JPH03502400A

JPH03502400A - 蛋白質からｎ‐末端メチオニンを除去するアミノペプチダーゼおよびこれにより調製される蛋白質

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Publication number: JPH03502400A
Application number: JP63504077A
Authority: JP
Inventors: ミラー，チャールズ　ジー; モーバ，ラオ; ウィングフィールド，ポール; マーツェイ，ゴンゾラ　ジェイ
Original assignee: バイオジェンインコーポレイテッド
Priority date: 1988-02-09
Filing date: 1988-02-09
Publication date: 1991-06-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白質からＮ−末端メチオニンを除去するアミノベプ　　−ゼお　びこれによ　、Ｊ　れ及ヨｍ野この発明は、酵素、この種の酵素を生産する生物、この酵素および生物を取得し、培養し、使用する方法、並びにこの種の酵素を使用して調製されるポリペプチドに関する。更に詳しくは、この発明は、ポリペプチドからＮ−末端メチオニンを特異的に除去し得る酵素、およびこれらの酵素を使用して調製されるポリペプチドに関する。

！見韮韮蛋白質合成において、ＡＵＧは普遍的なＲＮＡ翻訳開始コドンである。これは、アミノ酸のメチオニン（Ｍｅｔ）をコードする。よって、全ての蛋白質は、真核または原核起源のものであれ、生体内でＮ−末端アミノ５酸としてメチオニンを有するものとして最＠シニ合成される。ＪＪＫ核生物においては、これらのメチオニンはまたホルミル化（ｆ　−Ｍ　ｅ　ｔ　、）さ九る。

しかしながら、成熟蛋白質（例えば、成熟化および他の生体内翻訳後修飾により生産されるもの）は、しばしばＮ−末端アミノ酸としてｆ−ＭｅｔまたはＭｅｔを有さない１例えば、イー・コリの約半数の蛋白質は、生体内翻訳後修飾の後は、メチオニン以外のＮ−末端アミノ酸を有する（ジエー・ビー・ワーラー、「イー・コリの無細胞抽出物由来の蛋白質の、　　ＮＨ２末ｆＩ／Ａ歿基Ｊ　、Ｊ、　Ｎｏｔ、　Ｂｉａｌ、、　７．４８３−９６　（１９６３）　）　。

蛋白質のＮ−末端アミノ酸は、通常はアラニン、セリンまたはトレオニンである（ニス・ニス・サリモら、「微生物細胞蛋白質のアミノ酸の分類学的比較Ｊ　、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　９８゜３６８−７８　（１９６９）　）　。

Ｎ−末端メチオニンを除去することにより初期蛋白質を「成熟」させると考えられる２つの機構がある。生産される細胞によって分泌される蛋白質については、最初のＮ−末端メチオニンは、分泌の過程でシグナルペプチドの一部として除去される９例えば、プレーα−インターフェロン、プレ成長ホル（ン並びにプレ１０インシユリンのＮ−末端メチオニンは、分泌の過程でシグナルペプチドの一部として除去される。

通常は細胞によって分泌されない蛋白質については、初期蛋白質のＮ−末端メチオニンは、通常は脱ホルミル化されており（ジェイ・エム・アダムス、「ホルミル基の初期蛋白質からの放出に際してＪ　、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　３３．　Ｅ）Ｅｌ、　５７１−８９（１９６ｇ））　、その後にこのＮ−末端メチオニンは、蛋白質生産に際し細胞中に存在する幾つかの酵素によって生体内で除去される。

組換えＤＮＡ技術の出現により、蛋白質は、もともとこれらを生産していなかった形質転換単細胞宿主中で生産または過剰生産され始めな、これらの組換え蛋白質は、勿論、Ｎ−末端メチオニンを有するものとして生産された。しかしながら、そのメチオニンを除去して、対応または所望する成熟蛋白質とアミノ酸配列の点で同一の蛋白質を生産するのは問題が多い。

通常は分泌される蛋白質について、これらをそのシグナル配列と共に生産させ、分泌させ、生体内で成熟させて、成熟蛋白質中に通常存在するＮ−末端を生成する種々の試みがなされた。しかしながら、分泌の速度は、多くの場合、細胞から分泌される成熟蛋白質の商業的な量での生産を可能とするには余りに遅いことが分った０通常は分泌されない蛋白質を、随伴するＮ−末端メチオニンの除去を伴うその分泌および成熟化を生起すべく種々のシグナル配列に融合させて合成するに際しても、同様の結果が認められた。

生産される細胞中から通常は分泌されない蛋白質については、生体内の酵素レベルまたはこれらの過剰生産（通常は外来性）蛋白質に対する活性は、実質的にメチオニンを含有しない蛋白質を高レベルで生産するのに有効なるには低すぎることが分った。よって、これらの蛋白質は、しばしば、Ｎ−末端メチオニンを有する蛋白質とＮ−末端メチオニンを有さない他の蛋白質との混合物としてのみ得られ得る。この種の混合物は、商業的な生成工程において、単一の成分に分解するのが不可能な場合は困難性を与える９通常は分泌される蛋白質をシグナル配列を有さすに調製する場合（例えば、組換えｍｅｔ−インターフェロン、組換えｍｅｔ−ヒト成長ホルモン並びに組換えｍｅｔ−プロインシュリン）、類似する結果が同様に認められる。

単−の成分に容易に分解されない混合物を結果的に与えるのに加えて、メチオニンを含有するもの、メチオニンを含有しないものであっても、治療的用途のために調製される組換え蛋白質上のこれらＮ−末端メチオニンの存在により、幾つかの、少くとも観察し得る問題が生起する。第１に、健康管理の権威者は、単一成分の場合と興なり、蛋白質の異種混合物をしばしば、なかなか認可しない、第２に、６！康管理の権威者等は、天然の蛋白質以外に付加的にＮ−末端メチオニン来性のものと認識させ、したがって、これに対する抗体を産生させると依然として考えている。より有効でない薬剤を用いて継続的に処置を行うのに加えて、これらの抗体は、また、成熟蛋白質それ自体の活性に対しても影響を与え得る。

これらの問題の結果、組換えＤＮＡ技術により調製される蛋白質からＮ−末端メチオニンを除去すべく、種々の試みが行われ、継続中である。

分泌されない成熟蛋白質は、次のＮ−末端アミノ酸を有する傾向がある：ＡＩａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＶａｌ（ニス・ツナサワら、「酵母イソ−１−チトクロームＣの変異形態のアミノ酸末端のプロセシング」、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌ、、　２６０．５３８２−９ｔ　（１９８５））　、よって、これらノＮ−末端アミノ酸を有する分泌されない蛋白質は、もともとＮ−末端メチオニンを有しＡｌａ、Ｇａｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔ　ｈ　ｒ　、またはＶａｌを第２アミノ酸として有するものとして合成されたことは確実であり、メチオニンは、明らかに成熟化の過程で除去されたものである。しかしながら、要求されるＮ−末端メチオニンは、第２アミノ酸が、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉ　ｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ。

またはＭｅｔである場合、分泌されない蛋白質から明らかに除去されない。

微生物は、ペプチドからＮ−末端アミノ酸を除去する酵素を典型的には含有する。しかしながら、これらの酵素の大半は特異性の広い酵素であり、これらはその基質のＮ−末端から、メチオニン以外のアミノ酸を切断し得る。この種のペプチダーゼは、その基質からＮ−末端アミノ酸を切断するのみならず、更にアミノ酸の切断を続行し得る。これにより、ポリペプチドのＮ−末端から単一のアミノ酸を特異的に除去するのにこれらは有効でないものとなる０例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｉｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｉｕｒｉｕｌｌ）およびイー・コリの組成抽出液中には、少くとも４つのこの種の酵素が存在する（シー・ジー・ミラーら、「サルモネラ・チフィムリウムのペプチダーゼ変異株Ｊ　、Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１２０．３５５−６３（１９７４）、シー・ジー・ミラーら、「イー・コリのペプチダーゼ欠損変異株Ｊ　、Ｊ、　Ｂａｃｒｅｒｉｏｌ、、　１３５．６０３−１１　（ｔ９７ｇ）　、ゲー・エル・ストラウチら、「トリペプチダーゼ（ペプチダーゼＴ）を欠損するサルモネラ・チフィムリウム変興株の単離と特徴Ｊ　、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５４．７６３ −７１　（１９８３）　）　、これらの酵素が存在することにより、Ｎ−末端メチオニンのみに作用するアミノペプチダーゼを単離する困離性が増加する。

Ｎ−末端メチオニンに特異的なＮ−末端Ｍｅｔアミノペプチダーゼは、従来は単離されていない１種々の置換体からメチオニンを切断し得るある種の酵素は単離されているが（ブイ・エム・ボグト、「イー・コリからのアミノペプチダーゼの単離と特性Ｊ　、Ｊ、　Ｂｉｏｔ、　Ｃｈｅｌｌ、、　２４５．４７６０−６９　（１９７０）　）、これらの酵素は、未成熟ポリペプチドからＮ−末端メチオニンを特異的に除去するものではない、寧ろ、これらの酵素は、そのペプチド基質からメチオニン以外の多くのＮ−末端アミノ酸を除去するか（ボグト、前記文献＞　％　ｔなは、これらは、Ｎ−末端メチオニンを有するジペプチダーゼに限定される（ジェイ・エル・ブラウン、「イー・コリＢ由来のジペプチダーゼＭの精製と性質Ｊ　、、Ｊ、　Ｒｉｏｔ。ＣｈｅｌＮ、、　２４８．４０９−１６（１９７３））　、また、池の公知のアミノペプチダーゼも非特異的である。すなわち、これらは、その基質からメチオニンに加えて多くのアミノ酸を除去する。

よって、現在に至るまで、Ｎ−末端メチオニンに高度に特異的なアミノペプチダーゼは全く単離されていない、微生物のＤＮＡ中におけるその遺伝子の位置は同定されていない。

更に、このアミノペプチダーゼを使用し、組換え技術により、生体内または試験管内で、成熟ポリペプチドを特異的に調製するのは不可能であった。

几肌ｎｌ羞本発明は、ここにペプチダーゼＭとして具現した従来単離されていなかった°アミノペプチダーゼを単離することにより、従来技術の課題を解決するものである。ペプチダーゼＭは、Ｎ−末端メチオニンを含有するポリペ７ナトからへ一木ｒ＠メチオニンを除去し得る酵素である。ペプチダーゼＭは、他のＮ−末端アミノ酸を除去せず、またペプチダーゼは、Ｎ−末端以外の位置でポリペプチド中のメチオニンアミノ酸を加水分解しない。

更に、本発明によれば、ペプチダーゼＭを過剰生産する微生物の変異株が提供され、これにより、この株を培養して大量の酵素を得ることができる。その後、酵素を単離し、試験管内で使用し得る。また、これらの微生物は、組換え蛋白質を生産する宿主としても使用し得る０発明のこのＢ様では、ｅｈｔ酵素は生体内で作用し、同時に生産される組換え蛋白質のＮ−末端メチオニンを除去する。

また、この発明によれば、所望の組換え蛋白質を生産する宿主中で、ペプチダーゼＭまたはその活性断片をコードするＤＮＡ配列のクローン化が提供され、生体内で組換え蛋白質のＮ−末端メチオニンを除去するよう作用する。その他、この酵素は、そのＤＮＡ配列により形質転換された単細胞宿主中で生産することができ、その後この酵素を単離して試験管内で使用することができる。

最後に、本発明によれば、ペプチダーゼＭ、および特にサルモネラ・チフイムリウムのある種の株に見出される好適なペプチダーゼＭを使用して生産される成熟ポリペプチドが提供される１本発明の更なる観点および利点は、本明細書から明らかとなろう。

区１しとｌ崖」」ｉ朋第１図は、ニー・ケー　ラエムリ、Ｎａｔｕｒｅ　（ロンドン）、２２７、６８０−８５　（１９７０）の方法により調製した１２．５％アクリルアミドＳＤＳゲルを示す、穴２および３は、それぞれ、ニス・チフィムリウム株ＴＮ２５２９（穴３）およびＴＮ２５４７（穴２）の抽出物に由来する３０μｇの蛋白質を含有する。穴１は、クロマトフオーカシングカラムの活性ピークからの精製したペプチダーゼＭを含有する。ｐｅｐＭ１０Ｇ抽出物（穴２）中のペプチダーゼＭのバンド（ペプチダーゼＭを過剰生産する株）は、野生型ペプチダーゼＭ抽出物（穴３）におけるより一層濃いことが認められる。

日　　　　る　　の、様本発明がより十分に理解されるべく、以下の詳細な説明を記載する。この明細書においては、幾つかの次の用語を用いる。

以反人土泗：隣接するペントースの３′および５′炭素の間のホスホジエステル結合により互いに連結されたデオキシヌクレオチドの線状列。

コドン：　ｍＲＮＡを介して、アミノ酸、翻訳開始シグナル、または翻訳停止シグナルをコードする３つのヌクレオチド（トリプレット）のＤＮＡ配列、４つのＤＮＡ塩基は、アデニン（「Ａ」）、グアニン（’ＧＪ）、シトシン（’ＣＪ）並びにチミン（ｒＴ」）である、４つのＲＮＡ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃ並びにウラシル（’ＵＪ）である、ＤＮＡについて、１猛ヱ：鋳型またはメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）をｒｐＪはプリン（ＡまたはＧ）を示し、’ＱＪはピリミジン（ＣまたはＴ）を示し、「Ｎ」は４つの塩基（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）のいずれかを示す、ＲＮＡについて、ｒｐＪ、「Ｑ」並びにｒ　Ｎ　Ｊは同一の意味を有するが、「Ｕ」が「Ｔ」に置換されているのが例外である０例えば、ヌクレオチドトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡ並びにＣＴＧは、アミノ酸ロイシン（ｒＬｅｕＪ）をコードし、ＴＡＧ、ＴＡＡ並びにＴＧＡは翻訳停止シグナルであり、ＡＴＧはＤＮＡの翻訳開始シグナルであると共にメチオニンをコードする。これらは、アミノ酸（２６）より多い可能なヌクレオチドの組合せ（６４）であるため、遺伝子コードは「縮退」するといわれる、すなわち、幾つかの異なるトリプレットが同一のアミノ酸をコードし得る。２つＤＮＡ配列は、興なるコドンを使用する場合であっても、同一のアミノ酸をコードする場合は「縮退」する。

ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸の線状列、この明細書中で「ポリペプチド」を使用する場合、当業者により、この用語は「蛋白質」および「プレ蛋白質」を包含すると理解されよう。

ゲノム：細胞またはウィルスの全ＤＮＡ、これは、就中、細胞のポリペプチドおよびオペレータ、プロモータ、およびリポソーム結合および相互作用配列をコードするＤＮＡを包含し、これらそれぞれをコードする配列についてのシャインーダルガーノ配列のような配列を包含する。

明するが、イー・コリのような他の微生物も、ペプチダーゼ、　介して、特定のポリペプチドを特徴とするアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列。

及に遺伝子によって行われポリペプチドを産生ずる過程。

これには、ＤＮＡ配列のｍＲＮＡ配列への転写およびｍＲＮＡ配列のポリペプチドへの翻訳が包含される６発現されるべきポリペプチドをコードするＤＮＡ配列については、ＤＮＡ配列は、発現過程を制御する発現制御配列に機能的に連結されていなければならない。

Ｌｕ　：　５０またはそれ以上のアミノ酸からなるポリペプチド。

７に’Ｊ亘Ｉ：成熟（すなわち活性）蛋白質に対して余分なアミノ酸を有するポリペプチドまたは蛋白質。

久三二ヱ進：非性的複製によりこの種の生物体または配列から誘導される生物体またはＤＮＡ配列の集団を得る過程。

ＤＮＡ　　またはバイブトドＤＮＡ：生細胞の外部で末端−末端にて結合された興なるゲノムに由来するＤＮＡの断片からなり、生細胞中で維持され得る分子。

ムユニＺ囮１且差：宿主細胞中で複製し得るプラスミド、ファージＤＮＡ、または他のＤＮＡ配列、クローン化運搬体は、また、組換えベクタとしても知られている。

本発明の酵素は、ポリペプチドからＮ−末端メチオニンを除去するのに特異的である。以下の例は、サルモネラ・チフィムリウムにて認められるペプチダーゼＭを用いて発明を説Ｍｔたはアナログの起蒜として便出し得ることは明り刀）でのる、ここで使用するペプチダーゼＭの「アナログ」は、その酵素がペプチダーゼＭと同一のアミノ酸配列を有さないものであっても、他のＮ−末端アミノ酸を切断することなく、ポリペプチドからＮ−末端メチオニンを切断する酵素を意味する。当業者であれば、大半の生物は少くとも幾つかの非分泌性成熟蛋白質をＮ− 末端メチオニンを有することなく生産するため、この種の生物のそれぞれは、Ｎ −末端メチオニンを特異的に除去し得る少くとも１つの酵素を有すると期待し得ることを認識し得る。更に、このため、この種の酵素は、ここに記載するように単離、生産並びに使用され得る。しかしながら、本発明の酵素を生産するのに好適な微生物は、サルモネラ・チフィムリウムおよびイー・コリである。これらは取り扱いが容易であり、容易に利用可能なためである。サルモネラ・チフィムリウムは特に好適である。結果的に、ニス・チフィムリウムおよびイー・コリによって生産されるペプチダーゼＭが好適であり、ニス・チフイムリウムが特に好適である。

ペプチダーゼＭｌたはアナログを単離する第１の工程は、Ｎ−末端アミノ酸を切断し得る広い特異性の酵素を実質的に全く生産しない選択された微生物の変異株を得ることである。

この種の株を利用することにより、メチオニン特異的アミノペプチダーゼを過剰生産する変異株の選択が可能となる。更に、これら広い特異性の酵素が存在しないことにより、他の酵素（精製調製物中に存在すると、これらにより、ペプチド原の他の全ゆる修飾を生起することなくメチオニンを特異的に除去するのに利用できないものとなる）の除去が促進され、精製が促進される。これらのペプチダーゼを欠損する株は一連の工程によって単離するが、それぞれは、ペプチダーゼの１つの欠損を招く特定の変異を生起するよう設計する。（シー・ジー・ミラー、「サルモネラ・チフィムリウムのペプチダーゼの遺伝的および生理的役割Ｊ　、Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５＋３４６−４９　（１９８６）を参照するとよい）、多くの場合、これらの工程を特定の順序で行い、所望の株を生成する０例えば、ペプチダーゼＮを欠損する変異株は、発色性基質し一アラニルーＢ −ナフチルアミドを加水分解し得ないコロニーを直接スクリーニングすることにより、野生型味がら得られる。このスクリーニングにより与えられるｐｅｐＮ− 変異株をその後使用して、ペニシリン選択により、ロイシンの供給源としてペプチドし一ロイシルーし一アラニルアミドにより生育できない変異株について、ペプチダーゼＡを欠損する変異株を単離する（ジェー・アール・ロス、「細菌の代謝を研究する遺伝的技術Ｊ　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎｏｌ、　１７：３−３５　（１９７０））　、得られた株（ｐｅｐＮ−およびｐｅｐＡ）を使用して、ペニシリン選択により、ロイシンの供給源としてＬｅｕ−Ｇａｙを使用できないものにつき、ペプチダーゼＤを欠損する変異株を単離する。この手順により得られる変異株（ｐｅｐＮ−ｐｅｐＡ−ｐｅｐＤ）を、その後ペニシリン選択においてＬｅｕ−Ｌｅｕの利用性欠損について使用する。この手順により、ペプチダーゼＢを欠損する変異株が与えられる。（これらの株の単離は、シー・ジー・ミラーとゲー・マッキンノＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２０：３５５− ３６３　（ｔ９７４）に記載されている。）。

ペプチダーゼＰおよびＱを欠損する変異株は、これらの変異株から、プロリンの供給源としてＬｅｕ−Ｐｒｏを使用できないものにつき、ペニシリン選択により得られる。（ジー・エル・マクフとシー・ジー・ミラー、「サルモネラ・チフィムリウムのプロリンペプチダーゼ変異株Ｊ　、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ８ａｃｔｅｒｉｏｌｏ！ＩＩＹ、　１２０：３６４−３７１　（１９７４））　、ペプチダーゼＴは、既にペプチダーゼＮ、Ａ、Ｂ並びにＤを欠損する株から、この活性を欠損する変異株についてマイクロカルチャーを直接スクリーニングすることにより得られる（ストラウチら、「トリペプチダーゼ（ペプチダーゼＴ）を欠損するサルモネラ・チフィムリウム変異株の単離と特徴Ｊ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

１５４ニア６３−７７１　（１９８４））　、これらの全ての変異株の遺伝的特徴により、種々の有用な方法で組合せることが可能となる。ペプチダーゼ欠損のいずれかの組合せを担持する株を構成する。

本目的のためには、これらの手順の極致を、ペプチダーゼＮ、Ａ、Ｂ、Ｐ、Ｑ並びにＴを欠損するＴ　Ｎ　２６２４に類似する株の単離とした。この株はアミノ酸の供給源として大半の小さなペプチドを使用できないが、これはメチオニンの供給源として、ある種のＮ−末端メチオニンペプチドを使用し得る（第２表）、これは、広い特異性のペプチダーゼを除去することにより（特にペプチダーゼＮ、Ａ、Ｂ並びにＴであり、これらは全てＮ−末端メチオニンペプチドを加水分解する）、新規なペプチダーゼ、ペプチダーゼＭに由来するメチオニン特異的ペプチダーゼ活性の検出が可能となったことを示唆する。

広い特異性の酵素を変異により欠損する株（特にペプチダーゼＮ、Ａ、Ｂ並びにＴ）を使用して、実質的にペプチダーゼＭを過剰生産する変異株を単離する。この種の変異株の選択は、Ｔ　Ｎ　２６２４のような複数のペプチダーゼを欠損する変異株をメチオニン供給源Ｍｅ　ｔ−Ａ　ｌ　ａ−３ｅ　ｒまたはＭｅｔ−Ａｌａ−Ｍｅｔ（ただしＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙではない）として使用し得るという観察により示唆された（第２表）。

この種の株の抽出物は、Ｍｅ　ｔ　−Ａ　１　ａ−３ｅ　ｒの約１０分の１の速度でＭｅ　ｔ　−Ｇ　１　ｙ−Ｇ　Ｉ　ｙを加水分解した。したがって、メチオニンの供給源としてＭｅｔ−ｃｒｘｙ−Ｇｌｙを用いる生育について、この種の複数ペプチダーゼ欠損株の変異培養に対し、選択を適用しな、この選択により、ペプチダーゼＭの増加した量を与える変異株を得な、ＰｅｐＭ１００変異を担持するこの種の変異株の１つは、Ｍｅｔ−Ａｌａ−３ｅｒ加水分解活性の２０−３０倍の増加量を示し、この株はペプチダーゼＭを過剰生産するという結論を得た。

ｐｅｐＭｌｏｏを担持する株の過剰生産されたペプチダーゼの特異性は、第２表に示すペプチド使用パターンにより示される。この株は、非メチオニン性ペプチド上で生育する能力を有さない、前記した選択は、ストラウチらによって記載されたように〈前記引用）、ペプチダーゼＮ、Ａ、Ｂ、Ｄ並びにＴにおける変異の安定な非復帰対立遺伝子を担持する複数ペプチダーゼ欠損株の使用を要する。

他の生物の過剰生産株を単離するプロセスは前記したプロセスの改変を要し得、唯一のメチオニン供給源として興なるトリペプチドを使用することは、広い特異性のペプチダーゼを欠損する変異株を選択する際に他の生物に対してより適切であり得ることは、当業者に対し明らかたり得る。

ペプチダーゼＭのアナログは、Ｎ−末端メチオニンを有する興なるポリペプチドに対して異なるレベルの活性を有し得る。ペプチダーゼＭのアナログを過剰生産する変異株を産生ずる技術は、非過剰生産株による生育を回避するのに十分低い加水分解速度を有するｍｅｔ−ポリペ１チドを要し得る。

ニス・チフィムリウムおよびペプチダーゼＭの場合、ｍｅｔ−ポリペプチドはＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであると認められ、そのポリペプチドがニス・チフィムリウムの過剰生産株を選択するのに好適なトリペプチドであるが、他のトリペプチドが他の株においてペプチダーゼＭのアナログを選択するのにより好適たり得る。

変異過剰生産株を一旦培養することにより酵素自体を単離し得る。培養により得られる細胞を等張の媒体で洗浄し、当業界で知られた手段を使用して破壊する。

破壊に由来する顆粒物質を遠心分離のような公知の手段によって除去し、ろ過する。上澄をクロマトグラフカラムにかけることができ、ペプチダーゼＭを濃縮する。

好適な微生物、ニス・チフィムリウムを使用した場合、前記した手順を使用して過剰生産変異株Ｔ　Ｎ　２２７０を得た。この株は、０．４１ＨのＬｅｕおよび０．４　ｎＨのＭｅｔを含有する最少グルコース培地で生育する。得られる培養物をベレット化し、０、ＯＩＭのリン酸カリウム緩衝液（ＤＨ？、＋３　＞に懸濁し、超音波により細胞を破壊する。破壊した細胞を遠心分離する。クロマトグラフにより上澄を分画する。活性画分、すなわちｍｅｔ−ポリペプチドからＮ− 末端メチオニンを除去する両分を合せ、濃縮する０株Ｔ　Ｎ　２２７０を使用する場合、クロマトグラフのカラムは、好ましくは、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマンＤＥ−５２）カラムとする。同一のリン酸カリウム緩衝液でカラムを溶出する。活性画分は、好ましくは、限外ろ過膜（ＹＭ−１０、アミコン社）上で濃縮する。

株Ｔ　Ｎ　２２０７が過剰生産株である場合、クロマトグラフによる分離に由来する活性画分は、それぞれの両分に対し、０，６μｍｏｌの基質（好ましくはＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）、０゜０３μｍｏｌのＣｏ　Ｃ１２並びに６μｍＯ１のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）を含有する混合物を添加して全容積を３０ μｌとすることにより測定する。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後３μｌの５０％トリクロロ酢酸を添加することにより反応を停止する。遠心分離により沈澱したポリペプチドを除去する。混合物の一部をトリニトロベンゼンスルホン酸により誘導し、アルテックス・ウルトラスフェアＯＤＳカラムおよび適当なグラジェント（０，１％トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ０，１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル）を使用するＨＰＬＣにより分析する。

前記した手順を使用して活性画分を一旦測定したならば、この活性画分を、株Ｔ　Ｎ　２２７０の破壊コロニーから再び単離し得る。その後、この活性画分を、異なるＮ−末端のｍｅｔ−ポリペプチドに対して試験する。この手順を使用し、基質として特定のｍｅｔ−蛋白質またはｍｅｔ−ポリペプチドを置換することにより、全ゆるｍｅｔ−蛋白質またはｍｅｔ−ポリペプチドについて、ペプチダーゼＭの活性を測定し得る。

最終的に、第２表に示すような活性のプロフィールが与えられる。

前記した限外ろ過膜上の活性画分を、０．０５Ｍのリン酸カリウムＭ街液（ｐＨ７，５＞で平衡化したクルトロゲルＡｃＡ３４カラム（ＬＫＢ＞に通過させる０株Ｔ　Ｎ　２２７０について、Ｍｅｔ−Ａｌａ−３ｅｒ加水分解画分く前記した手順に由来する）を再び合せ、限外膜上で濃縮した。この２回目の濃縮物を、０．０２５　Ｍのイミダゾール−ＨＣ］　（ｐＨ７，４、ｐ１５．２　＞中にて、ファルマシアＰＢＥ９４カラムを使用するクロマトフオーカシングにより更に精製し、ポリバッファ７４−ＨＣ１（ｐＨ４，０）により溶出した。

酵素を単離する他の技術は、以下に実施例４に記載する。

株Ｔ　Ｎ　２２７０に由来する細胞を、フレンチ・プレス細胞技術を使用して破壊し、遠心分離する。その後上澄をろ過する。その後上澄を、クロマトグラフおよびタロマドフォーカシングを使用して分画する。同様に実施例４に開示するように、この他の技術により、高度に精製されたペプチダーゼＭが生産される。

単離したペプチダーゼＭを使用して、試験管内でポリペプチドからＮ−末端メチオニンを除去または「クリップ」し得る。以下の例に開示するように、ペプチダーゼＭを所望のｍｅｔ−ポリペプチドと単に混合して成熟ポリペプチドを生産し得る。成熟ポリペプチドを生産する好適な方法は、ｍｅｔ−ポリペプチドを精製または部分精製ペプチダーゼＭに露呈することによるが、ペプチダーゼＭを含有する破壊細胞の組成抽出物であワても、ｍ　ｅ　ｔ−ポリペプチドからＮ−末端アミノ酸を除去する活性を有する。勿論、広い特異性のペプチダーゼを欠損しない株の粗製抽出物が、本発明に有用たり得る。広い特異性のペプチダーゼは、他のＮ−末端アミノ酸を除去し得るためである。

精製したペプチダーゼＭは、ｍ　ｅ　ｔ−ポリペプチドに対し、約１　：　１ＧＧの割合で添加し得る０通常の条件下で、ポリペプチドからのＮ−末端メチオニンの除去を完遂するのに、一般に２時間以下を要する０通常の条件は、およそ室温および常圧で約７．０のｐＨとして定義する。

第３表に、ニス・チフィムリウム株Ｔ　Ｎ　２６２４の粗製細胞抽出物（広い特異性のペプチダーゼ、ペプチダーゼＮ、Ａ、Ｂ並びにＴを欠損し、ｐｅｐＭ１００変異を担持する株）は、Ｍｅｔ供給源として生育を支持するＭ−末端Ｍｅｔ）リペプチドの全てを加水分解したことを示す、それぞれの場合において、唯一のペプチド結合のみが加水分解され、唯一のアミノ酸生成物としてＭｅｔを与える。これらの抽出物は、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｌａ、またはＭｅ　ｔ−Ｍｅ　ｔ−Ｍｅ　ｔに対する検出し得る活性を含有しないが、Ｍｅｔ−Ａｌａ−３ｅｒまたはＭｅｔ−Ａｌａ−Ｍｅｔの約０．１の割合でＭｅｔ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙを実際に加水分解する。この特異性のパターンは、ペプチド中の第２アミノ酸の性状により、ペプチダーゼＭがＮ−末端メチオニンを除去し得るか否かが決定されることを強く示唆する。観察された特異性は、ペプチダーゼＭは生体細胞中でＮ−末端Ｍｅｔの除去を行う酵素であるという考えと完全に一貫する。

この抽出物は、また、Ｍｅｔ以外のＮ−末端のアミノ酸を有する幾つかのペプチドに対して測定し得る程の活性を有さない、他のサルモネラおよびイー・コリのペプチダーゼと異なり（ミラー・シーとマキノン・ケー、「サルモネラ・チフイムリウムのペプチダーゼ変異株Ｊ　、Ｊ、　ａａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１２０゜３５５−６３　（１９７４）　、ミラー・シーとシュワルツ・ジー、「イー・コリノへ１チダ一ゼ欠損変異株Ｊ　、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１３５゜６０３−１１　（１９７８）　）　、非変性ＰＡＧＥゲルによる粗製抽出物の電気泳動後は活性味によっても活性を検出し得ないくミラー・シーとマキノン・ゲー、「サルモネラ・チフイムリウムのペプチダーゼ変異株Ｊ　、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１２０．３５５−６３（１９７４））　、ペプチダーゼの加水分解は、ＣＯ＋２により促進されるが、Ｍｇ＋１、Ｍｎ＋２またはＺｎ”によっては促進されず、ＥＤＴＡによって阻害される（第４表）。

以下に示すように、実質的に精製または単離されたペプチダーゼＭを用いるｍｅｔ−ポリペプチドのインキュベートを行うことは、試験管内の使用に際し好適な方法である。当業者であれば、基質のインキュベート時間は反応混合物中の基質対ペプチダーゼＭの割合により変動することを認識し得る。

−ｉに、単位基質当り反応混合物中により多いペプチダーゼＭが存在する場合、基質からのＮ−末端メチオニンの除去を完遂するのに、より少ない時間を要する。

ペプチダーゼＭは生体内で使用することができる。酵素が過剰生産される株を宿主として使用し、所望の岨換え蛋白質の生産を図る。または、ペプチダーゼＭをコードするＤＮＡ配列を単離し、そのＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列に縮退するＤＮＡ配列、またはペプチダーゼＭの活性断片をコードするＤＮＡ配列を組換え宿主に挿入することにより、ｎｅｔ除去を望み得るポリペプチドを生産する。所望の蛋白質を生産する組換え宿主は、随伴するｍｅｔ蛋白質をしばしば大量に生産するが、全てのｍｅｔ蛋白質が宿主の天然ペプチダーゼにより成熟されるものではない、この種の宿主にペプチダーゼＭをコードするＤＮＡ配列を挿入し、その宿主のその発現を許容することにより、組換え系に大きな利点が存する。ペプチダーゼＭの増加したレベルは、生体内における蛋白質の発現に際しプレ蛋白質からのＮ−末端メチオニンの除去を促進するためである。このようにして、大量の所望のＭｅｔ−一蛋白質を、組換え宿主により生産することができる。

以下により詳細に示すように、ニス・チフィムリウムに由来しペプチダーゼＭをコードするＤＮＡ配列を単離し、ファージに挿入した。そのファージに由来するペプチダーゼＭをその後プラスミドに挿入し、次にこれをイー・コリ中に置く。

この組換え宿主はペプチダーゼＭを生産する。イー・コリは、組換え蛋白質を生産し得る宿主として知られている。よって、生体内でペプチダーゼＭを使用する１つの可能で好適な方法は、ペプチダーゼＭをコードするＤＮＡ配列を宿主に挿入し、ペプチダーゼＭの組換え宿主中での発現を可能とし、宿主によって同様に生産される天然または組換え蛋白質からのＮ二末端メチオニンの除去を図るものである。好ましくは、この宿主は、所望の蛋白質およびペプチダーゼＭ双方を過剰生産し得る。

ペプチダーゼＭを使用するその他の手段も利用可能である。

以下により詳細に示すように、ペプチダーゼＭを過剰生産する株は、それ自体組換え宿主として伴用し得る。一方、ペプチダーゼＭをコードするＤＮＡ配列を発現制御配列に機能的に連結し、組換えベクタを使用して既に所望の蛋白質を過剰生産する株に挿入し得る。

本発明は、また、組換え手段によって生産されるペプチダーゼＭの試験管内での使用を包含する。ペプチダーゼＭは組換え宿主により過剰生産され得、そのペプチダーゼは、試験管内または生体内で全ゆるポリペプチドからＮ−末端メチオニンを除去することができ、そのポリペプチドが組換え手段により生産されたか否かを問わない。

この発明は、また、ペプチダーゼＭにより除去されるＮ−末端メチオニンを有するポリペプチドを包含する。このポリペプチドは、試験管内または生体内でペプチダーゼＭの基質として作用し得る。ペプチダーゼＭは生体内または試験管内に存在し得、したがって、ポリペプチドからＮ−末端メチオニンの除去を結果的に与えるｍｅｔ−ポリペプチドとペプチダーゼＭとのいずれの組合せも、この発明の範囲内にある。

この発明は、また、通常は生体内では除去されないＮ−末端メチオニンをポリペプチドから除去し得る酵素を生産する微生物の株を単離する方法を包含する。前記開示したように、Ｎ−末端メチオニンは、第２アミノ酸がＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａ　ｓ　ｐ　、　Ｇ　１　ｕ　、　Ｇ　Ｉ　ｎ、Ｉ　Ｉｅ、Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＭｅｔである場合、分泌されないポリペプチドから明らかに除去されない、第２アミノ酸としてこれらのアミノ酸の１つを有するポリペプチドからＮ−末端メチオニンを除去し得る酵素は、ペプチダーゼＭ生産株（これは広い特異性のアミノペプチダーゼを有さない）を変異させ、変異株を唯一のメチオニン供給源としてそのポリペプチドを含有する培地で生育させることにより産生じ得る。このような環境で生育した株は、Ｎ−末端メチオニンを除去し得る酵素を有する。

酵素は、活性の程度は異なるが、多くの異なる基質に対して作用する。ペプチダーゼＭの場合、トリペプチドＭｅｔ−ｇｌＶ−ｇｌ：Ｙは、他のトリペプチドのように迅速には加水分解されない、この低い活性により、１を越える基質を有する酵素を過剰生産する株を単離する技術が提供される。過剰生産株は、必須栄養の唯一の供給源として、より反応の遅い基質を含有する培地で生育するが、酵素を過剰生産しない株は、この種の培地中では生育しない、その後、変異させた微生物をこの種の培地中で培養することにより、過剰生産株を単離し得る。この技術を公知の変異技術と共に使用して、株中にて、例えば、全ゆるボリベチドからＮ−末端メチオニンを切断し得る（通常は生体内でメチオニンの切断を許容しない第２アミノ酸を有するポリペプチドからも同様）酵素を生産し得る。

以下の限定的でない実施例により、本発明の詳な説明を提供する。

Ｍｅｔ−Ｇｌｙ　Ｇｌｙは、広い特異性のペプチダーゼを欠損する株における生育を支持しないが、第２アミノ酸としてアラニンを有する基質より遅い速度で抽出物により加水分解されるという観察は、ペプチダーゼＭを過剰生産する株を単離する方法を示唆した。前記した広い特異性のアミノペプチダーゼにより特定される遺伝子中の非復帰変異を担持するＭｅｔ要求株を、Ｍｅｔ供給源としてＭ　ｅ　ｔ　−Ｇ　Ｉ　ｙ　−Ｇｌｙを含有する培地上にブレーティングすると、このペプチドを使用し得る変異株が得られた（ゲー・エル・ストラウチら、「サルモネラ・チフィムリウムのペプチダーゼＴの過剰生産Ｊ　、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５６．７４３−５１　（１９８３）　）　。

ペプチダーゼＮ、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｐ、ＱおよびＴ並びにジペプチジル・カルボキシペプチダーゼを、ケー・エル・ストラウチら「トリペプチダーゼ（ペプチダーゼＴ）を欠損するサルモネラ・チフィムリウム変異株の単離と特徴」、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５４．７６３−７１　（１９８３）の手順を使用して得た。これらの株を、０．４％グルコースおよび０．４　ｎＨＬ−アミノ酸を補填したＥ培地で培養した。

広い特異性のペプチダーゼを欠損する株の変異誘発は、変異の頻度を増加させるべくジエチル硫酸を用いて行った。しかしながら、この種の変異は必要ではなく、検出し得る頻度で自然変異を認めることができた。メチオニンの供給源としてＭｅ　ｔ−Ｇ　１　ｙ−Ｇ　］　ｙを使用し得る変異株は、Ｍｅｔ−Ｇ　１　ｙ −０１ｙ　（０，１ｎＨ）をＭ　ｅ　を供給源として含有する適切に補填した最少プレート上で０．１１のＴ　Ｎ　２１８３の最少−夜培養培養物をブレーティングすることにより選択した。これらの幾つかの変異株を精製し、特徴を調べた。これらの変異株はＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ上で十分生育するが、これらは、Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｌａ、またはＭｅｔ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔを使用せず、Ｌｅｕ供給源として幾つかのＮ−末端ロイシンのペプチドのいずれを用いても生育しなかった。１つの変異株、ｐｅｐＭｌｏｏの抽出物におけるペプチド加水分解の試験により、２０−３０倍のＭｅｔ−Ａｌａ−３ｅｒ加水分解活性の増加が認められた。この株を更に特徴を調べるのに選択した。

ＰｅｐＭｌｏｏを担持する株のペプチド利用プロフィールを、第２表でその親株と比較する。第３表のデータは、変異株の抽出物中において、第２位置にＡｌａ、ＴｈｒまたはＧｌｙを有するＮ−末端Ｍｅｔのペプチドに対する活性のレベルは、全て、野生型ペプチダーゼＭを有する株の活性と比較して約２０倍増加したことを示す、メチオニン以外のＮ−末端を有するＭｅ　ｔ−Ｌｅ　ｕ−Ｇ　１　ｙ、　Ｍｅ　ｔ−Ｍｅ　ｔ−Ｍｅ　ｔ、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｌａ並びに幾つかの他のペプチドは、変異株または親株の抽出物によっては加水分解されない、全ての基質ペプチドについての相対的な加水分解速度は、２つの抽出物において同一である。したがって、単一のペプチダーゼのレベルはｐｅｐＭ１００変異によって増加する。このペプチドはＮ−末端メチオニンに対して特異的であり、ペプチドの第２アミノ酸によって影響を受ける。

Ｍｅｔ−Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ−ＭｅｔからのＮ−末端Ｍｅｔの除去は、酵素はテトラペプチドを加水分解することができ、トリペプチドに特異性が限定されないことを示す、変異株は幾つかのＮ−末端Ｍｅｔジペプチドのいずれによっても生育せず（例えば、Ｍｅｔ−ＧｌｙおよびＭｅｔ−Ａｌａ＞、また、抽出物は、これらのジペプチドを加水分解しなかった。

ＴＮ２１８３　　１ｅｕＢＣＤ４８５　　ｍｅｔＡＩ５　　匹吐皿肱旦旦肱吐旦肚吐Ｌ　Ｂ匹１　　凹旦Ｈ−：　Ｍｕ　ｄ　Ｉ　（Ｘ）Ｔ　Ｎ　２２７０°＆肚 ■旦Ｌｚａｅ−３ｔ４９：：Ｔｎ１０Δ１６Δ１７Ｔ　Ｎ　２５０１°”　　肚堕旦Ｌｚａｄ１６１５　：：Ｔｎ１０Δ１６Δ１７Ｔ　Ｎ　２５２９　　　凹且凹− Ｔ　Ｎ　２５４７°’　　ＬＪ！！ＬＬ［Ｚａｅ−３１４９：：ＴｎＩＱＡ１６ Δ１７Ｔ　Ｎ　２５６３°　ｐｅｐＤ３　　［ｐｙｒＡ６８５：：ＴｎｌＯ／ｐｙｒａＡ　”　］ゝＴ　Ｎ　２５６５°”　　Ｉ）ａｌｌＤ３　　［１）’／ｒａ６８５：：Ｔｎ　ｆｉ”　／ｐｙｒＡ”［Ｚａｅ１６１４：：Ｔｎ　１０Δ１６Δ１７にａｎｔ　］　＋ｂＴＮ２６２４＠肱吐り封Ｌ−Ｉ　　Ｚｃｆ８４５：：ＴｎｌＯＴ　Ｎ　２６２６・　肚吐り虹Ｌ−Ｉ　　ＺＣｆ８４５：：ＴｎｌＯ凹且旧ｌＬ°この株は、示したものに加えて、ＴＮ２１８３の全てのマーカを担持する。

”　Ｔｎ１０Δ１６Δ１７およびＴｎＩＱＡ　１６Δ１７にａｎ’は、フォースタ・ティら、「トランスボゾン■ｎ１０ノ遺伝機構Ｊ　、Ｃｅ１ｌ、２３．２０１−１３　（１９８１）に記載されている。

ゝ角括弧は、クロモシームのタンデムデユー１リクーシヨンが２種以上の雌を有する（　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ　）マーカを含む。

１１且ｌ過　　　　か　のペプチダーゼＭの株Ｔ　Ｎ　２２７３を、０．４１ＨのＬｅｕおよび０．４ａＭのＭｅｔを含有する最少グルコース培地中で生育させた。培養物からの細胞ベレットを０．ＯＩＭのリン酸カリウムｌｌｆ液（ｐＨ７，５）に懸濁し、超音波により破壊した。遠心分離の後、リン酸［１ｉ液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマンＤＢ−５２）カラムに装填し、同じｌＩ街液を用いて０．４ＭまでのＫＣＩリニヤ・グラジェントにより溶出させた。活性画分を合せ、限外ろ過膜（Ｙ　Ｍ−１０、アミコン社）上で濃縮し、０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したクルトロゲルＡｃＡ３４カラム（Ｌ　Ｋ　Ｂ　）を通過させた０Ｍｅｔ−Ａｌａ−３ｅｒを加水分解する画分を合せ、前記したようにして濃縮した。この材料の比活性は、出発抽出物より約１３倍高く、野生型抽出物のものより約２９０倍高かった。この材料をタロマドフォーカシングにより更に精製した（０．０２５　Ｍのイミダゾール−ＭＣＩ　ｎＨ７，４、ｐ１５．２　、ポリバッファ７４−ＨＣ１ｐＨ４，０を用いて溶出）、このカラムのピーク画分からの精製材料を、第１図に示す実験に使用した。

乱立■ユ過膜　　　からベプ　ダーゼＭ　　″　る　の　゛株Ｔ　Ｎ　２２７０に由来す −る細胞を、２５０　ａＨのショ糖と５ｒｘＨのＭ　ｇ　Ｃ１２を含有する２０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，５の等張培地中で洗浄した後、１００　ｉＨリン酸ナトリウム、１１Ｍアジ化ナトリウムを用いて再懸濁しな（１３０ｍ１当り５０ｇの正味の重量）、その後、フレンチ・プレッシャ・セルを使用して細胞を破壊し、１０，０００ｇ　テ３０分間および６０，０００ｇテ９０分間ノ遠心分離により顆粒物質を除去した。最終の上澄を０６４５μのニトロセルロース膜を用いてろ過し、１００　ｎ＋Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，１ｎＭアジ化ナナトリウム平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（１４ｘ５ｃｍ直径）に装填した。

カラムに結合するペプチダーゼＭはＯ−０，３ＭのＮａＣ１の１．５Ｌグラジエントを用いるに際して初期に溶出された。

活性を基準としてペプチダーゼＭをプールしく約３００１の全容積が得られた）、ダイアフローＰＭ１０限外ろ過膜を使用して２０１１に：ａ縮した。ミレックスーＧＶ０．２２μフィルタユニットによるろ沿接の濃縮物を、５０＋ｓＨリン酸カリウム、ｐＨ７，０で平衡化したクルトロゲルＡｃＡ３４カラムに装填した。３５ｍ１／ｈ「でカラムを溶出させ、６．５０ｉｌの画分を集めた。活性を基準としてペプチダーゼＭを再びプールしく約６６１１の全容積が得られた）、約５ｎｌに濃縮した。濃縮物の５ＤＳ−ＰＡＧＥは、３２−３５，０００Ｍ、１の主要バンドを示した。クロマトフオーカシング（モノＰ）または陰イオン交換クロマトグラフ（ファストＱ）を使用するＦＰＬＣにより更なる精製を行った。

前記したようにして得られた部分精製ペプチダーゼＭを５０ｒａＨす”ｙｆｆ４ナトリウム、ｐＨ７，０（約４．０−６．０　ｎｇ／ｎｌで０．５−１゜５１］）中に置き、２５１Ｎビス−トリス−ＨＣ１、ｐＨ７，４で平衡化したＦＰＬＣモノＰ　　ＨＲ５／２０カラム（ファルマシア）にこれを装填することによりクロマトフオーカシングを行った。水で１：１０に希釈しＭＣＩ″′Ｃ″ＤＨ４，０に調整した４９１１のポリバッファ７４−ＨＣＩ（ファルマシア）を用い、室温にて１１１／分でカラムを溶出させた０等量の２００１Ｈリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０を含有するチューブに両分（０，５ｍｌ）を集めた。

５０ｎＨリン酸ナトリウム、ｐＨ８，０で平衡化したＨＲ５１５カラム上で陰イオン交換クロマトグラフを行った。いずれの方法も９０％のペプチダーゼＭを生成した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析用ＥＧＦ）。

ペプチダーゼＭの過剰生産を与える変異のマツプ位！の決定、ｐ　ｅ　ｐ　Ｍ遺伝子の重複の構成、びに　ｅ　Ｍ４に対　る　ｅ　ＭｌｏｏのｆＥ越ｐｅｐＭ位置の近傍へＴ　ｎ　１０Δ１６Δ１７を挿入したもの（ティ・ジエイ・フォスタら、Ｃｅ１１．２３．２０１−１３　（１９８１）　）を単離した（ケー・エル・ストラウチら、「サルモネラ・チフィムリウムの酸素制御Ｊ　、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６１．６７３−８０（１９８５））　、この挿入物を使用し、Ｔｎ１０Δ１６Δ１７挿入の部位での移行開始点を備えるＨｆｒ形成の標的とした（エフ・ジー・チュムレイら、ｒ　Ｔ　ｎ　１０により指向されるＨｆｒ形成」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　９１．６３９−５５　（１９７９）　）　、このようにして構成したＨｆｒを使用する接合交差は、ｐｅｐＭはサルモネラゲノムの９８−７マツプ単位領域に位置することを示した（ゲー・イー・サウンダーソンら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、　Ｒｅｖ、、　４７．４１０−５３（１９８３））　、この領域のマーカを用いるファージＰ２２に媒介される誘発交差は、ｐｅｐＭｌｏｏは３マツプ単位でｌｅｕに対して約８％リンクすることを示した。ｐｅｐＭにリンクする他のトランスボゾン性要素を単離し、更にマツプ位置を特定すべくマーカとして使用しな、これらの交差の結果を第５表に示す、これらの結果は、ｐ　ｅ　ｐ　Ｍ遺伝子およびトランスボゾン性要素の位置を確立する。試験したＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの利用を与える全ての変異はｚ　ａｅ３１４９：　Ｔｎ１０Δ１６Ｌ旦に対するＰ２２誘発にリンクするため、これら全てがｐｅｐＭ位Ｉの対立遺伝子の可能性がある。

ｐｙｒＡ遺伝子中のＴ　ｎ　１０挿入を使用し、ｐｅｐＭ位置の重複を有する株をアンダーソンとロスの方法、「細菌の遺伝子重複：娘染色体交換によるジーン・ドーセージの変動」、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｒ＋ｇＨａｒｂｏｒ　５ｙｎｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、、　４３．１０８３−８７［１９７８）　）によって構成した。この重複株を、優勢試験および本発明の実施態様に使用した。コバルトイオンを添加してペプチダーゼＭの活性を増加させることができる。第４表を参照するとよい。

過剰生産変異の選択の基本は、Ｍｅ　ｔ−Ｇ　Ｉ　３’−Ｇ　Ｉ　Ｖがこの酵素の基質であるにも拘らず、これをＭ　ｅ　を供給源として使用し得る程十分に迅速に、−見して加水分解されないことを！１１！察することである。ペプチダーゼＭの過剰生産株の利用性は、この酵素の精製のためには便利な供給源を与えるが、当業者により、過剰生産株の調製はペプチダーゼＭを調製し単離するのに必須ではないことが認識されよう、ペプチダーゼＭの過剰生産は細胞の生育に対して有害であるとは期待されない、ｐｅｐＭ１００過剰生産変異を有する株は、試験を行つな全ての条件下で正常に生育したためである。酵素は第２アミノ酸に対して極めて明確な特異性を有するため、過剰生産は、結果的に、通常は修飾されないままの蛋白質からのＭｅｔの除去を与えるものではない、ペプチダーゼＭを過剰生産する株は、クローン化した蛋白質からＮ−末端を除去するのに有用たり得、これは、野生型細胞中で有効にＮ−末端を修飾するには高すぎるレベルで発現される。その他、たとえペプチダーゼＭの過剰生産が細胞に対して有害であっても、ｐｅｐＭ遺伝子を操作して、必要な場合にのみ、大量に発現させることができる。

Ｋ土■互Ｍｅｔ−インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）からの２５１Ｈのイミダゾール酢酸緩衝液ｐＨ７゜６に溶解したＩＬ−１β組換え誘導ＬＩ−１β（バイオジエン・ニス・ニー）を、ＦＰＬＣモノＰ　　ＨＲ５／２０カラム（ファルマシア、２１１／１の蛋白質濃度で２ＩＩｇを装填）または予めカラムｖｌ街液で平衡化したポリバッファを含有するカラム（Ｉｔｃｉｘ　１．５　ｃｒａ直径）に装填した。１：１５に水で希釈し酢酸を用いてｐＨ６，０に調整した５７１のポリバッファ９６／　７４混合物（２０：　ＩＶ／Ｖ）により、室温にて１１／分でモノＰカラムを溶出させた。（ファルマシア製ポリバッファ）、水で１：１３に希釈し酢酸を用いてＩ）８６．０に調整した２００１のポリバッファにより、５０ｍ１／ｈで４℃にて、ポリバッファ交換カラムを溶出させた。　２８０　ＩＩＩにおけるその吸光度を基準として２つの個々の画分をプールした。プールした画分からポリバッファを除去すべく、固体硫酸アンモニウムを８２％飽和にて添加しな、遠心分離により沈澱した蛋白質を回収し、２０ｉＨＮ　Ｈ４ＨＣＯｊ中に溶解した。

清澄な溶液を４℃にてこの緩衝液を何回か交換しつつ透析し、その後凍結乾燥を行った。

ＩＬ−１βとｍｅｔ−ＩＬ−１βとの間の分子量の差は僅かであるなめ、どの画分がどの形態の蛋白質を含有するかを決定するには５ＤＳ−ＰＡＧＥは適切ではなく、エドマン分解を使用した。

クロマトフオーカシングにより分離した２つの形態のＩＬ−１βのエドマン分解は、１つのプールにＮ−末端Ａｌａ−Ｐｒｏが存し、他のプールにＮ−末端Ｍｅｔ−Ａｌａが存することを示した。

組換え技術により製造されたＩＬ−１μ分子の約２５−３０％のみがＮ−末端メチオニンを有することが分った。

Ｂ、ベプ　ダーゼＭの標準反応混合物は、終容積０．２１中に、４０μモルのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，５，４０μモルのＮａＣ１、並びに０．１μモルのＣｏ　Ｃ１２、基質として６０−１００／ＪｇのＭｅｔ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含有するものとした。酵素を添加することにより反応を開始し、３０℃で１５ −３０分間行った。遊離のアミノ酸の一量は、５０μｇのし一アミノ酸オキシダーゼ、０．５μモルのＭｎＣｌ　２．１００　μｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ並びに５０μｇのジアニシジンを含有する５０μｍを添加することにより、４５ｎｍで分光光学的に測定した（この混合物により、遊離アミノ酸の酸化に際してＨ２Ｏ２が産生される。その後Ｈ２０，はペルオキシダーゼの基質として利用され、これにより０−ジアニシジンが酸化され、色の変化を与える）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ブタ腎臓由来）をコントロールのアミノペプチダーゼとして使用しな、０．２μモルのＭｎＣ１，を金属活性化剤とじて使用する以外は、コントロールについて同様の条件を使用した。

Ｃ，Ｍｅｔ−ＩＬ−１に　　るベプチ　−ゼＭの一組換えＩＬ−１βに対してペプチダーゼＭを試験すべく、前記したようにクロマトフオーカシングにより組換えメチオニル化および非メチオニル化ＩＬ−１βを分離しな。

薄層ポリアクリルアミドゲル（ＬＫＢアンホラインＰＡＧプレートｐＨ３，５− ９，５）上でエレクトロフォーカシングを行った。不連続ｖＩ街液系を使用して１３％アクリルアミドスラブゲル上で５ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。精製したメチオニンアミノペプチダーゼは、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−ＧｌｙおよびＬｅｕ−Ｇ　１　ｙ−ｃ　１　ｙのＮ−末端アミノ酸を、それぞれ１０．３３および０．４単位／Ｉ１ｇ酵素の速度で加水分解することができな。

２０％Ｎ−末端メチオニンを含有する精製したＩＬ−１β（１００μｇ）を、異なる時間に渡りペプチダーゼＭと共にインキュベートした（酵素対基質の比率は１　：　１００とした）。

メチオニル化ＩＬ−１βのＮ−末端メチオニル残基は、非メチオニル化ＩＬ−１ βの分解を伴うことなく、１５〜３０分以内のインキュベートにより除去された。

Ｎ−末端メチオニル化ＩＬ−１βの形態のものを、クロマトフオーカシングにより混合物の非メチオニル化ｒＬ−１βから分離した。１〜２時間のインキュベート後に非メチオニル化形態の分解を伴うことなく、ペプチダーゼＭ（０，６８μ ｇ）は、精製したメチオニル化ＩＬ−１β（６８μｇ）のｎ−末端メチオニンを完全に除去した。ＩＥＦ上で観察した所では、ロイシンアミノペプチダーゼは、メチオニル化ＩＬ−１βのＮ−末端メチオニンを除去しなかっな。

ペプチダーゼＭはＮ−末端メチオニンに特異的であり、他のＮ−末端アミノ酸を除去しないことを確認すべく、種々の分解時間ペプチダーゼＭと接触させた後に取得したｍｅｔ−ＩＬ−β１のサンプルにより５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。

また、イソエレクトリック・フォーカシングによって分離したバンドから溶出させた蛋白質により、Ｎ−末端配列決定を行った。その結果は、メチオニンより後のＮ−末端アミノ酸の更なるプロセシングは起っていないことを示した。

当業者であれば、勿論、ペプチダーゼＭまたはそのアナログを使用して試験管内でプレ蛋白質を処理できることを理解しよう、また、当業者であれば、本発明の微生物の過剰生産株を組換えＤＮＡの宿主として使用する利点を理解しよう。

また、ベプチタゼーゼＭをコードする遺伝子を宿主に挿入して、成熟組換えまたは過剰生産蛋白質の生産を促進することができる。

艮１ヱｌペプ　ダーゼＭの過　　　をコード　るＤＮＡ　　　のヨ５ａｕ３Ａを使用して、ニス・チフイムリウム株Ｔ　Ｎ　２５２９（野生型）に由来するＤＮＡを消化し、得られた９〜２２Ｋｂの断片を、ファージλＥＭＢＬ３およびＢａｍＨＩ部位のＤＮＡに挿入した。ニス・チフィムリウム株Ｔ　Ｎ　２５２９は、既にドイツチェ・ザンムルング・フォノ・ミクロオーガニスメン、西ドイツに寄託され、寄託番号としてＤＳＭＮｏ。

３９６９が付与されている。また、株Ｔ　Ｎ　２５４７に由来するＤＮＡ（ペプチダーゼＭ過剰生産株）を部分消化し、９〜２２に５画分をλＥＭＢＬ３のＢａｍＨＩ部位に挿入した。同様に株ＴＮ２５４７をドイツチェ・ザンムルング・７オン・ミクロオーガニスメンに、ＤＳＭ　　Ｎｏ、３９７０として寄託した。その後、そぞれのファージの１０００のプラークを、ケー・カイザーとエヌ・イー・ムライ、ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎΩ、第１巻（ディ・エム・クロパー編）（第１〜４７頁）、ＩＲＬプレス、オックスフォード、ワシントンＤＣに記載された手順を使用してスクリーニングした。これらの２つのファージを後の使用に備えて保存した。

実施例４に記載したように、ＡｃＡ３４クロマトグラフカラムを使用して、株Ｔ　Ｎ　２５４７の粗製抽出物からペプチダーゼＭを単離した。その後、濃縮したペプチダーゼを、イソエレクトリック・フォーカシングにより更に精製した。イソエレクトリック・フォーカシングにより結果的に与えられるｐＩ５．２のバンドがペプチダーゼＭであった。ペプチダーゼＭのＮ−末端の最初の約３０のアミノ酸を、その後、蛋白質配列決定装置により配列決定した。ペプチダーゼＭの最初の３０のアミノ酸を第７表に示す。

配列決定を使用して２つのオリゴヌクレオチドのプローブ、３２／　１ａおよび３２／Ｉｂを作製したが、これをキナーゼを使用しｐ１２によりγ−ラベルした。この２つのプローブは単一の不対舎のみを有し、パイプリダイゼーションは確実である。これらのプローブを使用し、固定化ニトロセルロースフィルタ上で株Ｔ　Ｎ　２５２９および株Ｔ　Ｎ　２５４７に由来するペプチダーゼＭのストランドを含有する２つのλＥＭＢＬ３ファージを同定した。それぞれの場合において、ファージおよびプローブを、６ＸＳＳＣ５５×ゾーンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、並びに０．１％ビロリン酸ナトリウムの溶液に浸漬した。キャリヤとして１０μｇ／ｌのウシ胸ｆｉＤＮＡを添加し、混合物を３７℃で一夜インキユベートした。２つの株Ｔ　Ｎ　２５２９およびＴ　Ｎ　２５４７について、プローブ３２／Ｉａは陽性を与え、グローブ３２／１ｂは陰性を与えた。

プローブに付着したＤＮＡを、３．２ＭのテトラメチルＮＨ，ＣＩ／１％ＳＤＳ溶液中にて、５２℃で９０分間洗浄した。

そのｔｉｅ、このＤＮＡを６ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中にて、室温で１０分間洗浄した。オートラジオグラフによりクローンを同定し、５つの陽性のプラークをそれぞれの株のＤＮＡの配列について最初に選択した。これらのファージを精製し、ＤＮＡを単離し、それぞれの株に由来する１つの配列を更なる検討に供すべく選択した。もともと株Ｔ　Ｎ　２５２９に由来するＤＮＡ配列（野生型株）をファージス１０Ａ中に挿入し、もともと株Ｔ　Ｎ　２５４７に由来するＤＮＡ配列（過剰生産株）をファージス３Ｂ中に挿入した。

また、ファージλ１０Ａを、前記したプローブより長い２つのプローブ（プローブは第８表に示す）とハイブリダイズさせ、挿入されたＤＮＡ配列はペプチダーゼＭをコードするものであることを確認した。同様にこれらの長いプローブを第８表に示す、この結果により、適切なりＮＡ配列が存在することが確認された。

ファージλ１０ＡのＤＮＡ配列を、サザンプロット技術を使用して３２／　１ａプローブとハイブリダイズさせ、ペプチダーゼＭのＤＮＡ配列が存在することを確認した。ファージス１０Ａ配列を５ａｌＪで切断した後、９〜１０Ｋｂの断片をＡｌｕ：［で切断し、この断片をプラスミドｍ　１３ｍ　ｐ　１９のＳｍａ工部位に挿入しな、このプラスミドをイー・コリに再導入し、プローブを用いるプラークハイブリダイゼーションに供し、陽性のプラークを得た。

株Ｔ　Ｎ　２５２９に由来するペプチダーゼＭのＤＮＡ配列を有するファージλ １０ＡからのＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＳａｌ工により別々に切断し、約３．５にｂおよび４．５　ＫｂのＤＮＡ断片を得な、それぞれの断片をプラスミドｐＵＣ１ｇに挿入し、得られたベクタをイー・コリの株ＪＭ８３に挿入した。この株も、ドイツチェ・ザンムルング・ミクロオーガニスメンに、ＤＳＭ　　Ｎｏ、３９７７として寄託した。ゲル電気泳動により、組換えグラスミドは、イー・コリおよびサルモネラ株中でペプチダーゼＭを発現するより大きい断片を有することが示された。酵素の同一性は、イムノブロッティング並びに単離によって確認する。

その精神または範囲を逸脱することなく本発明の種々の改良をなし、本発明を改変して本発明の方法および組成物を利用する他のＢ様を提供し得ることは、当業者に対し明らかであろう、したがって、本発明の範囲はここに添付する請求の範囲によって規定され、例として記載した特定のＢ様によらないことが理解されよう。

第２表　アミノ酸供給源としてのベグチドの利用ｅ　　Ｍ”　　　ｅ　　ＭｌｏｏＭｅｔ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　−−Ｍｅ　ｔ　　Ｇ　Ｉ　ｙ　　　　　’　　　　　　　　　　　　　−Ｍｅｔ−Ａｌａ−３ｅｒ　　＋　十Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　士Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ　　　　　　　＋　　　　　　＋Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ　　＋　＋Ｍｅｔ−ｃｘｙ−Ｇｌｙ　＋Ｍｅｔ−ｃｒｔｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ　＋　＋Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　−−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　−−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ− Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　−−＝ＭｅｔペプチドをＭｅｔ供給源として試験し、ＬｅｕペプチドをＬｅｕ供給源として試験した。

第３表　細胞抽出物により触媒されるペプチドの加水分解。

Ｔ　Ｎ　２６２４　　　　　Ｔ　Ｎ　２６２６ｅ　　Ｍ”　　　　（ｅ　　ＭｌｏｏＮｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ　　　　　　１．０　　　　　　１．０Ｎｅｔ−Ａｌａ −Ｎｅｔ　　　　　　１．０　　　　　　１．０Ｎｅｔ−Ｔｈｒ−Ｎｅｔ　　　　　　Ｏ，２０，２Ｎｅｔ−Ｇｌｙ−Ｎｅｔ　　　　　　０１５０．５Ｎｅｔ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　　　　　０．０９　　　　　　０．　ＩＮｅｔ−Ｇｌｙ−Ｎｅｔ−Ｎｅｔ　　　　Ｏ，８０，７Ｎｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　Ｏ・− ・　　　　　０−・・）１ｓｔ−Ｎｅｔ−Ａｌａ　　　　　　ＯＯＮｅｔ−Ｎｅｔ−Ｍｅｔ　　　　　　Ｏ０Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　　　　　　Ｏ，０２”” 　　　　　０．００４　”−−Ａ　Ｉａ−Ａ　Ｉａ−Ａ　Ｉａ　　　　　　０．００４　　　　　０Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ　　　　Ｏ，０４０４０分の反応時間を用い、実施例に記載したようにして試験しな。

°°　それぞれの抽出物についての加水分解速度を、その抽出物についてのＮｅｔ−Ａｌａ−３ｅｔに対する加水分解速度と比較した。

Ｎｅｔ−Ａｌａ−３ｅｒ　４：対する比活性は、Ｔ　Ｎ　２６２４抽出物ニツいては、０２９単位／ＩＩｇ蛋白質、Ｔ　Ｎ　２６２６抽出物については０．５３阜位／ＮＱ蛋白質であった。試験では、１４０　ｒＩＱ蛋白質（Ｔ　Ｎ　２６２４抽出物）または１４Ｈ蛋白質（Ｔ　Ｎ　２６２６抽出物）を含有するものとした。

＝”　　Ｔ　Ｎ　２６２４抽出物試験についての相対的加水分解速度であるｏ、ｏｏｅ　４たはＴ　Ｎ　２６２６についての、００３は、容易に検出し得るものとして計算しな。

°°°°　　極めて少量のｃｘｙおよびＬｅｕ−Ｇｌｙが産生した。

これがペプチダーゼＭ以外のペプチダーゼによる結果であることはほぼ確実である。

第４表　ペプチダーゼＭ活性に対する２価陽イオンの効果添加物°　　　　　　　　　相対的加水分解速度°。

Ｂ　Ｄ　ＴＡ　（１ｉＨ）　　　　　　　　　＜０．０００２７Ｊｉ　ｇ　＋　２　　　　　　　　　　　　　　ｏ。９Ｚ　　ｎ　＋　２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１°　２価陽イオンは、全て、終濃度３ｍＭにて塩化物塩として添加した。Ｃｏ口は、標準試験に使用した濃度、１ｎＨで同様の活性化を示した。

°°　記載したように、Ｍｅｔ−Ａｌａ−８ｅｒを基質として使用し、Ｔ　Ｎ　２６２６の粗製抽出物（８ｍｏ）を酵素として試験を行った。

第５表　Ｐ２２誘発によるｐｅｐＭのマツピング供与体　受容体　選択マーカ　非選択マーカ　共誘発頻度（％）ＴＮ２６９５　　　ＴＮ２５２９　　　Ｌｅｕ　　”　　　　　　　　ｐｅｐＨｌｏｏ　　′″　　　　　７．５（６／８０）Ｉｅｕ　　　ｐｅｐＨ” ｐｅｐＨｌｏｏ１、Ｔ２　　　ＴＮ２５４７　　Ｌｅｕ　”　　　　ｐｅｐＰ　　　　　８．３（２２／２６５）ＴＮ２５０１　　ＴＮ２５２９　　Ｋａｎ　’　　　　ＤｅＤＨｌｏｏｏ　　１７．０（５２／３０５）ｐｅｐＨｌｏｏ　ｐｅｐＨ” ｚａｅ１６１５；：Ｔｎ１０Δ１６Δ１７Ｋａｎ　’ ＴＮ２５０１　　ＴＴ４２１　　にａｎ　ｒＴｅｔ−１１，８（１７／１４４）ｚａｅｉｓｔｓ　ｐａｎＣ：： ■ｎｉ。

Ｔｎ１０Δ１６Ａ１７Ｋａｎ　’ ＴＴ４２１　　　ＴＮ２５０１　　ＴｅｔｒＫａｎ’　　　　　　　３．４（６／１７６）ｐａｎＣ：　　　ｚａｅ１６１５：：ＴｎＩＱ　　　　Ｔｎ１０Δ１６Δ１７ａｎ　　１ −　　ｐｅｐＭ対立遺伝子は、Ｍ　ｅ　を供給源としてＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ上での生育を試験することによりスコアした。

第６表　重複株におけるペプチダーゼＭのレベル株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　比活性。

μｎｏｔ　　Ｎｅｔ／分／ＩＩＱＴＮ２５２９　（ｐ　ｅ　ｐ　Ｍ”　＞　　　　　　　　　　０．０２５ＴＮ２５６３（ｐ　ｅ　ｐＭ”　／ｐ　ｅ　ｐＭ”　）　　　　０．０７６ＴＮ２５４７　（ｐ　ｅ　ｐ　Ｍｌｏｏ　＞　　　　　　　　　０．６０ＴＮ２５６５（ｐｅｐＭ”／ｐｅｐＭ１００）　　　０．７７基質としてＭｅｔ−Ａｌａ−３ｅｒを使用する標準試験第７表ペプチダーゼＭの部分的Ｎ−末端アミノ酸配列ｐ１５．２の画分から配列決定を行った。

Ａ　ｌａｌ　ＩｅＳｅｒＩ　ＩｅＬｙｓＴｈｒＳｅｒＧ　ＩｕＡｓｐｌ　ｌｅＧ　１ｕＬｙｓＨｅｔＡｒａＶａ　ｌＡ　Ｉａ（ｆ　ＩｙＡｒｏＬｅｕＡ　ｌａＡ　ＩａＧ　ｔｕｂａ　ｌ　１ｅｕＧ　ＩｕＨｅｔ　］　ＩｅＧ　ＩｕＰｒｏＴｙｒ１１ｅｌｙｓＰｒｏＧ！ｙＶａｌＴｈｒ、、。

第８表（３’　　）ＣＴＹ　ＣＴＲＴＡＲＣＴＹ　ＴＴＹ　ＴＡＣ（５”　　）Ａコ：二ｆ３２乙す（３’　）　　ＣＴＹ　ＣＴＲＴＡＴ　ＣＴＹ　ＴＴＹ　ＴＡＣ（５”　　’）（Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、唯一の不対台部位を下線で示す）（３’　）　ＧＣＴＡＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＣＴＴＣＴＧＡＡＧ＾ＴＡ（５ ’）（プローブＮ３２−１８およびグローブＮ５２−２’は、マークを付した塩基の闇で相補的である。これらのオリゴヌクレオチドは互いにアニールし、フレニュー酵素を補助として放射活性ヌクレオチド・トリフオスフェートにより延在し、オリゴヌクレオチドの取り込まれないトリフオスフェートは、オリゴヌクレオチドの混合物から分離される。このオリゴヌクレオチドの混合物をグローブとして使用し、ｐｅｐＭ遺伝子に対応するＤＮＡを同定した。）ｋＤａ１１ｍｌｌｌｋｅＭｌ　ａ＠″””””＝ＰＣＴ／ＥＰ　ａｌ１１０００９６− ＾竜雪内ｌ１９１−１＾１−−畳−１ｌｌ−ＩＮＮ−シｐｃτ／ＥＰｌ！８１０００９６１際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリベプチドからＮ−末端メチオニンを切断し得る酵素であって、前記酵素が、前記ポリベプチドから他の如何なるＮ−末端アミノ酸をも実質的に切断し得ず、前記ポリベプチドのＮ−末端以外の如何なる部分のメチオニンをも実質的に切断切断し得ないことを特徴とするポリベプチドからＮ−末端メチオニンを切断し得る酵素。
２．前記酵素がペプチダーゼＭである請求項１記載の酵素。
３．前記ポリベプチドの第２アミノ酸が、アラニン、システイン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン並びにバリンよりなる群から選択される請求項１記載の酵素。
４．Ｎ−末端のメチオニンを含有しないポリベプチドを製造するに際し、前記Ｎ −末端メチオニンを有するポリベプチドを請求項１または２記載の酵素で処理することからなることを特徴とするＮ−末端のメチオニンを含有しないポリベプチドの製造方法。
５．請求項４記載の方法によって製造されることを特徴とするポリベプチド。
６．Ｎ−末端メチオニンを含有しないポリベプチドを製造するに際し、（ａ）（ｉ）発現制御配列に機能的に連結された前記ポリベプチドをコードするＤＮＡ配列および（ｉｉ）発現制御配列に機能的に連結された請求項１または２記載の酵素をコードするＤＮＡ配列を含有する単細胞生物を培養し、（ｂ）前記微生物から前記ポリベプチドを回収する工程からなることを特徴とするＮ−末端メチオニンを含有しないポリベプチドの製造方法。
７．Ｎ−末端メチオニンを含有しないポリベプチドを製造するに際し、（ａ）Ｎ −末端メチオニンを有する前記ポリベプチドを生産する宿主を選択し、（ｂ）発現制御配列に機能的に連結された請求項１または２記載の酵素をコードするＤＮＡ配列により前記宿主を形質転換し、（ｃ）前記形質転換宿主を培養する工程からなることを特徴とするＮ−末端メチオニンを含有しないポリベプチドの製造方法。
８．Ｎ−末端メチオニンを含有しないポリベプチドを製造するに際し、（ａ）請求項１または２記載の酵素を過剰生産する宿主を選択し、（ｂ）発現制御配列に機能的に連結された前記ポリベプチドをコードするＤＮＡ配列により前記宿主を形質転換し、（Ｃ）前記形質転換宿主を培養する工程からなることを特徴とするＮ−末端メチオニンを含有しないポリベプチドの製造方法。
９．（ａ）ペプチダーゼＭをコードするＤＮＡ配列、（ｂ）ペプチダーゼＭの活性断片をコードするＤＮＡ配列、（ｃ）ペプチダーゼＭのアナログをコードするＤＮＡ配列、並びに（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかのＤＮＡ配列に対して縮退するＤＮＡ配列よりなる群から選択されることを特徴とするＤＮＡ配列。
１０．請求項９記載の少くとも１つのＤＮＡ配列からなることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
１１．請求項１０記載の組換えＤＮＡ分子によって形質転換されたことを特徴とする宿主。
１２．酵素を過剰生産する微生物の株を選択するに際し、前記酵素を第１基質および第２基質上で作用させ、前記酵素が前記第２基質に対するより前記第１基質に対して実質的に大きい活性を有し、（ａ）生育に必要な唯一の栄養源として前記第２基質を含有し前記第１基質を含有しない培養培地中で前記微生物を培養し、（ｂ）前記第２基質に対する高活性を示す前記微生物の株を単離する工程からなることを特徴とする酵素を過剰生産する微生物の株の選択方法。
１３．前記ポリベプチドがインターロイキンＩＢ（ＩＬ−ＩＢ）である請求項５記載のポリペプチド。