CN117487830A - 一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，首先通过引物设计在待组装片段中引入TypeIIS限制性内切酶的酶切位点，并利用设计的引物进行扩增和纯化，然后将得到的待组装片段任意比混合后再TypeIIS限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用下进行自组装，得到目的片段；然后通过PCR技术扩增目的片段，最后将目的片段连接至线性化载体上，获得重组质粒，并利用菌落PCR技术和测序进行验证，从而获得正确组装的重组质粒。本发明在组装过程中不依赖于片段摩尔比，同时也不需要将目的片段转入专用载体后再与目标载体进行连接，显著简化了实验方法，提高了重组效率。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法。
背景技术
2000年以生物振荡器(Synthetic oscillator)和波动开关(Toggle switch)为代表的人造功能器件的创造，宣告合成生物学作为一门新学科的正式诞生。十年后J.CraigVenter实验室完成了蕈状支原体的人工构建，合成生物学研究再次掀起了新风潮。事实上，人造生命得以成功产生，主要得益于DNA大片段组装方法的突破。近几年来，利用大肠杆菌、酵母与芽孢杆菌等菌种的高效同源重组能力，各种体内DNA多片段、大尺度的组装方法相继被开发，如DNA装配器、Gibson Assembly、SLC、Golden Gate等。这些体内、体外DNA组装方法的相继诞生，加速了合成生物学功能元件库、生物合成途径乃至酵母染色体的人工构建，促进了代谢功能、基因编辑、诱导多功能干细胞等领域的迅速发展。
DNA组装基因理念包括了两分子衔接思想和多片段组装模式。其中DNA分子的衔接更适用于小片段的分析拼接，而为了获取DNA大片段，需要将多个不同小片段加以组装，这就涉及到多片段的组装模式。当构建的DNA尺度很大时，碱基的突变频率将逐级增加，同时常规的限制性内切酶也不再使用，因此不仅需要使用高保真DNA聚合酶进行片段的扩增、通过测序进行鉴定筛选，还需要建立非典型酶切连接方法。
Gibson组装是Gibson等于2009年提出的一种多DNA片段拼接技术，其需要在核酸外切酶、DNA聚合酶和连接酶的共同作用下完成拼接。Gibson法既可以使用酶切得到的线性化载体，也可也使用通过PCR扩增得到的线性化载体，因此Gibson法不受酶切位点和载体的限制，也是目前非常常用的一种单片段和多片段克隆方法，如CN103589743A、CN114231524A、CN110684791A等均采用了该方法。但是当拼接片段较多、出现短片段及较多重复序列的情况下，该方法的重组效率和成功率显著下降。
Golden Gate Cloning采用一种特殊的II型限制性内切酶，其能在DNA识别处的相邻位置进行剪切，如果人为设计识别位点不同的相邻序列，就可以利用同种限制性内切酶产生不同的粘性末端，从而一次组装多个片段，克服传统多片段组装时限制性内切酶种类的限制，而且还可以进行无缝连接。Engle等利用该原理结合基因改组技术(Geneshuffling)发展了Golden gate shufing法，一次实现9个小片段与载体的拼接，构建了理论上可达19683种、不同的重组蛋白酶原基因，以筛选高效表达的胰蛋白酶突变体，同时这种方法还可用于重复序列的组装，如最近兴起的一种强大的基因组编辑工具--转录激活样效应子核酶(Transcription acivatorike efector nudleases,TALENs)，由于该蛋白的DNA结合结构域是由序列差异很小的多个模块组成。当进行人工设计组装时。Golden gatecloning正好满是此要求。中国专利CN104673833A利用Golden Gate成功构建了人3型腺病毒展示载体，中国专利CN107090466B利用两轮Golden Gate拼装技术，将预先设计在寡核苷酸上的编码双sgRNA中的间隔RNA的DNA片段插入到载体中，并利用三轮Golden Gate拼装技术构建随机双敲除sgRNA表达质粒文库，缩短了重组质粒的构建时间。
但是传统的Golden Gate Cloning法需要现将多个片段组装到适合该方法的专用载体上，在将整个片段通过其他方法如无缝克隆或同源重组克隆到目标载体上，造成构建流程复杂且效率不高的问题。同时利用Golden Gate Cloning法进行多片段组装时需要严格控制组装片段之间的摩尔比以及待组装片段与目标载体的摩尔比。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，通过在待组装片段中引入TypeIIS限制性内切酶位点后扩增，然后将待组装片段混合进行自组装得到目的片段，然后通过无缝克隆或同源重组等方法将目的片段引入线性化载体中，构建得到重组载体，该方法具有高效、不依赖于摩尔比和中间功能载体等优点。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，包括以下方法：
(1)设计引物，扩增和纯化待组装片段；
(2)将待组装片段混合后进行自组装，获得组装片段；
(3)对组装片段进行扩增、纯化得到正确组装的目的片段；
(4)将步骤(3)获得的目的片段连接至线性化载体上，获得重组质粒；
(5)将重组质粒进行转化、验证。
优选的，步骤(1)所述的引物含有保护碱基和TypeIIS限制性内切酶识别位点和酶切位点。
进一步优选的，所述TypeIIS限制性内切酶为BsaI、BsmBI和BbsI中的任一种。
优选的，步骤(2)所述待组装片段数量为2-10个，待组装片段混合后的总量为5-100ng
进一步优选的，所述片段与载体之间同源序列的长度为15-25bp。
优选的，步骤(2)所述的自组装过程中需要使用T4 DNA连接酶和TypeIIS限制性内切酶。
进一步优选的，所述T4 DNA连接酶和TypeIIS限制性内切酶的用量分别为100-500U和1-10U。
优选的，步骤(3)所述的扩增采用错配率≤10-6的高保真酶进行扩增。
优选的，步骤(4)所述的连接方法为无缝连接或同源重组。
进一步优选的，所述无缝连接时目的片段与线性化载体的摩尔比为3：1。
本发明的有益效果在于：
1、通过引物设计对待组装片段进行突变、插入等改造，并引入TypeIIS酶切位点，使得扩增出来的相邻待组装片段经TypeIIS限制性内切酶处理后可以产生互补的粘性末端，从而可以在T4 DNA连接酶的作用下进行自连，实现多片段的自组装。在自组装过程中，不需要考虑各个待组装片段的摩尔比，可以直接在胶回收过程中进行混合，只要保证在自组装时含有各个待组装片段既可以顺利进行后续的连接反应。
2、将自组装的目的片段通过PCR技术扩增，获得大量的目的片段，然后将目的片段与线性化载体按照一定的摩尔比混合，通过无缝连接或同源重组等方式进行连接，快速高效的实现了重组载体的构建。在该过程中不需要将目的片段与中间过程专用载体进行连接，然后再将整个片段与目标载体进行连接，节约了专用载体的构建以及验证过程，显著缩短了实验步骤，简化了实验流程，大大提高了重组载体的构建效率。
3、本发明的连接效率高、重组正确率高，自组装过程中不依赖于摩尔比，可以在任意比例下进行待组装片段的自连接，实现了长片段的快速组装，方法简单，可以快速、正确的构建重组载体，便于后续研究的快速、准确的开展。
附图说明
图1为本发明进行多片段组装并构建质粒的流程图。
图2为实施例1中5个片段的凝胶电泳图，图中M为DNA Ladder(0.2-12kb,12bands)的Marker。
图3为pYES2质粒图谱。
图4为实施例1中进行5个片段连接后的重组质粒在转化筛选生长的菌落图。
图5为实施例1中菌落PCR扩增后的凝胶电泳图，图中M为DL5000的Marker。
图6为实施例1中目标片段的突变位点测序图。
图7为实施例2中不同浓度的组装片段实验中菌落PCR扩增后的凝胶电泳图，图中M为DL5000的Marker。
图8为实施例3中的不同比例下的菌落PCR扩增后的凝胶电泳图，图中M为DL5000的Marker。
图9为对比例1中的转化筛选生长的菌落图。
图10为对比例2中重组质粒在转化筛选生长的菌落图。
图11为对比例2中菌落PCR凝胶电泳图，图中M为DL5000的Marker。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步解释说明，值得注意的是，下述实施例仅为本发明的优选实施例，而不应理解为对本发明的限制，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准。本领域技术人员在没有做出创造性劳动而对本发明的技术方案做出的修改、替换均落入到本发明的保护范围之内。
质粒与试剂：
pYES2质粒：北京庄盟国际生物基因科技有限公司，保存于三峡大学轻工业功能酵母重点实验室内。
BsaI、BamHI、EcoRI内切酶、T4 DNA Ligase：购买于NEB公司；
2×Rapid Taq Master Mix、DL5000 DNA Marker：购买于南京诺唯赞生物技术有限公司；
BeyoFusionTMPCR Master Mix(2×)、无缝克隆试剂盒Seamless Cloning Mix、DNALadder(0.2-12kb,12bands)：购买于碧云天生物技术有限公司；
氨苄青霉素：购买于阿拉丁生化科技有限公司；
大肠杆菌DH5α购买于生工生物，用氯化钙法制备成感受态；
下述实施例中设计的引物及测序均由擎科公司完成。
实施例1
以树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶XDH基因的CDS序列进行多个位点定点突变，然后根据突变位点将基因序列分为几个小片段，便于后续进行片段的组装，具体步骤如下：
(1)引物设计：从NCBI上获取树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶XDH基因的CDS序列(Gene ID:4852013)，并针对该基因的第135bp、295bp、795bp、945bp处进行定点突变，从而将XDH基因分割成大小为135bp、160bp、500bp、150bp、147bp的五个片段，并设计引物，引物序列见表1：
表1 5个片段的引物序列
注：单下划线部分为pYES2载体同源臂，小写字母部分为Bsa I酶切位点的保护碱基，大写加粗部分为Bsa I酶的识别位点，N为位于识别位点和目的片段之间的间隔碱基，以此保证酶切时不会影响目的基因，波浪线部分为Bsa I酶切后产生的粘性末端，双下划线为突变位点。
(2)PCR扩增：利用BeyoFusionTMPCR Master Mix(2×)高保真酶进行目的片段的扩增，扩增体系见表2，扩增程序见表2
表2扩增体系
表3扩增程序
(3)混合纯化：将扩增后的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳(图2)，然后切下含有目标片段的胶块，混合在一起后利用诺唯赞DNA凝胶纯化试剂盒进行纯化，并调整DNA浓度为50ng/μL，作为待组装片段混合物；
(4)酶切-连接：将步骤(3)得到的待组装片段混合物与T4 DNA连接酶、BsaI混合，配制酶切-连接反应体系，然后进行酶切-连接反应，反应体系见表4，反应程序见表5：
表4酶切-连接反应体系
表5酶切-连接反应程序
(5)PCR扩增：取步骤(4)酶切-连接后的产物1μL，并以步骤(1)中的引物XDH-F/XDH-R进行PCR扩增，以获得大量以正确顺序连接、并由5个片段的组成的目的片段，PCR反应体系见表2，反应程序见表3；反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳并进行切胶回收，得到纯化的目的片段；
(6)载体线性化：分析pYES2质粒序列(图1)，在质粒的MCS位置选择BamHI、EcoRI作为酶切位点，然后取提取的pYES2质粒与BamHI、EcoRI内切酶配制双酶切反应体系(表6)，然后将双酶切反应体系置于37℃恒温水浴中反应2-3h，酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收，得到纯化的线性化载体；
表6双酶切体系
(7)无缝克隆：利用无缝克隆试剂盒Seamless Cloning Mix对步骤(5)得到的目的片段和步骤(6)得到的线性化载体进行连接，连接反应体系见表7，然后将连接反应体系置于50℃恒温水浴中30min，即得到含有重组载体的反应液；
表7无缝克隆连接反应体系
(8)转化：取10μL步骤(7)中获得的含有重组载体的反应液，将其从水浴锅中取出后立即与融化的大肠杆菌感受态细胞DH5α(100μL)菌液混合，轻柔混合后再冰上静置30min，然后转移至42℃恒温水浴中热激90s，然后立即置于冰上，5min后加入900μL不含抗生素的LB培养基，在37℃、200rpm下孵育60min，然后将孵育后的菌液置于12000rpm下离心1min收集菌体，弃培养基后将剩余菌液吹打均匀，并转移至含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，涂布均匀后吹干，然后倒置于37℃培养箱中培养过夜，使菌充分生长(图4)；
(9)菌落PCR检测：随机挑选5个单菌落作为模版，利用XDH-F作为前引物、目标载体的通用引物(序列为SEQ ID NO:19)作为后引物，利用2×Rapid Taq Master Mix酶进行菌落PCR检测，然后将检测到预期大小的目标片段的菌落进行摇菌提取质粒，并送至擎科公司进行测序检测。
检测结果如图5所示，挑选的5个单菌落均能够扩增得到与目标片段大小一致的片段，将其抽质粒后进行测序，测序结果发现在目标片段的第135bp、295bp、795bp、945bp处均发生了突变，且突变结果与设计结果一致(图6)，表明本方法可以实现多个片段的快速组装，并成功构建了重组质粒。
实施例2
方法、步骤同实施例1，仅将步骤(3)中待组装片段混合物的总浓度分别调整为5ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、80ng/μL、100ng/μL，分别进行多片段的组装，确定组装时待组装片段混合物的含量范围。
按实施例1步骤(9)进行菌落PCR检测，结果如图7显示：五个不同浓度的组装片段进行实验，仍可以验证出与目的片段大小一致的条带。
证明在实验过程中，片段总量在5-100ng/μL之间都可以正常进行组装。
实施例3
方法、步骤同实施例1，仅将步骤(3)中总浓度为50ng的待组装片段比例调整为5个比例组，分别为：比例一：五片段等量；比例二：片段二为其他片段的两倍；比例三：片段三为其他片段的两倍；比例四：片段二与片段三为其他片段的两倍；比例五：片段二、三、四为其他片段的两倍。
按实施例1步骤(9)进行菌落PCR检测，结果如图8显示：五个不同比例片段的组装进行实验，仍可以验证出与目的片段大小一致的条带。
证明本发明在实验过程中，可以忽略片段比例的限制。
对比例1Gibson Assembly法进行多片段的组装
(1)设计Gibson Assembly引物序列：从NCBI上获取树干毕赤酵母的木糖醇脱氢酶XDH基因的CDS序列，并针对该基因的第135bp、295bp、795bp、945bp处进行定点突变，从而将XDH基因分割成大小为135bp、160bp、500bp、150bp、147bp的五个片段，并设计引物，引物序列见表1：
表8 Gibson Assembly引物序列
注：单下划线部分为无缝克隆的同源臂部分，双下划线为突变位点。
(2)PCR扩增、载体线性化及产物纯化：方法、试剂同实施例1；
(3)连接：将步骤(2)中的纯化后的5个片段混合，按照片段：载体的摩尔比为3：1进行混合，配制连接反应体系(表7)，然后将反应体系置于50℃下反应30min，得到连接反应液；
(4)转化：将步骤(3)得到的连接反应液与融化后含有感受态细胞DH5α(100μL)轻柔混匀，进行热激转化，然后将转化后菌液涂布在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，置于37℃下倒置培养过夜，观察菌落生长情况。
结果图如图9所示，利用Gibson Assembly法进行5个片段的组装，筛选平板上无阳性菌落，表明Gibson Assembly法无法成功的拼接多个短片段。
对比例2传统Golden Gate法组装片段
(1)取实施例1中扩增纯化后的5个片段作为待组装片段，以及载体为pGGAselect，该载体为Golden gate载体，只能用作克隆载体无法作为表达载体使用；
(2)将步骤(1)中的线性化载体与5个待组装片段按照摩尔比为2：1混合，然后加入BsaI和T4 DNA连接酶，混合均匀后按照表5的反应程序进行
表8 Golden Gate反应体系
(3)然后将酶切连接反应液进行转化，观察转化后菌落的生长情况(图10)。按照实施例1步骤(9)进行菌落PCR验证。
结果显示：挑取5个单菌落进行验证，其中有3个验证出正确条带(图11)。因此使用Golden gate方法也可以进行多片段的组转，且效率较高，但是该方法的局限性在于其只能用特定的载体，无法自主的选择载体，且特定的载体只是克隆载体，可能无法正常在宿主中表达，因此若需要表达载体，则还需要在克隆成功的Golden gate载体中，将片段PCR扩出，再连接到其他载体中，这无疑增加了工作量。
Claims (10)
1.一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：包括以下方法：
（1）设计引物，扩增和纯化待组装片段；
（2）将待组装片段混合后进行自组装，获得组装片段；
（3）对组装片段进行扩增、纯化得到正确组装的目的片段；
（4）将步骤（3）获得的目的片段连接至线性化载体上，获得重组质粒；
（5）将重组质粒进行转化、验证。
2.根据权利要求1所述的一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：步骤（1）所述的引物含有保护碱基和TypeIIS限制性内切酶识别位点和酶切位点。
3.根据权利要求2所述的一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：所述TypeIIS限制性内切酶为BsaI、BsmBI和BbsI中的任一种。
4.根据权利要求1所述的一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：步骤（2）所述待组装片段的数量为2-10个，待组装片段混合后的总量为5-100ng。
5.根据权利要求4所述的一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：所述片段与载体之间的同源序列的长度为15-25bp。
6.根据权利要求1所述的一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：步骤（2）所述的自组装过程中需要使用T4 DNA连接酶和TypeIIS限制性内切酶。
7.根据权利要求6所述的一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：所述T4 DNA连接酶和TypeIIS限制性内切酶的体积比为1：2。
8.根据权利要求1所述的一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：步骤（3）所述的扩增采用错配率≤10-6的高保真酶进行扩增。
9.根据权利要求1所述的一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：步骤（4）所述的连接方法为无缝连接或同源重组。
10.根据权利要求9所述的一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法，其特征在于：所述无缝连接时目的片段与线性化载体的摩尔比为3：1。
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