NO833205L - Fremgangsmaate for modifisering av et virus for vaksineformaal - Google Patents

Description

Virus med rekombinante overflateproteiner

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt innføring av proteinsegmenter med spesielle biologiske funksjoner i dyr og mennesker. Mer spesielt vedrører oppfinnelsen bruk av virale bærere for i organismene å innføre peptidsegmenter med visse funksjoner som normalt finnes på større protein-molekyler.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Mange biologiske funksjoner inkluderende antigeniske funksjoner, hormonale funksjoner, enzymatiske funksjoner og celleregulerende funksjoner tilveiebringes ved proteiner.

■Proteiner består av mange kjeder av aminosyrer i en spesiell sekvens. De ovennevnte funksjoner tilskrives typisk ganske begrensede segmenter av proteinet omfattende korte sekvenser av aminosyrer. Resten av proteinmolekylet tjener ofte som en bærer for det eller de funksjonelle segmenter. Bærersegmentene beskytter de funksjonelle segmenter av proteinet og frembyr de funksjonelle segmenter til substrater i en oriéntering som fremmer aktiviteten. I tillegg er visse egenskaper av de funksjonelle segmenter av proteinet bare istand til å virke når de korte segmenter av aminosyrer omfattende de funksjonelle segmenter er forbundet til en lengre proteinkjede. F.eks. krever immunrespons til en spesiell kort aminosyrefrekvens generelt at den korte sekvens kobles til et utstrakt molekyl. I prinsippet kunne bæresegmentene av proteinet erstattes med en rekke andre bærersegmenter uten å endre egenskapene av det funksjonelle proteinsegment.

Slike substitusjoner kan bevirke visse distingte fordeler, som skal forklares, ved utnyttelse av funksjonelle proteinsegmenter for kommersielle eller medisinske formål, som produksjon av nyttige vaksiner.

Spesielt ses det at virale proteiner er spesielt egnet for utnyttelse som bærere for små -^aminosyrefrekvenser med nyttige funksjoner. En spesielt nyttig funksjon av proteiner, som typisk kan tilskrives begrensede segmenter av en protein, er evnen til å indusere en immun-respons. Ved injeksjon, innånding, inntagning eller annen anbringelse i et levende dyr utløser et fremmede protein, det vil si et protein som ikke naturlig er tilstede i vertdyret, en immunrespons.

Immunresponsen består av mange forskjellige avstemte prosesser i dyret, inkluderende produksjon av antistoffer, som an-griper det fremmede protein og derved beskytter dyret mot infeksjon av en bærer av det fremmede protein. Et ytterligere trekk ved immunresponsen er en form av biologisk hukommelse riktig slik at en ytterligere utsettelse for det samme fremmede protein resulterer i en hurtigere og mye sterkere immunrespons. Dette er prinsippet for vaksinering som er en viktig del av moderne medisin.

Det er funnet at effektive immunresponser induseres ved små segmenter av proteiner når de er knyttet til større bærersegmenter selv om bærersegmentene ikke naturlig er av det samme protein. Vaksineringer med slike proteiner med et funksjonelt segment fra et protein knyttet til unaturlige bærersegmenter resulterer ikke bare i beskyttelse mot ytterligere injeksjon av det hybride protein men også mot det opprinnelige protein hvorfra det funksjonelle segment ble oppnådd.

Typisk fremstilles vaksiner i laboratorier ved fremstilling av midler med vesentlig reduserte patogenisitet med hensyn til sykdomsfremkallende virius som inneholder proteinsegmenter som induserer en immunrespons. Disse midler er enten stammer av mikroorganismer som frembringer bare milde sykdommer eller ellers er kjemisk innaktiverte mikroorganismer. Vaksinene innføres i dyret for å indusere en immun-respons i det injiserte dyr. Der har imidlertid vært problemer med slike vaksiner. Mange infeksjonsmidler er

vanskelig eller umulig å dyrke under styrte betingelser,

og de som dyrkes og deretter innaktiveres frembyr mulig-heten med delvis unnslipping fra innaktiveringsprosessen som frembyr en vesentlig risiko for det vaksinerte dyr.

Med svekkede stammer av infeksjons-mikroorganismer foreligger faren for naturlig mutasjon til mer farlige former, og dette betyr potensielt tilsvarende fare for det vaksinerte dyr. Videre er all teknikk i forbindelse med fremstilling av slike vaksiner tidkrevende og dyr.

Det er følgelig fordelaktig som vaksiner å anvende immunogeniske (immun-responsfremkallende) proteinsegmenter oppnådd fra infeksjonsmidler knyttet til unaturlige bærere istedet for selve infeksjonsmidlene. I samsvar med et aspekt av oppfinnelsen er virale proteiner spesielt nyttige som bærere, og immunogeniske proteinsegmenter innføres i virale proteiner på en slik måte at virusene bærer segmentene slik at de vil bli utsatt for immunsystemet av et vaksinert dyr uten at de immunogeniske proteinsegmenter forstyrrer viral levedyktighet eller reproduksjon. Forskjellige typer av virus kan anvendes for å bære immunogeniske proteinsegmenter, hver med distingte fordeler. Blandt disse er DNA-holdige bakteriofager, ikke-patogeniske DNA-holdige dyrevirus og ikke-patogeniske omhyllede RNA-influensavirus.

DNA-holdige bakteriofager, som f.eks. lambda-fage er virus som infiserer bakterier. Disse virus formerer seg i stort antall i bakterier og de kan fremstilles med lave omkost-ninger, er ikke-patogeniske for dyr og mennesker og kan innføres ved oral tilførsel, inhallering eller injeksjon. Ikke-patogeniske dyrevirus, som f.eks. de DNA-holdige adeno-virus og de omhyllede RNA influensavirus, formerer seg i humane eller animalske celler resulterende i utyde-lige eller ukonsekvente infeksjoner. Disse kan således sikkert innføres ved injeksjon, inntagning eller inhallering. Proteiner som er avdekket på overflaten av disse virus foretrekkes som fremmede immunogeniske proteinsegmenter. Overflateproteiner er capsidproteiner i tilfellet av ikke-omhyllede virus og transmembran-proteiner i tilfellet med omhyllede virus.

Når et immunogenisk proteinsegment innføres på en avdekket måte i et overflate-virusprotein tjener hele viruset som en utstrakt bærer. Virusbæreren bibeholder evnen til for-mering mens det innførte fremmede proteinsegment har potensial for indusering av den spesifikke immunrespons. Virusbæreren bebeholdes også sine biologiske funksjoner

som bidrar til proteinstabilitet.

André typer av virus kan også anvendes med fordel som bærere ved oppfinnelsen. Videre kan korte proteinsegmenter med andre funksjoner enn evnen til å stimulere immunresponser innføres som virale overflateproteinsegmenter ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Foreningen av proteinsegmenter med spesifikke funksjoner til proteinbærere kan oppnås ved å fra fordel av nylige fremskritt i forståelsen av den genetiske kode, molekylære biologiske prosesser og teknologien med rekombinant DNA genetikk. Aminosyresekvensene i cellulære proteiner,

såvel som de fleste virale proteiner, bestemmes av gener som er segmenter av deoksyribonukleinsyrer (DNA) i sekvens i samsvar med den genetiske kode. Den spesielle sekvens av aminosyrer syntetiseres i samsvar med sekvensen av kodoner (tripletter av nukleinsyre subenheter) i DNA. Innføring av fremmede DNA-sekvenser i DNA i en vert-organisme, resulterer under visse passende betingelser i ekspresjon av aminosyresekvensen spesifisert av den inn-førte, fremmede DNA-sekvens.

Rekombinant DNA-tekonologi tillater slike manipuleringer gjennomført på en grei måte. Sekvenser av DNA som koder for et spesielt protein eller proteinsegment kan nå lett isoleres og renses i store nok mengder til biokjemisk bruk. Disse sekvenser kan så kuttes opp på spesifikke steder under anvendelse av enzymer kjent som restriksjons-endonukleaser og sveises sammen med andre rensede fragmenter under anvendelse av DNA-ligaser. Disse rekombinante molekyler kan så innføres i levende organismer som bakterier eller høye celler.

Det ville være ønskelig å anvende den rekombinante teknikk som er blitt utviklet for innføring av proteinsegmenter med spesifikke funksjoner i overflate-viralproteiner til å gi nyttige midler for kommersielle og medisinske prosesser.

Det er formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for å knytte nyttige proteinsegmenter til virusbærer.

Et annet formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe virale bærer av immunogeniske proteinsegmenter for innføring av immunresponser i dyr. Det er spesifikt et formål å fremstille nye, sikre vaksiner. Et ytterligere formål er å tilveiebringe forbedrede vaksinasjoner av pattedyr, inklu-sive mennesker.

Oppsummering av oppfinnelseVi

Fremmede proteinsegmenter innføres som udekkede segmenter av overflate-viralproteiner på en måte som ikke påvirker den reproduktive levedyktighet av viruset. Viruser med rekombinante eller fremmede proteinsegmenter er nyttige for innføring av funksjonen, f.eks. immunrespons-inn-føring av det fremmede proteinsegment i et dyr, herunder mennesker. Det fremmede proteinsegment innføres ved å innføre et DNA-fragment med en nukleotid-basesekvens som koder for proteinsegmentet i den virale genom på en måte hvor det inførte DNA-fragment gir ekspresjon for seg selv som et udekket segment av et overflate-viralprotein.

For å innføre det fremmede DNA-fragment innføres den virale genom eller en del derav, i en kloningsvektor som i sin tur innføres i et vert-mikroorganisme for å frembringe multiple kopier av den rekombinante kloningsvektor. Det fremmede DNA-fragment isoleres og innføres i den rekombinante kloningsvektor på et passende sted innenfor den virale DNA genom-del. Den fremmede DNA-segment-holdige virale DNA genom-del isoleres fra kloningsvektoren og den fullstendige virale genom rekonstrueres. Den virale genom inneholdende det fremmede DNA-fragment anordnes som et komplett virus. Etter infeksjon av celler vil det utvikle avkom hvori det gis ekspresjon for det fremmede proteinsegment som en del av et av dets overflateproteiner.

Detaljert beskrivelse av det foretrukne utførelsesformer

I samsvar med den foreliggende oppfinnelse innføres funksjonelle proteinsegmenter i virale proteinbærere.

Heri skal betegnelsen "virus" inkludere bakterie-infiserende virus inkluderende bakterie-virus eller fager såvel som dyre-infiserende virus. Betegnelsen "rekombinant protein" anvendes heri for å vise til et protein som er ekspresjon av et gen inneholdende en fremmede nukleotid-baseseksvens idet det rekombinante protein inkluderer en aminosyresekvens som er fremmed eller unaturlig overfor proteinet i viruset.

Generelt kan metoden for proteinsegment-innføringen deles opp i en rekke på syv separate trinn som ikke behøver å gjennomføres strengt i det gitte rekkefølge.

Det første trinn er seleksjonen av et virus med et protein egnet for bruk som en bærer for det funksjonelle fremmede proteinsegment. Seleksjonen av det spesielle virus avhenger delvis av den endelige bruk av proteinet. Hvis f.eks. en vaksine for immunisering av kveg ønskes ville et passende virus være et som er istand til replikasjon i kveg uten å bevirke alvorlige patologiske virkninger. Videre kan det være passende å anvende en stamme av virus som angjeldende kveg tidligere ikke er eller er blitt lite utsatt for slik at det sikres at sterke, primære immunreak-sjoner utvikles. Andre betraktninger for virus-seleksjonen vil fremgå fra det etterfølgende eksempler og fra forhold som er generelt kjent vedrørende bakterie- og dyrevirus.

Når et virus er blitt selektert baseres valget av et bære-protein på undersøkelse av den kjente molekylær-biologi for dette virus. Passende bærerproteiner er på den ytre overflate av viruset, som ikke er vesentlige for levedyktigheten og replikasjonen av viruset eller som inneholder regioner

(hvor det funksjonelle proteinsegment vil bli innført)

som er ikke-vesentlige for levedyktighet og replikasjon. Eksempler på slike passende ikke-vesentlige viral-proteiner er D og E geneprodukter av bakteriofagen, nevrominidase-protein av ortomyksovirus og hekson og protein IX av adeno-virus.

Det annet trinn i fremgangsmåten er å innføre DNA-genomet av det valgte virus, eller en del av DNA-genomet inneholdende genet som koder for det valgte virale bærerprotein, i en kloningsvektor, som f.eks. en plasmidvektor. Plasmidvektoren tillater at DNA i viruset blir formert i bakterier hvori et stort antall kopier av denne DNA- produseres for ytterligere manipulasjoner.

Virus-genoldelen innføres i et plasmid med standard teknikk. Kort sagt kuttes plasmidet, som er en sirkel av en spesiell

DNA-sekvens, på kjente steder ved hjelp av et eller flere restriksjons-endonukleaser. De samme enzymer anvendes for å kutte det virale genom på spesifikke steder valgt til å inneholde genet av interesse mellom dem, idet kuttestedene bestemmes av de spesielle restriksjons-enzymer som anvendes. Som vel kjent etterlater kutting av to forskjellige stykker av DNA med det samme restriksjons-enzym fragmentender som knytter seg til hverandre ved hjelp av basepar-hydrogen-binding og som kan bindes kovalent ved hjelp av en enzymet T4-DNA-ligase. Hvis kuttestedene nødvendiggjør bruk av forskjellige restriksjonsenzymer kan endene gjøres forlikelige ved behandling med enzymet Sl eller Klenow-fragmentet av DNA Pol I etterfulgt av addisjon av korte DNA-segmenter benevnt linkere.

Når den forlikelige virale genomdel er forenet med plasmidet blir et av plasmidgenene typisk ødelagt. Det ødelagte gen er generelt et som koder for en medisinmotstand. Plasmider bærer vanligvis flere slike gener som koder for proteiner som medfører motstand mot forskjellige medisiner. Dette tilveiebringer en lett metode for seleksjon for et heldig rekombinert plasmid. Plasmidet innføres eller "transformeres" inn i bakterier og deretter blit kolonnier av bakterier selektert for forskjellige medisinmotstarider. Multiple kopier av det rekombinante plasmid oppnås ved lyse av celle-kolonnien.

Det tredje trinn består i og isolere et DNA-fragment med den nukleotid-baseseksjon som koder for den funksjonelle sekvens av aminosyrer som skal innføres som det fremmede proteinsegment i det virale protein. Slike DNA-fragmenter oppnås fra DNA klonet i en vektor eller fremstilles ellers i ren form. Genet som koder for det hele funksjonelle protein isoleres i sin helhet ved kutting med restriksjons-enzymer. Det ønskede DNA-fragment isoleres deretter ved å separere forskjellige DNA-fragmenter ved standard tek nikk, vanligvis ved elektroforese gjennom en agarose- eller alkrylamid-gel men også på annen måte, f.eks. i kolonner eller gradienter.

Under visse betingelser kan det funksjonelle segment av angjeldende protein ikke være kjent på forhånd. I dette tilfelle blir mange fragmenter av genet utviklet ved hjelp av restriksjonsenzymer. Blandingen av fragmenter anvendes så istedet for et renset DNA-fragment som ellers kunne isoleres, og et rekombinant virus med det korrekte DNA-

o

fragment oppnås i det endelige trinn av koden når en funksjonell seleksjon gjennomføres med de rekombinante virus som beskrevet i det følgende.

DNA-fragmentene som koder for det funksjonelle proteinsegment fremstilles videre ved å forene dem til passende linkere med forskjellige lengder. Typer av linker velges slik at den, er forlikelig med enzymet anvendt for å kutte det virale gen i det fjerde trinn. Linkere av forskjellige lengder anvendes for å anbringe idet minste noe av DNA-fragmentene i den passende utlesningsramme (slik at de tre nukleotid-kodoner som spesifiserer aminosyrer innlemmes i det virale protein i fase med kodonene av det virale DNA) og også for å tillate noen fleksibilitet i det rekombinante protein, f.eks. for å sikre at i det minste i noen av de rekombinante proteiner blir det fremmede segment avdekket på en måte som fremmer dets funksjonering. Fragmentene knyttes til linkerne ved først behandling med et enzym, som S 1 eller Klenow-fragmentet av DNA Pol I, etterfulgt av forening med T4-DNA ligase. Overskudd av ljnkere fjernes, typisk ved hjelp av en kolonne.

Det fjerde trinner er å kutte den virale genm-del for å fremstille den for innføring av det fremmede DNA-fragment som koder for det funksjonelle proteinsegment, og deretter å knytte de to samme på en produktiv måte. Hvis ikke- essensielle deler av det virale protein er kjent anvendes et enzym for kutting i dette område av DNA. Ellers anvendes en rekke enzymer som kutter på forskjellige steder i det virale gen. Hvis enzymene kutter mer enn en gang i det virale gen gjennomføres en partiell seleksjon, og DNA-molekyler med enkle kutt som foreligger i det valgte område isoleres ved hjelp av elektroforese gjennom en gel. Når det plasmid-bundne virale DNA spaltes forenes det med det tidligere fremstilte fremmede DNA-fragment fra trinn 3 med T4-DNA ligase for å frembringe et plasmid som inneholder resten av det opprinnelige plasmid, minst en del av det virale genom og det fremmede DNA-fragment i den virale genom-del. Dette modifiserte plasmid innføres ved transformasjon i celler, typisk av den samme kultur som ble tranformert i trinn 2, for å frembringe multiple kopier av det modifiserte plasmid. Multiple kopier av plasmidet oppnås fra dyrkingslysatet.

Det femte trinn av metoden er å rekonstruere det virale genom med det ønskede fremmede DNA-fragment innført. Den virale DNA-genomdel med det innførte fremmede DNA-fragment frigis fra plasmidet ved behandling med det samme restriksjons-enzym eller enzymet anvendt for fremstilling av det virale DNA-fragment for innføring i plasmidet i trinn 2. Hvis

bare en del av virus-genomet ble innført (istedet for hele viral-genomet) rekonstrueres viruset ved forening med andre fragmenter i en rekke av velkjente trinn, som hvert anvender enzymet T4-DNA ligase etterfulgt av rensing av nøyaktig forente fragmenter.

I et sjette trinn pakkes viral-genomet for å frembringe et intakt infeksjonsvirus med et fullstendig proteinovertrekk. Paknings,metoden avhenger av angjeldende virus. Bakteriof ag DNA som lambda-faget, pakkes inn i virus in vitro ved

hjelp av velkjente reaksjoner under anvendelse av rensede

fageekstrakter. Dyre-virusgenomer anbringes i celler, typisk ved hjelp av en teknikk kjent som DNA-kalsiumfosfat-kopresipitat-transfeksjon. Presipitater fremstilt ved å blande DNA, kalsiumklorid og fosfatbuffer er kjent å bli opptatt i dyreceller. Når det først er i cellene frembringer det virale DNA spesifikke RNA og disse RNA dirrigerer syntesen av proteiner hvorfra de intakte virus endelig dannes.

Hvis de pakkes in vitro fra fageekstrakter, transformeres

de pakkede virus i en vert-cellekultur hvori den pakkede virusstamme reproduserer. Hvis de pakkes ved transfesjon reproduseres virusene i den transfekterte kultur. Ved dyrking i kultur oppnås vesentlige kopier av rekombinante virus.

Pakkingen og reproduksjonen av rekombinante virus utgjør en seleksjon for virale genomer som er blitt rekonstruert på

en slik måte at de resulterende virus er reproduksjonsmessig levedyktige. Det bemerkes at virusgenomer, som frembringer proteinovertrekket av det komplette virus og somae er reproduksjonsmessig levedyktige som komplette virus,

kan representere bare en del av de rekombinante DNA-produkter fra prosessen. Rekombinante genomer som mangler nødvendige genomsegmenter eller som har nødvendige genomsegmenter i den feilaktige utlesningsramme danner ikke proteinovertrekket eller reproduserer ikke hvis de pakkes. Etter pakking og reproduksjon av korrekt rekombinerte virusgenomer blir ukorrekt rekombinerte genomer enten tapt eller repre-senterer en ubetydelig del av de rekombinante virus.

Pakkede, reproduksjonsmessige levedyktige virus kan ses

ved standard metoder, som platebedømmelse, og positiv platebedømmelser indikerer en heldig genom-rekombinasjon. Noen av de heldig rekombinerte genomer inneholder det fremmede DNA-fragment og noen av disse gir ekspresjon for

funksjonen av det fremmede proteinsegment.

Det endelige trinn ved oppfinnelsen består av.-seleksjon av individuelle plater av virus fra trinn 6 (som hver represen-terer en uavhengig rekombinant) for det funksjonelle inn-førte proteinsegment. Den spesielle seleksjonsmetode avhenger av den funksjonstype som ønskes fra det rekombinante virus. Standard bedømmelser forekommer for mange hormonale og enzymatiske funksjoner som kan ønkes. I tilfellet med bedømmelse for evnen til å indusere en immunrespons blir platene selektert med antiserum dannet mot det opprinnelige protein. Virus oppnås og renses fra duplikater av plater sensitive for antiserumet, og virusene injiseres i vert-dyr, f.eks. kaniner. Antistoffer frembragt av dyret mot det injiserte virus blir endelige testet for evnen til kryss-reaksjon med det opprinnelige protein. Induksjonen av antistoff -fremstilling til det opprinnelige protein med viruset er avgjørende bevis for at viruset inneholder i det minste et immunrespons-induserende segment av det opprinnelige protein på en måte slik at segmentet er utsatt for immunsystemet i vert-dyret.

Da viruset inneholdende det udekkede rekombinante proteinsegment er kjent å indusere en immunrespons, er det nyttig som en vaksine hvis det forblir hovedsakelig ikke-patogent og hvis den immunrespons som viruset induserer resulterer i effektiv nøytralisering av infeksjonsmidlet som naturlig bærer det immunrespons-induserende proteinsegment. På

grunn av at viruset hvori det fremmede protein er innført i seg selv er ikke-patogentt. er det generelt tilfellet at viruset med det rekombinante proteinsegment også er ikke-patogent, men dette må fastslås i hvert tilfelle. Om viruset med det rekombinante proteinsegment induserer en immunrespons som motvirker infeksjonsmidlet må også bestemmes i hvert tilfelle, og en effektiv dose bestemmes for de virus

(vaksiner) som induserer immunitet til infeksjonsmidlet.

Virus med rekombinante proteinsegmenter som viser, effektivitet som vaksiner dyrkes i passende cellekulturer og virusene gjénvinnes fra lysater fra disse kulturer. Fremgangsmåten for tilførsel av vaksinen vil variere alt etter det infek-sjonsmiddel som det vaksineres mot men er vel kjent på om-V rådet. Vaksiner fremstilt i samsvar med oppfinnelsen kan tilføres sammen med et farmasøytisk tålbart fortynningsmiddel ved injeksjon, ved inntagelse gjennom munnen, nesen, øynene, ørene eller andre kroppsåpninger, eller ved inhallering. Viruset blandes med en passende bærer egnet for den tilsiktede innføringsmetode. F.eks. kan virus med rekombinante proteinsegmenter blandes med en aerosol og tilføres dyrene gjennom luften for innhalering. En effektiv mengde av viruset til-føres som vel kjent på området. Generelt tilføres virus som inneholder et overflate-proteinsegment som induserer en immunrespons til infeksjonsmidlet i en mengde på omtrent 9 10

10 -10 pr. kilogram kroppsvekt av dyret.

Brukbarheten av virus med rekombinante proteinsegmenter er ikke begrenset til induksjon av immunologiske responser,

selv om en umiddebar praktisk bruk av disse viruser er som kunstige vaksiner. Virus kan f.eks. inneholde et proteinsegment som har en enzymatisk eller hormonal funksjon. Ved induksjon av en kontrollert, ikke-patogen infeksjon i et dyr, kan en kontinuerlig forsyning av en ønskelig hormonal eller enzymatisk funksjon gjøres tilgjengelig. F.eks. kan et virus som inneholder et segment av et gonadalt hormon være nyttig ved langtids-kontroll av fruktbarheten i et dyr.

De følgende eksempler er anført for ytterligere illustre-ring av oppfinnelsen og er ikke ment å begrense rammen for oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Dette eksempel viser kontruksjon av en rekombinant fage som en bærer for et antigenisk sted for vestikulær stomatis virus (VSV) G-protein som er ansvarlig for tilknytning av viruset til vert-cellene i den initiale infeksjonsfase. Antistoffer til G-proteinet bevirker virusnøytralisering,

det vil si eliminerer infektiviteten. Aminosyrefrekvenser inneholdende antigeniske steder av G-proteinet er kandidater for VSV-vaksiner.

Formålet ved denne konstruksjon er å innføre det antigeniske sted VSV inn i D eller E-subenheter av topp-overtrekksprotei-net i bakteriofagen lambda (som formere seg i Escherichia coli) på en slik måte at det VSV-antigeniske sted avdekkes til utsiden av fageovertrekket og tilgjengelig for immunsystemet i et vaksinert dyr. Innføringen gjøres på en slik måte at det ikke forstyrrer sammensetningen av lambda-fagen eller dens infektivitet.. Den konstruerte lambda-fage inneholder således det fremmede eller rekombinante proteinsegment i sitt proteinovertrekk. I denne rekombinant bidrar bærer-lambda-fagen med den virale stabilitet, evne til å reprodusere rikelig i enkle media og bærerfunksjonen for immunogenisitet. Det innførte proteinsegment bidrar med den spesifikke funksjon, det vil si det antigeniske sted for VSV-nøytralisering.

Konstruksjonen av det rekombinante protein gjennomføres ved in vitro rekombinasjon mellom DNA i fagelambda og DNA inneholdende G-genet i VSV. Innføringen av DNA-segmentet inneholdende et G-antigenisk sted i lambda-faget DNA gir den fordel at det rekombinante protein utvikles ved den regulære fageformering slik at lambda-fage som fremstilles bærer dette.

Valget av lambda-fage en bakteriofag som er ikke-patogenisk overfor dyr, som et passende bærervirus for G-genfragmentet utgjør trinn 1 ved den generelle metode.

Trinnet 2 innbefatter innføring av deler av lambda-fage

DNA i et plasmid som lett kan dyrkes i en celle-kultur.

I lambda-fage er de to hovedproteiner som utgjør hodetover-trekket spesifisert ved gener D og E i det 0,11 - 0,15 kb segment av fage DNA-genomet fra dets venstre ende. For å lette innføring av VSV-sekvensene blir lambda DNA fragmentert under anvendelse av restriksjons-endonukleaser Barn HI og Kpn I. Dette isolerer et fragment mellom 0,113 og 0,350 kb av fage DNA, inkluderende D og E-genene. Dette fragment forenes til plasmid PBR322 (inneholdende et Kpn I-sted).

som er blitt kuttet med Kpn I og Barn HI-enzymer. PBR 322-plasmidet med det innførte virale DNA-fragment transformeres i en kultur av E.coli og det rekombinante plasmid reproduseres deri når E.coli dyrkes i et passende syntetisk eller buljongmedium som vel kjent på området. Det rekombinante plasmid meddeles tetracyklin-sensitivitet og amplicilin-motstandsevne til det omdannede E.coli og tilveiebringer et lett metode for seleksjon av E.coli-rkulturer infisert med rekombinante plasmider. Ved lysning av positivt testede kulturer av E.coli frigir multiple kopier av rekombinant pBR322.

Det tredje trinn er isomeringen av den DNA-sekvens som

koder for det funksjonelle segment av G VSV-proteinet. Seleksjonen av G VSV-genfragment er basert på den kjente aminosyresekvens som inpliserer flere basesekvenser ved bestemmelsen av antigeniske steder. Det største Alu I-fragment av G VSV-genet isoleres og kuttes så med Sau 3a-érizym. Det lille segment inneholder et av de antigeniske steder og det store segment de to andre steder. De siste

to steder resolveres videre ved hjelp av Hind III enzymbehandling.

I det fjerde trinn blir de isolerte G VSV-genfragmenter innført i det plasmid-buridne virus-genomfragment etter at det plasmidbundne fragment er fremstilt ved restriksjons-enzymbehandling. Plasmidet kuttes ved delvis enzymbehandling med et av en rekke restriksjonsenzymer, som kutter lambda-fagen i regionene for genene D og E og plasmid DNA med et enkelt kutt i disse områder isoleres. Disse enkeltkuttede plasmidfragmenter rekombineres med forskjellige G VSV-fragmenter med passende linkere ved deres ender. Linkere av forskjellig lengde anvendes for å sikre at i det minste noe av G VSV-genfragmentene anbringes i den passende utlesningsramme og for å tillate noen fleksibilitet i det rekombinante protein. For å oppnå multiple kopier av de rekombinerte plasmider, inneholdende både de virale genomfragmenter og G VSV-fragmentet, reproduseres plasmidene ved transformasjon i E.coli som ved trinn 2 i det foregående, og multiple kopier av det re-'kombinerte plasmid oppnås fra E.coli-lysat. Trinn 5 består i rekonstituering av det intakte virale genom. Lambda fage DNA-fragmentet frigis fra det rekombintante plasmid ved enzymbehandling med Kpn I og Bam HI-enzymeræ og det frigitte fragment forbindes igjen i to trinn, først til venstre ende Bam HI-fragmentet av fage lambda DNA og deretter til det høyre ende Kpn I-fragment.

Det sjette trinn, i tilfellet av bakteriofage lambda involverer pakking in vitro av det rekonstituerte lambda fage DNA i lambda-kapsider. Pakkingen av fagen gjennom-føres in vitro med rensede fageekstrakter i henhold til metoden til Sternberg, Tiemeier og Enquist. Den rekombinante fage reproduseres ved infisering a v kulturer av E.coli dermed og lysingen av E.coli frigir multiple kopier av den rekombinante fage.

Endelig.blir rekombinante fager selektert ved fortynning

av fagen i saltløsning og injeksjon i kaniner med 10g

10"*"^ viruspartikler pr. kilogram kroppsvekt. Etter 8 døgn trekkes blod fra kaninene og deres blodserum testes ved hjelp av radioimmunobedømmelse for reaktivitet med G VSV antigen. Reaktivitet med G VSV-antigen viser produksjon av G VSV-antistoff i kaninene og følgelig innføring av G VSV-protein i fagen.

EKSEMPEL 2

Dette er et eksempel som utnytter en animalsk virusbærer passende for en humanvaksine mot et annet virus som i seg selv er patogenisk. Poliovirus-vaksiner er av to typer som anvendt hittil. Salk-vaksinen består av kjemisk for-krøplet poliovirus med den derav medfølgende fare for at et fåtall poliovirus forblir inntakt i vaksinen og innfiserer pasienten. Sabin-vaksinen anvender levende virus av svekkede stammer som har den medfølgende fare for å vende tilbake til patologisk form. For å fremstille en sikker vaksine kan

nøkkelimmunogenisk peptidsegmenter innføres i en virkelig sikker virus som så kan anvendes for å infisere pasienter uten de farer som følger med andre vaksiner. Et passende ikke-patogenisk virus som er egnet er adeno-virus type 2

(Ad 2) eller vaksinestammer av andre typer.

I henhold til trinn 1 ved fremgangsmåten identifiseres et passende protein i Ad 2 kapsider. Et av proteinene kjent å være udekket på overflaten av adeno-virus er hekson-proteinet. Et annet er "protein IV" eller "fiber". Videre er det siste protein av forskjellige lengder i forskjellige stammer av adeno-virus, og noen stammer må således inneholde områder som kan fjernes eller erstattes uten å redu-sere infektiviteten.

Hele Ad 2 er blitt innført i plasmider i -forskjellige labora torier. For å lette videre håndtering isoleres området som koder for fiber eller hekson og innføres i et annet plasmid i henhold til trinn 2 av fremgangsmåten. Bruken av fiber skal nå omhandles. Fiber er kjent å strekke seg fra kartenheter 87 til 91,5 kb. Det er viktig at det fiberkodende område ikke overlapper messagere for andre proteiner i likhet med andre Ad 2-gener. Hind III "F" fragment (et av produktene ved full enzymbehandling av Ad 2 DNA med enzymet Hind III) strekker seg fra 89,5 - 97,3 kartenheter. Dette fragment isoleres først. Ad 2 DNA-genom kuttes med Hind III og produktene separeres på en 1% agarosegel. Fragmentet med passende størrelse fjernes ved teknikken med elektroeluering.

Plasmidet pBR322 fremstilles med Hind III enzymbehandling

og behandling med CIP for å forhindre religasjon. F-fragmentet innføres så i plasmidet ved behandling med T4 DNA-ligase. En delvis Hind III enzymbehandling gjennomføres og molekylene som bare er kuttet en gang renses fra en gel. Dette material blir Sma I enzymbehandléty Sma I kutt ved 91 kartenheter frigir DNA-fragmentet som strekker seg 91-91,3 kartenheter. Fragmentet fra 89,5 t 91 enheter er fremdeles knyttet til plasmidet. Da Sma I er en "buttendekutter" kan DNA direkte forenes til Hind III linkere.

Etter ytterligere Hind III kutting lukkes plasmidet med T4 DNA ligase. Fragmentet, 89-91 kartenhetfragment, som nå bæres i plasmidet, er fullstendig innenfor kodingsområdet for AD 2 fiber (87-91,5). Plasmidet tranformeres inn i E.coli. Ampicillin-resistente, tetracyklin-sensitive E.coli-stammer, transformert med rekombinante plasmider, selekteres, dyrkes og lyses for å oppnå multiple kopier av det rekombinante plasmid.

Det tredje trinn er isolasjonen av et DNA fragment med en nukleotid-basesekvens som koder for det.ønskede fraksjonelle proteinsegment som skal knyttes til bæreren. I dette til felle er den ønskede funksjon evnen til å stimulere immunsystemet av en vaksinert person mot poliovirus. Et slikt proteinsegment vil finnes på utsiden av poliovirusen. Etter at viruser er fullstendig samlet spaltes et kapsid-protein, VPO, til å danne to proteinsegmenter VP4 og VP2. Da dette er tilgjengelig for spaltningsenzymer, følger det at aminosyrene ved VP4-VP2 møtestedene er på de ytterste deler av viruspartikkelen og således gode kandidater for immunogeniske områder av kapsidproteiner.

Polio er et RNA -snarere enn et DNA virus. Dette skaper et problem for den teknologi som er beskrevet. Imidlertid har nå DNA-kopier i full lengde av polio RNA-genomet nå blitt fremstilt ved hjelp av en prosess kjent som revers transkripsjon.

DNA som koder for det funksjonelle proteinsegment kan isoleres fra DNA, fremstilt ved revers transkripsjon, ved en dobbelt enzymbehandling med restriksjonsenzymene Nru I og Bam HI. Et 0,5 kb fragment renses ved elektroeluering fra bisakrylamid-gel. Fragmentet enzymbehandles så videre til korte fragmenter med Fnn 441 eller Mnl I som hvert kutter fragmentet på 3 steder.

De små DNA-fragmenter som fremstilles, hvorav noen koder for.de funksjonelle proteinsegmenter, fremstilles for innføring i det fage-bundne Ad 2-fragment ved buttending med Klena -eller Pol I og deretter ved forening til Bam HI linkere med T4 DNA ligase. Linkere av forskjellige størrel-ser anvendes for å sikre at noen fragmenter vil bli til-knyttet i den riktige utlesningsramme i det neste trinn.

Det fjerde trinn av den generelle metode innbefatter forening av bærerens kodende DNA til det funksjonelle protein-segments kodende DNA. Plasmidet som bærer Ad 2-fragmentet enzymbehandles meget forsiktig med enzymet Mbo I. Mbo I er en meget hyppig kutter av DNA og anvendes på grunn av at det beste sted for innføring av det fremmede proteinsegment ikke er kjent på forhånd. Ved generelt å kutte meget forsiktig kuttes hvert plasmidbundet Ad 2-fragment en gang.

Mbo I og Bam HI gir forlikelige ender og polio-fragmentene knyttes til det Mbo I-kuttede Ad 2 DNA med T4 DNA ligase.

En slik forening vil.'ikke kuttes på nytt av enzymet Bam HI. Igjen transformeres det rekombinante plasmid inn i E.coli for å oppnå multiple kopier derav. Ad 2 genomdelene inneholdende de innførte pseudo-polio-fragmenter kuttes ut fra plasmidet ved enzymbehandling av plasmidet med Hind III.

I det femte trinn blir det fullstendige Ad 2-genom, inneholdende de innskutte pseudo-polio-fragmenter, rekonstruert i to trinn. Først gir en delvis Sma I enzymbehandling av intakt Ad 2 DNA det kombinerte G-K Sma I-fragment (den høyre arm) som kan renses. Da Sma I er en buttendekutter blir Hind III linkere direkte knyttet dertil med T4 DNA ligase i den side som er kuttet av Sma I. Den venstre side er enden av det virale DNA og er ukuttet. Dette plasmid DNA blir Hind III-kuttet og det polio DNA-holdige Ad 2 virale genom isoleres fra plasmidfragmentet ved elektroforese. Det virale genomfragment knyttes til den fremstilte Ad 2 arm med fire DNA ligase idet halve molekylet har den riktige orientering. Den andre nødvendige Ad 2-arm fremstilles ved delvis Hind III enzymbehandling og isolering av det kombinerte G-E-C-H-D-A-B Hind III-fragment. Dette knyttes så til det rekombinante polio DNA-holdige Ad 2 fragment på den fri side og utvikler Ad 2-genomer hvorav en halvdel har en konfigurasjon med potensielle virus-fremstillende evne.

I det sjette trinn transfekteres de rekombinante Ad 2-genomer inn i Hela-celler ved hjelp av fosfat-kalsiumkopresipitering og de transfekterte Hela-celler dyrkes i DME-medium med 10% hesteserum. Bare virus med alle gener nødvendige for virus- levedyktighet og reproduksjon, i korrekt utlesningsramme, genererer det virale proteinovertrekk og bevirker lytisk infeksjon av Hela-celler for fremstilling av avkom-virus.

Noen av disse rekonstruerte virus inneholder også polio-virus DNA-fragmenter som det blir gitt ekspresjon for i fiber-proteinet av Ad 2 viruset.

Hvilke av de rekombinante virus som inneholder polio-virus-proteiner på en udekket måte bestemmes ved injeksjon av kaniner med forskjellige virale fraksjoner for å bestemme om kaninene fremstiller antistoffer mot polio-virus. Kaniner

9 10

injiseres med 10 til 10 partikler av rekombinant Ad 2

virus, fortynnet i saltløsning,.\ pr. kilogram kroppsvekt.

Etter 8 døgn trekkes blod ut. Reaktivitet av blodserum med polio-virus bestemmes ved hjelp av radioimmunobedømmelse. Rekombinant Ad 2 virus, inneholdende polio-virus-protein

som etablert ved antistoffinduksjon i kaniner, har potensial som sikker human polio-vaksine.

Mens oppfinnelsen er beskrevet på basis av visse foretrukne utførelsesformer kan opplagte modifikasjoner for den vanlige fagkyndige på området gjøres uten å gå utenfor rammen for oppfinnelsen. Mens f.eks. oppfinnelsen er beskrevet på basis av innføring av DNA nukleotidsekvenser i virale genomer kunne en RNA nukleotidsekvens innføres i virus som har et RNA-genom, ved å arbeide gjennom DNA-mellomprodukter, og slike rekombinante RNA-virus er omfattet av oppfinnelsen.

Forskjellige trekk ved oppfinnelsen gjengis i de etterfølgende patentkrav.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for modifisering av et virus til å gi viruset en ny biologisk funksjon, karakterisert ved å innføre en fremmede nukleotid-basesekvens i det virale genom på et sted hvor den fremmede nukleotid-basesekvens vil gi ekspresjon for seg selv som et udekket segment av overflate-viral protein.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, kar a..k\ t erise-rt ved å bestemme et overflate-viralt protein som ikke er kritisk for den reproduktive levedyktighet av viruset eller en del av et overflateprotein som ikke er kritisk for den reproduktive levedyktighet av viruset og innføre den fremmede nukleotid-basesekvens i det virale genom på et sted hvor den fremmede nukleotid-basesekvens gir ekspresjon for seg selv som et udekket segment av det ikke-kritiske overflateprotein eller av den ikke-kritiske del av et overflateprotein.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det selekteres et virus for modifisering som er ikke-patogent i et dyr hvortil det modifiserte virus skal tilføres.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den fremmede nukleotid-basesekvens innføres i genomet ved innføring i en kloningsvektor av en del av det nevnte virale genom inneholdende minst et fragment av genet for overflateproteinet, en orga,-nisme med den innførte kloningsvektor transfekteres til å oppnå multiple kopier av den nevnte innførte kloningsvektor, den innførte kloningsvektor spaltes på et sted innenfor overflateprotein-genfragmentet, den fremmede nukléotid-basesekvens knyttes til de spaltede ender avoverflate-genfragmentet, den innførte del av den virale genomdel inneholdende den fremmede nukleotidbasesekvens isoleres fra kloningsvektoren, og den isolerte genomdel forenes med ytterligere virale genomdeler nødvendige :for å skape et funksjonelt viralt genom.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det virale genom som inneholder den fremmede nukleotid-basesekvens pakkes som et fullstendig modifiserte virus.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved å oppnå den fremmede nukleotid-basesekvens ved å bestemme et segment av et protein som induserer en immunologisk respons i et dyr og isolere den nukleotid-basesekvens som koder for det nevnte proteinsegment og deretter å innføre den nevnte isolerte fremmede nukleotid-basesekvens i viruset på et slikt sted at det modifiserte virus induserer en immunologisk respons ved til-føring til et slikt dyr.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at det nevnte virus-genom oppnåsrfra et virus som er ikke-patogenisk for dyret, nukleotid-basesekvensen isoleres fra et middel som er infiktiøst for dyret, den isolerte ..nukleotid-basesekvens innføres i det virale genom på et sted hvor nukleotid-basesekvenser blir gitt ekspresjon for som et eksponert proteinsegment av det nevnte modifiserte virus slik at den reproduktive levedyktighet av det modifiserte virus opprettholdes, og det modifiserte virus til-føres til dyret for å indusere en immunrespons av en størrelse tilstrekkelig til å motvirke fremtidig utsettelse for det nevnte infektiøse middel.

8. Et reproduktivt levedyktig virus med fremmede nukleotid-basesekvens innført i sitt genom, karakterisert ved at den fremmede nukleotid-basesekvens gir ekspresjon for seg selv som et biologisk aktivt segment av et overflateprotein i viruset.

9. Virus som angitt i krav 8, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av bakteriofager, adeno-virus og omhyllede RNA-holdige influensavirus.

10. Virus som angitt i krav 8, karakterisert ved at proteinsegmentet inn-føres i et overflateprotein på et sted hvor proteinsegmentet ikke skadelig påvirker levedyktigheten av viruset.