CN111235172B - 基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统，该报告系统包括源自pFLX107的pUC复制子，Cat基因，rrnbT1T2，lambda t0转录终止子，源自质粒pRCL且内部ClaI、SacI和NdeI位点被沉默突变的lacZ基因。本发明还公开原核启动子报告系统的构建方法及应用。本发明构建的质粒pFGH06大小为4949bp，28℃培养条件下的背景活性仅为12.2±0.6，极显著低于低拷贝参考质粒pRCL的背景活性21.3±1.7，并应用于诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM的克隆及活性测定，在模拟应用于启动子筛选时，可通过蓝白斑筛选实现对目标启动子的100%识别。

Description

基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统及其构建 方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统及其构建方法和应用。

背景技术

原核启动子是位于基因上游的一段能被RNA聚合酶识别、结合并起始转录的特定DNA序列，其主要功能是控制基因表达的强度及模式，是基因转录水平调控的中心，因此对启动子进行准确的识别与鉴定是研究分析基因功能及其调控机制的前提和基础，对于为实现特定实验目的而进行的相关基因工程载体构建和突变菌株改造亦具有着十分重要的意义。

随着越来越多细菌和病毒基因组序列被测定并发布，以及生物信息学的发展，对启动子的识别可借助于各种基于不同算法的软件模型进行预测，但最终的验证或鉴定仍需通过报告基因系统来完成。迄今，已报道的可用于启动子筛选及活性测定的报告基因有氯霉素乙酰基转移酶、绿色荧光蛋白、荧光素酶和β-半乳糖苷酶等，其中由lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶广泛存在于多种生物中，能水解乳糖为半乳糖和葡萄糖，也具有转移半乳糖苷的作用，可将乳糖转变为异乳糖，而后者是乳糖操纵子的诱导物，在细菌的代谢过程中有着非常重要的作用。此外，β-半乳糖苷酶性质稳定，在多种生物体中均能正确表达和折叠，能使多种底物显色，具有多样化的读出过程，可比较方便地进行定量检测，这些优点使得lacZ自上世纪60年代末被分离以来就成为基因工程实验中最常用、最成熟的一种报告基因。

然而，当前市场上销售的各类启动子报告系统主要针对真核生物细胞，尚未见商品化的原核启动子报告系统，当前基于lacZ的原核启动子报告系统多为低拷贝的穿梭载体，体积较大，不便于启动子克隆时重组质粒的构建，理论上还会降低对弱启动子的检测灵敏度。此外，这些载体中紧邻lacZ基因上游的启动子探测区域克隆位点也普遍偏少，也不便于序列中含有相同酶切位点的启动子克隆；最后，部分报告系统所用宿主菌并非lacZ缺失突变株，潜在的背景活性也会干扰测定结果。这些问题的存在都会制约启动子报告系统的实际应用，不利于商业化推广，有待进一步改进或完善。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于降低原核启动子报告系统在实际应用时的设计和实验操作成本，本发明在保留传统lacZ报告系统应用优势的同时克服了其技术缺陷，具有体积小，克隆位点多，背景活性可调，同时提高其对原核启动子的识别筛选效率，在用于原核启动子的筛选和鉴定时具有更大的适应性，并赋予其一定的操作灵活性，具有广泛的应用前景。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明提供了一种基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统，所述报告系统包括源自于pFLX107的pUC复制子，氯霉素乙酰转移酶基因，核糖体RNA操纵子T1T2终止子，lambda t0转录终止子，以及源自于质粒pRCL且内部ClaI、SacI和NdeI位点被沉默突变的lacZ基因。

其中，所述紧邻lacZ基因上游的启动子探测区域含有SphI，PstI，EcoRI，XhoI，KpnI，SacI，SpeI和BglII多克隆位点，所述lambda t0转录终止子位于多克隆位点前。

本发明内容还包括所述的原核启动子报告系统的构建方法，包括以下步骤：

1)通过定点突变将lacZ基因中的ClaI、SacI和NdeI位点消除，并克隆至质粒pFLX107中启动子pR后的BglII和Xba I酶切位点之间，构建成含报告基因lacZ的重组质粒pFLX107-lacZ；

2)通过设计合成含有不同多克隆位点的序列将质粒pFLX107-lacZ中lacZ前的启动子pR及其调控元件cI857置换，依次构建出基于lacZ和pUC复制子的启动子报告系统(载体)。

其中，所述步骤2)的具体步骤如下：

S1)将寡聚核苷酸片段MCS1-F/MCS1-R和MCS2-F/MCS2-R溶于STE缓冲液中，取等体积混合后水浴，徐冷至室温，变性退火后的引物形成可与Sac II/Bgl II酶切产物互补的粘性末端，将其分别连入经Sac II/Bgl II酶切的pFLX107-lacZ中即构建成质粒pFGH01和pFGH02；

S2)以质粒pFLX107-lacZ为模板，利用引物对t0-F/t0-R扩增终止子t0并将其分别克隆至质粒pFGH01和pFGH02的Sac II和Sph I位点之间，即构建成质粒pFGH03和pFGH04，质粒pFGH05则是通过将质粒pFGH04中Pst I和Bgl II间的酶切序列以变性退火的引物对MCS5-F/MCS5-R置换而成，质粒pFGH06是将质粒pFGH05中Bgl II和Nde I间的酶切序列以变性退火的寡聚核苷酸片段MCS6-F/MCS6-R置换构建而成。

其中，所述pFGH06的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明内容还包括含有所述的原核启动子报告系统的重组菌。

其中，所述重组菌为大肠杆菌，优选地，所述大肠杆菌为MC4100。

本发明内容还包括所述的重组菌的构建方法，包括以下步骤：将原核启动子报告系统通过热激转化至大肠杆菌中即得。

所述重组菌的构建方法及背景活性的测定具体包括：制备大肠杆菌MC4100感受态细胞，并将上述构建成功的系列启动子报告质粒pFGH01-pFGH06和参考质粒pRCL转化至大肠杆菌MC4100，然后测定比较其在28℃和37℃培养条件下的背景活性。

本发明内容还包括所述的原核启动子报告系统、所述的重组菌在诱导性启动子和/或组成型启动子的克隆和/或目标启动子筛选中的应用。

其中，所述目标启动子筛选的应用中，包括测试质粒pFGH06通过蓝白斑筛选对目标启动子的识别效率。

其中，所述诱导性启动子为araBAD，所述组成型启动子为rpsM。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明最终构建成功的原核启动子报告系统，即质粒pFGH06大小为4949bp，在28℃培养条件下的背景活性仅为12.2±0.6，极显著低于低拷贝参考质粒pRCL的背景活性21.3±1.7，并成功应用于诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM的克隆及活性测定，在模拟应用于启动子筛选时，可通过蓝白斑筛选实现对目标启动子的100％识别。与已报道的各类原核启动子报告系统相比，质粒pFGH06体积较小，有利于提高质粒的稳定性和转化效率；在紧邻lacZ的启动子探测区域具有更多的克隆位点，便于序列中含有酶切位点启动子的克隆或筛选；由于pUC复制子的温度相关性，使得其背景活性可调，在具体应用时具有一定的灵活性，在用于原核启动子的筛选和鉴定时具有更大的适应性，可实现对原核启动子的高效识别。这些优点的综合加持下可有效降低该系统在实际应用时的设计和实验操作成本。

附图说明

图1lacZ基因的重叠PCR定点突变电泳图；泳道M为DNA Marker DL5000，泳道1为lacZ-F1/lacZ-M1-R，泳道2为lacZ-M1-F/lacZ-M2，泳道3为lacZ-M2-F/lacZ-M3-R，泳道4为lacZ-M3-F/lacZ-R，泳道5lacZ-F2+lacZ-F3/lacZ-R；

图2质粒pFGH06的物理图谱；

图3启动子报告质粒的PCR鉴定；M：DNA Marker DL5000；泳道1-6：

pFGH01～pFGH06；泳道7：pRCL；

图4启动子报告质粒的酶切鉴定；M：DNA Marker DL5000；泳道1-6：经BglII单酶切的质粒pFGH01～pFGH06 BglII；泳道7：经PstI单酶切的质粒pRCL；

图5启动子报告质粒的背景活性；

图6启动子araBAD和rpsM的PCR扩增；M：DNA Marker DL5000；泳道1-2：araBAD；泳道3：araBAD阴性对照；泳道4-5：rpsM；6：rpsM阴性对照；

图7质粒pFGH06-araBAD和pFGH06-rpsM的PCR鉴定；M：DNA Marker DL5000；泳道1：pFGH06-araBAD；泳道2：pFGH06-rpsM；泳道3：阴性对照；

图8启动子araBAD和rpsM活性；

图9大肠杆菌MC4100(pFGH06-rpsM)(A)和MC4100(pFGH06-araBAD)(B)的菌落形态和PCR鉴定(C)；其中，泳道M为DNA Marker DL5000，泳道1～10为MC4100(pFGH06-rpsM)菌落PCR产物电泳鉴定结果，泳道11～20为MC4100(pFGH06-araBAD)菌落PCR产物电泳鉴定结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明实施例中所采用的实验材料：

1、菌株和质粒

大肠杆菌DH5α化学感受态细胞购自南京诺唯唯赞生物科技有限公司，大肠杆菌lacZ突变菌株MC4100源自日本生物资源项目(CV-49)(https://shigen.nig.ac.jp/ecoll

/strain/resource/cvectorHost/list？keyword＝CV-49)。质粒pRCL和pKD46由中国农业科学院上海兽医研究所王少辉博士惠赠(Yi,Z.,et al.,The CpxR regulates typeVI secretion system 2expression and facilitates the interbacterialcompetition activity and virulence of avian pathogenic Escherichiacoli.Veterinary Research,2019.50(1):40；杨登辉,等.,密度感应系统luxS基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性及毒力的影响.中国兽医科学,2016.46(05):537-543)。pFLX107为本实验构建保存(付立霞,等.,金黄色葡萄球菌核酸酶A与不同外源DNA片段融合表达的作用比较.生物工程学报,2016.32(12):1654-1663)，pFPV25.1源自于南京农业大学动物医学院刘永杰教授课题组(李静,等.,绿色荧光蛋白基因标记嗜水气单胞菌的研究.畜牧与兽医，2009.41(3):1-4)。

2、主要试剂

限制性内切酶Bgl II，Sph I，Xba I，T4 DNA连接酶，PrimeSTAR HS(Premix)，Premix Taq，DNA Marker DL5000，X-gal，ONPG等均购自于Takara宝生物工程(大连)有限公司，氯霉素和SDS购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，Na₂HPO₄.7H₂O NaH₂PO₄.H₂O，MgSO₄，Na₂CO₃和氯仿等试剂购置于国药集团化学试剂有限公司。β-巯基乙醇和L-阿拉伯糖为Sigma公司产品，DNA Mini Kit，Presto Mini Plasmid Kit和Gel/PCR DNA FragmentsExtraction Kit等为Geneaid产品，所有操作均按产品说明书进行。

实施例1基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统pFGH06的构建1、引物设计

为便于后续实验设计，需将lacZ基因中的Cla I，Sac I，Nde I酶切位点消除。为此，基于同义密码子原理并根据已知lacZ基因设计定点突变引物，其中lacZ-M1-F/lacZ-M1-R，lacZ-M2-F/lacZ-M2-R，lacZ-M3-F/lacZ-M3-R反向互补，可对Cla I，Sac I，Nde I识别序列第三位碱基分别实现C→T，G→A，T→C的定点突变。lacZ-F1及lacZ-R为针对lacZ基因两端的扩增引物，引物lacZ-F2和lacZ-F3则为在lacZ-F1引物基础上依次引入所需序列和酶切位点(参见表1)。设计用于置换质粒中紧邻lacZ基因上游启动子的多克隆位点序列时，利用启动子分析预测数据库(www.softberry.com)进行反复分析，以确保序列中不含有潜在的启动子元件。所有引物均由赛默飞世尔(Thermo Fisher)旗下英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

表1本发明中所用引物

2、lacZ基因的定点突变及克隆

lacZ基因的定点突变通过重叠PCR进行。以质粒pRCL为模板，各自加入引物对lacZ-F1/lacZ-M1-R，lacZ-M1-F/lacZ-M2-R，lacZ-M2-F/lacZ-M3-R，lacZ-M3-F/lacZ-R，用PrimeSTAR HS(Premix)高保真酶进行PCR扩增，反应体系为50μL，其中模板和正反向引物各1μL，PrimeSTAR HS(Premix)25μL，灭菌双蒸水22μL。PCR扩增条件为：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环。

PCR反应结束后，产物于1％琼脂糖凝胶中电泳后在紫外分析仪中切下目的片段，引物对lacZ-F1/lacZ-M1-R，lacZ-M1-F/lacZ-M2-R，lacZ-M2-F/lacZ-M3-R，lacZ-M3-F/lacZ-R成功扩增出大小分别为861bp、1133bp、1042bp、122bp的预期目的片段，用胶回收试剂盒回收目的片段。然后以回收的片段为混合模板，lacZ-F2，lacZ-F3和lacZ-R为扩增引物，进行第二轮PCR重叠PCR，成功获得3119bp含突变位点的lacZ及附加序列的全长片段(图1)，最终的测序结果亦显示原lacZ基因中的Cla I，Sac I，Nde I酶切位点被成功消除，并且突变序列符合预期。

将第二轮PCR成功获得3119bp含突变位点的lacZ基因片段再次进行电泳并切胶回收，用Bgl II和Xba I对回收目的片段进行双酶切，连入同样经Bgl II/Xba I双酶切的pFLX107质粒中，最终构建成功的质粒命名为pFLX107-lacZ。

3、质粒pFGH06的构建

首先，参照Fu等所述方法(Fu,L.and C.Lu,A Novel Dual Vector CoexpressingPhiX174 Lysis E Gene and Staphylococcal Nuclease A Gene on the Basis ofLambda Promoter pR and pL,Respectively.Molecular Biotechnology,2013.54(2):436-444)将寡聚核苷酸片段MCS1-F/MCS1-R和MCS2-F/MCS2-R溶于STE缓冲液中(10mMTris–HCl(pH8.0),50mM NaCl,1mM EDTA)，取等体积混合后于94℃水浴5min，徐冷至室温。变性退火后的引物形成可与Sac II/Bgl II酶切产物互补的粘性末端，将其分别连入经SacII/Bgl II酶切的pFLX107-lacZ中即构建成质粒pFGH01和pFGH02。

在此基础上，以质粒pFLX107-lacZ为模板，利用引物对t0-F/t0-R扩增终止子t0并将其分别克隆至质粒pFGH01和pFGH02的Sac II和Sph I位点之间，即构建成质粒pFGH03和pFGH04。质粒pFGH05则是通过将质粒pFGH04中Pst I和Bgl II间的酶切序列以变性退火的引物对MCS5-F/MCS5-R置换而成，而质粒pFGH06则又是将质粒pFGH05中Bgl II和Nde I间的酶切序列以变性退火的寡聚核苷酸片段MCS6-F/MCS6-R置换构建而成(图2)。质粒pFGH06组成参见表2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

表2质粒pFGH06

对构建而成的系列启动子报告质粒pFGH01-pFGH06，以DSeq-F和DSeq-R引物进行PCR鉴定，可分别扩增出大小约为328bp，309bp，416bp，397bp，401bp和399bp的预期目的片段，而作为参照的pRCL质粒则未能扩增出片段(图3)。

为消除质粒超螺旋结构对其电泳体积大小的判断，用限制性内切酶BglII对质粒pFGH01-pFGH06进行单酶切，同时用PstI对质粒pRCL进行单酶切，然后进行电泳，如图4，结果显示经BglII单酶切的线性质粒pFGH01-pFGH06均位于5000bp附近，与预期大小(分别为4878bp，4859bp，4966bp，4947bp，4951bp和4949bp)相符。最终所构建质粒的测序结果也均与设计序列一致。

实施例2pFGH06的应用测试

1、背景活性测定

首先，参照Sambrook等所述方法(Sambrook,J.and D.W.Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual.3rd ed.2002,New York:Cold Spring HarborLaboratory Press)并略作修改进行大肠杆菌MC4100感受态细胞的制备，具体操作为：用接种环从冻存的大肠杆菌MC4100甘油保存液中沾取少量菌液划线于LB平板，置生化培养箱中37℃培养16-24h，然后用无菌牙签挑取单个菌落，接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，于37℃恒温振荡器培养过夜。次日取100μL细菌培养液于10mL的LB液体培养基中震荡培养3-4h，待OD值达到0.3～0.4时取出培养瓶，分装于1.5mL离心管中，8000rpm离心30s，弃去上清液，向沉淀中加入500μL预冷的0.1mol/LCaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/L CaCl₂,20mmol/LMgCl₂)重悬每份细胞沉淀，置碎冰上冰浴30min，10000rpm离心15s，向沉淀中加入100μL预冷的含15％甘油的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，置-40℃冰箱保存备用。

将上述构建成功的系列启动子报告质粒pFGH01-pFGH06和参考质粒pRCL分别通过热激转化至大肠杆菌MC4100，再接种至100mL含氯霉素(35μg/mL)的LB液体培养基中，于28℃和37℃培养至对数生长期，参照Thongaram等所述方法(Thongaram,T.,et al.,Prebiotic Galactooligosaccharide Metabolism by Probiotic Lactobacilli andBifidobacteria.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2017.65(20):4184-4192)并略有修改进行β-半乳糖苷酶活性测定。具体为：取至少2mL培养液，6000rpm离心10min，弃上清，于等体积预冷Z缓冲液(0.06M Na₂HPO₄.7H₂O，0.04M NaH₂PO₄.H₂O，0.01MKCl，0.001M MgSO₄，0.05Mβ-巯基乙醇)中重悬，以Z缓冲液为空白测定其OD₆₀₀。然后用Z缓冲液将重悬菌液等比例或10倍稀释至1mL，向稀释菌液中加入100μL氯仿和50μL0.1％SDS，涡旋混匀后于28℃水浴5min。水浴结束后向管中加入0.2mL ONPG(4mg/mL)，涡旋混匀，同时准确记录加入时间，然后置于28℃孵育观察，待呈现足够黄色后，加入0.5mL 1M Na₂CO₃停止反应，涡旋混匀，再次准确记录加入时间。转移1mL液体至EP离心管，以最大转速离心5min以去除细菌残骸和氯仿，测定每管在420nm和550nm处的OD值。根据下列公式计算β-半乳糖苷酶活力：

Miller Units＝1000×[(OD₄₂₀–1.75×OD₅₅₀)]/(T×V×OD₆₀₀)

T:反应时间(min)；V：用于检测的培养物体积(mL)。

测试结果：在28℃培养条件下，pFGH01-pFGH06的背景活性分别为31.4±2.2，74.8±3.3，18.2±2.0，32.7±1.8，18.7±1.3和12.2±0.6，而在37℃培养条件下的背景活性则分别为147.8±8.1，203.6±6.5，57.0±4.1，98.3±4.7，62.4±3.9和42.7±3.7(图5)。统计分析显示，pFGH01-pFGH06系列质粒在28℃培养条件下的背景活性均极显著低于其在37℃培养条件下的背景活性(p＜0.01)；在两种温度下，质粒pFGH06的背景活性均显著低于同系列其他质粒(p＜0.01)，而质粒pFGH01和pFGH02的背景活性则显著高于其衍生质粒pFGH03和pFGH04(p＜0.01)。作为对照的启动子报告质粒pRCL在两种温度下的背景活性分别为21.3±1.7和20.6±1.2(图5)，无显著差异(p＞0.05)，但均显著高于质粒pFGH06在28℃培养条件下的背景活性(p＜0.01)。

结论：质粒pFGH06的背景活性呈温度依赖性，在28℃培养条件下活性最低，甚至极显著低于低拷贝参考报告质粒pRCL的背景活性。

2、启动子araBAD和rpsM的克隆及活性测定

分别以质粒pKD46和pFPV25.1为模板，各自加入引物对araBAD-F/araBAD-R和rpsM-F/rpsM-R，用PrimeSTAR HS(Premix)高保真酶进行PCR扩增，电泳PCR扩增结果，扩增出大小约为1217bp和150bp(含限制性酶切位点和保护碱基)的预期目的片段(图6)，对PCR扩增产物进行胶回收，经Sph I和Bgl II酶切后，连入同样经Sph I/Bgl II双酶切的pFGH06质粒中，最终构建成功的质粒分别命名为pFGH06-araBAD和pFGH06-rpsM，以引物DSeq-F/DSeq-R对构建质粒进行PCR鉴定，可分别扩增出大小约为1571bp，498bp的预期目的片段，而对照则未见扩增出片段(图7)。最终的测序结果也表明，成功构建质粒pFGH06-araBAD和pFGH06-rpsM。

然后再分别通过热激转化至大肠杆菌MC4100，含有相应质粒的菌株分别命名为MC4100(pFGH06-araBAD)和MC4100(pFGH06-rpsM)。对启动子araBAD和rpsM的活性测定参照背景活性所述方法于28℃培养条件下进行，其中araBAD的活性测定需在细菌培养至对数生长期时(0h)加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导。

测试结果：重组菌株β-半乳糖苷酶活性测定结果显示，诱导前(0h)启动子araBAD的活性仅为5.3±0.2，加入阿拉伯糖诱导1h，2h和3h后的启动子活性分别为2276.4±52.2，4407.8±91.3，9160.5±163.0，较诱导前上调了429.5倍，831.7倍和1728.4倍；与之相应的是，组成型启动子rpsM在0h的活性即为6423.7±138.4，1h，2h和3h的活性分别为8670.3±310.8，10245.0±154.3，12081.7±253.6，仅为0h活性的1.3倍，1.6倍和1.9倍(图8)。

结论：质粒pFGH06可用于诱导性启动子和组成型启动子的克隆和活性测定。

3、启动子筛选测试

将含有质粒pFGH06-rpsM，pFGH06-araBAD和pFGH06的大肠杆菌MC4100分别接种至含氯霉素的LB液体培养基中震荡培养过夜，然后稀释调整其OD₆₀₀至0.5左右，按1∶1的比例将大肠杆菌MC4100(pFGH06-rpsM)和MC4100(pFGH06-araBAD)分别与MC4100(pFGH06)混合并作适当稀释后，分别涂布于仅含有X-gal的LB抗性平板和同时加有X-gal/阿拉伯糖的LB抗性平板，置于28℃培养。待长出菌落后，每组用无菌牙签随机挑取10个蓝色菌落，用引物DSeq-F/DSeq-R进行菌液PCR鉴定，并随机送3株PCR鉴定为阳性的克隆至上海生物工程有限公司进行测序验证。

测试结果：在含有X-gal的LB抗性平板上大肠杆菌MC4100(pFGH06-rpsM)菌落呈蓝色(图9A)，在含有X-gal/阿拉伯糖的LB抗性平板上大肠杆菌MC4100(pFGH06-araBAD)菌落也呈蓝色(图9B)，而大肠杆菌MC4100(pFGH06)在这两种平板上的菌落则均为白色。以引物DSeq-F/DSeq-R对随机挑取培养的目的克隆进行菌液PCR鉴定，所有克隆均可扩增出预期目的条带，大小分别约为498bp和1571bp(图9C)，随机送样测序结果也均符合预期。

结论：在应用于启动子筛选时，可通过蓝白斑筛选实现对目标启动子的100％识别。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统及其构建方法和应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4949

<212> DNA

<213> pFGH06(Artificial Sequence)

<400> 1

gcatgcctgc agaattctcg aggtaccgag ctcactagta gatctttaag aaggagattg 60

tcatatgacc atgattacgg attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 120

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 180

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 240

gcgctttgcc tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct 300

tcctgaggcc gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc 360

catctacacc aacgtgacct atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa 420

tccgacgggt tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca 480

gacgcgaatt atttttgatg gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg 540

ggtcggttac ggccaggaca gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg 600

cgccggagaa aaccgcctcg cggtgatggt gctgcgctgg agtgacggca gttatctgga 660

agatcaggat atgtggcgga tgagcggcat tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc 720

gactacacaa atcagcgatt tccatgttgc cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc 780

tgtactggag gctgaagttc agatgtgcgg cgagttgcgt gactacctac gggtaacagt 840

ttctttatgg cagggtgaaa cgcaggtcgc cagcggcacc gcgcctttcg gcggtgaaat 900

tattgatgag cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta cgtctgaacg tcgaaaaccc 960

gaaactgtgg agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg gtggttgaac tgcacaccgc 1020

cgacggcacg ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt ttccgcgagg tgcggattga 1080

aaatggtctg ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga 1140

gcatcatcct ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg atggtgcagg atatcctgct 1200

gatgaagcag aacaacttta acgccgtgcg ctgttcgcat tatccgaacc atccgctgtg 1260

gtacacgctg tgcgaccgct acggcctgta tgtggtggat gaagccaata ttgaaaccca 1320

cggcatggtg ccaatgaatc gtctgaccga tgatccgcgc tggctaccgg cgatgagcga 1380

acgcgtaacg cgaatggtgc agcgcgatcg taatcacccg agtgtgatca tctggtcgct 1440

ggggaatgaa tcaggccacg gcgctaatca cgacgcgctg tatcgctgga tcaaatctgt 1500

cgatccttcc cgcccggtgc agtatgaagg cggcggagcc gacaccacgg ccaccgatat 1560

tatttgcccg atgtacgcgc gcgtggatga agaccagccc ttcccggctg tgccgaaatg 1620

gtccatcaaa aaatggcttt cgctacctgg agagacgcgc ccgctgatcc tttgcgaata 1680

cgcccacgcg atgggtaaca gtcttggcgg tttcgctaaa tactggcagg cgtttcgtca 1740

gtatccccgt ttacagggcg gcttcgtctg ggactgggtg gatcagtcgc tgattaaata 1800

tgatgaaaac ggcaacccgt ggtcggctta cggcggtgat tttggcgata cgccgaacga 1860

tcgccagttc tgtatgaacg gtctggtctt tgccgaccgc acgccgcatc cagcgctgac 1920

ggaagcaaaa caccagcagc agtttttcca gttccgttta tccgggcaaa ccatcgaagt 1980

gaccagcgaa tacctgttcc gtcatagcga taacgaactc ctgcactgga tggtggcgct 2040

ggatggtaag ccgctggcaa gcggtgaagt gcctctggat gtcgctccac aaggtaaaca 2100

gttgattgaa ctgcctgaac taccgcagcc ggagagcgcc gggcaactct ggctcacagt 2160

acgcgtagtg caaccgaacg cgaccgcatg gtcagaagcc ggacacatca gcgcctggca 2220

gcagtggcgt ctggctgaaa acctcagcgt gacactcccc gccgcgtccc acgccatccc 2280

gcatctgacc accagcgaaa tggatttttg catcgagctg ggtaataagc gttggcaatt 2340

taaccgccag tcaggctttc tttcacagat gtggattggc gataaaaaac aactgctgac 2400

gccgctgcgc gatcagttca cccgtgcacc gctggataac gacattggcg taagtgaagc 2460

gacccgcatt gaccctaacg cctgggtcga acgctggaag gcggcgggcc attaccaggc 2520

cgaagcagcg ttgttgcagt gcacggcaga tacacttgct gatgcggtgc tgattacgac 2580

cgctcacgcg tggcagcatc aggggaaaac cttatttatc agccggaaaa cctaccggat 2640

tgatggtagt ggtcaaatgg cgattaccgt tgatgttgaa gtggcgagcg atacaccgca 2700

tccggcgcgg attggcctga actgccagct ggcgcaggta gcagagcggg taaactggct 2760

cggattaggg ccgcaagaaa actatcccga ccgccttact gccgcctgtt ttgaccgctg 2820

ggatctgcca ttgtcagaca tgtatacccc gtacgtcttc ccgagcgaaa acggtctgcg 2880

ctgcgggacg cgcgaattga attatggccc acaccagtgg cgcggcgact tccagttcaa 2940

catcagccgc tacagtcaac agcaactgat ggaaaccagc catcgccatc tgctgcacgc 3000

ggaagaaggc acatggctga atatcgacgg tttccacatg gggattggtg gcgacgactc 3060

ctggagcccg tcagtatcgg cggaatttca gctgagcgcc ggtcgctacc attaccagtt 3120

ggtctggtgt caaaaataat ctagacaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 3180

ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg 3240

agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata 3300

aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct 3360

acaaactcat cgatttacgc cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg taattcatta 3420

agcattctgc cgacatggaa gccatcacac acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc 3480

atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatcg tgaaaacggg ggcgaagaag 3540

ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg attggctgag 3600

acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc accgtaacac 3660

gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta ttcactccag 3720

agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg aacactatcc 3780

catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaact ccggatgagc attcatcagg 3840

cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct tatttttctt tacggtcttt 3900

aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc aactgactga 3960

aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat caacggtggt atatccagtg 4020

atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc tcggatctgt tgaagggcgg 4080

attatatcgg gttccgggcg gtgtttcaac acaatatggc ggattaacaa aaaccatgga 4140

gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 4200

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 4260

gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 4320

gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 4380

gttaccagtg gctgctgccg gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 4440

atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 4500

cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 4560

cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 4620

agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 4680

tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 4740

gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 4800

catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cgggattctc 4860

accaataaaa aacgcccggc ggcaaccgag cgttctgaac aaatccagat ggagttctga 4920

ggtcattact ggatctatca acaggagtc 4949

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> lacZ-F1(Artificial Sequence)

<400> 2

aggtatacat atgaccatga ttacggattc 30

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> lacZ-F2(Artificial Sequence)

<400> 3

actttattaa ggaggtatac atatgaccat ga 32

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> lacZ-F3(Artificial Sequence)

<400> 4

agtagatctt ttaactttat taaggaggta taca 34

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> lacZ-M1-F(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgaaattat tgatgagcgt gg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> lacZ-M1-R(Artificial Sequence)

<400> 6

ccacgctcat caataatttc ac 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> lacZ-M2-F(Artificial Sequence)

<400> 7

agcgataacg aactcctgca c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> lacZ-M2-R(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgcaggagt tcgttatcgc t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> lacZ-M3-F(Artificial Sequence)

<400> 9

acggtttcca catggggatt g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> lacZ-M3-R(Artificial Sequence)

<400> 10

caatccccat gtggaaaccg t 21

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> lacZ-R(Artificial Sequence)

<400> 11

acgtctagat tatttttgac accagacca 29

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> MCS1-F(Artificial Sequence)

<400> 12

ggatcctcga gcatgcctgc aggtaccaat tgagctcaag cttgaattcg tcgactagta 60

<210> 13

<211> 66

<212> DNA

<213> MCS1-R(Artificial Sequence)

<400> 13

gatctactag tcgacgaatt caagcttgag ctcaattggt acctgcaggc atgctcgagg 60

atccgc 66

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> MCS2-F(Artificial Sequence)

<400> 14

cgagctcgaa ttcactagta gatcttaact ttaaggaggt ataca 45

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> MCS2-R(Artificial Sequence)

<400> 15

tatgtatacc tccttaaagt taagatctac tagtgaattc gagctcggta c 51

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> t0-F(Artificial Sequence)

<400> 16

ttaccgcggg attctcacca ataaaaaac 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> t0-R(Artificial Sequence)

<400> 17

taagcatgcg actcctgttg atagatcca 29

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> MCS5-F(Artificial Sequence)

<400> 19

gaattctcga ggtaccgagc tcactagta 29

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> MCS5-R(Artificial Sequence)

<400> 19

gatctactag tgagctcggt acctcgagaa ttctgca 37

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> MCS6-F(Artificial Sequence)

<400> 20

gatctttaag aaggagattg tca 23

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> MCS6-R(Artificial Sequence)

<400> 21

tatgacaatc tccttcttaa a 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> DSeq-F(Artificial Sequence)

<400> 22

atggaaaaac gccagcaacg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> DSeq-R(Artificial Sequence)

<400> 23

ttcgctatta cgccagctgg 20

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> araBAD-F(Artificial Sequence)

<400> 24

agcgcatgct tatgacaact tgacggcta 29

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> araBAD-R(Artificial Sequence)

<400> 25

gtcagatctc ccaaaaaaac gggtatgga 29

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> rpsM-F(Artificial Sequence)

<400> 26

gaggcatgcc tgattttttc gcatatttt 29

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> rpsM-R(Artificial Sequence)

<400> 27

gcgagatcta atatgtacgt accatgctg 29

Claims (7)

1.一种基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统，其特征在于，所述报告系统包括源自于pFLX107的pUC复制子，氯霉素乙酰转移酶基因，核糖体RNA操纵子T1T2终止子，lambda t0转录终止子，以及源自于质粒pRCL且内部ClaI、SacI和NdeI位点被沉默突变的lacZ基因，紧邻lacZ基因上游的启动子探测区域含有SphI，PstI，EcoRI，XhoI，KpnI，SacI，SpeI和BglII多克隆位点，所述lambda t0转录终止子位于多克隆位点前；所述基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统为质粒pFGH06，所述质粒pFGH06的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.权利要求1所述的原核启动子报告系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）通过定点突变将lacZ基因中的ClaI、SacI和NdeI位点消除，并克隆至质粒pFLX107中启动子pR后的BglII和Xba I酶切位点之间，构建成含报告基因lacZ的重组质粒pFLX107-lacZ；

2）通过设计合成含有不同多克隆位点的序列将质粒pFLX107-lacZ中lacZ前的启动子pR及其调控元件cI857置换，构建出基于lacZ和pUC复制子的启动子报告系统；所述基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统为质粒pFGH06，所述质粒pFGH06的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.含有权利要求1所述的原核启动子报告系统的重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组菌，所述重组菌为大肠杆菌。

5.权利要求3所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将原核启动子报告系统通过热激转化至大肠杆菌中即得。

6.权利要求1所述的原核启动子报告系统或权利要求3或4所述的重组菌在诱导性启动子和/或组成型启动子的克隆和/或目标启动子筛选中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述诱导性启动子为araBAD，所述组成型启动子为rpsM。

Images