JP2000503551A

JP2000503551A - ポリオウイルスの複製コンピテント組換えセービンタイプ１菌株

Info

Publication number: JP2000503551A
Application number: JP11511995A
Authority: JP
Inventors: ソオバエ，ヨン; ジュン，ヒェ、ルハン
Original assignee: アルトウェルバイオテクインコーポレーテッド
Priority date: 1997-08-07
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2000-03-28
Also published as: KR19990023455A; BR9806084A; CN1239512A; KR100314142B1; US6696289B1; AU8751298A; CA2268737A1; WO1999007859A1; EP0966538A1

Abstract

(57)【要約】多重クローニング部位および３Ｃ−プロテアーゼ切断部位に対しコーディングする配列を含む複製コンピテント組換えセービンタイプ１ポリオウイルスベクターを提供する。このベクターは、感染ウイルスから種々のワクチン遺伝子をセービン１ポリオウイルスに導入することを容易にし、そしていくつかの感染性ウイルス病に対し強力な経口粘膜ワクチンであることが期待されるキメラセービン１ポリオウイルスの製造が容易である。

Description

【発明の詳細な説明】ポリオウイルスの複製コンピテント組換えセービンタイプ１菌株発明の背景１．発明の技術分野本発明は、生きているウイルスワクチンを発現するために有用なベクター系に関する。さらに詳細にはポリオウイルスの複製コンピテント組換えセービンタイプ１菌株に関し、これは粘膜性免疫を誘発できる生きているウイルスワクチンの開発のために使用できる。２．従来技術の記述最近、種々の感染性ウイルス病は、輸血、同性愛性交、または注射器共有のような血液媒介ルートによって広がることが良く知られており、また異性愛性交によって伝播することが報告されている。ＡＩＤＳ（Ackquired Immunodeficiency Syndrome）の場合には、異性愛伝播の数は血液媒介の場合のそれよりもはるかに大きい(Stingら、J.Am.Aca.Dermatol.，22，1210、1988)。韓国では、527人の中363人のＨＩＶ−１ポジティブ患者は異性愛であり、99人は同性愛ルートによって感染する（National Institute of Health,Korea,CommunicableDiseases Mo nthly Report,1996 4月)。これらの報告はＨＩＶ-1が血液媒介なしに性器の周囲に粘膜組織を通って伝播することができることを強く示唆している。いくつかのペーパーはＨＩＶ-1 伝播と蔓延は粘膜性組織でのランゲルハウス細胞または樹状細胞（ＤＣs）の感染によって始まるらしいことを報告している。感染した細胞はリンパ節に戻り抗原を引き渡し、これは帰巣性として良く知られており、ウイルス複製が起こり、その結果ウイルス血症とＡＩＤＳ進行となる。換言すると、ＨＩＶ-1 感染患者との異性愛交際をしている者は尿性器の粘膜領域にＨＩＶ-1 に感染したランゲルハウス細胞またはＤＣs を有し、感染したＤＣs はリンパ節に戻り、リンパ節中のＣＤ４⁺Ｔ細胞を活性化し、ＨＩＶを伝播し、ＡＩＤＳ進行に従いＣＤ４ ⁺Ｔ細胞の涸渇となる(Tshachler ら、J.In ves.,Dermator,88,238,1987;Langhoffら、Proc.NaU.Acad.Aci.ＵＳＡ,88,7998,1 991;Patterson ＆ Knight,J.Gen.Virol.,68,1177,1987;Patterson ら、Immnol., 72,361,1991;Cameronら、Science,257,383,1992;Embreston ら、Nature,362,369 ,1993; Fauci,Science,262,1011,1993;Pandeoら、Nature,362,355,1993;Ademaら、Natur e,387,713,1997)。これらの実験結果は、生殖器のＳＩＶ（Simianimmunodefici ency V1ms）で治療したマカクモンキーが感染し次いでＡＩＤＳ症状を示したインヴィヴォ実験により実証された(Miner＆Gardner,J.ＡＩＤＳ,4,1169,1991:M inerら、J.Virol,63,4277,1989)。さらに、たいていの感染性ウイルス病は呼吸器、消化器または尿生殖器で粘膜組織の第一感染によって広がるので、粘膜ワクチンの発達は感染性ウイルスを防ぐため大いに推奨される。特に、１つの場所での通常の粘膜免疫系−免疫感作は、生体の他の粘膜領域に同一の免疫、粘膜免疫の特定の特性を促すことができ、多くの研究が粘膜ワクチンを開発させた(Kott, Science,266,1335,1994;Cease＆Verzofsky,Ann.Rev.Immunol.,12,923,1994)。長い間、天然痘ウイルスは生きているウイルス性ワクチンビヒクルとして提案された。天然痘ウィルス性ゲノムにワクチン遺伝子を導入することによって生成した組換えワクシニアウイルスは免疫化したモンキーに細胞毒のＴリンパ球を引き起こすことが報告された。しかし、過剰増殖するとき免疫にした個体にワクチン症候群を起こすかもしれないので、それをヒトに応用することは許可されなかった。その可能性を避けるために、減毒したワクシニアウイルスがビルレント菌株の代わりにワクチンビヒクルとして示唆されたが、有効な免疫を引き出すことに失敗した(Cooney ら、Lamcet,337,567,1991;Tartagha ら、Virol.,188、217、 1992)。ワクシニアウイルスのそれよりも小さいゲノム（34kbp）をもつアデノウイルスはまたワクチンベクターとしてまた提案された(Natuk ら、Proc.Natr.Acad.Sc i.ＵＳＡ、89,7777,1992;Gamchar ら、J.Infec.Dis.,168,622,1993)。しかし組換えアデノウイルスはまだ、結膜炎または角膜炎のような副作用の限界があり、これらは粘膜ワクチンベクターとして使用されるようにアデノウイルスに対し解決されなければならない。ポリオウイルスは7.4kbヌクレオチドのポジティブセンス一本鎖ＲＮＡを含み、これは長いポリプロテインのユニークオープンリーディングフレームを符号化する(Kitamura ら、Nature 291,547,1981)。最近、いくつかのグループが既知の魅力的利点−安全、投与容易、経済的、そしてとりわけ理想的ワクチンとして強く推奨される有効な長期粘膜免疫を引き起こすための能力を有する、ワクチンビヒクルとしてポリオウイルスを開発することを試みている。以下はワクチンウイルスとして開発されたポリオウィルスに関連して刊行されたワクチン研究の概要である。 (1) ＶＰ１の一部、ポリオウィルスの主な外側カプシドプロテインを、gp41 、ＰＮＤ（Principle Neutralizing Domain）またはgp120のようなＨＩＶの仮定ワクチンエピトープと置換することが提案された。エピトープの特性により抗体を有効に誘導した遺伝的組換えからキメラウイルスは生成した(Burkeら、Nature 、332,81,1988;Burke ら、J.Gen.Viol.70,2475,1989;Evans ら、Nature,385,198 9;Dedieu ら、J.Virol.,66,3161,1992;Rose ら、J.Gen.Virol.,75,969,1994)。しかし、このキメラウイルスはモロウと彼の紹介したワクチン遺伝子に対し大きさの制限がある。キメラポリオウイルスは、挿入したワクチンエピトープが25アミノ酸残基よりも大きいとき、感染細胞に正確に組み込むことができなかった。 (2) モロウと彼の同僚（Porter ら、J.Virol.,69,1548,1993;Ansaradi ら、C ancer Res.,54,6359,1994,Porter ら、J.Virol.70,2643,1996,Porter ら、Vacci ne 15,257，1997）はポリオウイルスミニレプリコンを示唆した、これはポリオウイルス構造遺伝子が外来の配列によって置換えられ、ポリオウイルス介在粘膜ワクチンを発現する。ポリオウイルスミニレプリコンの場合、組換えウイルスゲノムの不完全な複製はキメラウイルスゲノムのパッキングのための他のカプシドプロテイン発現ベクターでコトランスフェクションされなければならない（Port erら、J.Vlrol.,69,1548,(1995)。さらに、生きているウイルスワクチンよりはむしろ複製欠陥標的特異的免疫源として働くので、有効な粘膜免疫を誘導するため、ミニレプリコンの高い力価がワクチン化に必要である。 (3) 最近、マッションら（J.・rol.68,3925，1994）およびアンディノら（Sc ienc,265,1448,1994）により、複製コンピテント組換えポリオウイルスにおける外来抗原の発現に対し新しい戦略が示唆された。かれらはポリオウイルスのポリプロテインのＮ−末端での３Ｃプロテアーゼ認識部位および新しいポリリンカー領域を紹介した。この系によれば、ポリオウイルスオープンリーディングフレームを用いインフレームにクローン化した外来遺伝子は、人工的３Ｃプロテアーゼ部位によって随伴され、ポリオウイルスポリプロテインからの外来プロテインの蛋白質分解を行う。外因性の核酸は直接ポリオウイルスゲノムに組み込まれる。外因性の配列はウイルスポリプロテインの一部としてウイルス複製の間に発現し、続いてウイルスコード化プロテアーゼにより処理され、フリー抗原および成熟ウイルスプロテインを生成する。外来抗原はビリオンには一括されないが、細胞質には放出される。この方法の基本は先に発表されたポリオウイルス特異的３Ｃプロテアーゼの特性に基づく。３Ｃプロテアーゼは特異的アミノ酸配列を認識し次いでそれをGlu(Ｑ)/Gly(Ｇ)間の結合で切断し(Hanecak ら、Pr oc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ 79,3793，1982)，タンパク質分解は長いポリプロテインの分子内で起きる(PalmenbergおよびReuckert,J.Virol.,41,244,1982;Hanecak ら、Cell 37,1063，1984)。これらの現象は一般にピコルナウイルス科で観察される(Palmenbergら、J.Virol.32,770,1979;PalmenbergおよびReuckert,J.Virol. ,41,244,1982)。Ｑ/Ｇ切断部位（ＡＸＸＱＧ）のＰ４位置のアラニン（Ａ）残基は有効な認識および３Ｃプロテアーゼによる切断に対し基本的であることが数回確認された(Nickhnson ら、Biotechnology4,33,1986;Panai ら、J.Bio.Chem.,26 4,9738,1989;Cordingley ら、J.Virol.,63,5037,1989;Orrら、J.Gen.Virol.,70, 2931,1989;Petithory ら、Proc.Natl.Aca.Sci.ＵＳＡ88,11510,1991;Blair およびSemler,J.Vlrol.65,6111,1991)。これら実験結果に基づき、マッションおよび彼の同僚らは多重クローニング部位および３Ｃプロテアーゼ切断部位をポリオウイルスのセービンタイプ３菌株のＮ末端に導入し(J.Viol.68,3925,1994)、キメラポリオウイルス発現ロータウイルスＶＰ７を構築した。アンディノおよび彼の同僚ら（Science,265,1448,1994）は多重クローニング部位および３Ｃ-プロテアーゼ切断部位をポリオウイルスマホニー菌株の長いポリプロテインのＮ末端に導入して組換えマホニーベクターを構築した(ＭoＶ-1.4)。彼らはキメラポリオウイルスを種々のＨＩＶ-１サブゲノムをベクターにクローニングして生成した(Science,265，1448,1994)。アンディノグループはＨＩＶ−１nef 遺伝子を発現するキメラポリオウィルスは直腸を通して免疫２週間後にモンキーに有効な粘膜免疫を誘発したことを報告している(Andino ら、Science,265,1448,1994)。それにもかかわらず、ポリオウイルスの組換えマホニー菌株は、消化器の一次感染を通じて霊長類の中枢神経系に感染させ、麻痺性の灰白髄炎を起こすことになる、きわめて有害な毒性の神経向性のウイルスであるから、さらに解毒工程なしにヒトに応用できないことを報告している。ところが、ムエラーおよびウインマー（J.Virol.,72,20-31,1998）はグリーン蛍光タンパク質遺伝子（gfp：252aa）およびＨＩＶ-１gag 遺伝子をアンディノマホニーべクターにクローニングして得られた組換えウイルスは、アンディノら（Sdence,265,1448,1994）によって先に報告されたように継代の間にあまり遺伝学的には安定ではなかったことが報告された。彼らの実験結果は１継代後にも組換えウイルスの大部分は導入したワクチン遺伝子を失い、６継代後には子孫ウイルスのどれもＲＴ-ＰＣＲ実験で全長外因性挿入をもつことが見出されなかったことを示した。 (4) 1996年に、アンディノおよび彼の同僚らはまた、同じマホニーべクター（Yim ら、Virology,218,61,1996）を用いるＢ型肝炎の組換えマホニーウイルス発現 preＳ（118aa,54aa）およびコア(155aa)プロテインを報告した。彼らは、これらのキメラウイルスが６番目の子孫まで継代の間に遺伝子学的に安定であることを述べているが、彼らのＲＴ-ＰＣＲ実験結果は、preＳ遺伝子（118aa）を維持する組換えウイルスの量が著しく５番目の継代の間に減ったことを示した。他方、彼らの報告は、55aa 残基をコードする小さい preＳプロテインを発現する組換えウイルスは、野生型または他の組換えマホニー菌株のそれと比較して著しく減った複製能をもつことを示した。その結果は組換えキメラウイルスの複製能が期待されたような挿入ワクチン遺伝子の大きさに密接に関連しているのではないことを示唆している。これらの実験結果は組換えキメラウイルスの生物学的特性が、遺伝子挿入物の大きさ、ウイルスベクターの特性、導入したワクチン遺伝子等のような幾つかの組み合わさった因子に依存するという結論へと我々を導く。 (5) アンディノらは、上記のようにマホニーベクターの問題を受け入れて、マホニーポリプロテインｃＤＮＡのＰ1/Ｐ2結合での２Ａプロテアーゼ切断部位および多重クローニング部位を挿入して新規のマホニーベクター（ＭoＶ-2.1）を発現した(Tangら、J.Virol.,71,7841-7850,1997)。このＭoＶ.2.1べクターを用い、ＳＩＶgag遺伝子（p17またはｐ27)またはenv遺伝子（gp130または gp41 ）を発現する組換えキメラウイルスを構築した。これらの組換えキメラウイルスは野生型マホニーのそれと似た複製能をもち、効率的に導入ワクチン遺伝子を発現する。しかし、ＭoＶ2.1ベクターはまだ遺伝学的に不安定の問題がある。組換えキメラウイルスの99％以上は第３継代内で導入ワクチン遺伝子を失う。彼らは、継代間に配列欠失が新しく導入された多重クローニング部位での繰り返された配列間の相同的組換えによると考えた。彼らは、アミノ酸配列に影響を与えずに配列を変えるようにサイレント突然変異によってＭoＶ-2.1ベクターの繰り返し配列で37％によって配列相同性を減らし、それをＭoＶ-2.11 と名付けた。彼らは、ＳＩＶp27 遺伝子を操作マホニーベクター（ＭoＶ-2.11）にクローニングして組換えキメラウイルスＳp27（ＭoＶ-2.11）を構築した。サイレント突然変異のない組換えウイルス［Ｓp27(ＭoＶ-2.1)］に対し、20−30％のプラークは最初の継代後クローン化ワクチン遺伝子を維持し、第３継代後のプラークはクローン化遺伝子を保持した。他方、繰り返し配列でのサイレント突然変異をもつ組換えウイルス［Ｓp27(Ｍo-2.11)］に対し、90％以上の一継代プラークはクローン化遺伝子（gag）を維持し、30−50％のプラークは第３継代にてＳＩＶ遺伝子生成物を発現した。それにもかかわらず、配列相同性を減らすことによりマホニーベクターの遺伝子学的安定性を増加するためある工程を持っていても、まだマホニーベクターＭoＶ-2.11 は継代の間に遺伝学的不安定の問題をもつ。彼らの実験結果によれば、継代が３継代内で進行したとしても、挿入維持子孫ウイルスの集団は著しく減少する；第１(90％)、第２(50-70％)、そして第３(30-50％)。これは、さらにほんの少し経過した場合に挿入維持組換えキメラマホニーウイルスが全集団の間で迅速に希釈されることを意味する。アンディノグループにより発現されたマホニーベクターのいくつかの制限を考慮すると、マホニーベクターはポリオウイルス介在粘膜ワクチンベクターのためのモデルシステムとして許容することができない。従って、マホニーベクターに示される制限を解消することができるポリオウイルス介在粘膜ワクチンベクターのための新規のモデルシステムを開発することが大いに推奨される。そのために、新規のベクターは次の要求に合致しなければならない。（１）ウイルス性ベクターは人間に安全でなければならない；（２）組換えウイルスは複製可能で、そして野生型のそれと等しい複製能を持たなければならない；そして（３）導入されたワクチン遺伝子はウイルス継代の間に安定に維持されなければならない。発明の概要本発明の目的は、粘膜性ワクチンの開発のために生きているウイルスワクチンベクターとして有用な複製コンピテント組換えセービン１ポリオウイルスベクターを提供することである。本発明の他の目的は組換えセービン１ポリオウイルスの多重クローニング部位にクローン化したいくつかのワクチン遺伝子を発現するキメラポリオウイルスを提供することである。本発明は、セービン１ポリオウイルスｃＤＮＡの長いポリプロテインの第一と第二のアミノ酸の間の３Ｃ−プロテアーゼ切断部位および多重クローニング部位に対しコード化する非ゲノム配列をもつ複製コンピテント組換えセービン１ポリオウイルスベクターを提供する。さらに本発明は、それそれ、外因性のワクチン遺伝子を発現する複製コンピテントキメラセービン１ポリオウイルス、およびそれらの組換えｃＤＮＡプラスミドを提供する、ここでこれらは上記複製コンピテント組換えセービン１ポリオウイルスベクターの多重クローニング部位にて、それそれ外因性のワクチン遺伝子を有する。以下の詳細な説明から当業者には、本発明の上述の目的、他の特徴及び応用が一層さらに明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図１は、本発明を達成するために組換えプラスミドｐＴＺ−ＰＶＳ−３ｍの構築のための概略図である。図２は、セービン１ポリオウイルスｃＤＮＡから得た、組換えベクタ−ｐＴＺ −ＰＶＳ−３ｍおよびｐＴＺ−ＰＶＳ−４ｍの概略図であり、これらは多重クローニング部位および３Ｃ−プロテアーゼ切断部位をそれそれ有する。図３は、野生型および組換えポリオウイルスｃＤＮＡｓがヒーラ細胞にトランスフェクシヨンしたときに子孫ウイルスを生成することができることを示す写真である。ヒーラ細胞は野生型ｃＤＮＡ（Ａ）から合成したＲＮＡ転写物を用い、組換えプラスミドｐＴＺ−ＰＶＳ−３ｍ（Ｂ）から合成したＲＮＡ転写物を用い、または組換えプラスミドｐＴＺ−ＰＶＳ−４ｍ（Ｃ）から合成したＲＮＡ転写物を用い、トランスフェクションした。図４は、組換えプラスミドｐＴＺ−ＰＶＳ−３ｍの多重クローニング部位にＨＩＶ−１ｐ24 遺伝子を挿入することによるキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24の生成方法、およびＨＩＶ−１ｐ24プロテインの発現の概略図である。図５は、野生型および組換えセービン１ポリオウイルスの複製能を評価する１段階成長曲線を示す図である。培養上澄みのウイルスの力価は３時間ごとにＴＣＩＤ50およびプラークアッセイによって決定した。図６は、培養上澄みに発現したＨＩＶ−１ｐ24 プロテイン、およびキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 で感染させたヒーラ細胞のウェスタンブロットを示す図である：レーン１：ＨＩＶ−１／−tat(tat 欠陥ＨＩＶ-１菌株；Dr Sodroski,Dana-F arber Cancer Ins.,ＵＳから供給)。レーン２：コントロール（野生型セービン１ポリオウイルス感染ヒーラ細胞溶菌液）レーン３：キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞溶菌液レーン４：キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞の培養上澄み図７は、キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 から発現したＨＩＶ-1ｐ2 4の抗原性を評価するためのラジオイムノ沈降の結果を示す図である。レーン１：非感染細胞溶菌液レーン２：野生型セービン１ポリオウイルス感染ヒーラ細胞溶菌液レーン３：キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24感染ヒーラ細胞溶菌液図８は、継代中のキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 の遺伝的安定性を評価するため１２番目までの継代で、キメラポリオウイルスでクローニングしたｐ24のＰＣＲ分析を示す図である。レーン１：野生セービン型１ポリオウイルス感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン２：組替えポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン３：キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン４：第２継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン５：第４継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン６：第８継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン７：第１２継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物図９は、継代中のキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 の発現安定性を評価するため１２番目までの継代で、キメラポリオウイルスから発現したＨＩＶ −１ｐ24 プロテインのウェスタンブロットの結果を示す図である。レーン１：ＨＩＶ−１／−tat レーン２：ヒーラ細胞溶菌液レーン３：野生型セービン１ポリオウイルス感染ヒーラ細胞溶菌液レーン４：第１継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン５：第３継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン６：第６継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン７：第９継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン８：第１２継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ｐ24 感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液図１０は、組換えプラスミドｐＴＺ−ＰＶＳ−３ｍの多重クローニング部位にＨＩＶ-1 エンベロープグリコプロテイン遺伝子 env(125aa)をクローニングすることによるキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／env の構築方法、およびＨＩＶ -1エンベロープグリコプロテインのその発現を示す概略図である。図１１は、継代中のキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／env の遺伝子安定性を評価するため１２番目までの継代で、キメラポリオウイルスでクローニングしたＨＩＶ−１env 遺伝子のＰＣＲ分析を示す図である。レーン１：野生型セービン１ポリオウイルス感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン２：組換えポリオウイルスＰＶＳ-3ｍ感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン３：第３継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／env 感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン４：第６継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／env 感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン５：第９継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／env 感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン６：第１２継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／env 感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物図１２は、継代中のキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／envの発現安定性を評価するため１２番目までの継代で、キメラポリオウイルスから発現したＨＩＶ −１envプロテインのウェスタンブロットを示す図である。レーン１：ヒーラ細胞溶菌液レーン２：組換えポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ感染ヒーラ細胞溶菌液レーン３：第３継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／env 感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン４：第６継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ/env 感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン５：第９継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ/env 感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン６：第１２継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ/env 感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液図１３は、組換えプラスミドｐＴＺ−ＰＶＳ−３ｍの多重クローニング部位にＨＣＶコア遺伝子をクローニングすることによるキメラポリオウイルスＰＶＳ− ３ｍ／ＨＣＶｃの構築方法、およびＨＣＶコアプロテインのその発現を示す概略図である。図１４は、キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃの複製能を評価するための１ｓテップ成長曲線を示す図である。培養上澄みにおけるウイルスの力価は３時間ごとにＴＣＩＤ50およびプラークアッセイによって決定した。図１５は、ヒーラウイルスをキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃで感染させたときＨＣＶコアプロテインの発現パターンをチェックするためのＨＣＶコアプロテインのウェスタンブロットを示す図である。レーン１：ヒーラ細胞溶菌液レーン２：野生型１ポリオウイルス感染ヒーラ細胞溶菌液レーン３：キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃ感染ヒーラ細胞溶菌液レーン４：キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃのペレットレーン５：ウイルスを含まないヒーラ細胞の培養上澄み濃縮液レーン６：キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃ感染ヒーラ細胞溶菌液のペレットレーン７：キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃ感染ヒーラ細胞溶菌液の上澄み図１６は、継代中のキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃの遺伝子安定性を評価するため１２番目までの継代で、キメラウイルスでクローニングしたＨＣＶコアプロテイン遺伝子のＰＣＲ分析を示す図である。レーン１：野生型セービン１ポリオウイルス感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン２：組換えポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン３：第３継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃ感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン４：第６継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃ感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン５：第９継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃ感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物レーン６：第１２継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃ感染ヒーラ細胞からのＰＣＲ生成物図１７は、継代中のキメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣＶｃの発現安定性を評価するため１２番目までAI Kの継代で、キメラポリオウイルスから発現したＨＣＶコアプロテイン遺伝子のウェスタンブロットを示す図である。レーン１：第１継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣVc感染ヒ一ラ細胞の細胞溶菌液レーン２：第３継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣVc感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン３:第６継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣVc感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン４：第９継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ／ＨＣVc感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液レーン５:第１２継代キメラポリオウイルスＰＶＳ−３ｍ/ＨＣVc感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液発明の詳細な説明ピコルナビリダエ科に属するポリオウイルスは、中枢神経系に感染し破壊することによる灰白髄炎のcausative剤である(Bodian and mdHowe,1995;Coudercら、 1989)。灰白髄炎は不活性または生きている減毒ワクチンの使用によって有効にコントロールされた。減毒菌株の３血清型はインヴィヴォおよびインヴィトロモンキー組織における野生型菌株の多くの継代によって選択された(Sabinulger,J. Biol.Stand.,1,115,1973)。霊長類消化管に複製し強い粘膜および組織の免疫を引き起こすこれら菌株（セービン１、２、および３）は、良好な安全記録を示した。しカル、5-10のケースのワクチン結合灰白髄炎（ＶＡＰ）は経口ポリオウイルス（ＯＰＶ）で免疫感作後に米国では毎年起こるこたが報告された(OgraandFa den,J.Pediatr.,108.1031,1986;Nkowane et al.,ＪＡＭＡ,257,1335,1987)。ＶＡＰは、組換え（Furione et al.,Virology,196,199,1993）または点突然変異(G uillot et al.,Vaccine,12,503,1994)のような、セービン菌株の遺伝学的変異体に由来する。実際に、ワクチン由来の神経毒性菌株は健康なワクチンの内部およびＶＡＰの患者の中枢神経系に見出される(Georgescu et al.,J.Virol.,68,8089 ,1994; Friedrich,Acta Virol.,40,157,1996)。しカル、ＶＡＰはセービン２および３と最も頻繁に結合するが、セービン１とは滅多に結合しない（Furione et al.,Virology,196,199,1993;Oteleaetal.,DevBiol.Stand.,78,33,1992）ことが報告されている。セービン１において大多数の減毒突然変異体は多分、タイプ２および３の菌株と比較してこの菌株の安全性がさらに高いことを示しているのであろう。従って、ポリオウイルスのセービン１菌株は生きているウイルス性のベクターに対し最良の候補であり、粘膜免疫が感染性病気の保護のために望ましい場合に腸管に外来性の抗原を届ける。本発明は、セービンタイプ１菌株のこれら利点に基づく。本発明者らは、粘膜ワクチンビヒクルとしてポリオウイルスのセービンタイプ１菌株を使用するために努力した。彼らは多重クロージング部位および３Ｃプロテアーゼ切断部位をセービン１ポリオウイルスのｃＤＮＡのＮ末端に導入することによって組換えプラスミドｐＴＺ−ＰＶＳ−３ｍを構築した。プラスミドから合成したＲＮＡ転写物はヒーラ細胞にトランスフェクションするとき感染性であり、組換え子孫ウイルス（ＰＶＳ−３ｍ）を導入することになる。組換えウイルスは野生型セービンのそれよりも１−１０倍低いわずかに減った複製能をもつ。それにもかかわらず、ベクタ−ｐＴＺ−ＰＶＳ−３ｍに種々のワクチン遺伝子をクローニングした後に上記トランスフェクションによって得られたキメラセービン１ポリオウイルスは、少なくとも１２までの連続継代で安定に発現するように外来遺伝子を保持する。ポリオウイルスのセービンタイプ１菌株はセービンおよび彼の同僚によって19 61 年に開発された。彼らは、モンキー腎臓細胞の確立された細胞ラインにおける野生型マホニー菌株の連続継代により、弱毒化した神経毒性のさらに一層免疫原生のポリオウイルスワクチン菌株を開発し、セービン１ポリオワクチン菌株と呼んだ。セービン１は野生型マホニー菌株と比較して 57 個のヌクレオチド置換基をもち、そのうち 21 個はアミノ酸置換を起こす。セービン１タイプ菌株のヌクレオチド配列はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.1として示される。コーディング変化改変のすべてはＶＰ１主要外部カプシドプロテインのＮ末端半領域に濃縮される(Kitan lura et al.,Nature,291,547-553,1981:Nomoto et al.,Proc.Nad.Acad.Sci.ＵＳＡ,79,5793-5797,1982)。セービン１菌株の複製能は野生型マホニー菌株のそれよりも２−３ log 低い。継代中に向神経性を失ったので、霊長類において麻痺性灰白髄炎を起こさない。それにもかかわらず、よく効く粘膜性および全身性の免疫を促すために充分な向腸内性能力を末だ維持している。それは先ず1961年に米国で経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）として最初に認可され、1963年には一般に使用されるようになった(Ogra et al.,Revlnf.Diseases2,352-369,1980)。本発明について、多重クローニング部位および３Ｃ−プロテアーゼ切断部位は新しく、セービン１の第一と第二のアミノ酸の間に長いポリプロテインｃＤＮＡを、組換えプラスミドｐＴＺ−ＰＣＶ−３ｍを構築するために部位特異的挿入実験によって導入される(図１)。多重クローニング部位はＳstII,ＨpaI及びＥagI の３個の制限部位をもつように設計する。組換えプラスミドpＴＺ-ＰＣＶ-３ｍは、ポリオウイルスの異なる位置で外因性の多重クローニング部位と３Ｃ-プロテアーゼ切断部位を含むいくつかの組換えプラスミドの中で、そのＲＮＡ転写物を用いてヒーラ細胞単分子層にトランスフェクションするとき、組換え子孫ウイルスの生成のためにもっとも有効であった(図３)。ＴＣＩＤ₅₀アッセイとプラークアッセイによるウイルス力価を測定することによってプロットした１ステップ成長曲線は、組換えポリオウイルスＰＣＶ−３ｍの複製能がせいぜい１ log 野生型セービン１菌株のそれよりも低いが、種々のキメラポリオウイルスの中でもっとも高いことを示している(図５)。本発明では、３個の外因性ワクチン遺伝子、ＨＩＶ-1p24(169aa)、ＨＩＶ-1 e nv(125aa)およびＨＣＶコア遺伝子(100aa)がpＴＺ-ＰＣＶ-3ｍの多重クローニング部位にうまく導入され、それらのＲＮＡ転写物がヒーラ細胞にトランスフェクションされるとき、それそれ、キメラポリオウイルスＰＣＶ−3ｍ／ｐ24、ＰＣＶ-３ｍ／env およびＰＣＶ-3ｍ/ＨＣＶc を生成することになった(図４、図１０および図１３)。これらのキメラポリオウイルスは、ヒーラ細胞において複製中に外因性プロテインを有効に発現し(図６および図１５)、発現したプロテインは元の抗原性を維持する(図７)。さらに、これらキメラポリオウイルスは連続継代中に遺伝学的に安定であり(図８、図１１および図１６)、外来遺伝子の発現は継代中に損傷を受けない(図９、図１２および図１７)。これらの結果は、組換えプラスミドpＴＺ−ＰＣＶ−３ｍが、いくつかの感染性病気に対しいくつかの粘膜ワクチンの開発のために有効なワクチンベクターとして使用できることを強く示唆している。本発明の組換えプラスミド pＴＺ−ＰＣＶ−3ｍは、韓国のタエジョンにある Korea Research Institute of Bioscie nce and Biotechnology(ＫＲＩＢＢ)のKorea Conection of Type Cultures(ＫＣＴＣ)に、1997年８月６日、受託番号ＫＣＴＣ-0365Ｂp にて寄託された。本発明の組換えプラスミドpＴＺ−ＰＣＶ−３ｍの多重クローニング部位に導入できる外因性ワクチン遺伝子は、ＨＩＶ,ＨＢＶ,ＨＣＶヒトパピロマウイルス、ロータウイルスのような、これらに限られるものではないが、種々の感染性ウイルスに由来するものを含むことができる。種々の外因性ワクチン遺伝子を含む組換えポリオウイルスプラスミドは、経口ワクチンとして使用されるキメラポリオウイルスを得るために既知の方法によって、ヒーラ細胞のような、宿主細胞にトランスフェクションされる。配列目録のフリーテキストＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.2 は多重クローニング部位および３Ｃ-プロテアーゼ切断部位をもつＤＮＡ増幅のための合成配列プライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２によってペプチドコード化された人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.４は多重クローニング部位および３Ｃ-プロテアーゼ切断部位をもつＤＮＡ増幅のためのプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.５はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.４によってペプチドコード化された人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.6は多重クローニング部位および３Ｃ-プロテアーゼ切断部位をもつＤＮＡ増幅のためのプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７は多重クローニング部位および３Ｃ-プロテアーゼ切断部位をもつＤＮＡ増幅のためのプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.８はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７によってペプチドコード化された人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９は多重クローニング部位および３Ｃ-プロテアーゼ切断部位をもつＤＮＡ増幅のためのプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１０はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９によってペプチドコード化された人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１１は多重クローニング部位および３Ｃ-プロテアーゼ切断部位をもつＤＮＡ増幅のためのＳstII-センスプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.1２は多重クローニング部位および３Ｃ-プロテアーゼ切断部位をもつＤＮＡ増幅のためのＥagI-アンチセンスプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.1３はcＤＮＡ合成プライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.1４は多重クローニング部位および３Ｃ-プロテアーゼ切断部位をもつＤＮＡ増幅のためのセンスプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１５はセービン１ポリオウイルスのヌクレオチド 797−814 をカバーするＤＮＡ増幅のためのアンチセンスプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１６はＰＣＲ増幅のためのＳstII センスプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１７はＤＮＡ増幅のためのＥagI アンチセンスプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８はＤＮＡ増幅のためのセンスプライマーである人工配列である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１９はＤＮＡ増幅のためのアンチセンスプライマーである人工配列である。そしてＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２０は多重クローニング部位および３Ｃプロテアーゼ切断部位をもつ人工配列である。実施例本発明はさらに種々の実施例により詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。実施例１：組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＣＶ-3ｍの構築プラスミドＰＶＳ(１)ＩＣ-(0)Ｔ（ポリオウイルスセービン１ｃＤＮＡプラスミド；東京大学の Dr．Nomoto からの好意ある行為により得た）は、制限酵素ＥcoＲIを用いて消化し、cＤＮＡを単離した。ｃＤＮＡはプラスミド pＴＺ −18／Ｒ（Pharmacia）のＥcoＲI 部位にクローン化してプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ(1)を構築した。プラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ(1)を、制限酵素ＰstI で消化し、cＤＮＡの大きさを減らし、自己連結を行い、ポリオウイルス cＤＮＡのヌクレオチド配列１−1 813を有するプラスミドサブクローンｐＴＺ-ＰＶＳ(1)／５を生成した。プラスミド pＴＺ-ＰＶＳ(1)／５をE.coli ＣＪ236(dut^-、ung^-、Ｃ^mr)に形質転換し、形質転換体をウリジン0.25μg/mlで補足したＬＢ-amp クロラムフェニコール媒体（ＬＢ、40μg/ml アンピシリン、30μg/ml クロラムフェニコール）に培養した。培養のＯＤ600nm が約 0.5-0.6 に達したとき、細胞をＭ13Ｋ07 ヘルパーフアージ（Pharmacia）のバクテリア当たり 10moi 以上に重感染させ、次いでさらに８時間以上、カナマイシン、チミジンおよびウリジンを用いて補足したＬＢ−amp クロラムフェニコールで培養し、ウラシル組み込み一本鎖ファージミドを得た。ファージミドはＰＥＧ/ＮaＣl（20％ＰＥＧおよび2.5ＭＮaＣl,,ＤＤＷ中）で沈殿させてフェノール／クロロフォルムで抽出し ssＤＮＡを得た。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.2 として示される配列をもつ突然変異原性のプライマー５ｐモルと ssＤＮＡ１μgを１０μlの緩衝液(2ｍＭＭgＣl₂、50ｍＭＮaＣl)20 ｍＭトリス−ＨＣl：ｐＨ7.4）に添加し、70℃の水浴で10分間インキュベーションして30℃まで徐々に冷却してアニーリングした。１μl の 10Ｘ合成緩衝液（５ｍＭの各 dＮＴＰ、10ｍＭのｒＡＴＰ、100ｍＭのトリス-ＨＣl:pＨ7.4、50ｍＭのＭgＣl₂、20ｍＭのＤＴＴ)、３ユニットのＴ4 ＤＮＡリガーゼ（Bio-Rad）および１ユニットのＴ4 ＤＮＡポリメラーゼ（Bio-Rad）を添加し、氷上５時間、25℃５分間、そして37℃90分間逐次反応させた。合成したds-ＤＮＡはＥ.coli ＭＶ1190（dut⁺、ung⁺、Ｃ^mr）に形質転換し、これらの酵素を用いて消化によってＳstII、ＨpaI、およびＥagI の制限部位をもつものに対してスクリーニングした。ＰstI を用いてプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ(1)を消化して得られたｃＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド 1814-7440 をカバーする）は、処理したプラスミド pＴＺ-ＰＶＳ(5)/ｍの対応するＰstI 部位に連結し、組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍを生成した。組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍは３Ｃ-プロテアーゼ切断部位(ＡＸＦＱ/Ｇ)(Dougherty and Se mler,Microbiological Rev57,781-822,1993)および多重クローニング部位（Ｓst II-ＨpaI-ＥagI）を、ポリオウイルスセービン１cＤＮＡの長いポリプロテインの第一と第二のアミノ酸の間の結合にてもつ。新しく挿入した領域はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３のアミノ酸配列を有する。比較例１：組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-ｍの構築ＳＥＱ.ＩＤ.Ｎ０.４の配列をもつ異なる突然変異原性のプライマーを使用したことを除き実施例１と同じ方法に従い、組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-ｍを構築した。組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-ｍは３Ｃ-プロテアーゼ切断部位および多重クローニング部位（ＳstII-ＨpaI-ＥagI）を、ポリオウイルスセービン１ｃＤＮＡのＮ末端の第三と第四のアミノ酸の間の結合にて有する。新しく挿入した領域はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.５のアミノ酸配列を有する。このベクターは、３Ｃ仲介プロセシング中に保持された myristoylation を予期しＧＧ---で始まるウイルス性のポリプロテインのＮ末端をもつように設計した。比較例２：組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-2ｍの構築ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.６の配列をもつ異なる突然変異原性のプライマーを使用したことを除き実施例１と同じ方法に従い、組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-2ｍを構築した。組換えベクタ−ｐＴＺ-ＰＶＳ-2ｍは３Ｃ-仲介プロセシング中にウイルス性ポリプロテインのＮ末端にて、２個の代わりに１個のグアニン（Ｇ）をもつことを除き比較例１のｐＴＺ-ＰＶＳ-ｍに似ている。比較例３：組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ.2m/1の構築２つの点を除いて実施例１と同じ方法に従い、比較例２の組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-2ｍを突然変異原性の鋳型に対し使用し、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.７の配列をもつ異なる突然変異原性のプライマーを使用し、組換えプラスミドｐＴＺ- ＰＶＳ-2ｍ/lを構築した。組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-2ｍ/lは、Ｇ/Ｃのある部位をＡ/Ｔと置換して、比較例１のプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-ｍまたは比較例２のプラスミドｐＴＺ -ＰＶＳ-2ｍよりも低いＧ/Ｃ含量を多重クローニングにおいて有するように設計した。そして、多重クローニング部位はＳstII-ＨpaI-ＸhoI に変化させ、新しく挿入した領域はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.８のアミノ酸配列を有する。比較例４：組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-4ｍの構築ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９の配列をもつ異なる突然変異原性鋳型および突然変異原性プライマーを使用したことを除き実施例１と同じ方法に従い、組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-4ｍを構築した。組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-4ｍは３Ｃプロテアーゼ切断部位および多重クローニング部位（ＡpaI-ＨpaI-ＸhoI）を、セービン１ポリオウイルスｃＤＮＡの長いポリプロテインのＶＰ3 とＶＰ1 との間の結合部位にて有している。新しく挿入した外因性領域はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１０のアミノ酸配列をもつ実施例２：組換えポリオウイルスプラスミドから合成したＲＮＡ転写物の感染力実施例１および比較例１−４のプラスミドを、ＳaII 消化によって線状にし、インヴィトロ転写を行い先に述べたようにＲＮＡ転写物を合成した(Bae et al .,Nucleic Acid Res.,21,2703,1993)。ベンダーのプロトコルに従って（Stratagene Kit）ＤＥＡＥ-デキストラン法によって 10％ＦＣＳ（Fetal Calf Serum）を用い補足したＤＭＥＭ媒体(ＧＩＢＣＯ/ＢＲＬ)中で成長した単分子層ヒーラ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞は、メチルセルロース-ＤＭＥＭ（1.2％メチルセルロースを10％ＦＣＳで補足したＤＭＥＭ媒体に添加して調製した）を用い、37℃のＣＯ₂インキュベーターで２日間培養した。細胞は0.1％クリスタルバイオレットで染色しプラークを観察した。表１に示されるようにプラークの数は、各ＲＮＡ転写物のトランスフェクション能を示す。図３は組換えプラスミドから合成した各ＲＮＡ転写物のトランスフェクションによって生成したプラークの図を示す。表１は、プラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍからのＲＮＡ転写物が、野生型菌株を除いて組換えプラスミドの中でもっとも強い転写能をもつことを示している。組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍはＫＣＴＣ-0365ＢＰの取得番号で1997年８月６日にKorea Conection of Type Culturesに寄託された。実施例３：キメラポリオウイルスプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3m/p24 の構築およびキメラポリオウイルスＰＶＳＳ-3m/p24の生成ＨＩＶ-1 p24のＮ末端169アミノ酸残基をカバーするcＤＮＡフラグメントは、２個のp24−特異的ＰＣＲプライマー:Terwillinger ら(Proc.Nad.Acad.Sci.,86, 3857,1989）によって刊行された配列情報に基づくＳstII-p24 センスプライマー(ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.11)およびＥagI-p24-アンチセンスプライマー(ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.12)、を用いＰＣＲによってＨＩＶ-１ｃＤＮＡ(ＨＸＢ2;ＮＩＨＡＩＤＳ Research and Reference Reagent Program,ＵＳＡ）から増幅した。ＰＣＲフラグメントはアガロースゲルから抽出し、ＳstII およびＥagI で消化し、次いで実施例１のプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍの対応する部位に導入し、図４に示されるように組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3m/p24を構築した。組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3m/p24 から合成したＲＮＡ転写物は実施例２に述べたように単分子層ヒーラ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションしたヒーラ細胞はさらに、完全な細胞変性の効果（ＣＰＥ）が単分子層細胞に検出されるまで37℃ ＣＯ₂インキュベーターにて培養した。培養した上澄みをキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24源として収集した。実施例４：キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24の１ステップ成長曲線ＨＩＶ-1 p24 プロテインを発現するキメラポリオウイルスの複製能を評価するために、１ステップ成長曲線を各時点にて培養上澄みのウイルスカ価を測定して決定した。野生型セービン１ポリオウイルス(ＰＶＳ)、またはＰＶＳ-3ｍ、ＰＶＳ-4ｍ、ＰＶＳ-3m/p24、またはＰＶＳ-4m/p24 の組換えまたはキメラポリオウイルスを、１時間室温にて10moiにて60mm プレート（4.8×10⁵cells）で接種し、ウイルスが細胞に付着できるようにした。細胞はＰＢＳで洗浄し、次いで 3ml のＤＭＥＭを再供給し、次に37℃ ＣＯ₂インキュベーターで培養した。感染後、培養上澄みを３時間ごとに取り出し、Virology a Practical Approach（ｐ13 ed.B y ＢＷＪ Mahy.ＩＲＬ press,1985)に記載されているようなプラークアッセイまたはＴＣＩＤ₅₀アッセイによって各試料からウイルスの滴定を行った。結果を図５に示す。図５に示されるように、組換えポリオウイルスＰＶＳ-3m は複製能において野生型セービン１（ＰＶＳ）よりも低い最大１log であるが、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 は組換えポリオウイルスＰＶＳ-3m のそれと似た複製能を示す。ところが、組換えポリオウイルスＰＶＳ-4m は複製能において野生型セービン１（ＰＶＳ）よりも低い２log 以上であり、p24-組み込みプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-4m/p24は複製コンピテントキメラポリオウイルスＰＶＳ-4m/p24を殆ど生成しない。実施例５：キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 の複製中の外因性p24 プロテインの発現パターンキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 が複製中にＨＩＶ-1 p24 プロテインを発現できるかどうか決定するために、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 をヒーラ細胞に10moi濃度にて接種した。６時間後、細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解緩衝液（80ｍＭＮaＣl)5ｍＭＭgＣl₂、10ｍＭトリス-Ｃl：ｐＨ7. 4、1ｍＭＤＴＴ、0.5％ＮＰ−40）で再懸濁し、５分間氷上に放置し、次いで遠心分離して核と細胞破砕物を除去した。上澄みを等容量の２Ｘ試料緩衝液（50ｍＭトリス：pＨ6.8、１％β−メルカプトエタノール、10％グリセロール、0.03％ブロモフェノールブルー）と混合し、３分間沸騰させ、次いで10％ＳＤＳ-ＰＡＧＥに分離させた。分離した試料は半乾燥トランスブロッター（Bio-Rad）を用いるニトロセルロース膜（Millipore ）に移し、ＡＩＤＳ患者の血清を用いてスクリーニングした。その結果を図６に示す。図５に示されるように、組換えポリオウイルスＰＶＳ-3ｍは複製能が野生型セービン１（ＰＶＳ）よりも最大１log 低いが、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3 m/p24は組換えポリオウイルスＰＶＳ-3ｍのそれと似た複製能を示す。ところが、組換えポリオウイルスＰＶＳ-4ｍは複製能が野生型セービン１（ＰＶＳ）よりも２log 以上低く、p24−組み込みプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-4m/p24 は複製コンピテントキメラポリオウイルスＰＶＳ-4m/p24を殆ど生成しない。実施例５：キメラポリオウイルスＰＶＳ-4m/p24 の複製中の外因性p24 プロテインの発現パターンキメラポリオウイルスＰＶＳ-3mlp24が複製中にＨＩＶ-１ｐ24プロテインを発現できるかどうか決定ために、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 をヒーラ細胞に 10 moi濃度で接種した。６時間後、細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶菌緩衝液（80ｍＭＮaＣl、５ｍＭＭgＣl₂、10ｍＭトリス-Ｃl：ｐＨ 7.4、1ｍＭＤＴＴ、0.5％ＮＰ−40）で再懸濁し、５分間氷上に放置し、次いで遠心分離して核と細胞破砕物を除去した。上澄みを等容量の２Ｘ試料緩衝液（50 ｍＭトリス：pＨ6.8、１％β−メルカプトエタノール、10％グリセロール、0.0 3％ブロモフェノールブルー）と混合し、３分間沸騰させ、次いで10％ＳＤＳ- ＰＡＧＥに分離させた。分離した試料は半乾燥トランスブロッター（Bio-Rad）を用いるニトロセルロース膜（Millipore）に移し、ＡＩＤＳ患者の血清を用いてスクリーニングした。その結果を図６に示す。組換えp24プロテイン(169aa)はウェスタンブロット実験において野生型p24 のそれよりも低いバンド(18.4kＤa)で検出された、これは組換え p24 がキメラポリオウイルスの感染によって生成し、野生型 p24 が混入したのではないことを意味する。従って、図６に示されたその結果は、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 が効果的に、組み込まれたＨＩＶ-1p24 プロテインを発現することができることをはっきりさせている。実施例６：キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 によって発現された外因性ワクチンプロテインの抗原性の維持実施例４でのキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24によって生成したＨＩＶ-1p 24プロテインが野生型 p24 の抗原性を保持できるかどうか決定するため、放射線免疫沈殿アッセイを抗−p24抗体で行った。キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24をヒーラ細胞に 10moi で接種した。感染５時間後、細胞は新しいＤＭＥＭにメチオニン／システイン（ＧＩＢＣＯ/ＢＲＬ）なしで移した。飢餓１時間後、同位体標識メチオニン／システイン[(Ｌ-³⁵ Ｓ)-Ｍet/Ｃys、比活性＞1000Ｃi/mmole；Amersham]を培養基に最終濃度50μＣi /mmole で添加し更に２時間培養した。細胞はトリプシン処理して、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで 500μl の放射線免疫沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（150 ｍＭＮaＣl、１％のＮＰ-40、0.5％のＤＯＣ、0.1％のＳＤＳ、50ｍＭのトリス−Ｃl ｐＨ8.0）を用い氷上 10 分間溶解した。遠心分離後、核と細胞破砕物を除去した。３μl のウサギ抗−p24抗血清を上澄みに添加し、混合物を４℃12 時間反応させた。80μlのＰＢＳ中 10％プロテインＡ-セファローズを反応混合物に添加し、室温で１時間抗体と反応させ、遠心分離してセファローズビーズを回収した。抗原−ビーズコンプレックスを３回ＲＩＰＡ緩衝液で洗浄し、50μ lの１Ｘ試料緩衝液で再懸濁し、３分間沸騰させ、10％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、次いでオートラジオグラムによって感染細胞の溶菌液中抗体−反応性抗原を検出した。その結果を図７に示す。図７の結果は、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 によって生成したＨＩＶ-1ｐ24プロテインはＨＩＶ-1の野生型p24のそれに似た抗原性を得た。実施例７:キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24の遺伝的安定性実施例４のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 の遺伝的安定性を評価するために、ＰＶＳ-3m/p24のキメラ子孫ウイルスはヒーラ細胞に連続して継代培養し、クローニングした遺伝子の統合性はウイルスの各経路から抽出したウイルス性ＲＮＡからＲＴ-ＰＣＲを行うことによって決定した。ウイルス性粒子は最終濃度５％/0.125ＭでＰＥＧ/ＮaＣlを添加して沈殿させた。室温で30分間放置し、混合物は10 分間遠心分離して沈殿させた。ウイルス性ＲＮＡはフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって得られた。抽出したＲＮＡ（10μg）はcＤＮＡ合成プライマー(ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.13)（１μg）と混合し、混合物は70℃で10分間変性させた。混合物はすばやく氷上に移し、逆転写酵素反応溶液(50ｍＭトリス-ＨＣI：ｐＨ8.3、65ｍＭＫＣl、３ｍＭＭgＣl₂、10ｍＭＤＴＴ、1ｍＭｄＮＴＰ混合物、20ユニットのＲＮＡsin) および200ユニットの逆転写酵素のＭＭＬＶ（Moloney Murine Leukemia virus; ＧＩＢＣＯ/ＢＲＬ）を添加し、42℃で60分間反応させた。反応混合物は100℃で３分間保温して酵素を失活させた。ＲＴ-ＰＣＲを行いセービンタイプ１センスプライマー(ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.14 )およびセービンタイプ１アンチセンスプライマー(ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.15)を用いてクローン化した外因性遺伝子を含む処理領域を増幅した。ＲＴ-ＰＣＲは Taq ポリメラーゼ（Bioneer，Korea）で25サイクルを各サイクルに対し94℃にて１分間、45℃にて30秒間、72℃にて45秒間行った。その結果は図８に示される。図８では、666bp で示されるバンドはクローン化した p24 遺伝子(504bp、169 aa)、およびクローニング部位の周りのポリオウイルスゲノムの部分からなる。2 70bp でのバンドは、組換えキメラウイルスのトランスフェクションと継代培養の工程の間にクローン化した p24 遺伝子に若干の内部欠失があることを示唆している。それにもかかわらず、継代培養が進行するにつれて 666bp でのバンド強度が弱められていないその結果は、図８に示されるように、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24が第12番目の継代を超えてクローン化した外因性遺伝子を非常に安定にすることが示唆される。キメラウイルスの遺伝的安定性はまた継代の間にキメラウイルスの p24 発現パターンの分析によって確認された。キメラウイルスの継代中のＨＩＶ-1 p24 プロテインの発現パターンが観察された。ヒーラ細胞は 10moi にて各継代のキメラ子孫ウイルスで接種した。細胞は８時間後に収集し、溶菌液をＳＤＳ-ＰＡＧＥの電気泳動にかけ、ウサギ−p24 抗血清を用いてウエスタンｂロットハイブリッド形成を行ったその結果は図９に示される。図９の結果は、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 が第12番目の継代を超えて常にクローン化したｐ24プロテインを非常に安定に発現することが確認され、組み込まれた外因性遺伝子が継代の間に効率的に保持されることを示している。これら実験結果は、組換えベクター pＴＺ-ＰＶＳ-3ｍの多重クローニング部位にＨＩＶ-1 p24 遺伝子（169aa）を導入することにより得られる、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 が、野生型ＨＩＶ-1p24 プロテインのそれと似た抗原性をもつクローン化した p24 プロテインを効率良く発現できることを実証している。さらに、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 はクローン化した p24 遺伝子の配列を保持し、12継代を超えてｐ２４プロテインの発現レベルを良好に保ち、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24 がクローンとして使用するに充分な遺伝学的安定性があることを示している。本発明のための出発ベクターとして使用されるポリオウイルスのセービンタイプ１が現在まで人間に何らかの不都合な副作用を起こすことが報告されていないことを考慮すると、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p24は、Walker および彼の同僚によって示唆されたように(Science 280,825,1998,Rosenberget al.,Science,278,1447,1997)、ＡＩＤＳに対し強力なＣＴＬ-誘導性粘膜ワクチン候補として使用されることが大いに期待される。本発明について、組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍがＨＩＶ-1 エンベロープグリコプロテインgp120、特にＶ3領域を発現するために有用なワクチンベクターとして使用できるかどうかの可能性を評価した。このようにして、ＨＩＶ-1 gp120のＶ３ループ領域をカバーする125アミノ酸残基に対しコード化する遺伝子は、組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍの多重クローニング部位に導入され、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env を製造した。クローン化した外因性 en v 遺伝子の発現とキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/envの遺伝学的安定性を評価した。実施例８:組換えキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env の構築とキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/envの生成図10に記述したように、ＨＩＶ-1 gp120のＶ3ループ領域を含む125アミノ酸残基(251-375でのenvプロテインのアミノ酸配列)に対しコード化するcＤＮＡフラグメント（375bp）は、ＰＣＲによって増幅され、組換えベクタ−pＴＺ-ＰＶＳ- ３ｍの多重クローニング部位に導入された。２個のプライマー：制限酵素ＳstII とＥagI-認識部位を５′−端および３′ −端にそれぞれ有するＳstII-env-センスプライマー（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.15）およびＥagI-env-アンチセンスプライマー（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.16）を用いて、ＨＸＢ2（ＮＩＨＡＩＤＳ Research and Reference Reagent Program,ＵＳ.から入手）からenv(125aa)遺伝子の設計領域をPCRによって増幅した。ＰＣＲ生成物はＳstIIおよびＥagIで消化し、375bp の遺伝子フラグメントを、実施例１のベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍの対応するＳstIIおよびＥagI部位に導入し、組換えプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3m/envを生成した(図10)。実施例２の方法に従って、プラスミド pＴＺ-ＰＶＳ-3m/p24 をインヴィトロ転写し、ＲＮＡ転写物を 60mm 培養プレートに単分子層にしたヒーラ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションしたヒーラ細胞を２日間37℃ ＣＯ₂インキュベーターにて 10％ＦＣＳを用いて補足したＤＭＥＭ培養基で培養した。完全なCPEが観察されたとき、培養上澄み液を収集しキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env源として使用した。実施例９：キメラポリオウイルスＰＶＳ.3mjenvに対する１ステップ成長曲線ＨＩＶ-1envプロテインを発現するキメラポリオウイルスの複製能を評価するため、実施例４に記載した方法に従い、各時点にて培養上澄み液のウイルス力価を測定して１ステップ成長曲線を決定した。実験を４回繰り返し、その平均を表２に示す。表２に示されるように、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env の複製能は野生型セービン１（ＰＶＳ）のそれよりも最大1log低かったが、ＰＶＳ-3ｍのそれとは似ていた。実施例10:キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/envの複製中の外因性 env プロテインの発現パターンキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env がその成長の間にクローン化した env プロテインを発現するかどうかを決定した。キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/e nvは 10moi でヒーラ細胞に接種した。８時間後、感染した細胞を収集し、10％ＳＤＳ-ＰＡＧＥの電気泳動にかけた。次に、ウェスタンブロツトハイブリツド形成を、ＡＩＤＳ患者の血清を用いて行い、その結果を図１１に示す。図１１に示される結果は、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env が有効にＨＩＶ-1 envプロテイン（125aa,15kＤa）を発現することを確認する。実施例11：キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/envの遺伝学的安定性実施例８のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env の遺伝的安定性を評価するために、ＰＶＳ-3m/envのキメラ子孫ウイルスはヒーラ細胞に連続して継代培養し、クローニングした遺伝子(375bp)の統合性は実施例７に記載したものと同じ方法に従いＲＴ-ＰＣＲを行うことによって決定した。図11に示される結果は、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/envが非常に安定に12番目の継代を超えて外因性遺伝子を運ぶことを説明している。さらに、キメラポリオウイルスの遺伝学的安定性はまた継代中のキメラウイルスのenv発現パターンの分析により確認された。キメラウイルスの継代中の HIV-1 env プロテインの発現パターンは、ウェスタンブロットハイブリッド形成のためのＡＩＤＳ患者の血清を使用したことを除いて、実施例７に記載したものと同じ方法で決定された。その結果を図 12 に示す。図 12 の結果は、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/envが 12 継代を超えて一定にクローン化した env プロテイン(125aa)を発現し、クローン化した遺伝子が継代中に有効に保持されることを確かめさせる。これらの実験結果は、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env が、ＨＩＶ-1 env 遺伝子（125aa）を組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍの多重クローニング部位に導入することにより得られ、クローン化した env 遺伝子を有効に発現できることを実証する。さらに、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env は、クローン化した env 遺伝子の完全配列を保持し、12継代を超えて env プロテインの発現レベルを良好に保ち、ワクチン候補のためのクローンとして使用するに充分なほど遺伝学的に安定であることを示していることが実証される。本発明の出発ベクターとして使用されるポリオウイルスのセービンタイプ１菌株は、現在まで人間に何らかの不都合な副作用を起こすことが報告されていないことを考慮すると、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/env は、ＡＩＤＳに対し強力な経口粘膜ワクチンとして使用されることが大いに期待される。上記のように、本発明の組換えベクタ−ｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍが多重クローニング部位および３Ｃ−プロテアーゼ切断部位を持ち、組換えセービン１ポリオウイルスに種々の外因性ワクチン遺伝子を導入することを容易にし、セービン１ポリオウイルスの長所を生かすことにより幾つかの感染性ウイルス病に対し経口ワクチンとして使用できる遺伝学的に安定なキメラポリオウイルスの生成を容易にする。本発明について、組換えベクタ−ｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍをＡＩＤＳとは別の感染性ウイルス病に有用なワクチンベクターとして応用できる可能性を評価するため、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶc）のコアプロテインコード化遺伝子を組換えベクターpＴＺ-ＰＶＳ-３ｍにクローニングした。このようにして、Ｎ-末端の 100 アミノ酸残基に対し一部のコア遺伝子を、組換えベクターpＴＺ-ＰＶＳ-３ｍの多重クローニング部位に導入し、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc を生成した。クローン化した外因性ＨＣＶc 遺伝子の発現とキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc の遺伝学的安定性を評価した。実施例 12:キメラポリオウイルスプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3m/ＨＣＶc の構築とキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcの生成Ｎ-末端コアの 100 アミノ酸残基に対しコードするＨＣＶc 遺伝子をＰＣＲによって増幅し、図13に記載したように、組換えポリオウイルスｐＴＺ-ＰＶＳ -3ｍの多重クローニング部位に導入した。２個のプライマー：ＳstII-ＨＣＶc-センスプライマー（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.17 ）とＥagI-ＨＣＶc-アンチセンスプライマー（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.18）を用いて、pcＤＮＡ/Ｎeo −ＨＣＶコアプラスミド（Postech,Korea の Dr.Sung の好意により入手）の鋳型からＨＣＶコア遺伝子（300bp、100aa）の設計領域をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物はＳstIIとＥagIで消化し、300bpの遺伝子フラグメントを実施例１のプラスミドｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍの対応するＳstII とＥagI 部位に導入して、組換えプラスミドpＴＺ-ＰＶＳ-3m/ＨＣＶcを生成した(図13)。実施例２の方法に従って、プラスミド pＴＺ-ＰＶＳ-3m/ＨＣＶc をインヴィトロ転写し、ＲＮＡ転写体を 60mm 培養プレート中で単分子層のヒーラ細胞にトランスフェクションした。形質転換したヒーラ細胞を２日間37℃ ＣＯ₂ インキュベーターで 10％ＦＣＳを用いて補足したＤＭＥＭ培養基で培養した。完全なＣＰＥが認められたとき、培養上澄みを収集し、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc源として使用した。実施例 13：キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcのための１ステップ成長曲線ＨＣＶコアプロテインを発現するキメラポリオウイルスの複製能を評価するために、実施例４に記載した方法に従って各時点での培養上澄み液のウイルス力価を測定して１ステップ成長曲線を決定した。その結果をあ表３と図 14 に示す。表３の値は４回繰り返した実験から平均化した。表３と図 14 に示されるように、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcは1 2時間後に野生型（ＰＶＳ）のそれよりも最大 10 倍低い複製能を示す。キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcの平均複製能は野生型セービン１のそれよりも約５０倍低く、組換えポリオウイルスＰＶＳ-3ｍのそれよりも３倍低い。実施例14：キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcのＲＮＡ合成先の報告（Mottion et al.,J.Virol.68,3925,1994）に従い実験を行った。24 穴プレートで清澄したヒーラ細胞を 10moi の野生型とキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcでmock感染または感染させた。１時間室温で吸着後、細胞をＰＢＳで洗浄し、アクチノマイシンＤ（5μg/ml,Difco）を含むＤＭＥＭに供給した。１時間 37℃でインキュベーションした後、25μＣi/ml の［5,6-³Ｈ］−ウリジン（Amersham;比活性 45Ｃi/mmole）を添加した。細胞を３時間ごとに集め、３回ＰＢＳで洗浄し、次いで0.5mlの溶菌緩衝液(80ｍＭＮaＣl)５ｍＭＭgＣ l₂、10ｍＭトリス-Ｃl8.2、1ｍＭＤＴＴ、10ｍＭバナジルリボヌクレアーゼコンプレックス、および0.5％のＮＰ-40)を添加して５分間氷上で溶解した。トリクロロ酢酸を溶菌液に最終濃度20％まで添加して、溶菌液を30分間氷上でインキュベーションした。試料はグラスファイバーフィルター（Whatsman,ＧＦ-Ｃ fil ter）で濾過し、放射能をシンチレーション検出器（Hewlett Packard）で測定し、その結果は表４に示す。表４に示すように、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcのＲＮＡ合成の速度論が野生型（ＰＶＳ）または、感染６時間後のレベルを除いて感染ヒーラ細胞における組換えＰＶＳ-3ｍのパターンとほぼ同じである。その結果は、実施例13のキメラウイルスの一層低い複製能（約５倍低い）が、減少したＲＮＡ合成によるものではなく、集合ステップでのキメラウイルスの不十分なプロテイン処理に原因があるらしいことが示唆される。結論すると、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc は野生型または組換えウイルスのそれに似たＲＮＡ合成能をもち、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/p 24の減少した複製能（野生型よりも約５倍低い）は経口ワクチンとしてキメラポリオウイルスを使用するために不利な影響を与えない。実施例15:キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcの複製中の外因性ＨＣＶc ブロテインの発現パターンキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc が増殖中にＨＣＶコアプロテインを発現するかどうかを決定するために、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc を単分子層ヒーラ細胞に 10moi で１時間接種し、吸着しなかったウイルスを除去した。感染細胞をさらに37℃ ＣＯ₂インキュベーターで培養した。細胞を８時間後に集め、10％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで電気泳動にかけた。ウェスタンブロットハイブリッド形成は、ウサギ抗血清（Hallim大学、KoreaのDr.Hwangの好意により入手）またはＨＣＶコアプロテイン(Bio-genesis,Sandown,Korea)に対するモノクロナール抗体で行い、その結果を図15に示す。図15（レーン３）に示したウェスタンブロットのシグナルから本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m /ＨＣＶc がクローン化したＨＣＶコアプロテイン（100aa、12kＤa）を良く発現することを確認した。図15において、所望の 12kＤaの１個とは別のいくつかのバンドは、ＨＣＶコアプロテインのＮ−末端で疎水性の残基によって疎水性細胞オルガネラに融合したＨＣＶコアプロテインに起因すると思われる。この仮定を確認するために、組換えウイルスペレット(レーン４)、ウイルスを含まない培養上澄み濃縮物(レーン５)、またはキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc感染ヒーラ細胞の細胞溶菌液の沈殿物（レーン６）または細胞溶菌液の上澄み液（レーン７）を、同じ抗血清を使用するウェスタンブロットハイブリッド形成によって分析した。細胞溶菌液の沈殿物（レーン６）と上澄み液（レーン７）は、１％ＮＰ-40 で感染細胞を処理して得られた。図15に示すように、感染ヒーラ細胞溶菌液の沈殿物（レーン６）と上澄み液（レーン７）のみが、特異的抗血清でスクリーニングしたとき抗原バンドのシグナルを示し、このシグナルは抗血清の非特異的反応に起因することを示唆している。さらに、沈殿留分（レーン６）が一層明らかな強いバンドを 12kＤa で示すという事実は、さらにその仮定を説得力のあるものにする。これらの結果は、一部は小胞体のルーメンにＨＣＶの集合が起きるが、細胞質には起きず、膜結合小胞を形成するという先の報告と一致する(Dubission et al .,1994)。ＨＣＶコアプロテイン細胞オルガネルコンプレックスが組換えウイルスの複製に影響を与えないならば、コンプレックスはＨＣＶに対して体液の免疫とともにＣＴＬ免疫を誘導する効果がさらにあるであろう。実施例16: キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcの遺伝学的安定性実施例12のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶcの遺伝学的安定性を評価するために、ＰＶＳ-3m/ＨＣＶc の子孫ウイルスをヒーラ細胞中で連続して継代培養し、クローン化した遺伝子（300bp）の結合性を実施例７に記載したものと同じ方法でＲＴ-ＰＣＲを行って決定した。結果を図16に示す、図において 459bp での強いバンドは明らかに継代の数にかかわらず各試料ではっきりした。ＰＶＳ-3m/p24 で示されたような内部欠失によるバンドはなく、継代培養中に挿入が検出された。従つて、図16の結果は本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶが非常に安定に12継代を超えて外因性遺伝子を運ぶことをはっきりさせる。さらに、キメラポリオウイルスの遺伝子学的安定性はまた継代培養中のキメラウイルスのＨＣＶ発現パターンの分析によっても確認された。組換えウイルスの継代培養中のＨＣＶコアプロテインの発現パターンは、ウェスタンブロットハイブリッド形成のためのＨＣＶコアプロテイン（Bio-genesis, Sandown,NH,ＵＳＡ）に対しモノクローナル抗体を使用したことを除き、実施例７に記載したものと同じ方法で決定した。図 17 に示した結果は 12 番目の継代を超えて常にＨＣＶコアプロテイン(100aa)をキメラポリオウイルスＰＶＳ-3 m/ＨＣＶcが発現することを支持する。これらの実験結果は本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc が、組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍの多重クローニング部位にＨＣＶコア遺伝子( 100aa)を導入して得られ、クローン化したＨＣＶコア遺伝子を有効に発現することを実証する。さらに、クローン化したＨＣＶコア遺伝子の完全な配列を維持し、12番目の継代を超えてＨＣＶコアプロテインの発現レベルを良好に保持し、キメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc がＨＣＶワクチン候補のためのクローンとしてしようされるに充分な遺伝子学的安定性を示す。ポリオウイルスのセービン１菌株は、本発明の出発ベクターとして使用され、現在までに人間に何ら不利な副作用を与えることは報告されておらず、本発明のキメラポリオウイルスＰＶＳ-3m/ＨＣＶc はＨＣＶに対し強力な経口粘膜ワクチンとして使用されることが大いに期待される。上記のように、組換えベクターｐＴＺ-ＰＶＳ-3ｍは多重クローニング部位と３Ｃプロテアーゼ切断部位を持ち、種々の外因性ワクチン遺伝子を組換えセービン１ポリオウイルスに導入することが容易であり、セービン１ポリオウイルスの利点をつかって種々の感染性ウイルス病に対し経口ワクチンとして使用できる遺伝子学的に安定なキメラポリオウイルスを容易に製造する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリオウイルスｃＤＮＡのセービンタイプ１のＮ末端の第一と第二のアミノ酸の結合にて多重クローニング部位および３Ｃ−プロテアーゼ切断部位に対しコーディングする配列を含む複製コンピテント組換えセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。２．前記多重クローニング部位および３Ｃ−プロテアーゼ切断部位に対しコーディングする配列がＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.19 である、請求項１記載の複製コンピテント組換えセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。３．ベクター pＴＺ−ＰＶＳ-3ｍ（ＫＣＴＣ-0365ＢＰ）である、請求項１または２記載の複製コンピテント組換えセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。４．外因性ワクチン遺伝子および複製コンピテントベクターを含み、前記ベクターが請求項１記載の複製コンピテント組換えセービンタイプ１ポリオウイルスベクターであり、前記ワクチン遺伝子の挿入体がその多重クローニング部位に導入される、複製コンピテントキメラセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。５．前記ワクチン遺伝子が感染ウイルスから誘導される、請求項４記載の複製コンピテントキメラセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。６．前記感染ウイルスがＨＩＶ-1 である、請求項５記載の複製コンピテントキメラセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。７．前記感染ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項５記載の複製コンピテントキメラセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。８．前記ワクチン遺伝子がＨＩＶ-１p24 遺伝子である、請求項４記載の複製コンピテントキメラセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。９．前記ワクチン遺伝子がＨＩＶ-１gp 120のV3ループを含むエンベロープグリコプロテイン遺伝子である、請求項４記載の複製コンピテントキメラセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。１０．前記ワクチン遺伝子がＨＣＶコア遺伝子である、請求項４記載の複製コンピテントキメラセービンタイプ１ポリオウイルスベクター。１１．請求項１記載の複製コンピテント組換えセービンタイプ１ポリオウイルスベクターでトランスフェクションした宿主細胞。１２．請求項４記載の複製コンピテントキメラセービンタイプ１ポリオウイルスベクターでトランスフェクションした宿主細胞。１３．前記ワクチン遺伝子が感染ウイルスから誘導される、請求項１２記載の宿主細胞。１４．前記感染ウイルスがＨＩＶ-1 である、請求項１３記載の宿主細胞。１５．前記感染ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項１４記載の宿主細胞。１６．前記ワクチン遺伝子挿入体がＨＩＶ-１p24 遺伝子である、請求項１５記載の宿主細胞。１７．前記ワクチン遺伝子挿入体がＨＩＶ-１gp 120 の V3 ループを含むエンベロープグリコプロテイン遺伝子である、請求項１６記載の宿主細胞。１８．前記ワクチン遺伝子挿入体がＨＣＶコア遺伝子である、請求項１２記載の宿主細胞。１９．宿主細胞を請求項１記載のベクターでトランスフェクションし感染した細胞を得る工程；感染した細胞を培養基で培養し子孫ウイルスを得る工程；および子孫ウイルスを培養上澄みから収集する工程からなる、請求項１記載の複製コンピテント組換えセービンタイプ１ポリオウイルスベクターの製造方法。２０．宿主細胞を請求項４記載のベクターでトランスフェクションし感染した細胞を得る工程；感染した細胞を培養基で培養し子孫ウイルスを得る工程；および子孫ウイルスを培養上澄みから収集する工程からなる、請求項４記載の複製コンピテントキメラセービンタイプ１ポリオウイルスベクターの製造方法。