CN117070546A - 一种高效构建gRNA的方法 - Google Patents
一种高效构建gRNA的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117070546A CN117070546A CN202311010586.5A CN202311010586A CN117070546A CN 117070546 A CN117070546 A CN 117070546A CN 202311010586 A CN202311010586 A CN 202311010586A CN 117070546 A CN117070546 A CN 117070546A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- grna
- gene
- template
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 105
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 19
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 15
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 101150102092 ccdB gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101150091037 nfsB gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 claims description 10
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 9
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 8
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 claims description 8
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims 1
- 101710117021 Tyrosine-protein phosphatase YopH Proteins 0.000 claims 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 31
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 14
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 14
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 26
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 20
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 6
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100385364 Listeria seeligeri serovar 1/2b (strain ATCC 35967 / DSM 20751 / CCM 3970 / CIP 100100 / NCTC 11856 / SLCC 3954 / 1120) cas13 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001192924 Parna Species 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 101150059443 cas12a gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高效构建gRNA的方法，属于基因编辑技术领域。本发明利用反向筛选的方法，将反向筛选基因和gRNA质粒结合，提供了一种高效的gRNA构建方法，本发明提供的gRNA构建的方法只需要简单的引物设计和一次PCR产物扩增，只需要使用PCR回收试剂盒进行PCR产物纯化后就可直接用于后续线性化PCR环化步骤，将上述PCR产物进行连接，构建成一个完整的质粒，然后通过电转或化转的方法将其导入到目的菌株，复苏后将其涂布于反向筛选基因对应的筛选平板上，在筛选平板上正常生长的菌落即为含有构建成功的gRNA质粒的菌种。使用本发明构建的gRNA质粒，可以大幅度提高构建效率并且减少送测序的个数以降低质粒构建成本。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种高效构建gRNA的方法。
背景技术
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein(Cas)是古细菌或细菌中特有的一种获得性免疫系统。研究人员将其开发成基因编辑工具之后，凭借其高效、精准、通用性强等优点迅速成为合成生物学领域的热门研究方向，在生命科学、生物工程技术、食品科学及农作物育种等多个领域引发了革命性的影响。CRISPR/Cas系统在进行基因编辑时，只需要20bp的space就可以实现精准定位和基因编辑，因此除CRISPR/Cas系统本身进化以提高CRISPR/Cas系统的基因编辑效率和降低脱靶率之外，高效的gRNA质粒构建方法也是科研人员一直在探索的一个方向。
现在主流的gRNA构建方法主要分为两种：一种是通过设计两对引物分别PCR扩增得到线性化载体和插入片段，使扩增得到的线性化的片段和模板质粒大小差距较大，可以使用琼脂糖凝胶电泳将模板质粒和线性化片段进行分开，然后通过T5连接酶、Gibson或Golden Gate方法进行连接，此方法在进行gRNA质粒构建时，需要进行两次PCR及两次胶回收，然后再进行两片段的连接；另一种方法是使用单对引物对PCR产物进行线性化，只需要进行一次PCR，但是因为模板和线性化片段差距太小，无法使用凝胶电泳的方法将其分开，因此要使用消化模板的酶(如DpnI)，但是受到市场上常用的消化模板方法的影响，进行模板消化时会出现模板消化不彻底并且线性化片段损失量较大的问题，并且模板消化时间也较长；现在常用的gRNA构建除了构建过程复杂之外，还因其无特殊的筛选标签或者无合适的筛选方法，在进行后续操作之前还要进行基因测序，以保证gRNA已经实现成功构建，不管是时间成本还是物质成本都是巨大的。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供了一种高效构建gRNA的方法，本发明利用反向筛选的方法，将反向筛选基因和gRNA质粒结合，提供了一种高效的gRNA构建方法，本发明提供的gRNA构建的方法只需要简单的引物设计和一次PCR产物扩增，无需进行琼脂凝胶电泳，并且由于反向筛选基因的存在不需要对质粒模板进行消化，只需要使用PCR回收试剂盒进行PCR产物纯化后就可直接用于后续线性化PCR环化步骤，将上述PCR产物进行连接，如使用Gibson方法进行连接构建成一个完整的质粒，然后通过电转或化转的方法将其导入到目的菌株，复苏后将其涂布于反向筛选基因对应的筛选平板上，在筛选平板上正常生长的菌落即为含有构建成功的gRNA质粒菌种。使用本发明构建的gRNA质粒，可以大幅度提高构建效率并且减少送测序的个数以降低质粒构建成本。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种高效构建gRNA的方法，包括以下步骤：
(1)针对Cas9：构建模板质粒，以sacB、ccdB、nfsI基因为反向筛选基因，以常规的gRNA质粒模板作为骨架结构，使用T5连接酶、Gibson、Golden Gate方法将反向筛选基因和骨架结构进行连接，形成一个完整质粒，以得到的质粒为模板，使用正向引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’和反向引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTAGTATTATACCTAGGAC TGAG-3’对模板进行PCR扩增，其中20bp的N表示需要构建的gRNA质粒的space序列；
针对Cas12a：构建模板质粒，以sacB、ccdB、nfsI基因为反向筛选基因，以常规的gRNA质粒模板作为骨架结构，使用T5连接酶、Gibson、Golden Gate方法将反向筛选基因和骨架结构进行连接，形成一个完整质粒，以得到的质粒为模板，使用正向引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCTACAAGAGTAGAAATTAAAAAGGTCTTTTG-3’和反向引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCAGCATATGCGGTG-3’对模板进行PCR扩增，其中20bp的N表示需要构建的gRNA质粒的space序列；
(2)将步骤(1)得到的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒进行纯化；
(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行PCR产物自身环化，构建成环形质粒；
(4)将步骤(3)构建的环形质粒转入到感受态细胞中，复苏后涂布于含有反向筛选标签相互作用物质的平板上，培养过夜；
(5)平板上生长出来的菌株均为含有构建成功的gRNA质粒的菌株。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的常规的gRNA质粒包括pDY和pUC19；
针对Cas9：pDY的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，pUC19的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；
针对Cas12a：pDY的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，pUC19的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中针对Cas9：nfsI基因的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，sacB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，ccdB基因的核苷酸序列如SEQID NO:7所示；
针对Cas12a：nfsI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，sacB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，ccdB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中纯化后核酸浓度在50ng/μL以上。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中PCR产物自身环化过程使用Gibson、T5连接酶或Golden Gate方法进行。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中转入的方式包括化学转化和电转化；感受态细胞包括Escherichia coli MG1655和DH5α。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中复苏的条件为在35～39℃培养0.5～3h。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中，当所述的毒性基因为nfsI，宿主菌在添加甲硝唑的平板培养基中培养。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中，当所述的毒性基因为sacB，宿主菌在添加蔗糖的平板培养基中培养。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中，当所述的毒性基因为ccdB，宿主菌只需要在含有抗生素的平板上培养即可。
基于上述技术方案，进一步地，所述的抗生素包括壮观霉素和氨苄霉素。
本发明另一方面提供上述方法获得的gRNA。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
本发明的高效gRNA质粒构建方法通过构建含有毒性蛋白的模板质粒，在后期进行构建gRNA质粒过程中，只需要一对引物对模板进行线性化扩增，线性化的片段经过自身环化后可以直接导入菌体，然后涂在对应的筛选平板上后得到的菌株即为含有构建成功的gRNA质粒的菌株。相比于传统的方法，本发明在gRNA质粒构建的过程中减少了引物使用的个数、不需要使用消化酶对环形质粒模板进行消化、不需要使用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定以及不需要使用PCR产物胶回收，极大的提高了构建的速度和减少了人力和物力的投入。除上述优势之外，本发明所提供的方法构建gRNA质粒的成功率在90％以上，可以保证在筛选平板上所生长的菌株中所含有的质粒均为构建正确的质粒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为Cas9构建质粒示意图。
图2为Cas12a构建质粒示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
现在基于CRISPR/Cas系统的基因编辑工具主要以II型的Cas蛋白为主，包括Cas9、Cas12a/b/c、Cas13等。因Cas9和Cas12a的space RNA和scaffold的连接顺序不同，本发明以Cas9和Cas12a的gRNA构建为例来介绍本发明所提供的方法的菌体操作步骤以及体现本发明所提供方法的优越性。
实施例中的pDYBE参见Double Selection Enhances the Efficiency ofTarget-AID and Cas9-Based Genome Editing in Yeast.Despres PC,Dube AK,Nielly-Thibault L,Yachie N,Landry CR.G3(Bethesda).2018Oct 3；8(10):3163-3171。实施例中AAV:ITR-U6-sgRNA参见CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and CancerModeling.Platt RJ,Chen S,Zhou Y,Yim MJ,Swiech L,Kempton HR,Dahlman JE,ParnasO,Eisenhaure TM,Jovanovic M,Graham DB,Jhunjhunwala S,Heidenreich M,Xavier RJ,Langer R,Anderson DG,Hacohen N,Regev A,Feng G,Sharp PA,Zhang F.Cell.2014Sep24.pii:S0092-8674(14)01163-5。实施例中pJT303_SNR52_sgRNA参见Engineering ofhigh-precision base editors for site-specific single nucleotidereplacement.Tan J,Zhang F,Karcher D,Bock R.Nat Commun.2019Jan 25；10(1):439。实施例中pBBR1MCS-2-J23119-NFSI、pBBR1MCS-2-J231119-sacB参见发明专利CN115927423A。
实施例1
针对大肠杆菌中的Cas9的gRNA质粒的构建：
(1)以pDYBE为模板，用引物bb-pDYBEDgalkstop-R(5’-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAG-3’)和bb-pDYBEDgalkstop-F(5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’)进行PCR扩增，使用诺唯赞的2×Phanta Flash Master M(ixDyePlus)酶进行PCR产物扩增，Tm值为64℃，退火时间为11秒，扩增后的片段命名为backbone-pDY；
(2)以pBBR1MCS-2-J23119-NFSI为模板，用引物IN-galkstop-nfsi-F(5’-CTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCTTATTGCGAGGAAACCC-3’)，IN-galkstop-nfsi-R(5’-CTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTCTACATACAAGCAACA AATTCATAAGGAGGA-3’)进行扩增，使用和上述相同的诺唯赞的PCR酶，Tm值为64℃，退火时间为12秒，扩增产物命名为inside-nfsi；
(3)将上述PCR产物在1％的琼脂凝胶电泳后进行胶回收；将backbone-pDY使用TaKaRa的quick DpnI进行模板消化，37℃消化2小时后进行PCR产物纯化，将上述得到的两种PCR产物使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit酶进行连接，50℃连接30分钟后，将连接产物转进大肠杆菌MG1655中，复苏1小时后涂布在含有壮观霉素的平板上，37℃过夜培养，转点后接种提质粒后送测序，得到载体质粒pDYBE—nfsi-backbone模板质粒(见SEQ ID IO:1)，此质粒可以作为模板用于后续的gRNA的高效构建；
(4)以pDYBE-nfsi-backbone质粒为模板，用引物bb-pDYBEDsacB1-new-R(5’-CTTTCGCAAACGCTTGAGTTGCACTAGTATTATACCTAGGACTGAG-3’)和bb-pDYBEDsacB1-new-F(5’-GCAACTCAAGCGTTTGCGAAAGGTTTTAGAGCTAGA AATAGCAAG-3’)进行PCR扩增，Tm值为65℃，退火时间为12s进行扩增，扩增后片段命名为backbone-nfsi；
(5)将PCR产物进行纯化后，使用Nanodrop进行浓度测定，测定浓度为120ng/μl，继续进行后续实验；将纯化后的PCR产物使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One StepCloning Kit酶进行单片段自身环化，50℃连接30分钟，将连接后的产物通过化学转化转入到MG1655中，复苏1小时后，涂布10微升菌液在含有壮观霉素和甲硝唑的平板上，37℃培养过夜，在平板上长出的菌株即为含有构建成功的gRNA质粒的菌株，将菌落转点后扩培提取质粒，可直接用于后续基因编辑实验。
实施例2
针对大肠杆菌的Cas12a的gRNA质粒的构建：
(1)以实施例1中的pDYBE—nfsi-backbone-Cas9为模板，使用引物bb-replacecas9-F(5’-ATCTCCGTCGTGAAGCTC-3’)和bb-replacecas9-R(5’-ATCGACTGATGTCATCAGCGG-3’)进行PCR扩增，Tm值为65℃，退火时间为19秒，扩增后的片段命名为backbone-pDYBE-Cas12a；
(2)将上述PCR产物在1％的琼脂凝胶电泳后进行胶回收，然后使用诺唯赞的DpnI酶进行模板消化，37℃消化2小时后，以金唯智合成的minigene为插入片段，其序列为：5’-GTTGAGCTTCACGACGGAGATCCAGCGCTCGGCCACCAAGTCCTTG ACTGCGTATTGGACCGTCCGCAAAGAACGTCCGATGAATCTACAAGAGTAGAAATTAAAAAGGTCTTTTGAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAACCACCGACTATTTGCAACAGTGCCGTTGATCGTGCTATGATCGACTGATGTCATCAGCGGTGGAGTG-3’，使用Gibson的方法将上述两片段进行连接，使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One StepCloning Kit酶进行连接，50℃连接30分钟，将连接产物转进大肠杆菌MG1655中，得到载体质粒pDYBE—nfsi-scaffold-Cas12a质粒(见SEQ IDIO:7)，此质粒可以作为模板用于后续的gRNA的高效构建；
(3)以pDYBE—nfsi-scaffold-Cas12a质粒为模板，用引物bb-ldhA-Cas12a-F(5’-CGTGATGGCAGCCGATTATGATCTACAAGAGTAGAAATTAAAAAGGTCTTT TG-3’)和bb-ldhA-Cas12a-R(5’-CATAATCGGCTGCCATCACGGGATCCAGCATATG CGGTG-3’)进行PCR扩增，64℃扩增10秒，扩增后片段命名为backbone-ladA；
(4)将PCR产物进行纯化后，使用Nanodrop进行浓度测定，测定浓度为98ng/μl，继续进行后续实验；将纯化后的PCR产物使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One StepCloning Kit酶进行单片段自身环化，将连接后的产物通过化学转化转入到MG1655中，复苏1小时后，涂布10微升菌液在含有壮观霉素和甲硝唑的平板上，37℃培养过夜，在平板上长出的菌株即为含有构建成功的gRNA质粒的菌株，将菌落转点后扩培提取质粒，可直接用于后续基因编辑实验。
实施例3
使用T5连接酶的构建针对大肠杆菌的Cas9的gRNA质粒：
(1)以pDYBE为模板，用引物bb-pDYBE-scaffold-R(5’-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAG-3’)和bb-pDYBE-sacffold-F(5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’)进行PCR扩增，使用诺唯赞的2×Phanta Flash Master M(ixDyePlus)酶进行PCR产物扩增，Tm值温度为64℃，退火时间为11秒，扩增后的片段命名为backbone-pDY；
(2)以pBBR1MCS-2-J231119-sacB为模板，用引物In-pDYBE-sacB-F(5’--CTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCTTATTGCGAGGAAACCC-3’)和In-pDYBE-sacB-R(5’-CTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTCTACATACAAGCAAC AAATTCATAAGGAGGA-3’)进行扩增，使用和上述相同的诺唯赞的PCR酶，Tm值为64℃，退火时间为8秒，扩增产物命名为inside-sacB；
(3)将上述PCR产物在1％的琼脂凝胶电泳后进行胶回收；将backbone-pDY使用TaKaRa的quick DpnI进行模板消化，37℃消化2小时后进行PCR产物纯化，将上述得到的两种PCR产物使用5×T5核酸外切酶在体外进行酶切，使经过PCR产物扩增后的片段产生粘性末端，按照backbone-pDY:inside-sacB＝1:1的比例添加，并且控制反应总DNA量为0.1pmol，在加入酶和模板后，轻轻混合，30℃反应40分钟后，将连接产物转进大肠杆菌MG1655中，复苏1小时使其在细胞内完成细胞重组，涂布在含有壮观霉素的平板上，37℃过夜培养，转点后接种提质粒后送测序，得到载体质粒pDYBE—sacB-scaffod模板质粒(见SEQID IO:2)，此质粒可以作为模板用于后续的gRNA的高效构建；
(4)以pDYBE—sacB-scaffod质粒为模板，用引物bb-pDYBEDsacB1-new-R(5’-CTTTCGCAAACGCTTGAGTTGCACTAGTATTATACCTAGGACTGAG-3’)和bb-pDYBEDsacB1-new-F(5’-GCAACTCAAGCGTTTGCGAAAGGTTTTAGAGCTAGA AATAGCAAG-3’)进行PCR扩增，Tm值为65℃，退火时间为12s，扩增后片段命名为backbone-sacB1；
(5)将PCR产物进行纯化后，使用Nanodrop进行浓度测定，测定浓度87ng/μl，继续进行后续实验；将纯化后的PCR产物使用酶进行单片段自身环化，使用5×T5核酸外切酶在体外进行酶切，使经过PCR产物扩增后的片段产生粘性末端，控制反应加入线性化片段为0.1pmol，30℃反应40分钟后，将连接产物转进大肠杆菌MG1655中，将连接后的产物通过化学转化转入到MG1655中，复苏1小时后，涂布10微升菌液在含有壮观霉素和5％蔗糖的平板上，37℃培养过夜，在平板上长出的菌株即为含有构建成功的gRNA质粒的菌株，将菌落转点后扩培提取质粒，可直接用于后续基因编辑实验。
实施例4
针对AVV载体模板Cas9的gRNA高效构建方案：
(1)以AAV:ITR-U6-sgRNA为模板，用引物bb-U6-R(5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’)和bb-U6-F(5’-ATCGCGTGGGCGTATTCG-3’)进行PCR扩增，使用诺唯赞的2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)酶进行PCR产物扩增，Tm值为65℃，退火时间为32秒，扩增后的片段命名为backbone-AAV；
(2)以pBBR1MCS-2-J23119-NFSI为模板，用引物IN-galkstop-nfsi-R(5’-CCGTGCGAATACGCCCACGCGATTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGG-3’)，IN-galkstop-nfsi-F(5’-TTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCACTTGGGTTGCGCAGC AAC-3’)进行扩增，使用和上述相同的诺唯赞的PCR酶，Tm值为65℃，退火时间为12秒，扩增产物命名为inside-nfsi；
(3)将上述PCR产物在1％的琼脂凝胶电泳后进行胶回收；将backbone-AAV使用TaKaRa的quick DpnI进行模板消化，37℃消化2小时后进行PCR产物纯化，将上述得到的两种PCR产物使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit酶进行连接，50℃连接30分钟后，将连接产物转进大肠杆菌MG1655中，复苏1小时后涂布在含有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养，转点后接种提质粒后送测序，得到载体质粒AVV—nfsi-scaffold模板质粒，此质粒可以作为模板用于后续的gRNA的高效构建；
(4)以AVV-nfsi-scaffold质粒为模板，用引物bb-AAV-new-R(5’-GATGTACA GAGTGATATTATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’)和bb-pDYBEDsacB1-new-F(5’-ATAATATCACTCTGTACATCGGTGTTTCGTCCTT TCCAC-3’)进行PCR扩增，Tm值为65℃，退火时间为32s，扩增后片段命名为backbone-AAVnew1；
(5)将PCR产物进行纯化后，使用Nanodrop进行浓度测定，测定浓度87ng/μl，继续进行后续实验；将纯化后的PCR产物使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One Step CloningKit酶进行单片段自身环化，50℃连接30分钟，将连接后的产物通过化学转化转入到MG1655中，复苏1小时后，涂布10微升菌液在含有氨苄青霉素和甲硝唑的平板上，37℃培养过夜，在平板上长出的菌株即为含有构建成功的gRNA质粒的菌株，将菌落转点后扩培提取质粒，可直接用于后续基因编辑实验。
实施例5
针对酿酒酵母的Cas9的gRNA高效质粒构建：
(1)以pJT303_SNR52_sgRNA为模板，用引物bb-pJT303-R(5’-AGTCATTCAATTTTGGACGT-3’)和bb-pJT303-F(5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’)进行PCR扩增，使用诺唯赞的2×Phanta Flash Master M(ixDye Plus)酶进行PCR产物扩增，Tm值为64℃，退火时间为33秒，扩增后的片段命名为backbone-pJT303；
(2)以pBBR1MCS-2-J23119-NFSI为模板，用引物IN-nfsi-F(5’-GACGTCCA AAATTGAATGACTTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGG-3’)，IN-nfsi-R(5’-TGCTAT TTCTAGCTCTAAAACCACTTGGGTTGCGCAGCAAC-3’)进行扩增，使用和上述相同的诺唯赞的PCR酶，Tm值为70℃，退火时间为8秒，扩增产物命名为inside-nfsi；
(3)将上述PCR产物在1％的琼脂凝胶电泳后进行胶回收；将backbone-pJT303使用TaKaRa的quick DpnI进行模板消化，37℃消化2小时后进行PCR产物纯化，将上述得到的两种PCR产物使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit酶进行连接，50℃连接30分钟后，将连接产物转进大肠杆菌MG1655中，复苏1小时后涂布在含有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养，转点后接种提质粒后送测序，得到载体质粒pJT303—nfsi-scaffold模板质粒，此质粒可以作为模板用于后续的gRNA的高效构建；
(4)以pJT303—nfsi-scaffold质粒为模板，用引物bb-pJT303-gRNA-R(5’-GTTGTTACGCAGTTGCAGATGATCATTTATCTTTCACTGCGGAG-3’)；
bb-pJT303-gRNA-F(5’-ATCTGCAACTGCGTAACAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3’)进行PCR扩增，Tm值为64℃，退火时间为33s，扩增后片段命名为backbone-gRNA；
(5)将PCR产物进行纯化后，使用Nanodrop进行浓度测定，测定浓度为73ng/μl，继续进行后续实验；将纯化后的PCR产物使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One StepCloning Kit酶进行单片段自身环化，50℃连接30分钟，将连接后的产物通过化学转化转入到MG1655中，复苏1小时后，涂布10微升菌液在含有氨苄青霉素和甲硝唑的平板上，37℃培养过夜，在平板上长出的菌株即为含有构建成功的gRNA质粒的菌株，将菌落转点后扩培提取质粒，可直接用于后续基因编辑实验。
实施例6
针对AVV载体模板Cas12a的gRNA高效构建方案：
(1)使用实例4中构建的模板质粒AVV-nfsi-scaffold为模板，使用引物bb-replaceCas12a-F(5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGG-3’)和bb-replaceCas9-12(5’-CTCTCTAACAGCCTTGTATCGTATATGC-3’)进行PCR扩增，Tm值为71℃，退火时间为38秒，扩增后的片段命名为backbone-AVVCas12-gRNA；
(2)将上述PCR产物在1％的琼脂凝胶电泳后进行胶回收，然后使用诺唯赞的DpnI酶进行模板消化，37℃消化2小时后，以金唯智合成的minigene为插入片段，其序列为：5’-GCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGCGAATACGCCCACGCGATTCAAAAGACCTTTTTAATTTCTACTCTTGTAGATTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGG-3’，使用ClonExpress Gibson的方法将上述两片段进行连接，使用诺唯赞的Ultra One StepCloning Kit酶进行连接，50℃连接30分钟，将连接产物转进大肠杆菌MG1655中，得到载体质粒AVV—nfsi-scaffoldCas12a质粒,此质粒可以作为模板用于后续的gRNA的高效构建；
(3)以AVV—nfsi-scaffoldCas12a质粒为模板，用引物bb-gRNA-Cas12a-F(5’-CATAATCGGCTGCCATCACGCTGCAGACAAATTCTAGAGG-3’)和bb-gRNA-Cas12a-R(5’-CGTGATGGCAGCCGATTATGATCTACAAGAGTAGA AATTAAAAAGG-3’)进行PCR扩增，64℃扩增25秒，扩增后片段命名为backboneCas12a-gRNA；
(4)将PCR产物进行纯化后，使用Nanodrop进行浓度测定，测定浓度为112ng/μl，继续进行后续实验；将纯化后的PCR产物使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One StepCloning Kit酶进行单片段自身环化，将连接后的产物通过化学转化转入到MG1655中，复苏1小时后，涂布10微升菌液在含有氨苄霉素和甲硝唑的平板上，37℃培养过夜，在平板上长出的菌株即为含有构建成功的gRNA质粒的菌株，将菌落转点后扩培提取质粒，可直接用于后续基因编辑实验。
实施例7
针对酿酒酵母的Cas12a的gRNA高效质粒构建：
(1)使用实例5中构建的模板质粒pJT303—nfsi-scaffold模板，使用引物bb-replaceCas12a-F(5’-GCTCAGTCCTAGGTATAATGC 3’)和bb-replaceCas9-12(5’-TCTAGAGTTGTACTTCAAACG-3’)进行PCR扩增，Tm值为65℃，退火时间为38秒，扩增后的片段命名为backbone-pJT303Cas12a-gRNA；
(2)将上述PCR产物在1％的琼脂凝胶电泳后进行胶回收，然后使用诺唯赞的DpnI酶进行模板消化，37℃消化2小时后，以金唯智合成的minigene为插入片段，其序列为：5’-CGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCATTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGCATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCGACGTCCAAAATTGAATGACTTCAAAAGACCTTTTTAATTTCTACTCTTGTAGATTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGC-3’，使用ClonExpress Gibson的方法将上述两片段进行连接，使用诺唯赞的Ultra One Step Cloning Kit酶进行连接，50℃连接30分钟，将连接产物转进大肠杆菌MG1655中，得到载体质粒pJT303-nfsi-scaffoldCas12a质粒,此质粒可以作为模板用于后续的gRNA的高效构建；
(3)以pJT303—nfsi-scaffoldCas12a质粒为模板，用引物bb-gRNA-Cas12a-F(5’-CGTGATGGCAGCCGATTATGGTGCTTTTTTTGTTTTTTATGTCTTC-3’)和bb-gRNA-Cas12a-R(5’-CGTGATGGCAGCCGATTATGATCTACAAGAGTAGAAA TTAAAAAGG-3’)进行PCR扩增，59℃扩增30秒，扩增后片段命名为backboneCas12a-gRNA；
(4)将PCR产物进行纯化后，使用Nanodrop进行浓度测定，测定浓度为79ng/μl，继续进行后续实验；将纯化后的PCR产物使用诺唯赞的ClonExpress Ultra One StepCloning Kit酶进行单片段自身环化，将连接后的产物通过化学转化转入到MG1655中，复苏1小时后，涂布10微升菌液在含有氨苄霉素和甲硝唑的平板上，37℃培养过夜，在平板上长出的菌株即为含有构建成功的gRNA质粒的菌株，将菌落转点后扩培提取质粒，可直接用于后续基因编辑实验。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，并非对其限制，对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种高效构建gRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对Cas9：构建模板质粒，以sacB、ccdB、nfsI基因为反向筛选基因，以常规的gRNA质粒模板作为骨架结构，使用T5连接酶、Gibson、Golden Gate方法将反向筛选基因和骨架结构进行连接，形成一个完整质粒，以得到的质粒为模板，使用正向引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’和反向引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTAGTATTATACCTAGGAC TGAG-3’对模板进行PCR扩增，其中20bp的N表示需要构建的gRNA质粒的space序列；
针对Cas12a：构建模板质粒，以sacB、ccdB、nfsI基因为反向筛选基因，以常规的gRNA质粒模板作为骨架结构，使用T5连接酶、Gibson、Golden Gate方法将反向筛选基因和骨架结构进行连接，形成一个完整质粒，以得到的质粒为模板，使用正向引物5’-
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCTACAAGAGTAGAAATTAAAAAGGTCTTTTG-3’和反向引物5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCAGCATATGCGGTG-3’对模板进行PCR扩增，其中20bp的N表示需要构建的gRNA质粒的space序列；
(2)将步骤(1)得到的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒进行纯化；
(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行PCR产物自身环化，构建成环形质粒；
(4)将步骤(3)构建的环形质粒转入到感受态细胞中，复苏后涂布于含有反向筛选标签相互作用物质的平板上，培养过夜；
(5)平板上生长出来的菌株均为含有构建成功的gRNA质粒的菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的常规的gRNA质粒包括pDY和pUC19，
针对Cas9：pDY的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，pUC19的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
针对Cas12a：pDY的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，pUC19的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中针对Cas9：nfsI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，sacB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，ccdB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
针对Cas12a：nfsI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，sacB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，ccdB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中纯化后核酸浓度在50ng/μL以上。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR产物自身环化过程使用Gibson、T5连接酶或Golden Gate方法进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中转入的方式包括化学转化和电转化；感受态细胞包括Escherichia coliMG1655和DH5α。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中复苏的条件为在35～39℃培养0.5～3h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，当所述的毒性基因为nfsI，宿主菌在添加甲硝唑的平板培养基中培养。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，当所述的毒性基因为sacB，宿主菌在添加蔗糖的平板培养基中培养，当所述的毒性蛋白为ccdB，宿主菌只需要在含有对应的抗生素的平板上培养即可。
10.权利要求1-9任一项所述的方法获得的gRNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311010586.5A CN117070546A (zh) | 2023-08-11 | 2023-08-11 | 一种高效构建gRNA的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311010586.5A CN117070546A (zh) | 2023-08-11 | 2023-08-11 | 一种高效构建gRNA的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117070546A true CN117070546A (zh) | 2023-11-17 |
Family
ID=88716346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311010586.5A Pending CN117070546A (zh) | 2023-08-11 | 2023-08-11 | 一种高效构建gRNA的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117070546A (zh) |
-
2023
- 2023-08-11 CN CN202311010586.5A patent/CN117070546A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107400677B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体及其制备方法 | |
| CN105331627B (zh) | 一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法 | |
| CN110358767B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用 | |
| CN110747187B (zh) | 识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及方法 | |
| CN109136248B (zh) | 多靶点编辑载体及其构建方法和应用 | |
| CN106755037A (zh) | 一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I‑B‑sv14型CAS基因编辑系统 | |
| CN108384812B (zh) | 一种酵母基因组编辑载体及其构建方法和应用 | |
| US20240084285A1 (en) | Method for producing target dna sequence and cloning vector | |
| WO2022057094A1 (zh) | 基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法 | |
| CN116286931B (zh) | 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用 | |
| CN117070546A (zh) | 一种高效构建gRNA的方法 | |
| CN104212827B (zh) | 不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法 | |
| CN111850050B (zh) | 一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法 | |
| CN115747242B (zh) | 消除质粒、质粒组合、基因编辑试剂盒、制备方法及应用 | |
| CN110982834A (zh) | 一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用 | |
| CN100494384C (zh) | T载体及其构建方法 | |
| CN117987436B (zh) | 一种双链靶dna序列的制备方法 | |
| CN116064631A (zh) | 一种识别并删除大片段非必需基因区的质粒的构建方法及其在基因编辑中应用 | |
| CN117683755B (zh) | 一种C-to-G碱基编辑系统 | |
| CN110358812B (zh) | 一种用于λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法 | |
| WO2024067644A1 (zh) | 一种无细胞制备mRNA转录模板的方法 | |
| CN115976058B (zh) | 毒素基因及其在重组和/或基因编辑的工程菌构建中的应用 | |
| CN118086353A (zh) | 一种大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体、重组质粒及其应用 | |
| CN116411003A (zh) | 基于刺糖多孢菌内源CRISPR-Cas系统编辑载体的构建及其应用 | |
| CN117487830A (zh) | 一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |