JPS59500042A - 組換え体表面タンパク質を持つウイルス - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 組換え体表面タンパク質を持つウィルス技術分野 一般的には、本発明は特有の生体機能を持つタンパク質セグメントを人間を含む 動物に導入する事に関連する。

特に、本発明は通常大きなタンパク分子に観察されるある種の機能を持つ小さな ペプチドセグメントを生体に導入するためのウィルスキャリアの使用に関連する 。

背景技術 抗原機能、ホルモン機能、酵素機能および細胞調節機能などの多くの生体機能は タンパク質によりなされる。

タンパク質は特定の配列をしたアミノ酸の長い鎖からなる。上記に記載１−だ機 能は典型的には短い配列のアミノ酸からなるかなり限定されたタンパク質のセグ メントの寄与による。残りのタンパク分子はしばしば、機能性セグメントまたは 複数のセグメント類のキャリアとして働く。

キャリアセグメントはタンパク質の機能性セグメントを防御し、また機能性セグ メントを基質の方向に差し出し活性を促進させる。更に、タンパク質の機能性セ グメントのある種の性質は、機能性セグメントを含むアミノ酸の短い配列が、よ り長いタンパク鎖と連結している時にのみ効果を現す事ができる。例えば、特定 の短いアミノ酸配列に対する免疫応答は一般的には短い配列が広がった分子と連 結している事が必要である。原則として、タンパク質のキャリアセグメントは機 能性タンパクセグメントの性質を変えることなく種々の他のキャリアセグメント に置き換えうる。そｔような置換は、後で明らかになるが、有用なワクチンの生 産のような機能性タンパク質セグメントの商業上または医学上の利用においであ る種の明りような利点を生じる。

特に、有用な機能を持つ小さなアミノ酸配列のためのキャリアとして利用するの にウィルスタンパク質が特に適しているのがわかるだろう。一つの特別に有用な タンパク質の機能（典型的にはタンパク質の限定された配列に帰因する）は、免 疫応答を誘導する能力である。外来性タンパク質（即ち、宿主動物に、自然には 存在しない）を注射、吸入、摂取または他の方法で生きている動物へ入れると免 疫応答を引き出す。動物での免疫応答は、抗体の産生などの多くの異った協奏的 な過程からなり、外来性タンパク質を攻撃し、それにより外来性タンパク質のキ ャリアによる感染から動物を防護する。重要な点は、免疫応答の更なる特徴が生 物的記憶をなす事であり、それにより同一の外来性タンパク質に二度目にさらさ れた場合より速（より強い免疫応答がおこる。これが現代医学の重要な一部分で あるワクチン接種の原理である。

たとえキャリアセグメントが自然の場合と同じタンパク質でなくても、タンパク 質の小さなセグメントが太きなキャリアセグメントに結合している場合、効果的 な免疫応答が誘導される事が観察されている。

一つのタンパク質からの機能性セグメントを自然には存在しないキャリアセグメ ントに結合したようなタンパク質のワクチン接種により、ハイブリットタンパク 質の更なる注入に対する防護だけでなく、その機能性セグメントが得られた本来 のタンパク質に対しての防護ともなる。

典型的には、免疫応答を誘導するタンパク質セグメントを含み、疾病発現に関し ては実質的に病原性を減じたウィルスを持つ因子を実験室で製造する事によりワ クチンを生産する。これらの因子とはただ軽い疾病を起こす微生物の株かまたは 化学的に不活性化した微生物である。

これらのワクチンを動物に注入し、注入された動物中で免疫応答を誘導する；し かしながら、これらのワクチンには問題がある。多くの感染因子は管理条件下成 長が困難または不可能であり、成長後年活性化するものは不活性化の過程で部分 的に逃れる可能性があり、それはワクチン接種する動物に大きな危険を与える。

病原性を弱くした感染微生物株では、より危険な型へ自然突然変異する危険性は 生来のものであり、同様にワクチン接種した動物をもしかすると危険にさらす事 になる。さらに、このようなワクチンの生産に含まれるすべての技術は時間を浪 費し経費が高い。

従って、感染因子を感染因子それ自身のキャリアのかわりに自然には存在しない キャリアに結合させる事により得る免疫原（免疫一応答−産生）タンパク質十グ メン４ トをワクチンとして使用すると便利である。本発明の一つの点に従うと、ウィル スタンパク質は特にキャリアとして有用であり、免疫原タンパク質セグメントが ウィルスの生存または繁殖に影響せずに、またワクチン接種した動物の免疫系に 露出されるようにスグメントをウィルスが運搬するように、ウィルスタンパク質 の中へ免疫原タンパク質セグメントは挿入される。数種のウィルスが免疫原タン パク質セグメントを運搬するのに使用でき、各々独特な利点がある。それらはＤ ＮＡ−含有バクテリオファージ、非病原性ＤＮＡ−含有動物ウィルスおよび非病 原性エンベロープＲＮＡ−含有インフルエンザウィルスである。

ラムダファージのようなり　Ｎ　Ａ−含有バクテリオファ−ジはウィルスであり 細菌に感染する。これらのウィルスは細菌中で増殖し大量になり、すくない経費 で生産され、動物または人間に対し病原性がなく、摂取、吸入または注射により 導入できる。ＤＮＡ−含有アデノウィルスおよびエンベロープＲＮＡ−含有イン フルエンサウイルスのような非病原性動物ウィルスは、人間または動物の細胞中 で複製し、不顕性または取るに足りない感染となる。これらは注射、摂取または 吸入により安全に導入される。

これらのウィルスの表面に露出しているタンパク質は外来性免疫原性タンパク質 セグメントとして良好である。

非エンベロープウィルスの場合表面タンパク質はタンパク殻タンパク質であり、 エンベロープウィルスの場合膜透過タンパク質である。

免疫原タンパク質セグメントが表面ウィルスタンパク質に露出した様式で取り込 まれた時、ウィルス全体が広がったキャリアとして働く。取り込まれた外来性タ ンパク質セグメントが特定の免疫応答を誘導する潜在力を持っていても、ウィル スキャリアは複製の能力を保持している。ウィルスキャリアはまた、タンパク質 の安定に寄与するその生物的機能も保持する。

他の型のウィルスもまた本発明によるキャリアとして有効に使用される。さらに 、免疫応答を刺激する能力と別の機能を持つ短いタンパク質セグメントも本発明 の方法によりウィルス表面タンパク質セグメントとして取り込まれる。

特定の機能のタンパク質セグメントをタンパク質キャリアに接合するのは、遺伝 子コードの理解、分子生物学的手法、および組換えＤＮＡ遺伝学の技術の最新の 発達を利用する事により達成される。＃ｌ胞タンパク質のアミノ酸配列は、多く のウィルスタンパク質同様に、遺伝コードにより配列したデオキシリボ核酸（Ｄ ＮＡ　）のセグメントである遺伝子により決定される。特定のアミノ酸の配列は ＤＮＡ中のコードン（核酸サブユニットの三つの組）の配列に従って合成される 。外来性ＤＮＡ配列の宿主生体のＤＮＡへの挿入は（ある適当な条件下）挿入し た外来性ＤＮＡ配列により特定されるアミノ酸配列の表現となる。

組換えＤＮＡ技術によりそのような操作を都合よ〈実施できる。特定のタンパク 質またはタンパク質セグメントをコードしているＤＮＡ配列は現在簡単に単離さ れ、生化学的使用には十分な量精製される。これらの配列はその後制限エンドヌ クレアーゼとして知られて℃・る酵素を用い、特定の場所で切断し、Ｄ　Ｎ　Ａ 　リガーゼを用い精製した他のフラグメントを一緒に結合する。これらの再結合 した分子をその後バクテリアまたはより高度な細胞のような生きている生物に入 れる。

特定の機能を持つタンパク質セグメントを表面ウィルスタンパク質に取り込ませ 、商業上および医学上の過程の為に有用な試薬を提供するように発達してきた組 換え技術を利用するのが望ましい。

本発明の目的は有用なタンパク質セグメントをウィルスキャリアに結合させる方 法を提供する事である。

本発明の他の目的は、動物に免疫応答を誘導するため免疫原性タンパク質セグメ ントのウィルスキャリアを提供する事である。特に、新しい安全なワクチンを生 産するのが目的である。更なる目的は、人間を含む哨乳類の改良されたツクチン 接種を提供する事である。

発明の概略 外来性タンパク質セグメントを露出したセグメントとして表面ウィルスタンパク 質に取り込ませ、しかもウィルスの生殖の生存能力には影響を寿えな℃・。組換 え体または外来性タンパク質セグメントを持つウィルスは人間のような動物に外 来性タンパク質セグメントの機能（例えば免疫応答誘導）を導入するのに有用で ある。外来性タンパク質セグメントのためにコートしたヌクレオチド塩基配列を 持つＤＮＡフラグメントをウィルスゲノム中へ挿入する事により外来性タンパク 質を組み込ませるが。

それにおいて挿入されたＤＮＡフラグメントはそれ自身表面ウィルスタンパク質 の露出したセグメントを表現する。

外来性ＤＮＡフラグメントを組み込むために、ウィルスゲノム（またはそれらの 一部）をクローニングベクターに挿入し、それは順番に宿主微生物へ導入し、組 換え体クローニングベクターの多くのコピーを生産する。外来性ＤＮＡフラグメ ントを単離し、組換え体クローニングベクターの中のウィルスＤ　ＮＡゲノム部 分内の適当な位置に挿入する。クローニングベクターから外来性ＤＮＡセグメン ト含有ウィルスＤ　Ｎ　Ａゲノム部分を単離し、完全なウィルスゲノムを再構成 する。外来性ＤＮＡフラグメントを含むウィルスゲノムを完全なウィルスとして パッケージする：細胞を感染させた後、子孫を作り、それには外来性タンパク質 士グメントがその表面タンパク質の一つとして表現されている。

好しい態様の説明 本発明によると、機能性タンパク質セグメントはウィルスタンパク質キャリアに 取り込まれる。

８ ここで使用する゛ウィルス″という用語は動物−感染ウィルス同様バクテリアウ ィルスまたはファージを含むバク、Ｔ＋）アデノウィルスを含む。ここで使用す る“組換え体タンパク質″という用語は、外来性ヌクレオチド塩基配列を含む遺 伝子の表現型であるタンパク質を示し、組換え体タンパク質はウィルスのタンパ ク質に対して異種または自然にはないアミノ酸配列を含む。

一般的に、タンパク質セグメント導入の方法は、７つの別個の段階に分解される が、与えた順番に厳密に実行する必要はない。

第一の段階は、機能性外来性タンパク質セグメントのキャリアとして使用するの に適当なタンパク質を持つウィルスの選択である。特定のウィルスの選択は幾分 、使用するタンパク質に依存する。例えばもし、畜牛を免疫するワクチンを望む 場合、適当なウィルスは畜牛中で重大な病的効果を示す事なく複製できるもので ある。さらに、強力な第一次の免疫反応の発達を確実にする為問題にする畜牛が 以前に暴露された事がほとんどまたは全くないウィルス株の使用が適当である。

ウィルス選択の他の考慮は以下に記す実施例および一般的にバクテリアおよび動 物ウィルスについて知られている事実から明らかになる。

一度ウイルスが選択されたら、キャリアタンパク質の選択はそのウィルスの分子 生物学で知られている試験に基づく。ウィルスの生存および複製に非必須である か、または生存および複製に非必須である領域（ここに機能性タンパク質セグメ ントを取り込ませる）を含むウィルスの外部表面上に適したキャリアタンパク質 はある。そのような適した非必須ウィルスタンパク質は、バクテリオファージの ＤおよびＥ遺伝子生産物、オルトミクスウイルスのニューロミダーゼタンパク質 ；およびアデノウィルスのヘキソンおよびタンパク質■である。

方法の第２の段階は選択したウィルスのＤ　Ｎ　Ａゲノムまたは選択したウィル スキャリアタンパク質のためにコードされた遺伝子を含むＤ　Ｎ　Ａゲノムの一 部を、プラスミドベクターのようなりローニングベクターの中へ挿入する。ブ、 ラスミドベクターはバクテリア中ウィルスのＤＮ　Ａを繁殖さぜ、以後の操作の ための多数のこのＤＮＡのコピーが生産される。

ウィルスゲノム部分は通常の技術によりプラスミドの中へ挿入される。簡単に記 せば、特定のＤＮＡ配列が環状であるプラスミドを制限エンドヌクレアーゼによ り既知の所で一つまたはそれ以上に切断する。同じ酵素を使用し、興味ある遺伝 子をその間に含むように選択された特定の部位でウィルスゲノムを切断し、切断 する部位は使用する特定の制限酵素により決定される。よく知られているように 、同じ制限酵素で２つの異ったＤＮＡ切片を切断すると、塩基対水素結合で互に くっつき、また酵素Ｔ　４−　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼにより共有結合で結合さ れるフラグメント末端を得る。もし、部位の切断に異った制限０ １素の使用を必要とする場合、リンカ−と呼ばれている短いＤＮＡセグメントを 加えた後、酵素ＳＩまたはＤＮＡＰｏ１　ＩのｋｌｅｎθＷフラグメントで処理 すると、末端が適合するようになる。

一度適合するウィルスゲノム部分がプラスミドに結合したら、プラスミド遺伝子 の一つは典型的には分解する。

一般的には分解された遺伝子は薬剤耐性のコートを持つ。

プラスミドは通常異った薬剤に対する耐性を表わすタン・々り質をコードした数 種のそのような遺伝子を運んでいる。この事は、うまくいった組換えプラスミド のスクリーニングに簡単な方法を提供する。プラスミドをバクテリア中に入れま たはパトランスホームさせ″、その後バクテリアのコロニーを種々の薬剤耐性て スクリーンする。

細胞コロニーの溶解により組換え体プラスミドの多くのコピーを得る。

第６の段階はウィルスタンパク質の外来性タンパク質セグメントとして取り込ま れた機能性のアミノ酸配列としてコードされたヌクレオチド塩基配列を持つＤＮ Ａフラグメントを単離する事である。そのようなりＮＡフラグメントはクローン 化したベクターのＤＮＡまたは他の方法で純粋な型で製造されて得られる。すべ ての機能性タンパク質のための遺伝子コードは制限酵素で完全に切断する事によ り単離される。一般的にはアガロースまたはアクリルアミドゲルを通す電気泳動 、しかしカラムや密度勾配法のような他の方法も用いる標準的な技術により種々 のＤ　Ｎ　Ａフラグメントを分離する事により目的のＤＮＡフラグメントを単離 する。

ある種の条件下では、問題にしているタンパク質の機能性セグメントが前もって わからな（・場合がある。そのような場合には、制限酵素により多くの遺伝子の フラグメントを発生させる。フラグメントの混合物を精製したＤＮＡフラグメン ト（他の方法により単離される）のかわりに使用し、組換え体ウィルスの機能性 スクリーニングを以下に記載するように実施すると、正しいＤ　ＮＡフラグメン トを持つ組換え体ウィルスを方法の最後の段階で得る。

機能性タンパク質セグメントのためにコート化されたＤＮＡフラグメントはさら にそれらを種々の長さの適当なリンカ−と結合させる事によっても製造される。

選択するリンカ−の型は第４の段階でウィルス遺伝子を切断するのに用いる酵素 に適合させる。少くともＤ　Ｎ　Ａフラグメントのいくつかを適当な解続わく（ アミノ酸を特定する６つのヌクレオチドコードンをウィルスＤ　Ｎ　Ａのコドン と同調してウィルスタンパク質に取り込ませるために）にするために種々の長さ のリンカ−を使用し、例えば外来性タンパク質がその機能を果たせるように露出 するのを確保するために（少くともいくつかの組換え体タンパク質において）、 組換え体タンパク質のある程度の融通性をもたせるようにもする。フラグメント は最初Ｓ１またはＤＮＡＰｏＺＩのｋｌｅｎｏｗ　７ラグメントのよう１２ な酵素で処理し続（・てＴ０ｎ、ＮＡＩＪガーゼで結合させる事によりリンカ− と結合する。過剰のリンカ−は典型的にはカラムで除去する。

第４の段階は、ウィルスゲノム部分を切断し、機能性タンパク質セグメントをコ ードした異種ＤＮＡフラグメントの挿入のために製造し、その後生産方法により ２つを互にくっつける。もし、ウィルスタンパク質の非必須な部分が既知であれ ば、ＤＮＡのその領域を切断する酵素を使用する；その他の場合はウィルス遺伝 子の異なる部位を切断する種々の酵素を利用する。もし、酵素がウィルス遺伝子 を一度以上切断したら、部分分解を行い、選択した領域には単一の切断点を持つ ＤＮＡ分子をゲルを通した電気泳動により単離する。一度プラスミドー結合ウィ ルスＤＮＡを切断し、第６段階で先に製造した異種ＤＮＡフラグメントとＴ４Ｄ ＮＡリガーゼで結合し、本来のプラスミドの残りの部分を含むプラスミドを製造 する（少くともウィルスゲノムの一部分および異種ＤＮＡフラグメントがウィル スゲノム部分の中である）。この改良プラスミドを細胞にトランスホーメーショ ンする事により導入しく典型的には段階２でのトランスホームしたものと同じ培 養）、改良プラスミドの多数のコピーを生産する。培養物の溶菌によりプラスミ ドの多数のコピーを得る。

方法の第５の段階は、ウィルスゲノムと挿入した目的の外来性ＤＮＡフラグメン トの再構成である。取り込んだ外来性ＤＮＡフラグメントを持つウィルスＤＮＡ ゲノム部分を同じ制限酵素または段階２でプラスミド中に挿入するためのウィル スＤＮＡフラグメントを製造するのに使用した酵素で分解し、プラスミドから遊 離させる。

もしウィルスゲノムの一部分だけが挿入されたなら（すべてのウィルスゲノムと いうより）、ウィルスは他のフラグメントと一連のよく知られた段階による結合 により再構成され、各々には酵素Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを使用し、続 いて実際に結合したフラグメントを精製する。

第６の段階では、ウィルスゲノムを・々ツケージし完全なタンパク質の殻の無傷 の感染ウィルスを製造する。・ぐソケージング過程は用いるウィルスに依存する 。ラムダファージのようなバクテリオファージＤＮＡは、精製したファージ抽出 物を用いるよく知られた反応により、エン　ビトロでウィルスにパッケージする 。動物ウィルスは細胞内へ入れ、典型的にはＤ　Ｎ　Ａ　−ＩＪン酸カルシウム 共沈トランスフエクンヨンとして知られている技術である。ＤＮＡ、塩化カルシ ウムおよびリン酸緩衝液の混合により生じる沈殿は動物細胞に取り込まれる。一 度細胞内にはいると、ウィルスＤＮＡは特定のＲＮＡ、ｒを生産し、ＲＮＡ’、 ｒはタンパク質の合成を方向づけそれにより最終的に無傷のウィルスが形成され る。

モジ（ｙ　ｅ上ヱでファージ抽出物からパッケージされたら、パッケージされた ウィルスを宿主細胞培養ヘト７７スホームし、その中でパッケージされたウィル ス株４ カ繁殖−Ｊ’−る。もしトランスフェクションによりパッケージされたら、ウィ ルスはトランスフェクトされた培養液中で繁殖する。培養液中での増殖により組 換え体ウィルスの実質的なコピーを得る。

パッケージングおよび組換え体ウィルスにおし・では再構成されたウィルスゲノ ムの選択を行うので生じるウィルスは増殖可能である。完全なウィルスのタンパ ク質殻を生成し、完全なウィルスとして増殖可能であるウィルスゲノムは本過程 の組換え体ＤＮＡ生成物のただの一部分の表現である事が認められる。必要なゲ ノムセグメントを失ったかまたは、必要なゲノムセグメントヲ持っていても不適 当な解読わく中にあると組換え体ゲノムはもしパッケージされていてもタンパク 質殻を形成せずまた増殖モしない。パッケージングおよび正確に組換えたウィル スゲノムを増殖させた後、不正確に組換えたゲノムは失われるかまたは組換え体 ウィルスの重要でない部分を表現する。パッケージされ増殖可能なウィルスはプ ラーク検定のような標準的な方法で識別され、プラーり検定が陽性であればゲノ ム組換えが成功している事を示す。

成功して組換えゲノムのいくつかは異種ＤＮＡフラグメントを含んでおり、その いくつかは異種タンパク質セグメントの機能を表現する。

本発明の最後の段階は、段階乙のウィルスの個々のプラーり（各々独立した組換 えを表す）の機能性取り込みタンパク質セグメントのためのスクリーニングであ る。

特定のスクリーニング過程は組換え体ウィルスの目的の機能の型に依存している 。標準的な検定は多（のホルモンおよび酵素機能がありそれが望ましい。免疫応 答の誘導能力を検定する場合は、プラークは本来のタンパク質に対して高めた抗 血清でスクリーンする。抗血清に感受性のある二つのプラークからウィルスを得 て精製し、そのウィルスを宿主動物（例えば、ウサギ）に注射する。

動物により注射したウィルスに対し生産される抗体は最後に、本来のタンパク質 と交差反応をする能力があるか試験する。ウィルスによる本来のタンパク質に対 する抗体産生の誘導は、ウィルスが本来のタンパク質の少くとも免疫応答−誘導 セグメントを□、宿主動物の免疫系にセグメントが露出するような方法で取り込 んでいる事の結論的な証拠である。

露出した組換え体タンパク質セグメントを取り込んだウィルスが免疫応答を誘導 する事がわかったので、実質的に非病原性であり、免疫一応答−誘導タンパク質 セグメントを自然に運搬する感染因子を効果的に中和するようなワクチンとして 有用である。外来性タンパク質を取り込んだウィルスはそれ自身非病原性である ので、組換え体タンパク質セグメントを持つウィルスも同様に非病原性であると 見・う事は一般的には真実であるが、しかしそれは各々の場合について確めなけ ればならな（・。組換工体タンパク質セグメントを持つウィルスが感染内子を中 和するような免疫応答を誘導するかどうかもまた各々ｌ６ の場合決定しなければならず、感染因子に対し免疫を誘導するこれらのウィルス （ワクチン）の効果的な量を決定しなければならない。

組換え体タンパク質セグメントを持つウィルスはワクチンとしての有効性を示し 、適当な細胞培養中で増殖しウィルスはそのような培養液を溶解したものから回 収される。ワクチンの投与の方法はワクチン接種する感染因子により変化するが この分野ではよく知られて（・る事である；本発明により生産されるワクチンは 医薬として適当な希釈剤とともに注射、口、鼻、眼、耳または他の体の穴からの 摂取または吸入により投与する。意図された導入の方法に適した適当なキャリア とウィルスを混ぜ合わせる。例えば、組換え体タンノ（り質セグメントを持つウ ィルスをエアロゾルと混ぜ合わせ、空気を通して吸入により動物に投与する。こ の分野でよく知られて℃・るように効果的量のウィルスを投与する。一般的に、 感染因子に対し免疫応答を誘導するような表面タン・（り質セグメントを含むウ ィルスは動物体重キログラム当り約１０９１０１０粒子の量で投与する。

組換え体タンパク質セグメントを持つウィルスの有用性は免疫応答の誘導に限定 されるものではなし・が、このようなウィルスの即時で実際的な使用法は人工ワ クチンである。例えば、ウィルスに酵素またはホルモン機能を持つタンパク質セ グメントを取り込ませる。調節した非病原性の感染を動物におこせば、必要なホ ルモンまたは酵素機能を連続的に供給する事が可能になる。例えば性腺ホルモン のセグメントを取り込んだウィルスは長期間にわたる動物の繁殖力の調整に有益 と考えられる。

更なる本発明の例示の目的で、以下の実施例を示す。

これらの実施例は本発明の範囲の限定を意図するもので本実施例は、ベステイキ ュラーストマチスウイルス（ｖｓｖ）ｃタンパク質の抗原部位のキャリアとして の組換え体ファージの作製法であり、このタンパク質のため感染の初期段階にお いて宿主細胞にウィルスが付着する。Ｇタンパク質の抗体はウィルスの中和を起 こす、即ち伝染性の消滅。Ｇタンパク質の抗原部位を含むアミノ酸配列がＶＳＶ ワクチンの候補である。

本作製法の目的は、バクテリオファージラムダ（大腸菌中で増殖する）の頭部殻 タンパク質のＤまたはＥサブユニットにＶＳＶの抗原部位を導入するものであり 、それによりファージ殻の外側にＶＳ■抗原部位が露出され、ワクチン接種され た動物の免疫系に近すきやすい。ラムダファージの集合、またはその伝染性をそ こなわな見・ような方法で挿入を行う。そのように作製されたラムダファージは 外来性または組換え体タンパク質セグメントをそのタンパク質殻に含む。この組 換え体において、キャリアラムダファージはウィルスの安定性、単純な培地で豊 富に増殖する能力および免疫原性のためのキャリア機８ 能に寄与する；取り込まれたタンパク質セグメントは特定の機能に寄与する、即 ち、ＶＳＶ中和のための抗原部位。

組換え体タンパク質の作製はｔン　（上ヱでファージラムダのＤＮＡおよびＶＳ ＶのＧ遺伝子を含むＤＮＡの組換えにより行う。Ｇ抗原性部位を含むＤＮＡセグ メントをラムダファージＤＮＡに導入する事により、組換え体タンパク質が通常 のファージ増殖により発生する事になり、生成するすべてのラムダファージがそ れを運搬するという利点が生じる。

Ｇ遺伝子フラグメントのための適当なキャリアウィルスとして、ラムダファージ 、動物に対して非病原性のバクテリオファージを選択する事が一般的な方法の段 階１である。

段階２では、ラムダファージＤＮＡの一部を細胞培養で容易に成長するプラスミ ドに挿入する。ラムダファージにおいてその頭部殻は２つの主要なタンパク質か ら成っており、ファージＤＮＡゲノムの左端から０１１からり、　１５　ｋｈ　 セグメント中の遺伝子りおよびＥにより特定される。■ＳＶ配列の挿入を簡単に するため、ラムダＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ■　およびＫｐｒＬ Ｉを使用してフラグメント化する。これによりＤおよびＥ遺伝子を含むファージ ＤＮＡの０．１１３および０ろ６Ｑｋｂのフラグメントな単離する。このフラグ メントをあらかじめＫｐｒＬＩおよびＢａｍＨｉ酵素で切断したプラスミドｐＢ Ｒ３２２（Ｋ７）−Ｉ部位を含む）に結合する。ウィルスＤＮＡフラグメントが 挿入されたｐＢＲろ２２プラスミドを大腸菌の培養液に加え、大腸菌をこの分野 では周知の合成またはブロス培地中で培養し、その中で組換え体プラスミドを増 殖させる。組換え体プラスミドはトランスホームした大腸菌にテトラサイクリン −感受性およびアンピシリン−抵抗性を授けるため、組換え体プラスミドに感染 した大腸菌の培養液を選択する方法は容易である。陽性を示した大腸菌の培養液 の溶菌により、組換え体ｐＢＲろ２２の多数のコピーが遊離する。

第６の段階はＧＶＳＶタンパク質の機能性セグメントをコードしたＤＮＡ配列の 単離である。Ｇ　ＶＳＶ遺伝子フラグメントの選択は既知のアミノ酸配列に基づ いており、抗原部位の決定にいくつかの塩基配列が関係がある。

最も大きいＧＶＳＶ遺伝子のＡｔｕ■フラグメントを単離して、Ｓａ、ｗ　６ａ 酵素で切断する。より小さなフラグメントは抗原部位の１つを含んでおり、より 大きなセグメントには他の２つの部位がある。後者の２つの部位はＨｉｎ、ｄ　 ＩＩＩによる分解で更に分けられる。

第４の段階は、制限酵素分解によりプラスミド−結合ウィルスゲノムフラグメン トを作った後、単離したＧＶＳＶ遺伝子フラグメントをプラスミド−結合フラグ メントに挿入する。プラスミドは種々の制限酵素のうちの一つでラムダファージ を遺伝子りおよびＥの領域で切断するものによる部分分解で切断され、ぞの領域 で単一の２０ 切断点を持つプラスミドＤＮＡを単離する。これらの切断点が一つであるプラス ミドフラグメントを適当なリンカ−をその末端に持つ種々のＧ　ＶＳＶ遺伝子フ ラグメントと組換える。少くともいくつかのｃｖｓｖ遺伝子フラグメントを適し た解続わく中に置くためまた、組換え体タンパク質にある程度の融通性を与える ために種々の長さのリンカ−を使用する。ウィルスゲノムフラグメントおよびＧ ＶＳＶフラグメントの両方を含む組換えプラスミドの多量のコピーを得るため、 上記段階２の如く、大腸菌でのトランスホーメーションによりプラスミドを増殖 させ、大腸菌の溶菌により組換えプラスミドの多数のコピーを得る。

段階５は無傷のウィルスゲノムの再構成である。ＫＰｒＬ■および１３ａｍ、Ｈ ■酵素による分解で組換え体プラスミドからラムダファージＤＮＡフラグメント を遊離し、遊離したフラグメントは２段階で再結合させる、即ち最初ファージラ ムダＤＮＡの左端の１３ａｍＨ■フラグメントに続いて右端のＫＰ７ＬＴフラグ メントである。

へのパッケージングである。４ｙ　ｅ上ｒ：ｙでのファージのパッケージングは Ｓｔｅγ１）、ｈｅγｇ、　’ｆＪｉｅｍｅ乙ＣγおよびＥルｑ７ｔｉ８ｔらの 方法による精製したファージ抽出物を用℃・て実施する。組換え体ファージはそ れで大腸菌の培養液を感染させる事により増殖し、大腸菌を溶菌して組換え体フ ァージの多数のコピーを遊離させる。

最後に、組換え体ファージは食塩水で希釈し、体重キログラム当り１０−１［］ 　ウィルス粒子でウサギへ注射してスクリーンする。８日後、ウサギから血液を 採取し、その血清のＧ　ＶＳＶ抗原との反応性をラジオイムノアッセイにより試 験する。Ｇ　ＶＳＶ抗原への反応性はウサギによりｃ　ｖｓｖ抗体が生産されて いる事即ちｃ　ｖｓｖタンパク質がファージに組み込まれている事を示す。

実施例２ 本実施例はそれ自身病原性を持つ他のウィルスに対する人間用のワクチンに適し た動物ウィルスキャリアの利用の例である。５ａｌｋワクチンは化学的に無能力 化したポリオウィルスでできており少量のポリオウィルスが無傷で残り患者に感 染する生来の危険がある。５ａｈｉｎワクチンは弱くした株の生ウィルスを用い ており、病原性型へ復帰する生来の危険をもっている。安全なワクチンの生産の ため、かぎどなる免疫原性ペプチドセグメントを本当に安全なウィルスに挿入で きれば他のワクチンでみられる生来の危険なしに患者を感染させるのに使用でき る。適した非病原性のウィルスはアデノウィルス２型（Ａｄ　２）または他の型 のワクチン株である。

方法の段階１により、Ａｄ２カプシドの適当なタンパク質を同定する。アデノウ ィルスの表面」二に露出している事が知られて℃・るタンパク質の１つはヘキソ ンタンパク質である；他は°′タンパク質ＩＶ　”または゛′ファイバー″。

２ 更に後のタンパク質はアデノウィルスの異った株により種々の長さであり、従っ である種の株は感染力を減少させる事なく、除去できまたは置換できる領域を含 んでいるにちがいない。

Ａｄ　２ゲノムの全体はいろいろの研究室でプラスミドに挿入されている。後の 操作の便利さのため、ファイバーまたはヘキソンがコード化されている領域を単 離し、本方法の段階２に従って他のプラスミドへ挿入する。ここではファイバー の使用を追ってみる。ファイバーは図単位８７から９１．５ｋＡに拡がっている 事が知られている。重要な点は、他のＡｄ　２遺伝子と異なりファイバーをコー ドしている領域は他のタンパク質の信号と重なり合っていない事である。Ｈｉｎ ｃｌ　ＩＩＴ　”’ｆｊ”″フラグメント（Ａｄ　２　ＤＮＡを酵素Ｈｌルｄ■ ■■　で完全に分解した時の一つの生成物）は８９５から９７．３図単位に拡が っている。このフラグメントを最初に単離する。Ａｄ　２ＤＮＡゲノムはＨｉｎ ｄ　ＩＩＩで切断し、生成物は１％アガロースゲル上分離する。特定の大きさの フラグメントは電気泳動の技術により移動する。

プラスミド７）ＢＲ３２２はＨｉｎｃｌ　ｉｉ（分解により製造され、再リガー ゼ処理を防ぐためＣＩＰで処理する。ＦフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼによ る処理によりプラスミドに挿入する。ＨＬｒＬｄＩＩ■部分分解を行い、一度分 子を切断しゲルで精製する。この物質を３ｍα■分解する。

Ｓｍ、ａ　■は９１図単位を切断し、遊離するＤＮＡフラグメントは９１から９ １．６図単位に拡がっている。８９５から９１単位のフラグメントはまだプラス ミドに結合している。Ｓｍａ　■は゛′平滑端切断″であるので、ＤＮＡは直接 Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　リンカ−に結合する。更にＨｉｎｃｌ　ＩＩＩでの切断した 後、プラスミドはＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　リガーゼで閉環する。８９から９１図単 位のフラグメントは完全にＡｄ２ファイバー（８７から９１５）のコード領域中 にありプラスミドにより運搬される。プラスミドは大腸菌内へトランスホームさ れる。組換え体プラスミドによりトランスホームされた、アンピシリン−抵抗、 テトラサイクリン−感受性大腸菌株を選択し、培養し組換え体プラスミドの多量 のコピーを得るため溶菌する。

第６段階はキャリアと結合させる目的の機能性タンパク質セグメントがコードさ れているヌクレオチド塩基配列を持つＤＮＡフラグメントの単離である。今の場 合、目的の機能はワクチンを接種した人間の免疫系を刺激する能力でポリオウィ ルスに対するものである。そのようなタンパク質セグメントはポリオウィルスの 外側ニみつけられる。ウィルスが完全に集合した後、カプシドタンパク。質（ｖ ｐｏ）を分裂させると２つのセグメントＶＰ４およびＶＦ６を生成する。分裂酵 素が近づき易いので、ＶＦ４−ｖｐ２結合のアミノ酸はウィルス粒子の最も外側 部分に存在しており、従ってカプシドタンパク質の免疫原性領域のよい候補であ る。

ポリオはＤＮＡウィルスというよりＦＩＮＡである。こ２４ の事は以下に記す技術上の問題を作り出す。しかしながら、現在では逆転写とし て知られている過程によりポリオＲＮＡゲノムの完全な長さのＤＮＡコピーが作 られている。制限酵素Ｎｒｗ　ＩおよびＢａｍ　Ｈ■による２重分解により、逆 転写により作られたＤＮＡから機能性タンパク質セグメントのＤＮＡコードが単 離される。０，５ｋｈフラグメントをビスアクリルアミドゲルでの電気泳動によ り精製する。このフラグメントをＦｎｎ４４ｉまたはＭｎｌ■でさらに短℃・フ ラグメントに分解する（各々の酵素でフラグメントは５ケ所で切断される）。

生成した小さなりＮＡフラグメント（あるものは機能性タンパク質セグメントが コードされて℃・る）は、ＫｌｅｎａまたはＰｏｌ■で平滑端としその後Ｔ４Ｄ ＮＡリガーゼで１３ａｍＨ■リンカーを結合し、ファージ−結合Ａｄ２　Ｄ　Ｎ 、Ａフラグメントに挿入する準備をする。次の段階においていくつかの７ラグメ ントが適した解読わくに結合するのを確保する為、種々の大きさのリンカ−を使 用する。

一般的方法の第４の段階は、キャリアをコードしたＤＮＡと機能性タンパク質を コードしたＤＮＡの結合である。Ａｄ　２フラグメントを運搬しているプラスミ ドを酵素Ｍｈｏｉで非常に軽く分解する。ＭｈｏｉはＤＮＡの切断に非常にしば しば使用され、前もって外来性タンパク質セグメントを取り込む最適の場所がわ からないので使用する。非常に軽く切断する事により一般的には、各々のプラス ミド−結合Ａｄ　２フラグメントは一度だけ切断される。ＭｈｏｉおよびＢａｎ 　Ｈ■は適合末端を与えるので、ポリオフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼでＭ ｈｏｉ−切断Ａｄ２ＤＮＡに結合させる。そのような結合では酵素１３ａｍＨ■ による再切断は行わない。再び、組換え体プラスミドはそれらの多量のコピーを 得るため、大腸菌中ヘトランスホームされる。挿入された擬−ポリオフラグメン トを含むＡｄ２ゲノム部分は、プラスミドをＨｚｎｄｉ［で分解してプラスミド から切り取る。

第５段階では、挿入された擬−ポリオフラグメントを含む完全なＡｄ　２ゲノム を２段階で再構成する。第１に、無傷のＡｄ２ＤＮＡのＳｍａ　■による部分分 解で結合Ｇ−ＫＳｍａ■フラグメント（右腕）を得、それを精製する。

Ｓｍ、ａ　ｉは平滑端切断を行うので、Ｓｍ、ａ　■による切断部位にＨｉｎｄ 　ｉｉ■リンカ−を直接結合する。左側は切断されていな℃・ウィルスＤＮＡの 末端である。このプラスミドを旧ｎｄ　ＩＩＩで切断し、ポリオＤＮＡ−含有Ａ ｄ２ウィルスゲノムをプラスミドフラグメントがら電気泳動により単離する。ウ ィルスゲノムフラグメントを調整したＡｄ　２の腕にＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪ ガーゼで結合する（分子の半分は正しい方向である）。他の必要なＡｄ２の腕は 部分Ｈｉｎｔｉ　ｉＩＩ分解により製造し、結合（１，−Ｅ−Ｃ−Ｈ−Ｄ−Ａ　 −Ｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントを単離する。これをＡｄ２ゲノムによく生 じる自由部位上で組換え体ポリオＤＮＡ−含有Ａｄ−２７ラグメントと結合させ る（半分はあ 強力なウィルス−生産能力のある形を持つ）。

第６段階では、組換え体Ａｄ　２ゲノムをリン酸カルシウムとの共沈によりＨｅ １ａ細胞へトランスフェクトし、トランスフェクトされたＨｅ１ａ細胞をＤＭＥ 培地中１０％馬血清で培養する。ウィルスの生存力および増殖力に必要なすべて の遺伝子を持つ（正しい解読わくに）ウィルスのみが、ウィルスタンパク殻を発 生し、Ｈｅ　ｌ　ａ細胞の溶解感染をおこし、子孫ウィルスを生産する。これら の再構成ウィルスのあるものは、Ａｄ２ウィルスのファイバータンパク質として 表現されるポリオウィルスＤＮＡフラグメントもまた取り込んでいる。

どれがポリオウィルスタンパク質を露出させた状態でとり込んだ組換え体ウィル スであるかは、ウサギに種々のウィルス分画を注射し、ウサギがポリオウィルス に対する抗体を生産するかどうかを決定する事でわかる。ウサギに体重キログラ ム当り１０９−１０１０の食塩水希釈組換え体Ａｄ　２ウィルス粒子を注射する 。８日後、血液を採取する。血液血清のポリオウィルスに対する反応性をラジオ イムノアッセイにより決定する。ポリオウィルスタンパク質を取り込んだ組換え 体Ａｄ２ウィルスはウサギにおける抗体誘導で確立し、それは安全な人間用ポリ オワクチンとしての可能性を持つ。

ある良好な具体例により本発明を記載してきたが、この分野に精通する者には明 らかなように、本発明の範囲から離れる事な（変形する事ができる。例えば、本 発明はＤＮＡヌチレオチド配列をウィルスゲノムに挿入する事により記載してき たが、ＲＮＡゲノムを持ちＤ　Ｎ　Ａ中間体を通して作用するウィルスにＦＩＮ Ａヌクレオチド配列を挿入するとそのような組換え体ＲＮＡウィルスは本発明の 範囲である。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）外来性ヌクレオチド塩基配列がそれ自体露出した表面ウィルスタンパク質 のセグメントとして発現されるようなウィルスゲノム中の位置へ、上記外来性ヌ クレオチド塩基配列を挿入することからなるウィルスを修飾し、ウィルスに新し い生物的機部を与える方法。 （２）上記ウィルスの繁殖能力に対し必須でない表面ウィルスタンパク質または 上記ウィルスの繁殖能力に対し必須でない表面タンパク質の一部分を決定し、上 記必須でない表面タンパク質または上記・必須でな℃・表面タンパク質の一部分 のセグメントとして、上記外来性ヌクレオチド塩基配列がそれ自体発現されるよ うなウィルスゲノム中の位置へ上記外来性ヌクレオチド塩基配列を挿入すること からなる請求の範囲第１項記載の方法。 （３）上記修飾ウィルスが投与される動物内で非病原性である修飾のためのウィ ルスを選択することからなる請求の範囲第１項記載の方法。 （４）上記外来性ヌクレオチド塩基配列を少くとも上記表面タンパク質のための 遺伝子のフラグメントを含む上記ウィルスゲノムの一部をクローニングベクター へ切り継ぎする事により上記遺伝子中に挿入し、上記切り継キしたクローニング ベクターで生体をトランスフェクトし上記切り継ぎしたクローニングベクターの 多数のコピーを得、上記表面タンパク質遺伝子フラグメント内の位置で上記切り 継ぎしたクローニングベクターを切断し、上記外来性ヌクレオチド塩基配列を上 記表面タンパク質邊伝子フラグメントの切断末端と結合し、上記クローニングベ クターからの上記外来性ヌクレオチド塩基配列を含む上記ウィルスゲノム部分の 上記切り継ぎした部分を単離し、および上記単離されたゲノム部分を機能性ウィ ルスゲノムを作るのに必要な付加的なウィルスゲノム部分を結合させる請求の範 囲第１項記載の方法。 （５）上記外来性ヌクレオチド塩基配列を完全な修飾ウィルスとして含む上記ウ ィルスゲノムのパッケージングを含む請求の範囲第４項記載の方法。 （６）動物において免疫学的応答を誘導するタンパク質のセグメントを決定する 事により上記外来性ヌクレオチド塩基配列を得、上記タンパク質セグメントをコ ードしたヌクレオチド塩基配列を単離し、上記修飾ウィルスがそのような動物に 投与された際免疫学的応答を誘導するような上記ウィルスの位置に上記単離され た外来性ヌクレオチド塩基配列を挿入することを含む請求の範囲第１項記載の方 法。 （力　上記ウィルスゲノムを上記動物に対し病原性を示さないウィルスから得、 上記動物に感染性の因子から上記ヌクレオチド塩基配列を単離し、上記修飾ウィ ルスの繁殖能力を保つように上記単離したヌクレオチド塩基配列を上記ウィルス ゲノム中の上記ヌクレオチド塩３０ 基配列が上記修飾ウィルスの露出タンパク質セグメントを発現するような位置に 挿入し、および上記修飾ウィルスを上記動物に投与して上記感染因子の将来の暴 露を中和する程十分な程度の免疫応答を誘導する事を含む請求の範囲第６項記載 の方法。 （８）そのゲノムに挿入された外来性ヌクレオチド塩基配列を持ち、外来性ヌク レオチド塩基配列はそれ自身上記ウィルスの表面タンパク質の生物学的に活性な セグメントとして表現されるような繁殖能力のあるウィルス。 （９）バクテリオファージ、アデノウィルスおよびエンベロープＲＮＡ−含有イ ンフルエンザウィルスよりなる群より選択される請求の範囲第８項記載のウィル ス。 ００）上記タンパク質セグメントがウィルスの生存能力に有害な影響をおよぼさ ないような位置に上記タンパク質セグメントが表面タンパク質に取り込まれてい る請求の範囲第８項記載のウィルス。 １　′Ｉ！を表ｎｏ５９−５０００４２　（２）