CN110606894B - 提高基因编辑效率的Cas9融合蛋白、编码基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高基因编辑效率的Cas9融合蛋白、编码基因及其应用。本发明要解决的技术问题是提高CRISPR‑Cas9系统在基因组靶位点的编辑效率，尤其是提高在低活性靶位点上的编辑效率。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种Cas9融合蛋白。该Cas9融合蛋白的碳端连接了一段来源于拟南芥泛素受体蛋白RAD23a的UBA2结构域。进一步的，本发明还提供了该Cas9融合蛋白的编码基因。基于本发明Cas9融合蛋白编码基因构建的CRISPR‑Cas9基因编辑系统能够有效的增加不同基因位点，特别是低效率位点的基因编辑效率。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高基因编辑效率的Cas9融合蛋白、编码基因及其应用。
背景技术
基因编辑技术已经成为基因功能分析、基因治疗、物种改良等基础研究与应用研究的常规技术方法，其中CRISPR-Cas9基因编辑系统因其构建简单、剪切高效、成本低廉，成为应用最广泛的基因编辑技术。然而由于CRISPR-Cas9的作用依赖sgRNA与Cas9的配合，识别位点依赖于NGG，因此该系统在应用中还存在脱靶现象从而影响编辑效率。另外，该系统在不同物种或不同位点的编辑效率差异较大，有些位点效率高达100％，有些却仅有1％，甚至没有编辑效率，因此迫切的需要高效稳定的CRISPR-Cas9编辑系统，以实现基因组内无差别的高效基因编辑。
为了提高CRISPR-Cas9系统在基因组靶位点的编辑效率，本领域通常的技术方案是提高Cas9蛋白的表达量或自身活性。从蛋白质表达的基本分子机制可知，通过增强转录、翻译的水平等方式可以提高蛋白的表达量，为此本领域技术人员在之前的报道中尝试了多种手段提高Cas9蛋白在细胞内的表达量及活性，以期提高CRISPR-Cas9系统在基因组靶位点的编辑效率。这些报道过的手段主要包括两个方面：一是对Cas9蛋白进行定向进化等方式优化Cas9蛋白的结构以筛选高活性蛋白；二是在表达系统中使用合适的强启动子以增加Cas9基因的表达量等。这些改进方法都可以一定程度的提高Cas9蛋白的表达量和活性，并影响其基因编辑效率，但对于一些低活性位点的作用却不明显，难以实现基因组内无差别的高效、稳定、定向基因编辑。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高CRISPR-Cas9系统在基因组靶位点的编辑效率，尤其是提高在低活性靶位点上的编辑效率。
本发明解决技术问题的技术方案是提供一种Cas9融合蛋白。该Cas9融合蛋白的碳端连接了一段来源于拟南芥泛素受体蛋白RAD23a的UBA2结构域，该UBA2结构域的氨基酸序列为EEQESIERLEAMGFDRAIVIEAFLSCDRNEELAANYLLE(Seq ID No.2)。
进一步的，上述Cas9融合蛋白的氨基酸序列为Seq ID No.11所示。
本发明还提供了上述Cas9融合蛋白的编码基因。
优选的，上述Cas9融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.10中的1～4221位核苷酸所示。
本发明还提供了含有上述编码基因的表达载体。
其中，上述表达载体中含有核苷酸序列如Seq ID No.10所示的Cas9融合蛋白表达框。
进一步的，上述表达载体中还含有gRNA克隆及转录单元(gRNA cloningscaffold，gRNA CS)。
本发明还提供了上述表达载体在建立CRISPR-Cas9基因编辑系统中的用途。
基于上述方案，本发明也提供了一种基因编辑的方法。该方法使用上述了表达载体为CRISPR-Cas9基因编辑系统提供Cas9蛋白活性。
进一步的，该方法包括以下步骤：
a、骨架载体构建：以pTX172载体为基本骨架，将权利要求3或4所述的Cas9融合蛋白编码基因替换其中的Cas9蛋白编码基因，构建CRISPR-Cas9骨架载体；
b、定向基因编辑载体构建：针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及sgRNA，人工合成sgRNA的引物对，将引物对退火形成带粘性末端的双链DNA，将双链DNA替换pTX172载体骨架中的ccdB元件，获得定向编辑表达载体；
c、定向基因编辑及检测：使用步骤b得到定向编辑表达载体转化原生质体，检测原生质体的基因定向编辑情况，将成功定向编辑的原生质体培养得到定向基因编辑植株；
或者使用步骤b得到定向编辑表达载体转入根癌农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体导入目标植物，获得定向基因编辑植株。
使用pTX172载体为骨架时，上述方法主要用于对植物的定向基因编辑。优选的，上述方法中的植物为水稻。
本发明的有益效果在于提供了一种能提高CRISPR-Cas9系统基因编辑效率的Cas9融合蛋白编码基因及相应的基因编辑系统的构建方法。基于本发明Cas9融合蛋白编码基因构建的CRISPR-Cas9基因编辑系统能够有效的增加不同基因位点，特别是低效率位点的基因编辑效率。通过实施例表明，可将一般效率的靶位点的基因编辑效率从40-50％提高到90％，可将在低效率靶位点上从<10％到60％左右。在实现基因组中高效无差别的基因编辑有广阔的应用前景。
附图说明
图1、本发明中Cas9-UBA-SD2定向编辑系统的载体构建示意图。Cas9系统：对照及骨架载体pTX172的Cas9及sgRNA表达框部分；Cas9-UBA-SD2系统：融合UBA-SD2结构域的pZXL-UBA-SD2载体示意图；Cas9-UBA-SD2定向编辑载体：针对OsPDS-sgRNA02位点的pZXL-UBA-SD2-OsPDS-sg02载体示意图；pZmUbi：玉米Ubiquitin启动子；SpCas9：化脓链球菌来源的Cas9蛋白基因；UBA-SD2：经密码子优化的泛素相关结构域基因；NLS：核定位信号；pA：poly(A)序列；RZ位点：核酶剪切位点；ccdB：ccdB致死基因；RZ：核酶序列。
图2、基于原生质体瞬时转化体系的不同Cas9-UBA编辑系统剪切活性检测结果。OsPDS-sg02：OsPDS-sgRNA02靶位点不同编辑系统的剪切活性；OsDEP1-sg02：OsDEP1-sgRNA02靶位点不同编辑系统的剪切活性；Cas9：基于pTX172的CRISPR-Cas9系统；UBA1：基于Cas9-UBA1融合蛋白的编辑系统；UBA2：基于Cas9-UBA2融合蛋白的编辑系统；UBA3：基于Cas9-UBA3融合蛋白的编辑系统；UBA-SD1：基于Cas9-UBA-SD1融合蛋白的编辑系统；UBA-SD2：基于Cas9-UBA-SD2融合蛋白的编辑系统；UBA-SD3：基于Cas9-UBA-SD3融合蛋白的编辑系统。
图3、水稻稳定转化植株中不同Cas9-UBA-SD编辑系统在OsPDS-sgRNA02靶位点的编辑效率检测结果。A：OsPDS-sgRNA02位点的编辑效率酶切检测结果，M：分子量标记；WT：野生型植株扩增片段；WT+：野生型植株扩增片段经HindIII酶切；1、2、3、…15：不同单株的转基因植株扩增片段经HindIII酶切结果；CRISPR-Cas9：基于pTX172的CRISPR-Cas9系统；Cas9-UBA-SD1：基于Cas9-UBA-SD1融合蛋白的编辑系统；Cas9-UBA-SD2：基于Cas9-UBA-SD2融合蛋白的编辑系统；Cas9-UBA-SD3：基于Cas9-UBA-SD3融合蛋白的编辑系统。B：不同基因编辑系统在OsPDS-sgRNA02靶位点的定向突变效率统计结果。
图4、不同Cas9融合蛋白的定向编辑突变体OsPDS-sgRNA02靶位点测序结果。CRISPR-Cas9：作为对照的基于pTX172的CRISPR-Cas9编辑系统；Cas9-UBA-SD1：基于Cas9-UBA-SD1融合蛋白的编辑系统；Cas9-UBA-SD2：基于Cas9-UBA-SD2融合蛋白的编辑系统；Cas9-UBA-SD3：基于Cas9-UBA-SD3融合蛋白的编辑系统。
图5、基于融合蛋白Cas9-UBA-SD2的定向编辑系统在OsCKX6-sgRNA01靶位点的编辑效率检测结果。A：OsCKX6-sgRNA01位点的编辑效率酶切检测结果，M：分子量标记；WT：野生型植株扩增片段；WT+：野生型植株扩增片段经SacI酶切；1、2、3、…11：不同单株的转基因植株扩增片段经SacI酶切；CRISPR-Cas9：基于pTX172的CRISPR-Cas9系统；Cas9-UBA-SD2：基于Cas9-UBA-SD2融合蛋白的编辑系统。B：CRISPR-Cas9与Cas9-UBA-SD2基因编辑系统在OsCKX6-sgRNA01靶位点的定向突变效率统计结果。
具体实施方式：
如背景技术所述，为了提高CRISPR-Cas9系统在基因组靶位点的编辑效率，本领域通常的技术方案是提高Cas9蛋白的表达量或自身活性。报道过的手段主要包括两个方面：一是对Cas9蛋白进行定向进化等方式优化Cas9蛋白的结构以筛选高活性蛋白；二是在表达系统中使用合适的强启动子以增加Cas9基因的表达量等。这些改进方法都可以一定程度的提高Cas9蛋白的表达量和活性，并影响其基因编辑效率，但对于一些低活性位点的作用却不明显，难以实现基因组内无差别的高效、稳定、定向基因编辑。
为解决目前这一困扰本领域的难题，本发明想到从另一个前人没有想到的角度入手。本发明的思考在于Cas9蛋白的剪切活性与其在细胞内的有效含量密不可分，而每一个蛋白在胞内的有效含量都受到细胞精确的调控和平衡，除了与表达水平(入库)有关外，还与蛋白的降解(出库)息息相关。调节蛋白在胞内的有效含量，从“入库”、“出库”两个方面同时入手，可能才会有更显著的效果。以往单方面的提高蛋白转录翻译水平或优化Cas9蛋白自身结构的方式虽然可以增加Cas9在细胞内的表达或本身的活性水平，但是却忽略了对Cas9蛋白降解的有效抑制。因此，本发明考虑能否在增加Cas9蛋白表达量的基础上进一步增强其蛋白的稳定性，延长半衰期，提高Cas9蛋白在胞内的有效含量，从而提高Cas9蛋白在基因组内的编辑效率，实现基因组内无差别的高效、稳定、定向编辑。
蛋白在细胞内的降解途径较多，其中典型的是泛素/26S蛋白酶体途径进行最终的降解。但是这一过程十分复杂，涉及大量特异蛋白及酶的参与，影响因素众多。通过筛选大量文献，发现一类UBA(Ubiquitin Associated domain)结构域在很多蛋白质中均存在，其作用主要是作为泛素结合结构域，在蛋白质的降解过程有所参与。而之前在拟南芥中的一项研究显示，将来自泛素受体蛋白RAD23a和DDI1的泛素相关结构域UBA1、UBA2、UBA与内源的转录因子HFR1PIF3及胞内信号蛋白分子茉莉酸信号通路中蛋白JAZ10.1融合，增强了这些转录因子和信号分子的稳定性(Jang等，Enhancing protein stability with retainedbiological function in transgenic plants，2012，The Plant Journal)。
发明人考虑能否利用细胞的这一内源降解体系，将能增强拟南芥中内源转录因子稳定性的UBA结构域与古细菌来源的外源核酸酶Cas9蛋白融合，在其他植物中进行基因编辑，是否有可能提高Cas9蛋白在其他植物的细胞内的稳定性，进而提高其胞内瞬时有效含量，以达到提高基因编辑活性的目的。为此，在本发明的一个实施例中，将拟南芥RAD23a蛋白的UBA1、UBA2结构域，DDI1蛋白的UBA结构域(本发明中统一编号为UBA3)分别与Cas9蛋白融合，在水稻中进行基因编辑，以期增加Cas9蛋白的稳定性与基因编辑活性。但水稻原生质体基因剪切活性的检测结果显示，融合了这三个UBA结构域的Cas9融合蛋白在基因编辑效率上没有明显提高，反而有所下降。
发明人在此基础上进行了深入思考，考虑到是否是跨物种的差异，水稻在转录翻译表达系统与胞内蛋白降解系统都有可能与拟南芥有所不同，试图通过对UBA结构域的编码基因进行密码子的优化来增强其表达和抑制其降解，以提高编辑效率。对三个UBA结构域都进行了密码子偏好性的优化，发现融合了三个密码子优化后的UBA-SD结构域的Cas9蛋白，在水稻原生质体活性检测中表现出比对照稍好的剪切活性，似乎表明了密码子优化是一个有效的手段。但是，通过进一步的稳定转化结果却显示，对UBA1、UBA进行密码子优化后的编码基因UBA-SD1与UBA-SD3并没有明显提高Cas9蛋白的基因编辑效率，而优化后的UBA2的编码序列UBA-SD2可以显著的提高Cas9蛋白的基因编辑效率，特别是在低活性位点，其效率增加量高达600％，超出了预期。
就本发明的具体实施而言，在前述公开的信息的基础上，本领域技术人员根据本领域的已公开信息、常规实验操作方法和各种相应的试剂盒及使用说明，是能够利用本发明Cas9-UBA融合蛋白的编码基因构建各种Cas9-gRNA重组载体，配合目前的Cas9-gRNA方法，实现基因编辑。关于重组载体的选择，可以根据使用的Cas9-gRNA基因编辑体系进行挑选。可以使用传统的Cas9和gRNA分别在两个载体中表达的体系。为了更方便操作，也可以使用Cas9和gRNA在同一个载体中表达的体系。而Cas9和gRNA在同一个载体中表达的体系中，Cas9和gRNA可以由不同的启动子启动表达。为了更好地实现Cas9和gRNA的协同表达，可以使用一个启动子同时表达Cas9和gRNA。比如，使用中国专利文献CN105132451A中公开的使用一个启动子实现Cas9和多个gRNA共表达的载体。
在本发明的一个实施例中，使用的是与中国专利文献CN105132451A中公开的载体结构相似的pTX172载体(Tang等，A Single Transcript CRISPR-Cas9 System forEfficient Genome Editing in Plants,2016,Molecular Plant)。通过原生质、基因枪及农杆菌介导的多种转化方法，将构建的Cas9-gRNA重组载体转入植物细胞，使转化细胞同时具有Cas9核酸酶蛋白及针对特定基因组目标序列的gRNA单元；在Cas9核酸酶蛋白及gRNA单元共同作用下，实现高效基因编辑。本发明所述的CRISPR/Cas9载体在植物中应用时，可以使用包括卡那霉素、潮霉素、basta等抗性基因进行植物转化子筛选，由阳性转化子细胞或组织(如原生质体或愈伤组织)分化再生，得到而来包含目标位点定向修饰的再生植株。也可使用装载本发明所述的CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体导入植物，以获得稳定的转基因植株。
具体的，该方法包括以下步骤：
1、骨架载体构建。以pTX172载体为基本骨架，该载体由玉米强启动子Ubiquitin启动Cas9蛋白和sgRNA单元的共同转录。将pTX172载体用FD-HpaI和FD-SmaI限制性内切酶进行酶切，酶切回收产物与前述Cas9-UBA-SD2融合蛋白基因片段通过Gibson组装法组装，取Gibson组装产物转化大肠杆菌菌株DB3.1感受态细胞，进行菌落PCR的阳性鉴定，其阳性扩增产物长度约1500bp。进一步酶切和测序验证所得载体的序列，从而构建得到CRISPR-Cas9-UBA-SD2骨架载体pZXL-UBA-SD2(参见图1)，该骨架载体的CRISPR-Cas9-UBA-SD2-NLS区序列如SEQ ID No.10所示。
2、定向基因编辑载体构建。针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点sgRNA，人工合成sgRNA引物对，引物对混匀经95℃变性，退火形成粘性末端的靶基因双链DNA。将退火片段和pZXL-UBA-SD2载体的BsaⅠ酶切产物利用Golden Gate法克隆连接。连接程序结束后，取反应产物加入大肠杆菌DH5a感受态细胞中进行转化，涂布含Kan的LB固体培养基平板培养。经单克隆菌落PCR鉴定阳性菌落，对阳性菌落进行提取质粒、酶切、测序等验证，获得定向编辑表达载体pZXL-UBA-SD2(图1)。
3、定向基因编辑及检测。定向基因编辑及效果的检测可以分别用以下方法进行：
a、通过PEG介导的原生质体制备及转化体系进行水稻原生质体瞬时转化，并提取gDNA，通过检测对CRISPR-Cas9-UBA-SD2编辑系统的剪切活性进行初步评价。
b、将CRISPR-Cas9-UBA-SD2载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，如根癌农杆菌EHA105，筛选得到阳性克隆。通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体导入目标植物，则可获得稳定的转基因植株。可对获得的转基因株系逐一进行定向突变体检测。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1 不同Cas9-UBA融合蛋白的骨架载体构建
1、不同UBA编码序列的合成及优化：
根据Jang等2012年在the Plant Journal期刊(Jang,Enhancing proteinstability with retained biological function in transgenic plants.2012,PlantJournal)公布的拟南芥AtRAD23a基因(GenBank：AT1G16190)的cDNA序列及UBA1、UBA2的氨基酸序列(Seq ID No.1、Seq ID No.2)，以及AtDDI1基因(GenBank：AT3G13235)的cDNA序列及UBA3的氨基酸序列(Seq ID No.3)，分别合成拟南芥UBA1(Seq ID No.4)、UBA2(Seq IDNo.5)和UBA3(Seq ID No.6)基因片段。通过水稻密码子偏好性优化，分别设计和合成新的UBA-SD1(Seq ID No.7)、UBA-SD2(Seq ID No.8)、UBA-SD3(Seq ID No.9)基因片段。
2、不同Cas9-UBA融合蛋白的基因片段获得：
表1构建不同Cas9-UBA融合蛋白的引物及用途
| 引物名称 | 引物序列 | 引物用途 |
| Cas9-F | gctctcccatctaagtacgttaactttc(SEQ ID No.12) | Cas9蛋白融合部分引物5-端 |
| ccdB-R | gagtgatattattgacacgcccgggcgac(SEQ ID No.13) | ccdB蛋白融合部分引物3-端 |
| UBA1-A | ttgctcaatactactgccatcaccaccgagctg(SEQ ID No.14) | Cas9-UBA1/UBA-SD1融合部分引物3-端 |
| UBA1-B | ctcggtggtgatggcagtagtattgagc(SEQ ID No.15) | Cas9-UBA1/UBA-SD1融合部分引物5-端 |
| UBA1-C | cttcttaggatcagcccttgaagaatatagataatcc(SEQ ID No.16) | UBA1-NLS融合部分引物3-端 |
| UBA1-D | ctatattcttcaagggctgatcctaagaagaagag(SEQ ID No.17) | UBA1-NLS融合部分引物5-端 |
| UBA-SD1-C | cttcttaggatcagcccttgaagagtagaggtaatcc(SEQ ID No.18) | UBA-SD1-NLS融合部分引物3-端 |
| UBA-SD1-D | ctctactcttcaagggctgatcctaagaagaagag(SEQ ID No.19) | UBA-SD1-NLS融合部分引物5-端 |
| UBA2-A | aattgattcttgctcttcatcaccaccgagctg(SEQ ID No.20) | Cas9-UBA2/UBA-SD2融合部分引物3-端 |
| UBA2-B | gctcggtggtgatgaagagcaagaatca(SEQ ID No.21) | Cas9-UBA2/UBA-SD2融合部分引物5-端 |
| UBA2-C | ggatcagcccttgactctagtagatagtttgcag(SEQ ID No.22) | UBA2-NLS融合部分引物3-端 |
| UBA2-D | ctatctactagagtcaagggctgatcctaa(SEQ ID No.23) | UBA2-NLS融合部分引物5-端 |
| UBA-SD2-C | ggatcagcccttgactcaaggaggtagtttgcag(SEQ ID No.24) | UBA-SD2-NLS融合部分引物3-端 |
| UBA-SD2-D | ctacctccttgagtcaagggctgatcctaa(SEQ ID No.25) | UBA-SD2-NLS融合部分引物5-端 |
| UBA3-A | cttggcttcaaaatcaccaccgagctgtg(SEQ ID No.26) | Cas9-UBA3/UBA-SD3融合部分引物3-端 |
| UBA3-B | gctcggtggtgattttgaagccaagattgc(SEQ ID No.27) | Cas9-UBA3/UBA-SD3融合部分引物5-端 |
| UBA3-C | ggatcagcccttgagccaaagagaaacccag(SEQ ID No.28) | UBA3-NLS融合部分引物3-端 |
| UBA3-D | ggtttctctttggctcaagggctgatcctaagaa(SEQ ID No.29) | UBA3-NLS融合部分引物5-端 |
| UBA-SD3-C | ggatcagcccttgagccgaagaggaacccag(SEQ ID No.30) | UBA-SD3-NLS融合部分引物3-端 |
| UBA-SD3-D | ggttcctcttcggctcaagggctgatcctaagaa(SEQ ID No.31) | UBA-SD3-NLS融合部分引物5-端 |
为了获得不同的Cas9基因3’末端片段，以pTX172(Tang等，A Single TranscriptCRISPR-Cas9 System for Efficient Genome Editing in Plants,2016,MolecularPlant)载体的Cas9基因片段为模板，Cas9-F(见表1)和不同的后缀为A的引物(见表1)为上下游引物，建立以下KOD-Plus-Neo PCR反应体系：10×KOD-Plus-Neo缓冲液，5uL；dNTPs(2mM)，3uL；MgSO4(25mM)，5uL；Cas9-F，1uL；引物A，1uL；KOD-Plus-Neo高保真Taq酶，1uL；pTX172质粒DNA，1uL；ddH2O，32uL。KOD-Plus-Neo PCR反应程序如下：94℃，2min；(94℃，30s；56℃，30s；68℃，30s/Kb)×35个循环；68℃，5min；12℃，5min。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收。
为了获得不同的UBA融合片段，分别以人工合成的UBA1、UBA2、UBA3、UBA-SD1、UBA-SD2、UBA-SD3基因片段为模板，相应的后缀为B的引物(见表1)和后缀为C的引物(见表1)为上下游引物，建立如前所述的KOD-Plus-Neo PCR扩增体系，并按照如前所述的KOD-Plus-Neo PCR反应程序扩增，获得的PCR产物将1％琼脂糖凝胶电泳后回收。
为了获得不同的ccdB基因5’末端片段，以pTX172载体为模板，不同的后缀为D的引物(见表1)和ccdB-R(见表1)为上下游引物，建立如前所述的KOD-Plus-Neo PCR扩增体系，并按照如前所述的KOD-Plus-Neo PCR反应程序扩增，获得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收。
将获得的不同Cas9基因3’末端片段，UBA融合片段，ccdB基因5’末端片段混合产物作为模板，以Cas9-F(同上，见表1)和ccdB-R(同上，见表1)为上下游引物，进行融合PCR扩增，反应体系和反应程序如前所述，获得约910bp的不同Cas9-UBA融合蛋白基因片段，经1％琼脂糖凝胶电泳后回收。
3、构建基于pTX172的不同CRISPR-Cas9-UBA编辑系统骨架载体
如图1所示以pTX172载体为基本骨架，该载体由玉米强启动子Ubiquitin启动Cas9蛋白和sgRNA单元的共同转录。将pTX172载体用FD-HpaI和FD-SmaI限制性内切酶进行酶切，酶切体系如下：10×Fastdigest Green Buffer，3uL；FD-HpaI，1uL；FD-SmaI，1uL；pTX172质粒DNA(2ug)，1uL；ddH2O，24uL；37℃，1h～2h。酶切片段大小约为870bp和14680bp，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收约为14680bp片段。进一步酶切和测序验证所得载体的序列，从而构建得到CRISPR-Cas9-UBA-SD2骨架载体pZXL-UBA-SD2(图1)。
将pTX172酶切回收产物分别与前述不同的Cas9-UBA融合蛋白基因片段通过Gibson组装法组装，反应体系如下：Gibson Assemble Mix，15uL；pTX172酶切片段，2uL(50ng)；不同Cas9-UBA融合片段，3uL(摩尔量为载体的10倍)；50℃，1h。反应结束后，取6uLGibson组装产物转化大肠杆菌菌株DB3.1感受态细胞，涂布含Kan(50mg/L)抗生素的LB固体平板，37℃培养18～22h。
分别挑取平板上单克隆菌落至含50uL灭菌去离子水中稀释混匀，取5uL该菌液作为模板，Cas9-F(同上，见表1)和ZY065-RB(5'-ttctaataaacgctcttttctct-3'，SEQ IDNo.32)为上下游引物，进行菌落PCR的阳性鉴定，其阳性扩增产物长度约1500bp。进一步酶切和测序验证所得载体的序列，从而构建得到不同的CRISPR-Cas9-UBA骨架载体：pZXL-UBA1、pZXL-UBA2、pZXL-UBA3、pZXL-UBA-SD1、pZXL-UBA-SD2、pZXL-UBA-SD3。其中骨架载体pZXL-UBA-SD2的CRISPR-Cas9-UBA-SD2-NLS区序列见Seq ID No.10，其中的第1～4104位是Cas9编码序列，4105～4221位是UBA-SD2编码序列，4222～4233位是连接Cas9融合蛋白和NLS核定位信号的连接序列，4234～4254是NLS核定位信号，4255～4257是终止密码子。
实施例2 基于原生质体瞬时表达系统的不同Cas9-UBA融合蛋白剪切活性检测
1、不同Cas9-UBA系统的内源基因靶位点定向突变载体构建
表2、构建OsPDS及OsDEP1靶位点定向突变载体的引物及用途
| 引物名称 | 引物序列 | 引物用途 |
| OsPDS-sg02-F | cggacttgagcttcaacataagct(SEQ ID No.33) | 合成OsPDS-sgRNA02上游引物 |
| OsPDS-sg02-R | aaacagcttatgttgaagctcaag(SEQ ID No.34) | 合成OsPDS-sgRNA03下游引物 |
| OsPDS-F | caagattcccagaagtacatcgta(SEQ ID No.35) | OsPDS突变PCR-RFLP(HindIII)检测上游引物 |
| OsPDS-R | gagtacatgaagcatttcatcctca(SEQ ID No.36) | OsPDS突变PCR-RFLP(HindIII)检测下游引物 |
| OsDEP1-sg02-F | cggaactgcagtgcgtgctgcgct(SEQ ID No.37) | 合成OsDEP1-sgRNA02上游引物 |
| OsDEP1-sg02-R | aaacagcgcagcacgcactgcagt(SEQ ID No.38) | 合成OsDEP1-sgRNA02下游引物 |
| OsDEP1-F | ctagtccagggatgtaatcatctt(SEQ ID No.39) | OsDEP1突变PCR-RFLP(HhaI)检测上游引物 |
| OsDEP1-R | gcagttgcactgggacttga(SEQ ID No.40) | OsDEP1突变PCR-RFLP(HhaI)检测下游引物 |
针对水稻八氢番茄红素脱氢酶基因OsPDS和直立型密穗基因OsDEP1分别设计靶位点，人工合成其相应的上下游引物(见表2)。上下游引物各取20uL混匀，经95℃变性10min，自然冷却退火形成粘性末端的靶位点双链DNA。将退火片段和BsaⅠ酶切的不同Cas9-UBA骨架载体产物利用Golden Gate法克隆连接(图1)。Golden Gate反应体系如下：10×T4ligase缓冲液，2uL；BsaⅠ，1uL；T4DNA连接酶，1uL；Cas9-UBA骨架载体酶切产物(100ng)，1uL；不同内源基因靶位点退火产物(10mM)，2uL；ddH2O，13uL。反应程序如下：(37℃，5min；16℃，10min)×10个循环；37℃，10min；80℃，10min。程序结束后，取6uL Golden Gate反应产物加入大肠杆菌DH5a感受态细胞中进行转化，涂布含Kan(50mg/L)LB固体培养基平板培养18-22h。经单克隆菌落PCR鉴定阳性菌落(体系如前所述)，对阳性菌落进行提取质粒、酶切、测序等验证，获得不同内源基因靶位点的定向编辑表达载体。
根据以上方法，构建获得OsPDS-sgRNA02靶位点的不同定向编辑载体：pTX172-OsPDS-sg02、pZXL-UBA1-OsPDS-sg02、pZXL-UBA2-OsPDS-sg02、pZXL-UBA3-OsPDS-sg02、pZXL-UBA-SD1-OsPDS-sg02、pZXL-UBA-SD2-OsPDS-sg02、pZXL-UBA-SD3-OsPDS-sg02；以及OsDEP1-sgRNA02靶位点的不同定向编辑载体：pTX172-OsDEP1-sg02、pZXL-UBA1-OsDEP1-sg02、pZXL-UBA2-OsDEP1-sg02、pZXL-UBA3-OsDEP1-sg02、pZXL-UBA-SD1-OsDEP1-sg02、pZXL-UBA-SD2-OsDEP1-sg02、pZXL-UBA-SD3-OsDEP1-sg02。
2、不同Cas9-UBA系统的剪切活性检测
通过PEG介导的水稻原生质体制备及转化体系(Zhang等，A highly efficientrice green tissue protoplast system for transient gene expression andstudying light/chloroplast-related processes.Plant Methods,2011,7(1):30)，将30ug上述OsPDS-sgRNA02和OsDEP1-sgRNA02靶位点的不同载体质粒进行水稻原生质体瞬时转化，并提取gDNA，对定向编辑靶位点片段OsPDS-sgRNA02或OsDEP1-sgRNA02进行PCR扩增，扩增引物见表2，扩增体系如下：10×Taq Buffer，2.5uL；Taq DNA Polymerase(2.5U/μL)，0.4uL；dNTPs(10mM)，0.5uL；上游检测引物F，0.5uL；下游检测引物R，0.5uL；gDNA(100ng/μL)，2uL；ddH2O，18.6uL。扩增程序如下：95℃，3min；(95℃，30s；56℃，20s；72℃，40s)×28个循环；72℃，5min；12℃，5min。获得的PCR扩增产物分别用HindIII、HhaI限制性内切酶酶切，若为野生型会得到较小的两条带，若为突变体则只有一条较大的抗性条带。通过检测抗性条带与酶切条带的量，对不同的Cas9-UBA编辑系统的剪切活性进行初步评价。
如图2所示，与pTX172(Cas9)对照相比，pZXL-UBA1、pZXL-UBA2、pZXL-UBA3三个编辑系统在OsPDS-sgRNA02和OsDEP1-sgRNA02两个靶位点的活性均显著下降；pZXL-UBA-SD1、pZXL-UBA-SD2、pZXL-UBA-SD3三个编辑系统在两个靶位点的剪切活性有所提高，但与对照相比没有显著差异。该结果表明融合经密码子优化的泛素相关结构域UBA-SD不会降低Cas9蛋白的剪切活性，还略有提高。
实施例3 不同Cas9-UBA-SD融合蛋白对OsPDS-sgRNA02靶位点的编辑效率比较
1、基于不同编辑系统的OsPDS-sgRNA02定向编辑载体稳定转化水稻
以冻融法将pTX172-OsPDS-sg02、pZXL-UBA-SD1-OsPDS-sg02、pZXL-UBA-SD2-OsPDS-sg02、pZXL-UBA-SD3-OsPDS-sg02载体分别转入根癌农杆菌EHA105，筛选阳性克隆。通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体分别导入水稻日本晴，以获得稳定的转基因植株(Hiei等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.1994.PlantJournal,6(2):271-282.)。
2、不同编辑系统在OsPDS-sgRNA02靶位点的定向编辑效率检测
采用前述原生质体中相同的检测方法，对获得的不同编辑系统的转基因株系逐一进行定向突变检测，部分PCR-RFLP检测结果见图3-A。图3-B的统计结果显示：pTX172-OsPDS-sg02(CRISPR-Cas9系统)对照中，突变比率约53.33％；pZXL-UBA-SD1-OsPDS-sg02(Cas9-UBA-SD1系统)的突变效率约为53.13％，pZXL-UBA-SD2-OsPDS-sg02(Cas9-UBA-SD2系统)突变体效率达到90.32％，pZXL-UBA-SD3-OsPDS-sg02(Cas9-UBA-SD3系统)突变效率为46.67％。由图可知，pZXL-UBA-SD2编辑系统与对照Cas9编辑系统相比定向编辑效率有显著的提高，该结果表明融合UBA-SD2的CRISPR-Cas9-UBA-SD2编辑系统显著的提高了Cas9系统的基因编辑效率。
随机挑取不同编辑系统的OsPDS-sgRNA02位点定向编辑植株进行测序，基因型分析表明(图4)：Cas9-UBA-SD1、Cas9-UBA-SD2、Cas9-UBA-SD3三种编辑系统的剪切方式与对照CRISPR-Cas9系统相比均没有明显差异，大部分为PAM邻近端的第3、4碱基处发生1bp的插入或缺失。该结果表明融合UBA-SD没有影响Cas9蛋白的剪切模式。
实施例4 Cas9-UBA-SD2融合蛋白编辑系统显著提高水稻OsCKX6基因的定向编辑效率
1、基于Cas9-UBA-SD2编辑系统的OsCKX6基因靶位点定向突变载体构建
表3、构建OsCKX6-sgRNA01靶位点定向突变载体的引物及用途
| 引物名称 | 引物序列 | 引物用途 |
| OsCKX6-sg01-F | cggaccgagatcgcggagctcgtc(SEQ ID No.41) | 合成OsCKX6-sgRNA1上游引物 |
| OsCKX6-sg01-R | aaacgacgagctccgcgatctcgg(SEQ ID No.42) | 合成OsCKX6-sgRNA1下游引物 |
| OsCKX6-F1 | tgatcaactgcaaagcgtcc(SEQ ID No.43) | OsCKX6突变PCR-RFLP(SacI)检测上游引物 |
| OsCKX6-R1 | cgagcacgttggcgatctg(SEQ ID No.44) | OsCKX6突变PCR-RFLP(SacI)检测下游引物 |
选取水稻内源基因OsCKX6的靶位点sgRNA01(ccgagatcgcggagctcgtccgg，SEQ IDNo.45，下划线为SacI酶切位点，末尾三个加粗碱基为PAM位点)，已有研究表明该位点在Cas9编辑系统的定向编辑中表现出极低的编辑效率(9.09％，图5)。人工合成其相应的上下游引物OsCKX6-sg01-F和OsCKX6-sg01-R(见表3)，各取20uL混匀，经95℃变性10min，自然冷却退火形成粘性末端的靶基因双链DNA。将退火片段和pZXL-UBA-SD2骨架载体的BsaⅠ酶切产物利用Golden Gate法克隆连接，Golden Gate反应体系如下：10×T4ligase缓冲液，2uL；BsaⅠ，1uL；T4DNA连接酶，1uL；pZXL-UBA-SD2骨架载体酶切产物(100ng)，1uL；OsCKX6-sgRNA01退火产物(10mM)，2uL；ddH2O，13uL。反应程序如下：(37℃，5min；16℃，10min)×10个循环；37℃，10min；80℃，10min。程序结束后，取6uL Golden Gate反应产物加入大肠杆菌DH5a感受态细胞中进行转化，涂布含Kan(50mg/L)LB固体培养基平板培养18-22h。经单克隆菌落PCR鉴定阳性菌落(体系如前所述)，对阳性菌落进行提取质粒、酶切、测序等验证，获得OsCKX6-sgRNA01的定向编辑表达载体pZXL-UBA-SD2-OsCKX6-sg01，同样方法构建对照pTX172-OsCKX6-sg01载体。
2、不同编辑系统的OsCKX6-sgRNA01靶位点定向编辑效率比较
以冻融法将pTX172-OsCKX6-sg01和pZXL-UBA-SD2-OsCKX6-sg01载体分别转入根癌农杆菌EHA105，筛选阳性克隆。通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体分别导入水稻日本晴，以获得稳定的转基因植株(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof the T-DNA.1994.Plant Journal,6(2):271-282.)。
对获得的pTX172-OsCKX6-sg01和pZXL-UBA-SD2-OsCKX6-sg01载体转基因株系逐一进行定向突变体检测，PCR-RFLP检测结果如(图5)所示：pTX172-OsCKX6-sg01突变比率极低(1/11)，仅为9.09％，pZXL-UBA-SD2-OsCKX6-sg01突变比率达到(7/11)63.64％，提高了近6倍。该结果表明融合UBA-SD2的CRISPR-Cas9-UBA-SD2编辑系统显著的提高了Cas9系统在低活性位点的编辑效率。
综合上述各实施例结果可见：在原生质体中的活性检测结果表明Cas9-UBA-SD2融合蛋白在水稻OsPDS-sgRNA02和OsDEP1-sgRNA02两个位点中均表现出比对照更好的剪切活性，提高了相应位点的编辑活性。水稻稳定转化的结果显示Cas9-UBA-SD2融合蛋白在OsPDS-sgRNA02和OsCKX6-sgRNA01两个位点显著的提高了编辑效率，其中在OsPDS-sgRNA02位点，基因编辑效率由50％左右提高到90％以上。在进一步的验证实验中，在OsCKX6-sgRNA01位点上，对照Cas9蛋白组的编辑效率不足10％，而使用本发明Cas9-UBA-SD2融合蛋白编码基因的编辑系统的编辑效率达到了64％，提高了接近600％，得到了出人意料的效果，解决了本发明要解决的提高低效率位点的基因编辑效率的技术问题，有望实现全基因组无差异的靶位点定向编辑。
Claims (7)
1.Cas9融合蛋白的编码基因，其特征在于核苷酸序列如Seq ID No.10中的1～4221位核苷酸所示。
2.含有权利要求1所述的编码基因的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于:所述的表达载体含有核苷酸序列如Seq ID No.10所示的Cas9融合蛋白表达框。
4.根据权利要求2或3任一项所述的表达载体，其特征在于:还含有gRNA克隆及转录单元，可共表达Cas9融合蛋白和gRNA。
5.权利要求2～4任一项所述的表达载体在构建水稻CRISPR-Cas9基因编辑系统中的用途。
6.水稻CRISPR-Cas9基因编辑的方法，其特征在于：使用了权利要求2～4任一项所述的表达载体为CRISPR-Cas9基因编辑系统提供Cas9蛋白活性。
7.根据权利要求6所述水稻CRISPR-Cas9基因编辑的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、骨架载体构建：以pTX172载体为基本骨架，将权利要求1所述的Cas9融合蛋白编码基因替换其中的Cas9蛋白编码基因，构建CRISPR-Cas9骨架载体；
b、定向基因编辑载体构建：针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及sgRNA，人工合成sgRNA的引物对，将引物对退火形成带粘性末端的双链DNA，将双链DNA替换pTX172载体骨架中的ccdB元件，获得定向编辑表达载体；
c、定向基因编辑及检测：使用步骤b得到定向编辑表达载体转化原生质体，检测原生质体的基因定向编辑情况，将成功定向编辑的原生质体培养得到定向基因编辑植株；
或者；
使用步骤b得到定向编辑表达载体转入根癌农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体导入目标植物，获得定向基因编辑植株。
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