 방선균 내에서 오프-타겟 결합 효율(off-target binding affinity)이 감소되고, 온-타겟 절단 효율(on-target cleavage efficiency)이 증진시켜 2차 대사산물을 효과적인 생산능을 증진시킬 수 있다.

Description

2차 대사산물 증가를 위한 유전자 조작된 Cas9 시스템과 이를 이용한 2차 대사산물 증진 방법 {Genome editing tool Cas9 system for improving of secondary metabolites production and method for producing secondary metabolites using the same}
본 발명은 2차 대사산물 증가를 위한 유전자 조작된 Cas9 시스템과 이를 이용한 2차 대사산물 증진 방법에 관한 것이다.
방선균은 다양한 2차 대사산물을 생산하는 균주로 항생제, 항암제, 면역억제제 등 다양한 생체활성 분자(bioactive molecule)를 생산한다. 방선균에서 생산되는 다양한 생체활성 분자는 현재도 계속 확인되고 있으며, 제약 시장의 성장과 인공장기 시장의 성장 등에 의해 더욱 주목받고 있다. 이에 따라 방선균 내 생체활성 분자를 생산하는 BGC, 바이오생합성 유전자 클러스(biosynthesis gene cluster)의 유전자 조작을 통해 생산량 증가나 생산물의 조작 등에 대한 관심도 같이 증가되고 있으나, 방선균 유전자의 높은 GC 함량으로 인해 유전자 조작에 어려움을 겪고 있다.
한편, Cas9 시스템은 편리하고 활용도가 높은 유전자 조작 기술로 각광받고 있으며, 다양한 실험에서 활용되고 있다. 뿐만 아니라, Cas9을 활용하는 다양한 방법들이 꾸준히 개발되고 있고 단일 염기 페어 편집(single base pair editing)을 위한 CBE나 ABE, 더블 브레이크(double break)를 일으키지 않고 유전자를 조작하는 프라임 편집(prime editing) 등이 그 예로 활용되고 있다. 그러나 Cas9은 표적 서열(target sequence)과 유사한 서열에 결합하여 절단하는 오프-타겟(off-target)이 존재할 수 있다는 단점이 있다. 특히, 방선균의 경우 유전자에 Cas9이 인식하는 PAM, -NGG 서열이 많고, 높은 GC 함량으로 인해 유사한 서열이 많아 세포 내 독성으로 인해 Cas9을 활용하기 더욱 어렵다.
따라서 해당 문제를 해결하기 위해 선행 연구에서는 Cas9 내 돌연변이를 가하여 오프-타겟에 대한 절단 효율(cleavage efficiency)을 낮추거나, 프로모터나 RBS를 변이 시켜 Cas9의 발현을 낮춤으로써 오프-타겟 절단 효율(off-target cleavage efficiency)을 감소시키는 방법을 사용하고 있다.
그러나, 기존 선행연구의 Cas9의 오프-타겟 절단 효율을 낮추는 방법은 비기역적으로 Cas9에 변이를 가하거나 발현 정도를 낮추는 방법으로, 이에 따라 온-타겟 절단 효율(on-target cleavage efficiency)도 같이 낮아지게 된다. 따라서 여전히 방선균 내에서 오프-타겟 절단 효율은 감소시키고 온-타겟 절단 효율은 증가시킬 수 있는 새로운 Cas9 시스템이 필요한 상황이다.
본 발명의 하나의 목적은 Cas9 단백질의 N-말단과 C-말단에 폴리-아스파르테이트(poly aspartate)가 링커로 연결된, 유전자 조작된 Cas9 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA(가이드 RNA, gRNA)를 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 편집용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 2차 대사산물 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 유전자 편집 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 유전자에 처리하는 단계를 포함하는 유전자 편집방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 2차 대사산물 증진 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 처리하는 단계를 포함하는 2차 대사산물 증진방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 Cas9 단백질의 N-말단과 C-말단에 폴리-아스파르테이트(poly aspartate)가 링커로 연결된, 유전자 조작된 Cas9 시스템을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 Cas9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 Cas9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 Cas9 단백질은 서열번호 2의 염기서열 또는 이의 축퇴된 서열로 코딩된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 맞춰 코돈 최적화된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 폴리-아스파르테이트는 아미노산 3개 내지 10개로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 링커는 글리신 링커, 글리신-세린 링커, 리지드 링커(rigid linker), EAAAK 링커 또는 XP 링커일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 링커는 GGCGGcGGCGGcTCCGGGGGcGGGGGcAGC인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템은 서열번호 4의 염기서열 또는 이의 축퇴된 서열로 코딩된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 Cas9 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열에서 10번째 아미노산 아스파르테이트가 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 Cas9 단백질은 Cas9 기반 기술(Cas9 배지ted tool)인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 Cas9 영향을 받은 툴은 dCas9 단백질인 것일 수 있다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA(가이드 RNA, gRNA)를 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA는 2개 이상의 복수 개로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 가이드 RNA는 상기 표적 DNA에 상보적인 18 내지 20개의 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 공여 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태인 것일 수 있다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것일 수 있다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 형질전환체는 방선균일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 형질전환체는 표적 DNA에 대한 오프-타겟 절단 효율(off-target binding affinity)이 감소되고, 온-타겟 절단 효율(on-target cleavage efficiency)이 증진된 것이 특징일 수 있다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 편집용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유전자 편집은 유전자 넉아웃 또는 표적 유전자 발현 억제인 것일 수 있다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 2차 대사산물 증진용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 2차 대사산물은 악티노로딘(actinorhodin), 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin) 또는 이의 조합일 수 있다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상기 형질전환체 또는 이의 배양물을 포함하는 2차 대사산물 증진용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 2차 대사산물은 악티노로딘(actinorhodin), 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin) 또는 이의 조합일 수 있다.
본 발명에 따른 새로운 Cas9 시스템을 이용하면, 방선균 내에서 오프-타겟 절단 효율은 감소시켜 세포 독성이 낮아지고, 동시에 온-타겟 결합 효율은 증가시켜 2차 대사산물을 효과적인 생산능을 증진시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 기존 Cas9과 조작된 Cas9의 세포내 독성 비교 및 조작된 Cas9의 cleavage efficiency 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 조작된 Cas9을 활용한 스트렙토마이세스 코엘리칼라(스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor)) M1152 균주 내 BGC 제거를 확인한 도이다.
도 3은 가이드 RNA 발현에 따른 스트렙토마이세스 코엘리칼라(스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor)) M1152 균주의 성장을 비교한 도이다. (A)는 각 가이드 RNA가 발현되지 않은 결과, (B)는 gusA 유전자의 프로모터 부위 대상으로 결과, (C)는 5` region을 대상으로 한 결과, (D)는 유전자의 가운데 region을 대상으로 한 결과, (E)는 상기 세 가지 모두를 대상으로 발현한 결과이다. 여기에서 gusA 유전자만 발현한 균주는 검은색 선, 가이드 RNA와 기존 dCas9이 발현된 균주는 붉은색 선, 가이드 RNA와 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 조작된 dCas9이 발현된 균주는 푸른색 선으로 표시하였다.
도 4는 가이드 RNA 발현에 따른 스트렙토마이세스 코엘리칼라(스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor)) M1152 균주의 gusA 유전자 발현을 비교한 도이다. (A)는 각 가이드 RNA가 발현되지 않은 경우, (B)는 gusA 유전자의 프로모터 부위 대상으로 한 결과, (C)는 5` region을 대상으로 한 결과, (D)는 유전자의 가운데 region을 대상으로 한 결과, (E)는 상기 세 가지 모두를 대상으로 발현된 결과이다. 여기에서 gusA 유전자만 발현한 균주는 검은색 선, 가이드 RNA와 기존 dCas9이 발현된 균주는 붉은색 선, 가이드 RNA와 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 조작된 dCas9이 발현된 균주는 푸른색 선으로 표시하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 조작된 dCas9을 활용한 라이브러리 구축 및 스트렙토마이세스 코엘리칼라(스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor)) A3 균주 2차 대사산물 생산량 증가를 확인한 도이다. (A)는 악티노로딘(actinorhodin)과 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin) 생산량 증가를 위한 표적 유전자이고, (B)는 형질절환 후 균주 배양, 및 (C)는 생산량 비교 결과이다. 생산량이 높은 균주들은 푸른 화살표, 성장 저해(growth inhibition)를 보인 균주는 보라색 화살표, 자라지 못한 균주는 검은 화살표로 표시하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 선별된 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 균주들의 악티노로딘(actinorhodin) 생산량을 비교한 결과 (A), 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin) 생산량을 비교한 결과이다(B). 야생형 균주는 검은색 실선, 가이드 RNA 없이 조작된 dCas9만 발현한 균주는 검은 점선, 가이드 RNA까지 발현된 균주는 각각의 색의 실선으로 표시하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 조작된 Cas9을 활용한 라이브러리 구축 및 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스(S. antibioticus) 균주의 오비에도마이신(오비에도마이신(오비에도마이신(oviedomycin))) 생산량 증가를 확인한 도이다. 오비에도마이신(oviedomycin) 생산량 증가를 위한 표적 유전자 및 프로모터를 나타내는 (A). 형질전환후 균주 배양 (B), 및 생산량 비교를 나타낸 (C)이다. 이 때 야생형 균주는 검은색 선으로 유전자 조작된 균주들은 각각의 색의 선으로 표시하였다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 조작된 Cas9을 활용한 라이브러리 구축 및 스트렙토마이세스 라파마이시니쿠스(S. 라파마이신icus) 균주의 라파마이신 생산량 증가를 확인한 도이다. 라파마이신 생산량 증가를 위한 target 유전자 및 프로모터를 나타낸 (A), MS 배지에서 각 균주별 생산량 비교 결과인 (B)라 있다. 야생형 균주는 검은색 선으로 유전자 조작된 균주들은 각각의 색의 선으로 표시하였다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 추가적으로 유전자 조작된 Cas9을 활용한 유전자 조작 실험 결과를 나타낸 도이다. 5-dimethylallylindole-3-acetonitrile BGC 구역인 (A), coelibactin BGC 구역인 (B), 및 상기 두 개의 BGC를 모두 포함한 구역인 (C)을 제거한 실험 결과이다. Positive confirmation은 제거 구역 외부를 PCR하여 성공 시 복제가 되도록 하였으며 Negative confirmation은 제거 구역 내부를 PCR하여 실패 시 복제가 되도록 하여 실험 결과를 확인하였다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명은 방선균 내에서 오프-타겟 결합 효율은 감소시키고 온-타겟 결합 효율은 증가시킬 수 있는 새로운 Cas9 시스템이 필요한 문제점을 해결하고자 새롭게 규명한 Cas9 시스템에 기인한 것이다.
이에 본 발명의 하나의 양태는, Cas9 단백질의 N-말단과 C-말단에 폴리-아스파르테이트(poly aspartate)가 링커로 연결된, 유전자 조작된 Cas9 시스템을 제공하고자 한다.
본 발명에서 용어, Cas9은 Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) 시스템이라고 불리는 시스템으로, 박테리아와 고세균에서 2차 방어 면역체계로서 작용하는 시스템이다. 바이러스가 박테리아를 감염시킬 때, 해당 시스템이 바이러스의 DNA 조각을 박테리아의 유전체 상으로 통합한다. 이후 2차 침입 시에 박테리아에 존재하는 바이러스의 DNA 서열이 전사되면서 해당 전사체가 뉴클레아제를 자신에 대해 상보적인 DNA 서열로 이동시켜 침입한 바이러스의 유전체를 파괴하도록 한다.
　CRISPR/Cas9　시스템은 진핵 생물에서　유전자　편집　기술로서 발전되었으며, 이를 위해서는　Cas9　단백질과 서열인식 RNA, trans-activating crispr RNA 세 요소가 필수적이다. 이 때 서열인식 RNA, 및 trans-activating crispr RNA는 하나의 RNA로 합성하여 single 가이드 RNA (sgRNA)로서 새롭게　유전자　편집　기술에서 사용되고 있다. 서열인식 RNA, trans-activating crispr RNA를 함께 일컬어 gRNA라고 하는데, gRNA의 구조는　Cas9　활성효율에 큰 영향을 끼친다.
기존 Cas9 시스템은 여러 연구들을 통해 두 종류의 gRNA를 따로 사용하는 것보다 하나의 형태로 합쳐진 sgRNA로서 작용하는 것이 더 높은　Cas9　활성효율을 나타낸다는 결론이 도출된 바 있다.
sgRNA는 표적 DNA 서열과 상보적으로 결합을 이루고 동시에　Cas9과 결합하여　Cas9이 표적 DNA에 대해 기능할 수 있도록 한다.　Cas9　단백질은 뉴클레아제로서 sgRNA에 의해 표적 서열로 이동하여, 유전체 상에 존재하는 PAM (Protospacer adjacent motif) 서열 덕분에 유전체와의 결합이 가능해지며 특정 지역에 DNA 이중가닥 절단을 형성한다. 이에 대해서 DNA 이중가닥 손상 수선과정이 일어나게 되고, 수선 과정에서 변화된 서열로 인해 해당　유전자의 정상적인 발현이 어려워지게 되어　유전자의 제대로 된 기능을 수행하지 못하게 된다.
뉴클레아제에 의해 DNA 상에 이중가닥손상이 발생하게 되면 해당 손상에 대한 수선과정이 일어나게 된다. 이때 수선과정은 손상 부위의 일정 부분을 삭제한 후 손상된 각 DNA 말단을 단순히 연결하는 비상동말단연결 (Non-homologous end joining, NHEJ), 상동염색분체 혹은 자매염색분체로부터 손상이 발생한 부위에 대한 상동 서열을 얻어 그를 기반으로 수선을 시행하는 상동 재조합(Homology-directed repair, HDR) 등이 있다.
본 발명의 용어, "유전자 조작된 Cas9 시스템"은 기존의 Cas9 시스템이 아닌 유전자 조작된 Cas9 시스템으로, 종래 Cas9 시스템이 2종 이상의 복수 개의 gRNA를 동시에 사용하였을 때 세포 독성으로 낮은 Cas9 활성 효율을 극복하고자 유전자 조작시킨 시스템을 말한다.
본 발명에서 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템은 Cas9 단백질의 N-말단과 C-말단에 폴리-아스파르테이트(poly aspartate)가 링커로 연결된 것일 수 있다.
상기 "Cas9 단백질"은 Cas9 효소라고도 불리며, Cas 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터 (national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas 단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 (CRISPR-associated, cas) 유전자는 종종 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)과 관련된다. CRISPR-Cas　시스템은 두 개의 class와 여섯 개의 type이 존재하며, 이들 중에서,　Cas9　단백질 및 crRNA 및 tracrRNA를 수반하는 type ±-Cas　시스템이 대표적으로 잘 알려져 있다.
상기 Cas9 단백직은 일 예로 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 이와 적어도 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
서열번호 2의 염기서열 또는 이의 축퇴된 서열이거나 상기 서열과 적어도 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열 또는 이의 축퇴된 서열로 코딩된 것일 수 있다.
상기 용어, “서열 상동성”은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요하면, 서열 정렬 및 갭 도입 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환 고려 없이, 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 상기 서열 상동성은 펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"이나 "상동성"과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열번호 2의 염기서열은 이와 각각 서열 상동성이 적어도 90% 이상, 구체적으로는 95%, 보다 구체적으로는 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가진 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 서열번호 1과 서열번호 2는 코돈 최적화된 서열일 수 있으며, 아스파르테이트 연결되지 않은 서열로 pCRISPomyces-2 플라스미드에 처음부터 코딩되어 있던 서열일 수 있다.
상기 Cas9 단백질은 방선균에 맞춰 코돈 최적화된 것일 수 있다.
상기 용어, "방선균"은 방선균류(放線菌類)는　방선균문(Actinobacteria)에 속하는　세균의 총칭으로, 몸은 실 모양이고 가지를 내기도 하며, 다른 세균류와 달리 외생 포자를 만들기 때문에 곰팡이와 비슷하나, 세포가 원핵성이고 그람 염색에 양성으로 반응한다. 방사선균, 방사균 등과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 방선균은 다양한 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로는 스트렙토마이세스 속일 수 있으며, 보다 구체적으로는 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스(Streptomyces antibioticus), 스트렙토마이세스 라파마이시니쿠스(Streptomyces rapamycinicus), 또는 스트렙토마이세스 추쿠바엔시스(Streptomcyes tsukubaensis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어, "코돈 최적화"는 코돈 편향에 의한 것으로서 더 빠른 번역 속도와 높은 번역, 발현 정확성을 달성하는 데 유리할 수 있도록 특정 서열에 최적화시키는 것을 말한다. 본 발명에서는 방선균에서 더 높은 번역, 발현 정확성을 높이기 위하여 방선균, 구체적으로는 스트렙토마이세스 속 균주의 유전자 서열을 토대로 코돈 최적화하였다.
코돈 최적화 방법은 공지된 다양한 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 유전자 조작된 Cas9 시스템은, Cas9 단백질의 N-말단과 C-말단에 폴리-아스파르테이트(poly aspartate)가 연결된 것일 수 있다.
상기 용어, 폴리-아스파르테이트(poly aspartate)는 아미노산 아스파르테이트가 여러 개 연결된 형태로, 일반적으로 결합 부위로 알려진 Cas9 단백질에서 양성을 띠는 아미노산 서열이 결합하지 못하도록 하는 역할을 한다.
상기 폴리-아스파르테이트는 특별히 제한되지는 않으나, 아스파르테이트 3개 내지 20개, 구체적으로는 3개 내지 10개로 구성된다.
상기 용어, "링커"는 Cas9 단백질의 N-말단과 C-말단에 폴리-아스파르테이트(poly aspartate)가 연결되도록 하는 것으로, 플렉서블한 형태일 수 있고, 일 예로 글리신 링커, 글리신-세린 링커, 리지드 링커(rigid linker), EAAAK 링커 또는 XP 링커일 수 있으나, 폴리-아스파르테이트를 연결할 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.
상기 유전자 조작된 Cas9 시스템은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템은 서열번호 4의 염기서열 또는 이의 축퇴된 서열로 코딩된 것일 수 있다.
또한, 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템은 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노산 서열에서 10번째 아미노산인 아스파르테이트가 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.
일 예로 상기 서열은 서열번호 5의 아미노산 서열일 수 있고, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 6의 염기서열로 코딩된 것일 수 있다.
상기 "치환"은 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 변경, 대체되는 것을 의미하는 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 10번째에 위치하는 아스파르테이트가 알라닌으로 치환되어 유전자 조작 효율을 높이고 2차 대사산물을 보다 효율적으로 생산하는 것을 말한다.
또한, 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템에서 상기 Cas9 단백질은 Cas9 기반 기술(Cas9 mediated tool) 또는 Cas9 관련 기술일 수 있다.
상기 용어, “Cas9 기반 기술(Cas9 mediated tool)”은 Cas9을 기반으로 하는 또는 관련된 기술을 의미한다. 예컨대, 다른 종류의 유전자 조작 기술이 아닌 Cas9에 점 돌연변이를 주거나(즉, 구조적으로 큰 변화가 없는 돌연변이), 전혀 다른 종류의 단백질을 Cas9에 부착하는 등의 과정을 통하여, 단순 절단을 만드는 것이 아닌 추가적인 효과를 도모하는 것을 말한다.
상기 Cas9 관련 기술의 일 예로 dCas9 단백질일 수 있으며, 비제한적인 예로 CRISPRi, CRISPRa, Base editor (CBE, ABE), prime editing, Casilio 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 dCas9 단백질은 Cas9 단백질이 절단으로 유전자 편집을 하는 것과 달리, 표적 DNA에 대하여 유전자 발현을 억제시킴으로써 유전자 편집과 동일한 역할을 수행할 수 있는 단백질을 말한다.
상기 dCas9 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이와 적어도 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열은 서열번호 8의 염기서열 또는 이의 축퇴된 서열이거나 상기 서열과 적어도 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열 또는 이의 축퇴된 서열로 코딩된 것일 수 있다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열과 서열번호 8의 염기서열은 이와 각각 서열 상동성이 적어도 90% 이상, 구체적으로는 95%, 보다 구체적으로는 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가진 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태는 유전자 조작된 Cas9 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA(가이드 RNA, gRNA)를 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 용어, “유전자 조작된 Cas9 시스템”과 이를 코딩하는 염기서열(폴리뉴클레오티드) 및 가이드 RNA는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 용어, “표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자”는 "공여체 핵산 서열"이라고도 할 수 있으며, 표적 DNA에 삽입하고자 하는 목적의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 천연의 또는 변형된 폴리뉴클레오타이드, RNA-DNA 키메라, 또는 DNA 단편, 또는 PCR 증폭된 ssDNA 또는 dsDNA 단편 또는 이의 유사체를 지칭할 수 있다.
이러한　공여　핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 형태, 예컨대, 단일-가닥 및 2중-가닥 형태를 포함할 수 있다.
상기 표적 DNA 상의 변형은 임의의 목적 위치에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
상기 표적 DNA 상의 변형은 야생형 DNA 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환에 의해 점 돌연변이가 도입(유도)된 것이고, 이러한 점 돌연변이의 도입은 예컨대, 올리고뉴클레오타이드에 의한 것일 수 있다.
상기 표적 DNA는 상기 crRNA 또는 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드는 표적 DNA의 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함할 수 있다.
상기 PAM은 5′-NGG-3′트리뉴클레오타이드 (trinucledotide)일 수 있다.
상기 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA는 2개 이상의 복수 개로 포함될 수 있다.
종래 Cas9 시스템은 2개 이상의 복수 개를 적용 시 세포 독성이 높아져 활용 가능성이 낮았으나, 본 발명의 유전자 조작된 Cas9 시스템은 2개 이상의 복수 개인 gRNA를 포함하여도 세포 독성이 높아지지 않고 효율적으로 유전자 조작이 증가되는 것을 새롭게 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 유전자 조작된 Cas9 시스템이 2개 이상, 일 예로 2개 또는 3개의 gRNA를 포함하여도 세포 독성이 높아지지 않고 효율적으로 유전자 조작이 되며, 나아가 2차 대사산물 생산량이 증가되는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 양태는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 용어, “폴리뉴클레오티드”는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, “재조합 벡터”는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서,　유전자　삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는　유전자　작제물을 말한다.
본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
예를 들어, 본 발명의　Cas9　서열과 공여 핵산분자 및 gRNA 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결시킴으로써, 상기 서열의 발현은 이 프로모터의 영향 또는 조절 하에 있게 된다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진　유전자　재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서와 같은 발현 조절요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며 구체적으로는 바이러스 벡터일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 운반체로서 플라스미드 (벡터)가 이용될 수 있다. 벡터에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 발현 카세트 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 카세트에서 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 동물세포, 구체적으로는 포유동물 세포, 보다 구체적으로는 인간 세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2　유전자의 프로모터, 인간 IFN　유전자의 프로모터, 인간 IL-4　유전자의 프로모터, 인간 림포톡신　유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF　유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 프로모터는 인간 CMV (hCMV)의 IE (im배지tely early)　유전자로부터 유래된 프로모터 또는 EF1 알파 프로모터이며, 가장 구체적으로는 hCMV IE　유전자의 프로모터/인핸서 및 엑손 1 전체서열부터 엑손 2의 ATG 개시코돈 직전까지를 포함하는 5'-UTR (untranslated region)일 수 있다.
본 발명에서 이용되는 시스템은 폴리아네닐화 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), beta-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995))를 포함할 수 있으나, 이에 제안되는 것은 아니다.
상기 바이러스 벡터에서 바이러스는 레트로바이러스일 수 있다.
상기 레트로바이러스는 자신의　유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에　유전자　전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env　유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159 (1983)). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, LTR 및 ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular 클로닝 vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여　유전자　전달 시스템으로 이용한다.
2 세대 레트로바이러스 벡터를 이용한　유전자　전달이 발표되었다. Kasahara 등(Science, 266:1373-1376 (1994))은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열도 이와 같은 2 세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 레트로바이러스에 탑재될 수 있다.
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에　유전자　전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스-엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주세포　유전자의 전사를 조절하는 단백질을 인코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 인코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래　유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551 (1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입될 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다.
본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실" 은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. 또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105％ 까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb 를 추가적으로 패키징 할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBOJ., 6:1733-1739 (1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42 개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5 가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래　유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 아데노 바이러스　유전자　전달 시스템을 이용한　유전자　치료가 안전할 것으로 판단된다.
본 발명의 또 다른 양태는 재조합 벡터가 도입된 형질전환체이다.
상기 용어 “재조합 벡터”는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 “형질전환체는”는 "숙주 세포"와 혼용되어 사용되며, 상기 형질전환체는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 "세포 내 도입"되는 진핵 또는 원핵 세포를 가리키고, 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 혹은 환경적 영향에 의해 상기 자손이 부모 세포와 완전히 동일하지 않더라도, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주세포는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 바이러스 벡터)가 도입된 것으로, 상기 형질전환 세포의 배양액 또는 상기 세포의 용해물로부터 상기 바이러스를 수득할 수 있다.
상기 세포는 방선규일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 체세포, 생식세포, 역분화줄기세포 (induced pluripotent stem cells), 성체줄기세포 등 인간의 모든 세포에 적용할 수 있다.
상기 체세포는 배아뿐 아니라 어린아이, 성인의 몸에서 얻을 수 있는 생식세포를 제외한 모든 세포를 말하며, 이들로부터 유래된　유전자변형 세포들까지 포함될 수 있다. 또한, 상기 성체줄기세포는 인간 배아 (embryo), 신생아 및 성인의 몸에서 얻을 수 있는 모든 성체줄기세포들 뿐만 아니라 제대혈유래 줄기세포 (cord blood stem cells), 태반유래 줄기세포 (placenta stem cells), 탯줄줄기세포 (Wharton's jelly stem cells), 양수줄기세포 (amniotic fluid stem cells), 양막상피줄기세포 (amniotic epithelial cells) 등 배외줄기세포 (extraembryonic stem cells)들과 이들로부터 파생된　유전자변형 세포들을 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포는 배양된 세포 (시험관내), 이식편 및 1차 배양물 (시험관내 및 생체외) 및 생체 내 세포일 수도 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포로서 그 제한을 두지 않는다.
그러나, 본 발명의 상기 숙주세포는 인간의 배아를 제외한 분리된 형질전환 세포일 수 있다.
본 발명에서, "세포 내 도입"는 당업계에 알려진 공지의 어떠한 방법도 사용할 수 있으며, 형질감염 (transfection) 또는 형질도입 (transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시킬 수도 있다. 형질감염은 칼슘포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 형질전환체는 표적 DNA에 대한 off-target binding affinity가 감소되고, on-target cleavage efficiency가 증진된 것이 특징일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 편집용 조성물을 제공한다.
상기 용어, “폴리뉴클레오티드”는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "유전체　편집　(genome editing)"은 인간세포를 비롯한 동식물 세포의 유전체 염기서열에 표적화된 돌연변이를 도입할 수 있는 기술로서, 특정　유전자를 넉-아웃 (knock-out) 또는 넉-인 (knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에 변이를 도입하는 것을 말한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 유전체　편집은　유전자　넉-아웃을 의미하며 넉-인에도 적용될 수 있다.
또한, 유전체　편집을 통해 유전체상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열시킬 수 있다.
본 발명에서, "결실"이란, 염색체의 일부 또는 DNA 상 염기의 일부가 누락되어 일어나는 돌연변이를 말한다.
본 발명에서, "중복"이란, 게놈 내에 같은　유전자가 2개 또는 그 이상 존재하는 것을 말한다.
본 발명에서, "역위"는 게놈의 일부가 원래의 게놈과 비교할 때 거꾸로 배치된 것을 말한다.
본 발명에서, "교체"는 하나의 뉴클레오티드 서열이 서로 교체되는 것(즉, 정보를 지닌 서열의 교체)를 의미하며, 반드시 하나의 폴리뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레티드로 화학적 또는 물리적으로 교체되는 것만을 의미하는 것은 아니다.
본 발명에서, "재배열"이란 염색체 상의　유전자의 위치 및 순서의 변화를 일으키는 구조적 변화를 의미하며, 트랜스포존 등과 같이 전이인자가 삽입되는 것도 포함된다. 아울러, DNA 분자 내에서 염기 재배열에 의한 유전 정보의 변환을 포함할 수 있다.
상기 유전자 편집은 유전자 넉아웃 또는 표적 유전자 발현 억제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 2차 대사산물 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 형질전환체 또는 이의 배양물을 포함하는 2차 대사산물 증진용을 제공한다.
상기 용어, “폴리뉴클레오티드”와 “형질전환체”는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 2차 대사산물은 2차적으로 발생하는 대사산물로 구체적으로는 악티노로딘(actinorhodin), 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin) 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어, “이의 배양물”은 본 발명의 형질전환체의 배양물로, 상기 형질전환체를 배지에서 배양하여 생기는 배양 결과물일 수 있으며, 일 예로, 배양물로부터 수득된 균체 그 자체, 또는 배양물을 여과 및 원심분리한 배양 상등액을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "배양"은 상기 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생 육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배 양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업 자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양 물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하 여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 미생물을 적당한 탄소 원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 유전자 조작 및 플라스미드 클로닝을 위해 사용된 올리고머 준비
본 발명의 유전자 조작된 Cas9 시스템의 구축을 위하여 사용한 올리고머는 하기 [표 1]과 같다.
올리고머 명칭 서열 (5' - 3') 특징
Cas9_FW cgacGGCGGcGGCGGcTCCGGGGGcGGGGGcAGCgacaagaagtacagcatcgg Cas9, dCas9 engineering 및 cloning을 위한 Cas9, dCas9 amplified 용
Cas9_RV cgtcGCCCCCcCCgCCGCTcCCCCCcCCcCCCGAgtcgccgccgagctgggaga
Vec_FW gAGCGGcGGgGGGGGCgacgacgacgacgactga gaattcagatctacgcgttccc Cas9 engineering 및 cloning을 위한 vector amplified 용
Vec_RV CGGAgCCGCCgCCGCCgtcgtcgtcgtcgtccattacgtctccgtcgtctactc
Des_B_gRNA_FW acgc GCGGGATCGGTGACGTCCGC S. coelicolor desferrioxamine B BGC guide RNA cloning 용
Des_B_gRNA_RV Aaac GCGGACGTCACCGATCCCGC
Des_B_HR_1_FW atatatGAAGACTACTAGCATGGGCGGCGACTACTTC S. coelicolor desferrioxamine B BGC homologous region cloning 용
Des_B_HR_1_RV atatatGAAGACATGCCCCCTCAGATCTTGTCCAGGGG
Des_B_HR_2_FW atatatGAAGACTAGGGCtcggcaccctgaagaaccc S. coelicolor desferrioxamine B BGC homologous region cloning 용
Des_B_HR_2_RV atatatGAAGACATCTAGGCGGCCACTACACCAAGG
SapB_gRNA_FW acgc aggacttccagggcgcgccc S. coelicolor SapB BGC guide RNA cloning 용
SapB_gRNA_RV Aaac gggcgcgccctggaagtcct
SapB_HR_1_FW atatatGAAGACTACTAG CGGTTGCTCTTGTACAGGAA S. coelicolor SapB BGC homologous region cloning 용
SapB_HR_1_RV atatatGAAGACATGCCC GAACGCACAAGTAACTTCGC
SapB_HR_2_FW atatatGAAGACTAGGGC gttcacctacctcgtccagt S. coelicolor SapB BGC homologous region cloning 용
SapB_HR_2_RV atatatGAAGACATCTA gagttccagtgtcccgtcag
SCO_2138_gRNA_FW acgc gacggctccgacgtcgacca S. coelicolor SCO-2138 BGC guide RNA cloning 용
SCO_2138_gRNA_RV Aaac tggtcgacgtcggagccgtc
SCO_2138_HR_1_FW atatatGAAGACTACTAG CTGGTGCTGCTGATCAACTG S. coelicolor SCO-2138 BGC homologous region cloning 용
SCO_2138_HR_1_RV atatatGAAGACATGCCC gacgacgactgctctacgc
SCO_2138_HR_2_FW atatatGAAGACTAGGGC gactccgactgaTCCGCCG S. coelicolor SCO-2138 BGC homologous region cloning 용
SCO_2138_HR_2_RV atatatGAAGACATCTA GCCCCTGAAGTGCGTGGAC
GusA_gRNA_1_FW acgc TGCTTTGACAACATGCTGTG gusA gene promoter targeting guide RNA cloning 용
GusA_gRNA_1_RV aaac CACAGCATGTTGTCAAAGCa
GusA_gRNA_2_FW acgc GGGTCGGGGTTTCGACGGGC gusA gene 5` region targeting guide RNA cloning 용
GusA_gRNA_2_RV aaac GCCCGTCGAAACCCCGACCC
GusA_gRNA_3_FW acgc TGTACAGCATGACCGAGCGG gusA gene middle region targeting guide RNA cloning 용
GusA_gRNA_3_RV aaac CCGCTCGGTCATGCTGTACA
GusA_FW atatatGAAGACatCTAGTGTTCACATTCGAACGGTCTCTGC Cloning을 위한 gusA gene PCR amplified 용
GusA_RV atatatGAAGACatCTAG TTACCGCCTTTGAGTGAGCTG
pta_gRNA_FW acgc CGACCGCGGCGACGGCCGCC pta gene targeting guide RNA cloning 용
pta_gRNA_RV Aaac GGCGGCCGTCGCCGCGGTCG
fabD_gRNA_FW acgc GGCGTCTGGGCGCCCTGGCC fabD gene targeting guide RNA cloning 용
fabD_gRNA_RV Aaac GGCCAGGGCGCCCAGACGCC
pyc_gRNA_FW acgc GTCGGCCCCCGCACGGCGGG pyc gene targeting guide RNA cloning 용
pyc_gRNA_RV Aaac CCCGCCGTGCGGGGGCCGAC
adhE_gRNA_FW acgc GGCCGAGGGGCCCGGTCCCG adhE gene targeting guide RNA cloning 용
adhE_gRNA_RV Aaac CGGGACCGGGCCCCTCGGCC
fabH_gRNA_FW acgc CGCGTACGGGGCGCCCTTGC fabH gene targeting guide RNA cloning 용
fabH_gRNA_RV Aaac GCAAGGGCGCCCCGTACGCG
gltA_gRNA_FW acgc GCTCCGCGCCCAGACCGGTC gltA gene targeting guide RNA cloning 용
gltA_gRNA_RV Aaac GACCGGTCTGGGCGCGGAGC
dCas9_lib_FW atatat gaagac at ctag ggctccttttggagcctttt dCas9 library 구축 시 gRNA amplified 용
dCas9_lib_RV atatat gaagac at ctag gataaaaaacgcccggcg
ovmOI_gRNA_FW acgc gtcccgggacggggagacgc S. antibioticus ovmOI gene guide RNA cloning 용
ovmOI_gRNA_RV aaac gcgtctccccgtcccgggac
ovmOII_gRNA_FW acgc Gtcgtcggcgcgggcccggt S. antibioticus ovmOII gene guide RNA cloning 용
ovmOII_gRNA_RV aaac accgggcccgcgccgacgaC
ovmOF_gRNA_FW acgc gcgggctgaggaacgctggg S. antibioticus ovmOF gene guide RNA cloning 용
ovmOF_gRNA_RV aaac cccagcgttcctcagcccgc
ovmOI_HR_1_FW atatat actagt ggccgcggcatgtaccaact S. antibioticus ovmOI gene homologous region cloning 용
ovmOI_HR_1_RV atatat aagctt gagacgccggtgaggtggct
ovmOI_HR_2_FW atatat aagctt atggacgctgccctcgtcga S. antibioticus ovmOI gene homologous region cloning 용
ovmOI_HR_2_RV atatat actagt agcggctgcatctcgctgcc
ovmOII_HR_1_FW atatat actagt cgacaccgccgcctccatca S. antibioticus ovmOII gene homologous region cloning 용
ovmOII_HR_1_RV atatat aagctt gaggacgtcagtccgcatgg
ovmOII_HR_2_FW atatat aagctt atgcggactgacgtcctc gtg gtg ggc gcc ggc ccc gtg ggc ctgatgctcgccggtgaact S. antibioticus ovmOII gene homologous region cloning 용
ovmOII_HR_2_RV atatat actagt ggtcgatcagctcgcggaag
ovmOF_HR_1_FW atatat actagt cggcctacgcggtcggcacc S. antibioticus ovmOF gene homologous region cloning 용
ovmOF_HR_1_RV atatat aagctt tcagcccgcgtacgcaagcc
ovmOF_HR_2_FW atatat AAGCTT gtgccggacggccggcgcgt S. antibioticus ovmOF gene homologous region cloning 용
ovmOF_HR_2_RV ATATAT ACTAGT ctggtcggtgggctcgtggt
ErmE_FW atatat gaagac at ctag tcgatcttgacggctggcgag ErmE promoter amplified 용
ErmE_RV atatat gaagac at agct gggacctcctggggtgcgtt
KasOp_FW atatatgaagacatctagTGTTCACATTCGAACGGTCTCTG KasO promoter amplified 용
KasOp_RV atatat gaagac at agct GGATCCGTCCGTACCTCCGT
Sp44p_FW atatat gaagac at ctag tgttcacattcgaaccgtctctg Sp44 promoter amplified 용
Sp44p_RV atatat gaagac at agct cagcctactccttacttagaCTG
rapH_gRNA_FW acgc tacattgcggagctctagtg S. rapamycinicus rapH gene guide RNA cloning 용
rapH_gRNA_RV Aaac cactagagctccgcaatgtA
rapH_HR_1_FW atatat ATTAAT tgaagacccggatgaagtgg S. rapamycinicus rapH gene homologous region cloning 용
rapH_HR_1_RV atatat ACTAGT gtctgttcgggccttcatcc
rapH_HR_2_FW atatat GCTAGC atgcctgccgtggagtgcta S. rapamycinicus rapH gene homologous region cloning 용
rapH_HR_2_RV atatat TTAATTAA gcggacatgtcgttgagtac
rapC_gRNA_FW acgc catggcgctatctccttgcg S. rapamycinicus rapC gene guide RNA cloning 용
rapC_gRNA_RV Aaac cgcaaggagatagcgccatg
rapC_HR_1_FW atatat ATTAAT ggcgatcacggcttgggctt S. rapamycinicus rapC gene homologous region cloning 용
rapC_HR_1_RV atatat GCTAGC atgcctgagcaagacaaagtgg
rapC_HR_2_FW atatat ACTAGT tca acg acg tgcgtggccgtttgctgcgt S. rapamycinicus rapC gene homologous region cloning 용
rapC_HR_2_RV atatat TTAATTAA agacacgaccgaccgtgaag
rapA_gRNA_FW acgc TCAGAAACACCGTACTTTGC S. rapamycinicus rapA gene guide RNA cloning 용
rapA_gRNA_RV Aaac GCAAAGTACGGTGTTTCTGA
rapA_HR_1_FW atatat ATTAAT tcgaccggctcagttctttg S. rapamycinicus rapA gene homologous region cloning 용
rapA_HR_1_RV atatat ACTAGT ccatacccctccacccccta
rapA_HR_2_FW atatat GCTAGC atgtcacgcgcggaactggta S. rapamycinicus rapA gene homologous region cloning 용
rapA_HR_2_RV atatat TTAATTAA cgccgaagacgtcctcgaag
rapB_gRNA_FW acgc gtgctggaggaagaacgatg S. rapabmycinicus rapB gene guide RNA cloning 용
rapB_gRNA_RV Aaac catcgttcttcctccagcac
rapB_HR_1_FW atatat ATTAAT gtgtggtcgaatctttgacc S. rapamycinicus rapB gene homologous region cloning 용
rapB_HR_1_RV atatat ACTAGT tcatcgttcttcctccagca
rapB_HR_2_FW atatat GCTAGC atgagggaagatcagcttctc S. rapamycinicus rapB gene homologous region cloning 용
rapB_HR_2_RV atatat TTAATTAA ATCaccatcttgatgacacca
D25A_pro_FW atatat aaGCTT gccctgcaggcggaagtcag 추가적인 D25A 돌연변이를 위한 5` region amplify 용
D25A_pro_RV Atatat GGTCTC a gatg GCcaggccgatgctgtacttc
D25A_Cas9_FW Atatat GAAGAC at Catcggcaccaacagcgtgg 추가적인 D25A 돌연변이를 위한 3` region amplify 용
D25A_Cas9_RV cgtagtacgggatccggaag
H855A_Cas9_FW Atatat GAAGAC at cgcc atcgtgccgcagtccttcct 추가적인 H855A 돌연변이를 위한 amplify 용
H855A_Cas9_RV Atatat GAAGAC at ggcg tcgacgtcgtagtcgctcag
5-dimeth_gRNA_FW acgc GGTGTCTTGTGCATCTTTCA 5-dimethylallylindol BGC guide RNA cloning 용
5-dimeth_gRNA_RV Aaac TGAAAGATGCACAAGACACC
5-dimeth_HR1_FW atatat GGTCTC a AATT GGTGACCGTCAATTTCGCCG 5-dimethylallylindol BGC homologous region cloning 용
5-dimeth_HR1_RV atatat GGTCTC a TG GAACCCCTGCAACGGCTCAA
5-dimeth_HR2_FW atatat GGTCTC a TC CAGCGCCGGTCCGGACATCT 5-dimethylallylindol BGC homologous region cloning 용
5-dimeth_HR2_RV atatat GGTCTC a AATT TGCCTTTTCTTTGCCCATCG
Coelibac_gRNA_FW acgc ATGCATGGGGCATACAGGTG Coelibactin BGC guide RNA cloning 용
Coelibac_gRNA_RV Aaac CACCTGTATGCCCCATGCAT
Coelibac_HR1_FW atatat GGTCTC a AATT TGTGCAGGGCAGCGGCTATC Coelibactin BGC homologous region cloning 용
Coelibac_HR1_RV atatat GGTCTC a TG GACAGTCATCGACTCACCTC
Coelibac_HR2_FW atatat GGTCTC a TC CACTTCCGTGCCGAGAGGTC Coelibactin BGC homologous region cloning 용
Coelibac_HR2_RV atatat GGTCTC a AATT ACTTCGTCTCCCTCCAGGTA
LD_gRNA_FW atatat GGTCTC a agct gctgctccttcggtcggacg 긴 영역 deletion을 위한 guide RNA cloning 용
LD_gRNA_RV atatat GGTCTC a agct GCTTgataaaaaacgcccgg
실시예 1: 유전자 조작된 Cas9 시스템 구축
유전자 조작된 Cas9 시스템을 구축하였다.
본 발명에서는 선행연구에서 활발히 사용되고 있는 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)유래 Cas9을 활용하였으며, 스트렙토마이세스에 맞춰 코돈 최적화하였다.
상기 코돈 최적화된 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)유래 Cas9 유전자를 코딩하고 있는 pCRSIPomyces-2 플라스미드(Addgene, Watertown, Massachusetts, USA)를 활용하여 실험을 진행하였다.
본 발명에서 Cas9 유전자는 PCR로 증폭되어 pCRISPomyces-2 벡터에 Gibson Assembly tool(New England Biolabs Inc., Massachusetts, USA)로 클로닝되었다.
구체적으로, 상기 pCRSIPomyces-2 플라스미드를 조작하여, 상기 코돈 최적화된 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)유래 Cas9의 N 말단과 C 말단에, 신축성 있는 링커(flexible linker)인 글리신-세린 링커(glysine-serine linker)(GGCGGcGGCGGcTCCGGGGGcGGGGGcAGC)를 이용하여 폴리 아스파르테이트(poly aspartate)를 결합시켰다. 상기 폴리 아스파르테이트는 상기 코돈 최적화된 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)유래 Cas9 내 인식 도메인(recognition domain)의 극성 아미노산(polar amino acid)에 결합한다.
이렇게 구축된 상기 유전자 조작된 플라스미드를 pCRISPomyces-2*라 명명하였다.
실시예 2: Cas9의 세포내 독성 확인
상기 실시예 1로 제조된 pCRISPomyces-2* 플라스미드를 이용하여, Cas9의 세포 내 독성을 확인하였다.
이를 위해, pCRISPomyces-2 플라스미드와 상기 실시예 1의 pCRISPomyces-2* 플라스미드를 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor) M1152 균주에 각각 컨쥬게이션(conjugation)을 통해 형질전환하였다.
구체적으로, 상기 플라스미드들을 먼저 컨쥬게이션(conjugation)을 위해 Escherichia coli ET12567/pUZ8002에 전기충격(electrophoresis)를 통해 형질전환하고, 상기 플라스미드를 포함하는(harboring)하는 균주들을 LB 배지로 600nm 파장에서 optical density 0.4이 되도록 배양하였다. 상기 배양한 균주들을 원심 분리와 증류수로 2차례 세척하였다. 상기 컨쥬게이션 시킬 스트렙토마이세스(Strepomyces)의 spore를 5 μL를 400μL LB 배지에 넣어 50에서 10분간 germination하고, 상온에서 15분간 휴지(resting) 후 세척한 Escherichia coli ET12567/pUZ8002와 함께 부유(resuspension)하였다. 상기 부유한 균주들을 MS 플레이트에 스프레딩(spreading)하고, 16시간 후 날리딕스산(nalidixic acid)과 아프라마이신(apramycin)을 MS 플레이트에 오버레이(overlay)하였다.
이후 콜로니 형성 정도를 확인해 본 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 기존 pCRISPomyces-2를 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) M1152에 형질전환하였을 때는 세포내 독성으로 콜로니가 형성되지 못한 것과 달리, 상기 실시예 1에서 제조된 pCRISPomyces-2* 플라스미드를 형질전환한 경우에는 54개의 콜로니가 형성된 것을 확인할 수 있었다 (도 1).
이를 통해, 상기 실시예 1에서 유전자 조작된 Cas9이 기존 Cas9보다 방선균 내에서 오프-타겟 결합 효율을 감소시켜 더 낮은 독성을 보인다는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 온-타겟 절단 효율을 확인하고자 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) 유전자 내 desferrioxamin B의 BGC를 표적하는 가이드 RNA를 pCRISPomyces-2* 플라스미드에 클로닝하여 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) M1152 균주에 형질전환하였다.
그 결과 도 1의 세번째 열에서 확인할 수 있는 바와 같이, 단 하나의 콜로니도 형성되지 않으면서 구축된 상기 실시예 1의 Cas9은 표적 서열에 대해 높은 절단 효율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: Cas9의 유전자 조직 효율 확인
상기 실시예 1에서 구축된 Cas9이 실제 유전자 조작에서도 높은 효율을 보이는지 확인하기 위하여, 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) M1152 내 desferrioxamin B, SapB 및 SCO-2138 BGC를 결실시키는 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 desferrioxamin B, SapB 및 SCO-2138 BGC를 결실하기 위한 상동 부위(homologous region)을 각각 PCR로 증폭시켰다. 이후, pCRISPomyces-2* 플라스미드에 표적 부위에 대한 가이드 RNA와 절단 이후 재조합이 될 상기 상동 부위(homologous region)를 각각 클로닝하고, 이렇게 구축된 플라스미드를 컨쥬게이션을 통해 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) M1152에 형질전환하였다 (도 2(A)).
이후 PCR로 형질전환된 균주를 확인한 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, 하나의 BGC를 결실하는 유전자 조작은 모두 성공하였음을 확인할 수 있었다.
다음으로, 상기 실시예 1에서 구축된 Cas9이 복수의 가이드 RNA를 활용한 여러 BGC 동시 제거도 가능한지 확인하였다.
구체적으로, 2개의 BGC, desferrioxamin B와 SapB, 및 3개의 BGC를 동시에 제거하는 실험을 진행하였다. 역시 상기 1개 BGC를 결실시키는 유전자 조작과 유사하되 BGC만을 복수 개 결실시키는 방식으로, pCRISPomyces-2* 플라스미드에 각각의 가이드 RNA, 즉 복수개의 가이드 RNA와 상동부위(homologous region)를 삽입하고, 이렇게 구축한 플라스미드를 형질전환하였다.
그 결과, 도 2의 B와 C에서 확인할 수 있는 것과 같이, 복수 개의 BGC를 동시에 제거하는 것도 가능한 것을 확인할 수 있었다 (도 2(B, C)).
이는 본 발명의 구축된 Cas9 시스템이 세포 독성이 낮아져 복수의 가이드 RNA를 활용한 여러 BGC 동시 제거도 가능한 것을 나타낸다.
실시예 4: Cas9의 유전자 조직 효율 확인
상기 실시예 1의 Cas9 구축이 Cas9 뿐만 아니라 다른 Cas9 mediated tool에도 활용할 수 있는지 확인해 보기 위해, dCas9을 이용하여 실험하였다. 여기에서 dCas9은 뉴클레아제 도메인(nuclease domain)의 돌연변이를 통해 유전자에 절단을 만드는 대신 표적 서열에 결합하여 해당 유전자의 발현을 억제시키는 것으로, 표적 유전자로 gusA 유전자를 활용하였다.
구체적으로, gusA 유전자와 dCas9 코딩하는 유전자를 한 플라스미드에 클로닝하여 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor)에 형질전환하고, 기존 dCas9이 발현되는 균주를 SCO0G, 조작된 dCas9이 발현되는 균주를 SCO0G*라고 명명하였다. 또한 이와 비교해 보기 위하여, dCas9 유전자가 포함되지 않고 gusA 유전자만 코딩된 플라스미드를 형질전환한 후 해당 균주를 SCOXG라 명명하였다.
이후 상기 구축된 균주들을 2 mL TSB 배지에서 2일간 2차례 계대 배양하고, 50 mL TSB 배지에 1 mL만큼 옮긴 후 플라스크 배양을 진행하였다. 이후 12시간 간격으로 1 mL 샘플링하여 각각 500 μL씩 용해시켜 DNA 디아민 염색(diamine staining)을 통해 세포 성장을, GusA 어세이를 통해 표적 유전자 발현 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 3A에서 확인할 수 있는 것과 같이, 기존 dCas9의 경우 성장 저해를 일으키는 것으로 확인되었으나, 반면 본 발명의 유전자 조작된 dCas9의 경우에는 성장 저해가 전혀 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 3(A)).
다음으로, dCas9의 세포내 독성을 확인하기 위해, 표적 유전자인 gusA의 kasOp 프로모터, 유전자의 5` region, 및 유전자의 가운데를 타겟팅 하는 가이드 RNA를 각각 pSET152 플라스미드(Addgene, Watertown, Massachusetts, USA)
에 클로닝 하여 형질전환시켰다. 이후, 각 가이드 RNA 유전자를 포함하는(harboring)하는 균주를 기존 dCas9과 같이 발현되는 경우 SCO1G, SCO2G, SCO3G라고 명명하고, 조작된 dCas9의 경우에는 SCO1G*, SCO2G*, SCO3G*로 명명한 후, 각각 배양하였다.
그 결과, 도 3의 B 내지 D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 기존 dCas9은 조작된 dCas9보다 매우 심한 성장 저해(growth inhibition)를 보였다 (도 3의 B, C, D). 또한 1번, 2번 가이드 RNA와 달리 3번 가이드 RNA의 경우에는 기존 dCas9에서 gusA 유전자의 leak expression이 나타났다. 그러나 이와 달리, 본 발명의 유전자 조작된 dCas9에서는 완벽히 발현이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 본 발명의 유전자 조작된 dCas9은 온-타겟(on-target)에 대한 결합 효율이 충분히 높은 것을 알 수 있다 (도 3의 B, C, D). 나아가, 3개의 가이드 RNA를 모두 발현시킨 경우에도 기존 dCas9이 발현되는 균주, SCO3gG는 심각한 성장 저해가 있음이 확인되나, 본 발명의 유전자 조작된 dCas9이 발현되는 균주와 SCO3gG*는 성장 저해가 적게 일어나는 것이 확인되었다 (도 3(E)).
실시예 5: Cas9의 2차 대사산물 생산 증가 확인
상기 실시예 1에서 구축된 Cas9과 실시예 4에서 구축된 dCas9을 활용하여 2차 대사산물 생산이 증가되는지 확인하였다. 특히, 본 발명의 구축된 Cas9은 기존 Cas9과 다르게 복수의 가이드 RNA를 활용할 수 있으므로, 본 발명에서 구축된 Cas9과 dCas9에 다양한 가이드 RNA를 넣은 라이브러리를 구축함으로써 생산이 증가되는지 확인하고자 하였다.
먼저, pCRISPomyces-2 플라스미드에 기존 Cas9 대신 조작된 dCas9을 클로닝한 pdCRISPomyces-2* 플라스미드를 구축 후, 상기 구축된 플라스미드에 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Stretpomyces coelicolor) A3 균주의 유전자들을 표적하는 가이드 RNA들을 랜덤하게 삽입하여 라이브러리를 구축하였다. 표적 유전자로는 2차 대사산물인 악티노로딘(actinorhodin)과 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin)의 전구체인 아세틸-CoA와 malonyl-CoA를 기질로 사용하는 6개의 효소 유전자, pyc, gltA, fabD, fabH, adhE, 및 pta로 해당 라이브러리를 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 균주에 컨쥬게이션하여 2차 대사산물 생산량이 증가되는지 확인하고자 하였다 (도 5(A)). 컨쥬게이션 후 형성된 콜로니 중 색을 띄는 23개 콜로니를 선택하여 2 mL TSB 배지에 접종하였으며, 2일 후 2 mL fresh TSB 배지에 100 μL 옮긴 후 2일간 배양하였다 (도 5(B)). 배양한 브로쓰를 1:1 비율로 메탄올과 섞어 1시간동안 vortexing한 플레이트 리더로 633 nm 파장에서 흡수도(absorption), 530 nm 파장에서 흡광도(absorbance)를 분석하여 각각 악티노로딘(actinorhodin)과 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin) 생산량을 비교하였다.
그 결과 도 5의 C에서 확인할 수 있는 것과 같이, 23개의 균주 중 성장이 저해된 균주를 제외한 대부분의 균주들이 생산량 증가를 보였으며, 그 중 5개 균주를 선별하여 이후 실험에 사용하였다 (도 5(C)). 상기 선별된 균주들은 각각 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3-1,2,12,13 및 16으로 명명하고, 50 mL MS 배지에서 7일 동안 플라스크 배양을 진행하였다. 1일마다 샘플링을 진행하였으며 상기 샘플은 1:1 비율로 메탄올과 섞어 1시간 동안 vortexing을 진행하였다. 이후 상기 샘플을 원심 분리하여 상등액 200 μL를 플레이트 리더로 분석하여 대사산물 생산량을 분석하였다.
그 결과 도 6의 A와 B에서 확인할 수 있는 것과 같이, 모든 균주들이 야생형 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 균주에 비해 증가된 것을 확인할 수 있었다 (도 6(A, B)). 특히, 악티노로딘(actinorhodin)은 최대 7배 생산량이 증가하였으며, 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin)의 경우 최대 4배까지 그 생산량이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 각 균주에서 발현되는 가이드 RNA를 확인하기 위해, 상기 균주들을 배양 후 미디 프렙(midi prep)을 진행하여 플라스미드 추출을 진행하고, 이렇게 얻은 플라스미드를 시퀀싱(sequencing)하였다.
그 결과, 하기 표 2에서 확인할 수 있는 것과 같이, 상기 균주들이 복수의 가이드 RNA를 포함하는(harboring)하고 있는 것을 확인할 수 있었다 (표 2).
균주 Description 악티노로딘(actinorhodin) titer (Abs633) 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin) titer (Abs530)
스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 Wild type Streptomyces coelicolor A3 0.11 ± 0.01 0.20 ± 0.02
스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3* 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 harboring pdCRISPomyces-2* 0.10 ± 0.02 0.18 ± 0.01
스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3-1 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 harboring pdCRISPomyces-2* contained gRNA of gltA, adhE, fabH 0.76 ± 0.03 0.77 ± 0.03
스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3-2 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 harboring pdCRISPomyces-2* contained gRNA of pyc, fabD, fabH and two gRNA of adhE 0.43 ± 0.2 0.49 ± 0.03
스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3-12 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 harboring pdCRISPomyces-2* contained gRNA of gltA and fabD 0.24 ± 0.1 0.31 ± 0.02
스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3-13 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 harboring pdCRISPomyces-2* contained gRNA of adhE and fabH 0.39 ± 0.2 0.44 ± 0.02
스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3-16 스트렙토마이세스 코엘리칼라(S. coelicolor) A3 harboring pdCRISPomyces-2* contained gRNA of pyc, adhE, fabH 0.38 ± 0.01 0.46 ± 0.01
실시예 6: 다양한 방선균에서 Cas9의 2차 대사산물 생산 증가 여부 확인
상기 실시예 1에서 구축된 Cas9이 여러 종류의 방선균에서도 효과적으로 활용 가능한지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 대상으로 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스(Streptomyces antibioticus)의 silence BGC인 오비에도마이신(oviedomycin) BGC와 스트렙토마이세스 라파마이시니쿠스의 라파마이신 BGC에서 여러 유전자의 프로모터를 동시에 엔지니어링하여 생산량이 증가되는지 확인하였다. 표적 유전자로 오비에도마이신(oviedomycin) BGC의 ovmOI, ovmOII, ovmOF를 선정하고 (도 7(A)), 라파마이신 BGC의 rapH, rapA, rapB, rapC 유전자를 선정하였다 (도 8(B)). 상기 유전자 프로모터 부위를 타겟팅하는 가이드 RNA, 상동 부위(homologous region) 및 세 종류의 프로모터인 ErmEp, KasOp, 및 Sp44를 먼저 PCR로 증폭 후 실시예 1에서 구축된 pCRISPomyces-2* 플라스미드에 랜덤하게 클로닝하여 라이브러리를 구축하고, 각 라이브러리를 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스(S. antibioticus)와 스트렙토마이세스 라파마이시니쿠스에 형질전환하였다. 이후, 상기 형질전환한 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스(S. antibioticus) 콜로니를 배양하였다.
그 결과 도 7의 B에서 확인할 수 있는 것과 같이, 오비에도마이신(oviedomycin) BGC가 silence인 야생형과 다르게 오비에도마이신(oviedomycin) 생산에 의해 진한 갈색을 띄는 것을 확인하였다 (도 7(B)). 또한, 상기 콜로니들을 MS 배지에서 배양한 결과, 대부분의 균주에서 silence BGC의 활성 및 생산량 증가를 확인할 수 있었다(도 7(C)). 나아가 시퀀싱 결과, 최대 3개, 복수의 프로모터가 엔지니어링된 것을 확인할 수 있었다 (표 3).
균주 Engineered 프로모터 오비에도마이신(oviedomycin) titer (mg/L)
ovmOI ovmOII ovmOF
S. antibioticus 2.71 ± 0.67
S. antibioticus-1 kasOp ermEp ermEp 83.4 ± 1.70
S. antibioticus-2 kasOp sp44p 34.3 ± 2.01
S. antibioticus-3 ermEp kasOp 22.3 ± 3.19
S. antibioticus-4 ermEp 2.10 ± 0.94
S. antibioticus-5 ermEp ermEp 41.9 ±1.48
또한 형질전환한 스트렙토마이세스 라파마이시니쿠스 균주를 배양한 결과, 3개 균주 중 2 균주에서 생산량 증가를 확인할 수 있었으며 (도 8(B)), 마찬가지로 최대 3개의 프로모터가 엔지니어링된 것을 확인할 수 있었다 (표 4).
균주 Engineered 프로모터 라파마이신 titer (mg/L)
rapH rapA rapB rapC
S. 라파마이신icus 58.2 ± 8.41
S. 라파마이신icus-1 kasOp kasOp 87.7 ± 5.35
S. 라파마이신icus-2 ermEp ermEp 17.6 ± 3.69
S. 라파마이신icus-3 kasOp ermEp kasOp 75.1 ± 5.35
실시예 7: 구축된 Cas9의 상보적 결합 가능성을 증진시키는 유전자 조작
상기 실시예 1에서 구축된 Cas9을 사용한 유전자 조작효율을 높이기 위해서, 상보적 결합의 가능성을 증가시킬 수 있도록 추가적인 유전자 조작을 가하였다.
구체적으로, 기존 Cas9이 두 개의 DNA 서열을 모두 절단하는 것과 다르게 Cas9의 10번째 아미노산 아스파르테이트(aspartate)를 알라닌(alanine)으로 변경할 경우 한 개의 DNA 서열만 절단하는 것으로 알려져 있다. 이렇게 한쪽 서열만 절단될 경우 다시 반대쪽 서열이 DNA 폴리머라제에 의해 재구축 되고, 또 상보적 결합의 가능성이 증가하여 유전자 조작의 효율이 증가할 것으로 기대하여, 이전 폴리 아스파르테이트(poly aspartate)를 연결하여 구축한 Cas9에 추가적인 D10A 점 돌연변이를 진행하였다.
이렇게 구축된 Cas9을 포함하는 플라스미드를 pnCRISPomyces-2*로 명명하고 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Stretpomyces coelicolor) M1152 유전자 조작에 활용하여 그 효율을 확인하고자 하였다. 상기 균주의 유전자 내 5-dimethylallylindole-3-acetonitrile BGC 구역, 17.2 kb와 coelibactin BGC 구역, 36.7 kb의 유전자를 제거할 수 있는지 확인해 보았다. 그 결과 도 9의 A와 B에서 확인할 수 있듯이, 상기 두 개의 구역 모두 완벽한 효율로 제거하는 것을 확인할 수 있었다 (도 9(A, B)).
나아가 더 긴 길이의 유전자를 제거하여 구축한 Cas9의 효율을 확인하고자 앞서 제거한 두 개의 BGC를 모두 포함하는 253.9 kb의 유전자를 제거하고자 하였다. 그 결과 도 9의 C에서 확인할 수 있듯이, 253.9 kb의 유전자가 완벽하게 제거된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 현재까지 방선균 내에서 Cas9을 활용한 유전자 제거 중 가장 긴 길이의 유전자를 제거한 결과이다 (도 9(C)).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (28)

  1. Cas9 단백질의 N-말단과 C-말단에 폴리-아스파르테이트(poly aspartate)가 링커로 연결된, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)유래인 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 서열번호 2의 염기서열 또는 이의 축퇴된 서열로 코딩된 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토마이세스 속 균주에 맞춰 코돈 최적화된 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리-아스파르테이트는 아미노산 3개 내지 10개로 구성된 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 링커는 글리신 링커, 글리신-세린 링커, 리지드 링커(rigid linker), EAAAK 링커 또는 XP 링커인 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 상기 링커는 GGCGGcGGCGGcTCCGGGGGcGGGGGcAGC인 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 상기 유전자 조작된 Cas9 시스템은 서열번호 4의 염기서열 또는 이의 축퇴된 서열로 코딩된 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 10번째 아미노산 아스파르테이트가 알라닌으로 치환된 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 Cas9 기반 기술(Cas9 mediated tool)인 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 상기 Cas9 기반 기술은 dCas9 단백질인 것인, 유전자 조작된 Cas9 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 유전자 조작된 Cas9 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA(가이드 RNA, gRNA)를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 가이드 RNA는 2개 이상의 복수 개로 포함되는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  16. 제14항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 상기 표적 DNA에 상보적인 18 내지 20개의 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 영역을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  17. 제14항에 있어서, 상기 공여 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  18. 제14항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것인, 재조합 벡터.
  20. 제18항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 형질전환체는 방선균인 것인, 형질전환체.
  22. 제20항에 있어서, 상기 형질전환체는 표적 DNA에 대한 오프-타겟 결합 효율(off-target binding affinity)이 감소되고, 온-타겟 절단 효율(on-target cleavage efficiency)이 증진된 것이 특징인, 형질전환체.
  23. 제14항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 편집용 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 유전자 편집은 유전자 넉아웃 또는 표적 유전자 발현 억제인 것인, 유전자 편집용 조성물.
  25. 제14항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 2차 대사산물 증진용 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 2차 대사산물은 악티노로딘(actinorhodin), 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin) 또는 이의 조합인 것인, 2차 대사산물 증진용 조성물.
  27. 제22항의 형질전환체 또는 이의 배양물을 포함하는 2차 대사산물 증진용 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 2차 대사산물은 악티노로딘(actinorhodin), 운데실프로디지오신(undecylprodigiosin) 또는 이의 조합인 것인, 2차 대사산물 증진용 조성물.
KR1020240001788A 2023-01-04 2024-01-04 2차 대사산물 증가를 위한 유전자 조작된 Cas9 시스템과 이를 이용한 2차 대사산물 증진 방법 KR20240109932A (ko)

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