JPH05508324A

JPH05508324A - ハイブリッド形態の新規可溶性、非開裂性ｇｐ１６０変異体

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Publication number: JPH05508324A
Application number: JP4509833A
Authority: JP
Inventors: キーニー　マリー―ポール
Original assignee: トランスジーンソシエテアノニム
Priority date: 1991-05-02
Filing date: 1992-04-30
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2018-10-06
Also published as: DK0541753T3; FR2676071A1; EP0541753A1; CA2086509C; GR3023070T3; FR2676071B1; CA2086509A1; US6284248B1; ES2099257T3; SG44828A1; EP0541753B1; WO1992019742A1; JP3453611B2; US6261799B1; ATE149203T1; DE69217614T2; DE69217614D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ハイブリッド形態の新規可溶性、非開裂性ｇｐ１６０変異体本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発生させるウィルスに対して、免疫保護応答を誘導することができる新しい分子の製造に必要とされる手段を構成する方法に関する。

個体において、この病気は、ＨＩＶ　（ヒト免疫不全ウィルス）レトロウィルスによるＴ−ヘルパーリンパ球の感染に引続いて、発生する。現在までのところ、これらのレトロウィルス類は、２つの主なタイプに分類されている：基本的にヨーロッパおよび北米で猛威を振るっているＨＩＶ−１タイプと、アフリカでの感染に特徴的なＨＩＶ−２タイプとにである。同一タイプ内でも、Ｈ■Ｖレトロウィルス類は、互いにある程度の多様性を示す。

この多様性は、例えば、細胞栄養特性の相違により、または互いに僅かに異なるウィルス蛋白質により、特徴付けられる。この理由から、特定のＨＩＶレトロウィルスに言及する必要がある場合には、“ウィルス株”という語を使用することが好ましい。

一般的ニ言って、ＨＩＶレトロウィルス類は、以下の構造を有している。ニゲツムＲＮＡ分子および種々の結合する蛋白質は、蛋白質性のキャプシド（ヌクレオキャプシド）により、囲まれている（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）　。その全体は、ウィルス起源のエンベロープ蛋白質を組み込んだ細胞起源の膜により、保護されている。

種々の形態のこのエンベロープ蛋白質は、現在エイズに対するワクチンの有望な治療成分であると考えられている。

自然的な条件下では、エンベロープ蛋白質（ｅｎｖ　）は、当初そのＮ−末端にシグナル配列を含む前駆体の形態で合成される。このシグナル配列は、前駆体から小胞体（分泌経路）への通過を開始させる。このシグナルペプチドは、次いで蛋白質分解切断により、除去される。この切断の生成物は、ｇｐ１６０と呼ばれる蛋白質であり、これは、それ自身引続いて切断されて、ｇｐ４０という小サブユニットとｇｐ１２０という大サブユニットとになる。ｇｐ１２０のＮ−末端は、ｇｐ１６０のＮ−末端に対応し、一方ｇｐ４０のＣ−末端は、ｇｐ１６０Ｌ：ｖＣ−末端に対応する。

これらのサブユニットのそれぞれは、感染した細胞から分泌される。しかしながら、ｇｐ４０は、そのトランスメンブラン　ドメインを介して、細胞膜に固定されている。そのＣ−末端部分（細胞質内ドメイン）は、細胞質と接触し続けるのに対し、そのＮ−末端部分（細胞質外ドメイン）は、細胞表面に位置する。ｇｐ１２０サブユニットは、細胞外に放出されて、ｇｐ４０サブユニットの細胞外ドメインと相互作用する。エンベロープ蛋白質の２つのサブユニットは、かくして、コンプレックスの形態で、関連し続ける。

種々のウィルス株のｅｎｖ蛋白質の前駆体のアミノ酸配列は、現在知られている。例えば、図１は、ウィルス株ＨＩＶ−Ｉ　Ｂｒｕ、ＨＩＶ−Ｉ　ＭＮ、ＨＩＶ −ＩＥＬＩ、ＨＩＶ−Ｉ　ＲＦ、ＨＩＶ−Ｉ　５Ｆ２ＣおよびＨＩＶ−Ｉ　ＳＣのｇｐ１６０蛋白質の前駆体の配列を示す。同様に、図２は、ウィルス株ＨＩＶ、−２Ｒ。

ｄのｇｐ１６０蛋白質の前駆体の配列を示す。

これ以降の記載においては、理解を容易とするために、ウィルス株ＨｒＶ−Ｉ　Ｂｒｕのｇｐ１６０以外のｇｐ１６０蛋白質の配列は、ウィルス株ＨＩＶ−３，Ｂｒｕのｇｐ１６０　（以後ｇｐ１６０−Ｂｒｕという）の配列を参照しつつ、説明する・ａ）　ｇ　１）　１６０−Ｂ　ｒ　ｕは、８３１個のアミノ酸を有しており、これらは、１から８３１までの番号を付されている。さらに、ｇｐ１２０−Ｂｒｕは、ｇｐ１６０−Ｂｒｕの最初の４８６個のアミノ酸の配列に対応する。

一方、ｇｐ４０　Ｂｒｕは、４８７位のアミノ酸から始まり、８３１位のアミノ酸で終わる配列に対応する。

ｂ）　他の種類のｇｐ１６０の配列は、最大の相同性を示す様に、ｇｐ１６０− Ｂｒｕの配列と並べられる。この目的のために、ギャップ（ｇａｐｓ）をｇｐ１６０−Ｂｒｕの配列または他の種類のｇｐ１６０の配列に導入しても良い。定義により、他の種類のｇｐ１６０中のアミノ酸の位置は、ｇｐ１６０−Ｂｒｕ中の相同アミノ酸の位置により、同様な方法で特定される。

Ｃ）　その結果、ギャップが他の種類のｇｌ）１６０の配列に導入された場合には、その位置Ｘのアミノ酸に対応するｇｐ１６０の配列中の位置Ｘには、アミノ酸は、存在しない。しかしながら、このアミノ酸は、実際に存在するものと見なされる。

ｄ）　アミノ酸の位置Ｘと位ａＸ＋１との間で、ｇｐ１６’　Ｏ−Ｂ　ｒ　ｕの配列に１個または２個以上のギャップが導入された場合には、他の種類のｇｐ１６０において、その位置は、少なくとも２個のサブポジションＸ　ＸＸ５、・・・・・・、Ｘ　（これらのそれぞれは、１個のアミノ酸により占められている）をカバーするものと見なされる。

定義により、下流の位置Ｘ　は、位置Ｘを表す。

ｅ）　位置１のアミノ酸の上流側において、ｇｐ１６０−Ｂｒｕの配列に１個または２個以上のギャップが導入された場合には、他の種類のｇｐ１６０においては、その位置ｌは、少なくとも２個のサブポジション１．１５、・・・・・・、１　（これらのそれぞれは、１個のアミノ酸により占められている）をカバーするものと見なされる。

定義により、ＮＦ２−末端の上流の位置１ｎは、位置１を示す。

ｆ）　ｇｐ１６０−ＢｒｕのＮＦ２−末端の１個乃至２個以上のアミノ酸に対応して、他の種類のｇ　ｐ　１６０　ニ１個または２個以上のギャップが導入された場合には、定義により、他の種類のｇｐｉｓｏ中のＮ　Ｈ２−末端におけるアミノ酸は、同時に位置１および相同アミノ酸の位置を占めることに注意すべきである。

ｇ）　ｇｐ１６０−ＢｒｕのＣ００Ｈ−末端の１個乃至２個以上のアミノ酸に対応して、他の種類のｇｐ１６０の配列に１個または２個以上のギャップが導入された場合には、定義により、他の種類のｇｐ１６０中のＣ００Ｈ−末端におけるアミノ酸は、同時に位置８４１および相同アミノ酸の位置を占めることに注意すべきである。

現在のところ、ワクチンに関しては、エンベロープ蛋白質は、治療的な観点から、有望な候補の１っである。

しかしながら、その自然状態での長鎖構造は、実用性の点で、ハンディキャップとなる。この理由から、ｇｐ１２０のエピトープとｇｐ４０とのエピトープの多くを保持するであろう単一鎖蛋白質を利用することがより好ましいと思われてきた。この種の蛋白質は、特許公報ＷＯ３７／６２６０に開示されている。これは、より詳しくは、非開裂性で可溶性のｇｐ１６０の変異体（ｖａｒｉａｎｔ　）である。

ＨＩＶ−１タイプのウィルス株の全てのｇｐ１６０蛋白質は、位置４８３−４８６に、１または２以上の蛋白質分解酵素により認識される、いわゆる主開裂サイト（ｍａｊｏｒ　ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ　）を有している。この主開裂サイトは、Ｆｉｇｕｒｅｌに示すｇｐ１６０蛋白質の全てについて同じであり、配列Ａｒｇ−Ｇ　１　ｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　（ＲＥＫＲ）に相当する。

蛋白質分解酵素は、この主開裂サイトの直ぐ下流を切断して、ｇｐ１２０およびｇｐ４０を遊離する。

この開裂サイトが、そこに存在しない場合には、効率は低いものの、蛋白質分解酵素は、いわゆる副開裂サイト（ｍｉｎｏｒ　ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ　）を認識し、その直ぐ下流で切断する。この開裂サイトについても、図１に示す全てのｇｐ１６０蛋白質について同じである。これは、ある研究者によれば、４７７〜４７９位に位置する配列Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　（ＫＲＲ）に対応しており、他の研究者によれば、４７５〜４７８位に位置する配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　（ＫＡＫＲ）に対応している。

さらに、ＨＩＶ−２タイプのウィルス株のｇｐ１６０蛋白質は、４７５〜４７８位に配列Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（ＫＥＫＲ）に対応する主開裂サイトのみを有していることに注意すべきである。

非開裂ｇｐ１６０変異体は、天然のｇｐ１６０の人工的類似体である。そのアミノ酸配列は、主開裂サイトおよび／または副開裂サイトが除去された天然のｇｐ１６０のアミノ酸配列に対応する。この様なｇｐ１６０変異体は、組替えＤＮＡ手法により、合成することができる。

これは、天然のｇｐ１６０をコードするＤＮＡフラグメントを単離し、次いで定方向突然変異により主開裂サイトをコードする領域を修正して、蛋白質分解作用に対して感応しないｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡフラグメントを得るだけで十分である。この様にして得られたＤＮＡフラグメントは、次いで、上記ｇｐ１６０変異体を形成するに適した条件下に発現される。主開裂サイトをもはや含まないこの様なｇｐ１６０変異体を以後タイプＡ非開裂ｇｌ）１６０変異体というものとする。

さらに、好ましくは、副開裂サイトをコードする領域を同様な目的で修飾しても良い。この様な条件下では、主開裂サイトおよび副開裂サイトのいずれをも含まないタイプＡ′非開裂ｇｐ１６０変異体が得られる。

この目的のためには、例えば、開裂サイトＲＥＫＲ，ＫＥＫＲまたはＫＡＫＲおよび開裂サイトＫＲＲのそれぞれを配列Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ　（ＮＥＨＱ）およびＧｌｎ−Ａｓｎ−Ｈｌｓ　（ＱＮＨ）により、置き換えても良い。

さらに、ｇｐ１６０を溶解型として得ることも必要である。この様なｇｐ１６０は、疎水性のトランスメンブラン領域が除かれた天然のｇｐ１６０に相当する。

このトランスメンブラン領域は、ｇｐ４０に相当するゾーン中の６５９位のアミノ酸残基から６８０位のアミノ酸残基に位置する。さらに、必須ではないが、４８７位のアミノ酸残基から５１４位のアミノ酸残基にまで伸びる他の疎水性領域を除去することも、出来る。

同様に、溶解性のｇｐｉ６ｏ変異体の合成に必要な手段は、明らかに対応するＤＮＡフラグメントを含む。これは、原ＤＮＡフラグメントの修飾により、得なければならない。

公知の異なるｇｐ１６０蛋白質の配列の比較により、その配列が相互に高変異性である少なくとも３つのドメインがあることが示されている。これらの３つのドメインは、通常Ｖ１、ｖ２およｑＶ３ドメイン（またはループンと称されている。

初めの２つのドメイン、ｖｌおよびｖ２は、９６位のシスティン残基と１７１１位のシスティン残基との間に位置しているのに対し、第３のドメインｖ３は、２７１位のシスティン残基と３０６位のシスティン残基との間に位置している。

さらに、程度はより低いと考えられているものの、ある程度の可変性を示す最終ドメインがある。これは、Ｔ−ヘルパーリンパ球のＣＤ４レセプターへの結合部位である；これは、はぼ３４０位のアミノ酸残基と４４０位のアミノ酸残基との間に位置している。

どのｇｐ１６０を使用するかに関わりなく、ワクチン接種実験によれば、第３の高変異性ドメインが、適切な免疫を得るために、必要であることが判明した。しかしながら、このドメインの高変異特性の故に、実現した保護は、使用したｇｐ、１６０から派生するウィルス株に対してのみ有効であろう。

最後に、第１および第２の高可変性ドメインならびにＣＤ４レセプター結合部位は、得られる免疫の程度に影響する様に思われる。

一般的な有用性を有するワクチンは、世界で蔓延しているＨ　Ｉ　Ｖウィルス株の多数に対する保護をヒトに与え得るものでなければならない。従って、ｇｐ１６０に基くワクチンは、個々の異なるウィルス株から得られた種々のｇｐ１６０蛋白質を含んでいなければならない。その様なワクチンを採用するためには、先ず第一に、各ウィルス株に対応する、非開裂性で且つ可溶性のｇｐ１６０変異体の製造用の手段を構築することが適切である。

従って、第１のアプローチとして、この操作は、以下の工程を含むであろう；いずれの場合にも、特定のウィルス株のｇｐ１６０をコードするＤＮＡフラグメントをクローン化する；その配列を決定する；置換または欠失により開裂部位および疎水性領域を除（ために、このＤＮＡフラグメントを修飾する；最後に、この様にして修飾されたＤＮＡフラグメントを発現に適した適切な条件下におく。このタイプの操作は、各ｇｐ１６０について繰り返さなければならないので、この様なワクチンの調製は、長時間を要し、高価になるものと予測される。

さらに、ウィルス株は、時間の経過とともに、例えば変異により、変化することがある。特定の時期に世界の特定の地域で感染の主な原因となっている特定の株は、感染菌としては、力が弱まり、他の特定の株がこれにとって代わる。従って、ワクチンを疫学的条件に急速に適合させ得ることが重要である。本発明に関しては、可能な限りの短時間内にｇｐ１６０変異体を入手し得ることが重要である。

この目的のために、問題となっているウィルス株の如何に関わらず、適切なｇｐ１６０変異体を得るための新しい方法が、見出された。第１のウィルス株から得られる非開裂性で且つ可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ　）のｇｐ１６０変異体の製造用の発現カセットが入手可能となりさえすれば、第２のウィルス株のｇｐ１６０をコードするＤＮＡフラグメントの完全なりローン化を回避しつつ、第２のウィルス株に由来する同様な変異体を得ることを可能にし、さらにこれから得られるであろう改良を可能にする。

従って、本発明は、非開裂性で且つ可溶性のｇｐ１６０変異体の前駆体または非開裂性で且つ可溶性のハイブリッドｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法を提供する。この変異体は、以下のアミノ酸配列を備えている：１）　第１のＨＩＶウィルス株のｇｐ１６０から得られ且つこのｇｐｉｓｏ中においてＸ位のアミノ酸からＹ位のアミノ酸までの間に位置する第１の領域（ここに、Ｘは１〜２７１の数であり、Ｙは３０６〜４８２の数である）；ｉｉ）　第２のＨｒＶウィルス株に由来するタイプＡの非開裂性で可溶性のｇｐ１６０変異体から得られ且つこのｇｐ１６０変異体中においてＹ＋１位のアミノ酸からＣ−末端のアミノ酸までの間に位置する第２の領域（ここに、Ｙは上記に定義した通りである）；および１ｉｉ）　Ｘが１以外の数である場合には、上記第２のＨＩＶウィルス株のｇｐ１６０から得られ且つこのｇｌ１６０中において１位のアミノ酸からＸ−１位のアミノ酸までの間に位置する第３の領域（ここに、Ｘは上記に定義した通りである）。

また、上記のＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための本発明方法は、以下の工程を備えている：ａ）　上記第１の領域をコードするＤＮＡフラグメントをクローン化する工程；およびｂ）　上記ａ）工程においてクローン化されたＤＮＡフラグメントを以下の構成を有するカセットの１つのサイト（ｓｉｔｅ）に挿入する工程：ｍ）　該サイトの上流側にあり、以下の配列を有するもの：ｉ）　プロモーター、ｉｉ）　翻訳開始コドン１ｉｉ）　必要ならば、シグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ領域、およびｉｖ）　Ｘが上記に定義した数であるが１以外である場合には、上記ハイブリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の上記第３の領域をコードする第２のＤＮＡ領域；およびｎ）　該サイトの下流側にあり、以下の配列を有するもの：ｉ）　Ｙが上記に定義した数である場合には、上記ハイブリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の上記第２の領域をコードする第３のＤＮＡ領域、およびｉｉ）　翻訳停止コドン。

この様な発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　）は、異種の発現システムにおいて可溶性で、非開裂性のハイブリッドｇｐ１６０変異体の製造を可能とするために、不可欠のツールである。

本発明の方法によれば、上記第１領域をコードしているＤＮＡフラグメントは、一般に用いられている任意の方法に従ってクローン化することができる。しかし、ＨＩＶウィルスの上記第２株に感染された細胞のゲノムＤＮ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ）から始まるＰＣＲ技術を使用すれば、当該クローニングがより有利に実施され得ることは注目に値する。クローン化されたＤＮＡフラグメントは、カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ　）に最初から存在しているか、又は例えばポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ　）を適宜使用してこの目的のために作成された制限サイト（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓ）において挿入（１ｎｓｅｒｔｉｏｎ）される。該方法の説明は、以下の実施例にて示す。

“ある種類のポリペブタイドをコードしているＤＮＡユニット（ＤＮＡ　ｕｎｉｔ　）”とは、５′位の第１コドン及び３′位の最終コドンに、それぞれポリペブタイドのＮ−末端位の最初のアミノ酸及びＣ−末端の最後のアミノ酸をコードしているＤＮＡ分節（ｓｅｇｍｅｎｔ）を意味する。

より有利な実施態様によれば、非開裂性（ｎｏｎ−ｃｌｅａｖａｂｌｅ）且つ可溶性ハイブリッドｇｐ１６０変異株（ｖａｒｉａｎｔ）の前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）をコードしているＤＮＡユニットを含む発現カセットを作成するために、本発明の方法が実施される。

“本発明のｇｐ１６０変異体の前駆体“とは、シグナルベプタイド及び成熟した（　ｍａｔｕｒｅ　）　ｇｐ　１６０変異体を含むポリペブタイドを意味する；該変異体のＮ−末端は、シグナルベプタイド（ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｃｌｅ　）のＣ−末端とペプチド結合を介して結合している。この前駆体は、該ＤＮＡユニット発現による最初の生成物である。

これは特に、宿主細胞の細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）中に、Ｎ−末端位で翻訳開始メチオニン残基（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　１ｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｒｅｓｉｄｕｅ）と結合して存在している。

シグナルペプタイドは、ｇｐ１６０変異体の開始の小胞体への転移を可能とする。この転移の際、該シグナルペプタイドはタンパク分解開裂（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｃｌｅａｖａｇｅ　）により切断され（ｒｅｌｉｎｑｕｉｓｈｅｄ　）　、ｇ　ｐ　１６０変異体の成熟型（ｍａｔｕｒｅ　ｆｏｒｍ）が生成される。

以下本文において１　″ｇｐ１６０変異体（ｖａｒｉａｎｔ　）　”なる用語は全てその成熟型を意味するものである。

シグナルペプタイドは、慣用されている任意のシグナルペプタイドで良い。しかしシグナルペプタイドは、本発明のｇｐ１６０変異体を製造するための宿主微生物を考慮して、選ばなくてはならない。例えば、宿主微生物が哺乳類の細胞である場合、本発明変異体の第１、第２及び第３領域の起源（ｏｒｉｇｉｎ　）とは無関係に、ＨＩＶウィルスと異なった株のｇｐ１６０タンパク前駆体のシグナルベプタイドから選ぶと有利である。或いは、合成シグナルペプタイドを使用することもできる。そのようなシグナルペプタイドとしては、例えばＮ−末端がＨｆ ■ウィルスの上記第２株のｇｐ１６０の前駆体に由来し、Ｃ−末端がＨＩＶウィルスの上記第１株のｇｐ１６０の前駆体に由来しているハイブリドシグナルベプタイドが挙げられる。参考までに、狂犬病ウィルス（ｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ　）株のグリコプロティンの前駆体のシグナルペプタイドも使用することができることを、さらに付は加えておく。最後に、ここに挙げた事項がこれに限定されるものでないことは、当業者にとっては自明のことである。

本発明はまた、以下のものから成る非開裂性且つ可溶性のバイブリドｇｐ１６０変異体を提供する：ｉ）　ＨＩＶウィルス第１株”ｇｐ１８０！：１ｍ由来し、且つこのｇｐ１６０中においてＸ位のアミノ酸からＹ位のアミノ酸までの間に位置する第１の領域（ここに、Ｘは１〜２７１の数であり、Ｙは３０６〜４８２の数である）；ｉｉ）　ＨＩ　Ｖウィルス第２株から生じたタイプＡの非開裂性且つ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、且つ該ｇｐ１６０変異体中のＹ＋１位（Ｙは上記に同じ）のアミノ酸からＣ−末端のアミノ酸に位置している第２領域：及びのｇｐ１６０に由来し、且つ該ｇｐ１６０変異体中の１位のアミノ酸からｘ−１位（Ｘは上記に同じ）のアミノ酸に位置している第３領域。

本発明のｇｐ１６０変異体の第１、第２及び第３領域は、第１株が第２株と異なっているという条件においては、任意のＨＩｖウィルスのｇｐ１６０に由来しても良い。第１領域は、ＨＩＶ−２ＲｏｄＳＨＩＶ−Ｉ　Ｅｌ　ｉ、ＨＩＭ−Ｉ　ＲＦ、ＨＩＶ−Ｉ　５Ｆ２Ｃ，ＨＩＶ−Ｉ　ＳＣ及びＨＩＶ−Ｉ　ＭＮの株から選ばれたウィルス株のｇｐ１６０に由来していることがより好ましく、後者が特に好ましい。同様に、第２及び第３領域はＨＩＶ−Ｉ　Ｂｒｕ株のｇｐ１６０に由来することが好ましい。

“タイプＡの非開裂性のｇｐ１６０変異体″は、以下のｇｐ１６０変異体を意味するものであるニー主要開裂サイトを含まないタイプＨＩＶ−１ウィルス株のｇｐ１６０に由来するか、 −または該開裂サイトを含まないタイプＨＩ　Ｖ−２ウィルス株のｇｐ１６０に由来するｇｐ１６０変異体がタイプＨＩＶ−１ウィルス株のｇｐ１６０に由来する場合、当該変異体はタイプＡ′が好ましい；これはすなわち、主要開裂サイトも副次的な（ｍ１ｎｏｒ）開裂サイトも含んでいないことを意味する。

“可溶性ｇｐ１６０変異体”は、膜内外領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｇｉｏｎ　）を−切含まない天然のｇｐ１６０に由来するか、又は膜内に固定する（　ａｎｃｈｏｒａｇｅ）作用がもはや不可能となるように天然の膜内外領域が突然変異されている天然のｇｐ１６０に由来するｇｐ１６０変異体を意味する。さらに、このような可溶性変異体が疎水性領域を含まないようにすることが可能であり、有利でもある。

“発現カセット”は、発現されるＤＮＡユニット及び後者を発現するために必要な要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）から成るＤＮＡ分節を意味する。ＤＮＡユニットの発現は、該ＤＮＡユニットのメツセンジャーＲＮＡへの転写及び当該メツセンジャーＲＮＡのタンパク質への翻訳により得ることができる。従って、必須要素は、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　）又は誘導性の（１ｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーター（転写開始）、翻訳開始コドン（ＡＴＧコドン）及び翻訳終了コドン（ＴＡＧＳＴＡＡ又はＴＧＡコドン）である。

さらに、発現カセットは他の要素、例えば転写ターミネータ−（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　）を含むことも可能である。

当業者は、ＤＮＡユニット発現に好ましい宿主微生物に沿った、且つ発現カセットが自己複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のだめに挿入されるべきベクターに沿った、適当なプロモーター及びターミネータ−を選択できることは明らかである。

上述したものを保持する場合、本発明は、本発明のｇｐ１６０変異体の前駆体又は本発明のｇｐ１６０変異体をコードしているＤＮＡユニット及び該ＤＮＡユニット発現に必要な要素を含む発現カセットをも提供するものである。

宿主微生物中の自律的適用（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉ。

ｎ）を提供するため、本発明の発現カセットは、宿主微生物に適している自己複製の起点（ｏｒｉｇｉｎ　）を有する異なったタイプのベクター、例えばプラスミド又はウィルスに挿入しても良い。ウィルス型ベクターは特に、そのゲノムにかなりの量の外来ＤＮＡをその自己複製能力を損なうことなく組み込む能力を有している。これらベクターは、例えばワクシニアウィルス、カナリア痘ウィルス及び鶏痘ウィルスのような痘そうウィルス：及びアデノウィルス−２又はアデノウィルス−５のようなアデノウィルスのようなバキュロウィルスを含む。

異種の製造システム（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　）における利用以外に、これらウィルス型ベクターのいくつかは、ワクチン剤（ｖａｃｃｉｎａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）として利用できる。これは特に、痘そうウィルス及びアデノウィルスに適用される。

それゆえ本発明は、そのゲノムに本発明の発現カセットが挿入されるウィルス型ベクターにも関連している。

本発明の他の側面においてはまた、本発明の発現カセットにより形質転換された細胞も得られる。細胞を形質転換する該発現カセットは、プラスミドによって運搬されるか、或いは宿主細胞のゲノムに挿入されても良い。

本発明のｇｐ１６０変異体製造用の宿主微生物はいかなるタイプの細胞でも良いが、真核細胞が好ましい。これは、例えば酵母のような真菌、昆虫細胞及び哺乳類細胞を含む。

本発明はさらに、本発明のｇｐ１６０変異体の製造に際して以下の２つの方法を提供するものであるニー第１の方法は、本発明の細胞を培養する工程および培地からの上記変異体の取り出し工程から成る、−第２の方法は、培養細胞を本発明のウィルス型ベク′ターに感染させる工程および培地からの上記変異体の収穫工程から成る。

本発明のｇｐ１６０変異体及びウィルス型ベクターはＨＩＶウィルスに対するワクチン活性（ｖａｃｃｉｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有しているので、特にＡＩＤＳの治療及び予防を目的とする医薬品として有用である。

従って、本発明は以下のものを提供するものである：ｉ）治療薬として本発明のｇｐ１６０変異体の少なくとも１つ又は本発明のウィルス型ベクターを少なくとも１つ含む、ＡＩＤＳの治療及び予防を目的とする医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　）、ｉｉ）本発明のｇｐｉｓｏ変異体又はウィルス型ベクターを、治療を必要とする患者に治療学的有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ａｍｏｕｎｔ　）で投与することからなる、ＡＩＤＳの治療及び予防方法、１ｉｉ）Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓの治療及び予防処置を目的とする治療薬としての、本発明のｇｌ）１６０変異体又はウィルス型ベクターの使用。

本発明の医薬組成物は、本発明のｇｐ１８０変異体を幾つか含んでいることが好ましい；各ｇｐ１６０変異体は、組成物中に存在する他の変異体と異なる、少なくとも１つの第３可変ドメイン（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　）（Ｖ３ループ（Ｖ　３１ｏｏｐ　）　）を有している。このような医薬組成物は、それゆえ種々のＨＩＶ株から患者を適確に保護することができる。

本発明の医薬組成物はさらに、例えばｇｐ１６０の第３可変ドメインと本質的に対応しているペプタイド（以下、ｖ３ペプタイドと略す）の様な他の治療薬から成ることも可能である。この様なペプタイドは、本発明の医薬組成物中に含まれるｇｐ１６０変異体の第３可変ドメインの配列と実質的に同等であるベプタイド配列を有しているのが好ましい。同様に、該組成物中に幾つかのＶ３ペプタイドが存在していても良い。特に、本発明の医薬組成物が異なったｇｐ１６０変異体を含んでいる場合、対応するｖ３ペプタイドがそこに添加可能であることは明らかである。

本発明の医薬組成物は常法に従って製造することができる。特に本発明のｇｐ１６０変異体は、薬学的見地から許容される希釈剤又は賦形剤と結合させることができる。最後に、本発明の組成物はミョウバン（ａｌｕｍ　）のようなワクチンアジュバント（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ａｄｊｕｖａｎｔ　）を含むことができる。或いは、該アジュバントは使用直前に本発明の組成物中に添加しても良い。

本発明の組成物は、ワクチン分野において通常用いられている任意の経路により投与しても良いが、特に皮下経路、例えば注射可能な溶液又は懸濁液の形態が好ましい。投与は、単独投与又は特定の時間間隔をおいた１回以上の繰り返し投与で実施できる。適切な投与量は、例えば治療する患者や投与形式などの種々のパラメーターによって変化する。

本発明の医薬組成物はまた、治療キット（ｔｒｅａｔｍｅｎｔｋｉｔ）の一部として提供されるものである。−例として、この様なキットは以下のものを含んでも良い；−一方で、本発明のｇｐ１６０変異体を少なくとも１つ含む医薬組成物、一他方で、Ｖ３ペプタイドを少なくとも１つ含む医薬組成物、 −また、キットに含まれている医薬組成物の順次投与又は同時投与に関する指示を特定するリーフレット（ｌｅａｆｌｅｔ）。

以下の図面により本発明を説明する：図１は、以下のウィルス株の天然のｇｐ１６０タンパク前駆体のアミノ酸配列を示す；ＨＩＶ−Ｉ　Ｂｒｕ（ａ）　、ＨＩＶ−Ｉ　ＭＮ　（ｂ）　、ＨＩＶ−Ｉ　Ｅｌ　１（ｃ）　、ＨＩＶ−Ｉ　ＲＦ　（ｄ）　、ＨＩＭ−Ｉ　５Ｃ（ｅ）、及びＨＩＶ−Ｉ　５Ｆ２Ｃ（ｆ）、シグナル配列のアミノ酸残基は−１〜−２９位の番号を付した。

−３０位のメチオニン残基は、翻訳開始コドンに対応している。成熟したｇｐ１６０タンパクのアミノ酸残基は１〜８４１位の番号を付した。アステリスク（＊）はその位置でのアミノ酸残基の同一性（１ｄｅｎｔｉｔｙ　）を示し、ドツト（・）は保存的変化（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｃｈａｎｇｅ）（アミノ酸は異なるが、同一クラスに属している）を示す。

図２は、ＨＩＶ−Ｉ　Ｂｒｕ　（ａ）及びＨＩＶ−２Ｒｏｄ（ｂ）のウィルス株の天然のｇｐ１６０タンパク前駆体のアミノ酸配列を示す。シグナル配列のアミノ酸残基は、−１〜−２９位の番号を付した。−３０位のメチオニン残基は翻訳開始コドンに対応している。成熟したｇｐ１６０タンパクのアミノ酸残基は１〜８４１位の番号を付した。アステリスク（＊）はその位置でのアミノ酸残基の同一性を示し、ドツト（・）は保存的変化（アミノ酸は異なるが、同一クラスに属している）を示す。

図３は、可溶性且つ非開裂性のｇ　１）　１６０−Ｂ　ｒ　ｕ変異体（膜内外ドメインなし）の前駆体コードしている配列及び該前駆体のアミノ酸配列を含むベクターｐＴＧ１１６３のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す。

図４は、バクテリオファージＭｌ　３ＴＧ４１６８及びＭ１３ＴＧ４１７４の構成（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　）工程を図式化したものである。

図５は、ｇｐ１２０−ＭＮの前駆体及び該前駆体のアミノ酸配列をコードしたヌクレオチド配列を示す。ｇｐｌ　２０−ＭＮの第３可変ドメインを少なくとも１つコードしているＤＮＡフラグメントを増幅させるためのオリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２４及び０ＴＧ２６２５Ｇｔ、ハイブリダイゼーション領域の上に示す。

図６は、ｇｐ１２０−Ｅｌｉの前駆体及び該前駆体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。少なくともｇｐ１２０−ＭＮの第３可変ドメインをコードしているＤＮＡフラグメントを増幅させるためのオリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２４及び０ＴＧ２６２５は、ハイブリダイゼーション領域の上に示す。

図７は、ｇｐ１２０−ＲＦの前駆体及び該前駆体のアミノ酸配列をコードしたヌクレオチド配列を示す。少なくともｇｐ１２０−ＲＦの第３可変ドメインをコードしているＤＮＡフラグメントを増幅させるためのオリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２４及び０ＴＧ２６２５は、ハイブリダイゼーション領域の上に示す。

図８は、ｇｌ）１２０−３Ｆ２Ｃの前駆体及び該前駆体のアミノ酸配列をコードしたヌクレオチド配列を示す。

少なくともｇｐ１２０−８Ｆ２Ｃの第３可変ドメインをコードしているＤＮＡフラグメントを増幅させるためのオリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２４及び○ＴＧ２６２５は、ハイブリダイゼーション領域の上に示す。

本文の記載及び理解を容易にするため、以下の実施例において「シグナル配列」は翻訳開始メチオニン残基を含むシグナル配列を意味するものと理解される。

実施例１：　バクテリオファージＭ１３ＴＧ４１６８が運搬する挿入カセットの作製。

図３に示すように、特許出願ＥＰＡ２４５，１３６に記載されているプラスミドｐＴＧ１１６３のＰｓｔｌ−Ｐｓｔｌ　ＤＮＡフラグメントは、非開裂性（ｎｏｎ−ｃｌｅａｖａｂｌｅ）で且つ可溶性のｇｐ１６０−Ｂｒｕ変異体の前駆体をコードするＤＮＡ配列を含む。このｐｓｔｌ−Ｐｓｌｌ　ＤＮＡフラグメントを、ｐｓｔｌによって事前にいる〕バクテリオファージＭ１３ｍｐ７０１に挿入してバクテリオファージＭ１３７Ｇ４１３７　（図４）を得る。

図３に示すようにＰｓ　ｌ　Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグメントのヌクレオチドの番号付与は、実施例１の以下の部分において参照される。

プラスミドｐＴＧ１１６３をＰｓｔｌとＡ”ｐ　ｎ　／とによって切断し、ヌクレオチド１から１３８に対応するＤＮＡ７ラグメント（図３）を、ＰｓｔｌとＫｐ　ｎ　Ｉとによって事前に消化した〔上記のエム、ビー、キーニーら（Ｍ、Ｐ、　Ｋｉｅｎｙ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８３）に記載されている〕バクテリオファージＭ１３７Ｇ１３０に挿入する。そして、バクテリオファージＭ１３ＴＧ４１４７を得る（図４）。

バクテリオファージＭｌ　３ＴＧ４１３７をＥｆｌｌｌによって切断し、フレノウ酵素（Ｋｌｅｎｏｗ　ｅｎｚｙｍｅ）　［：べ一リンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　）によって処理して平滑末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　）を得、その後、ＥｃｏＲｌによって切断する。この消化に由来し、ヌクレオチド１４２４から２６４４に対応する配列を含むＦＣθｋｌ−Ｂ７１１１　フラグメント（図３）を、！　ｃ　ｏ　ＲＶとＥｃｏＲＩとによって事前に消化したバクテリオファージＭ１３ＴＧ４１４７に挿入する。そして、ｉ）ヌクレオチド１から１３８に対応するＤＮＡフラグメント、ｉｉ）バクテリオファージＭ１３ＴＧ４１４７のポリリンカーの残存配列（ｒｅｍａｉｎｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）、即ち、ＡＴＣＧＣＡＴＧＣＧ。

１ｉｉ）ヌクレオチド１４２４から２６４４に対応するＤＮＡフラグメント、を含むバクテリオファージＭ１３ＴＧ４１５８を得ル。

−零値の非転写（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）バクテリオファージＭ１３ＴＧ４１５８は、アメルシャムキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｋｉｔ）と下記の配列を有するオリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２３　：とを使用して行う突然変異φ欠失（ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ）の鋳型になる。

この突然変異誘発によって、ヌクレオチド６７から１３８、配列ＡＴＣＧＣＡＴＧＣＧ及びヌクレオチド１４２４から１５２５を含む１８４塩基対フラグメントの欠失と、ヌクレオチド６６と１５２６との間に挿入される５′末端の酵素ｓｐ力Ｉと３″末端の５ｔｙｙｒｌとのための開裂部位の作製とを同時に行うことが可能となる。そして、ｉ）ヌクレオチド１から６６に対応するＤＮＡフラグメント、ｉｉ）酵素ｓｐ力Ｉと５ｔｙｙｔｙｌとのための開裂部位を含むＤＮＡ配列ＧＣＡＴＧＣＡＴＣＣＣＧ、並びに、１ｉｉ）ヌクレオチド１５２６から２６４４に対応するＤＮＡフラグメント、を含むバクテリオファージＭ１３ＴＧ４１６８を得る。

体合成用発現カセットの作製。

図５に示すように、ｇｐ１２０−ＭＮの前駆体の大部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ウィルス株ＨＩＶＩＭＮによって感染したＣＥＭヒト細胞のゲノムＤＮＡによって開始するＰＣＲ（複製連鎖反応）遺伝子増幅技術によってクローン化（ｃｌｏｎｅｄ）する。このクローニングには、増幅したＤＮＡフラグメントの５′末端に酵素ｓｐ力ｌのための開裂部位及び増幅したＤＮＡフラグメントの３゛末端に酵素、５”ｍｚｌのための開裂部位をそれぞれ導入するオリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２４と０ＴＧ２６２５とを使用する。これらのオリゴヌクレオチオリボヌクレオチド０ＴＧ２６２４と０ＴＧ２６２５とによってもたらされる配列修飾を考慮に入れると、増幅したｓｐ力１−８ｍａｌ　ＤＮＡフラグメントは図５に示すヌクレオチド５３から１５０５に対応する。このフラグメントを、ｓｐ力ｌとＳｍ１ｌとによって切断したバクテリオファージＭ１３ＴＧ４１６８に挿入する。

そして、Ｂｒｕ−ＭＮハイブリッドｇｐ１６０蛋白質の前駆体をコードするＤＮＡフラグメントを含むバクテリ３　オファージＭ１３７Ｇ４１７４を得る。Ｂｒｕ−ＭＮハイブリ”ツドｇｐ１６０変異体をコードするバクチリオフ：　アージＭ１３ＴＧ４１７４のｐｓｔｌフラグメントを、１　Ｅ７．５にプロモーターの下流であってチミジンキナーゼをコードするワクシニアウィルス遺伝子内にある〔エム、ビー、キーニーら（Ｍ、Ｐ、　Ｋｉｅｎｙ　ｅｔ　ａｌ、）　、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　、（１９８６）　４　：　７９０に記載されている〕　トランスファープラスミドｐＴＧ１８６ポリに挿入する。

続いて、エム、ビー、キーニーら（ＬＰ、　Ｋｉｅｎｙ　ｅｔ　ａｌ、）ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８４）、３１２，１６３−１６６に記載されている方法に従い、プラスミドｐＴＧ５１５６を使用して、Ｂｒｕ−ＭＮハイブリッドｇｐ１６０蛋白質の発現のためのブロックをワクシニアウィルス、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株のゲノムに転移させる。そして、ワクシニアベクターＶＶＴＧ５１５６を得る。

実施例３：　Ｂｒｕ−Ｅｌｉハイブリッドｇｐ１６０変異体合成用発現カセットの作製。

プラスミドｐＴＧ１８６ボリをＥ　ｔｔ　、／；７　Ｎ　／で切断し、フレノウ酵素によって処理１、Ｓｍｔｙｌによって切断してポリリンカーの大部分を欠失させ、その後、それ自身を再結合（ｒｅｌｉｇａｔｅｄ）　してプラスミドｐＴＧ１８６ＰＥを得る。ここで、ポリリンカーは酵素Ｐｓｔｌ、５ｉｌＩ及びＥｃｏＲＩのみのための開裂部位を保有している。

Ｅ７．５にプロモーターの下流であってチミジンキナーゼをコードするワクシニアウィルス遺伝子内にあるＰｓｌｌによって事前に切断したプラスミドｐＴＧ１８６ＰＥに、１）ａ３に示すＤＮＡフラグメントのヌクレオチド１から６６に対応するＤＮＡフラグメント、ｉｉ）酵素ｓｐ力Ｉと、９ｍ１ｌとのための開裂部位を含むＤＮＡ配列ＧＣＡＴＧＣＡＴＣＣＣＧ。

１ｉｉ）図３に示すＤＮＡフラグメントのヌクレオチド１５２６から２６４４に対応するＤＮＡフラグメント、を含む上記のバクテリオファージＭ１３ＴＧ４１６８のＰｓｔｌ−Ｐｓｉｊ　ＤＮＡフラグメントを挿入する。

そして、プラスミドｐＴＧ５１６０を得る。

図６に示すように、ｇｌ）ｆｆ２０−Ｅｌｊの前駆体の大部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ＨＩＶＩ−Ｅ１１ウィルスによって感染したＣＥＭヒト細胞のゲノムＤ　Ｎ　Ａによって開始するＰＣＲ遺伝子増幅技術によってクローン化する。このクローニングには、増幅したＤＮＡフラグメントの５゛末端に酵素Ｓｐ力Ｉのための開裂部位を、増幅したＤＮＡフラグメントの３−末端に酵素Ｓｍ１ｌのための開裂部位を、それぞれ導入するオリゴ、ｌ［、オチＩ’０ＴＧ２６２４と０ＴＧ２６２５とを使用する。オリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２４と０ＴＧ２６２５とによってもたらされる配列修飾を考慮に入れると、増幅したｓｐ力ｌ−５ｔｙｙｉｌ　ＤＮＡ７ラグメントは、図６に示すヌクレオチド５３から１４９０に対応する。

このフラグメントを、ｓｐ力ＩとＳｍ１ｌとによって事前に切断した〔上記のエム、ビー、キーニーう（Ｍ、　Ｐ、　Ｘ１ｅｎｙ　ｅｔ　ａｌ、）　（１９８３）に記載されている〕バクテリオファージＭ１３ＴＧ１３１に挿入して、バクテリオファージＭ１３ＴＧ４１９７を得る。その後、バクテリオファージＭ１３７Ｇ４１９７の５ｐ力ｌ−５ｍ１ｌ　フラグメントを、５ｐ／！ｉとＳｍｔｔｌとによって事前に切断した〔上記の〕　トランスファープラスミドｐＴＧ５１６０に挿入する。そして、ｐＴＧ５１９３を得る。

続いて、上記のエム５　ビー、　キーニーら（Ｍ、Ｐ、　Ｋｉｅｎｙｅｔａｌ、）（１９８４）に記載されている方法に従い、プラスミドｐＴＧ５１９３を使用して、Ｂｒｕ−Ｅｌｉハイブリッドｇｐ１６０蛋白質の発現のためのブロックをワクシニアウィルス、コペンハーゲン株のゲノムに転移させる。そして、ワクシニアベクターＶＶＴＧ５１９３を得る。

実施例４：　Ｂｒｕ−ＲＦハイブリッドｇｐ１６０変異体合成用発現カセットの作製。

図７に示すように、ｇｐ１２０−ＲＦ蛋白質の前駆体の大部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ＨＩＶＩ−ＲＦウィルスによって感染したＣＥＭヒト細胞のゲノムＤＮＡによって開始するＰＣＲ遺伝子増幅技術によってクローン化する。

このクローニングは、増幅したＤＮＡフラグメントの５′末端に酵素５β力Ｉのための開裂部位を、増幅したＤＮＡフラグメントの３−末端に酵素、！；ｍａｌのための開裂部位を、それぞれ導入するオリゴヌクレオチド○ＴＧ２６２４と０ＴＧ２６２５とを使用して行う。オリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２４と０ＴＧ２６２５とによってもたらされる配列修飾を考慮に入れると、増幅したＳｐ／ｙＩ −３ｍｉＩ　ＤＮＡフラグメントは、図７に示すヌクレオチド５３から１５２３に対応する。このフラグメントを１．５’ｐｌｙｌとＳｍ１ｌとによって事前に切断したバクテリオファージＭ１３ＴＧ１３１に挿入して、バクテリオファージＭ１３ＴＧ４１９８を得る。その後、バクテリオファージＭ１３ＴＧ４１９８のＳｐＡＩ−５ｍ、ｇｌフラグメントを１．５）ｙｌｙｌと５ｍａｌとによって事前に切断した〔実施例３に記載の〕トランスファープラスミドｐＴＧ５１６０に挿入する。

そして、ｐＴＧ５１９４を得る。

続いて、上記のエム、ピー、　キーニーら（１９８４）に記載されている方法に従い、プラスミドｐＴＧ５１９４を使用して、Ｂｒｕ−ＲＦハイブリッドｇＩ）１６０蛋白質の発現のためのブロックをワクシニアウィルス、コペンハーゲン株のゲノムに転移させる。そして、ワクシニアベクターＶＶＴＧ５１９４を得る。

実施例５：　Ｂｒｕ−８Ｆ２Ｃハイブリッドｇｐ１６０変異体合成用発現カセットの作製。

図８に示すように、ｇｐ１２０−８Ｆ２Ｃの前駆体の大部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ＨＩＶＩ−８Ｆ２Ｃウイルスによって感染したＯＥＭヒト細胞のゲノムＤＮＡによって開始するＰＣＲ遺伝子増幅技術によってクローン化する。このクローニングは、増幅したＤＮＡフラグメントの５′末端に酵素５β力Ｉのための開裂部位を、増幅したＤＮＡフラグメントの３′末端に酵素Ｓｍ５ｌのための開裂部位を、それぞれ導入するオリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２４と０ＴＧ２６２５とを使用して行う。オリゴヌクレオチド０ＴＧ２６２４と０ＴＧ２６２５とによってもたらされる配列修飾を考慮に入れると、増幅した５βｌｙｌ− ８ｍｉｌ　ＤＮＡフラグメントは、図８に示すヌクレオチド５３から１４９３に対応する。その後、このフラグメントを、ｓｐ力Ｉと５ｍ、ｙｌとによって事前に切断したバクテリオファージＭ１３ＴＧ１３１に挿入して、バクテリオファージＭ１３ＴＧ４１９９を得る。バクテリオファージＭ１３ＴＧ４１９９の５ｐ力！−８ｍ、ｑｌｌｌフラグメント５ｐ力ＩとＳｍ１ｌとによって事前に切断した〔実施例３に記載の〕トランスファープラスミドｐＴＧ５１６０に挿入する。

そして、ｐＴＧ５１９５を得る。

続いて、上記のエム、ピー、キーニーら（１９８４）に記載されている方法に従い、プラスミドｐＴＧ５１９５を使用して、Ｂｒｕ−８Ｆ２Ｃハイブリッドｇｌ）１６０蛋白質の発現のためのブロックをワクシニアウィルス、コペンハーゲン株のゲノムに転移させる。そして、ワクシニアベクターＶＶＴＧ５１９５を得る。

実施例６から９：　Ｂｒｕ−ＭＮ、Ｂｒｕ−Ｅｌｉ、Ｂｒｕ−ＲＦ及びＢｒｕ　５Ｆ２Ｃハイブリッドｇｐ１６０蛋白質の生産及び精製：ウシ胎児血清〔Ｆｅ２）１０％を添加したＧＭＥＭ培地〔ギブ：＋（Ｇｉｂｃｏ）　）でＢＨＫ−２１細胞を培養する。

細胞が全面を覆ったとき（５，８Ｘ１０６細胞／ｍｌ）、培養培地を除去し、細胞系（ｃｅｌｌ　ｌａｗｎ）をＰＢＳ　［デュベルコの（Ｄｕｂｅｌｃｃｏ″Ｓ）リン酸緩漬液塩ｉセロームド（Ｓｅｒｏｍｅｄ）　）　５０　ｍ　ｌを用いて２回洗浄する。その後、Ｆｅ２を含まないフレッシュＧＭＥＭ培地を添加する。

そして、上記実施例２から５に記載されているワクシニアウィルスＶｖＴＧ５１５６、ＶＶＴＧ５１９３、ＶＶＴＧ５１９４及びＶＶＴＧ　５１９５＋ｌＤ−ツを、１ｐｆｕ／細胞〔プラーク形成単位〕の感染力で添加し、感染を７２時間継続させる。その後、細胞屑（ｃｅｌｌ　ｄｅｂｒｉｓ　）を除去するためにリゼイト（Ｉｙｓａｔｅ）を１０，０００ｇで２０分間遠心分離機にかけて、特に（ｉｎｔｅｒ　ａｌｉａ）、ハイブリッドｇｐ１６０とヴイリオン（ｖｉｒｉｏｎ）とを含む上澄みを回収する。

上記のようにして得た培養上澄み２０ｍ１に１Ｍ塩化亜鉛（Ｚ　ｎ　Ｃｌ　２　）溶液１．３ｍｌを添加して最終的なＺ　ｎ　Ｃｌ　２濃度を６０ｍＭにする。

この混合物を水中で１時間放置する；そして、ヘロースＲＦミニフユージ（■ｅｒａｅｕｓ　ＲＦ　Ｍｉｎｉｆｕｇｅ）遠心分離機で２０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した後に、沈降上澄みを回収する。この方法で、蛋白質汚染物質（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の大部分とヴイリオンを沈降によって除去する。そして、それぞれの場合について、ハイブリッドｇｐｉ６ｏ変異体の精製された溶液を得る。

Ｌ且凹Ｌ」ムユ」」−」μとム匹Ｚ−１４１とム＝ルＬよ一里見し６６５　６７０　６７５　６８０　６８５　６９０　６９５　フ００　７０５　７１０　フ１５　７２０フ２５　７］０　フ３５　フ４０　フ４５　７５０　フ５５　フロ０　７６５　フッ０　７７５　７８０７Ｂ５　７９０　７９５　１１００　ＳＯ５１１１０８１５８２０８２５８３０シ計扛１ユＦ工ｕｒｅ２（続き）３５５　３６０　３６５　３７０　３７５　コ８０　３８５　３９０　３９５　４００　４０５　４１０４１５　４２０　４２５　４３０　４コ５　４４０　４４５　４５０　４５５　４６０　４６５　４７０４７５　４８０　４１３５　４９０　４９５　５００　ＳＯ５５１０５１５５２０５２５５３０６００６０５６１０６１５６２０６２５６３０６コ５　６４０　６４５　６５０　６５５６６０　６６５　６７０　６７５　６Ｂ０　６８５　６９０　６９５　７００　７０５　７１０７１５　７２０　７２５　７３０　７３５　７４０　７４５　７５０　７５５　フロ０　７６５ムエこｓ２五４Ｌ− ム且扛１」ｐｓｔｌＬｙ　ｓ　ＴｈｒＰｈｓＡｓ　ｎＧ　１ｙＴｈ　ｒＧ　ｌｙ　Ｐ　ｒｏｅ　ｙｓ　Ｔ　ｈ　ｒＡｓ　ｎＶａｌｓａｒＴｈｒＶａ　１Ｇｌｎｃ凵@ｓＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＡＧＧＣＣＡＧＴＡＧＴＡＴＣＭＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴにＴＴＧＡＡＴＧＧＣＡＧＴ　８１８Ｔｈ　ｒＨｉ　ｓＧ　ｌ　ｙ　Ｉ　ｌｅＡｒｇＰ　ｒｏＶａｌＶａ　ｌ　Ｓ　ｅｒＴｈｒＧ　ｌ　ｎＬａｕＬａｕＬｓ　ｕＡｓ　ｎＧｌｙｓ■■ ムニューシ」μＬＦ工ｕｒｅ　３　（続き）ＰｈａＡｓ　ｎ　Ｘ　１ａＴｈｒＡｓ　ｎＴｒｐＬａｕＴｒｐＴｙｒ　Ｘ　ｌ　ｅＬｙｓＡｇ　ｎＡｒｇｖａ　ｌＡｒｇＧｌ　ｎＧ　ｌ　ｙＡｒｇＰｒｏＧｌｕＧｌｙＩｌｅＧｌｕＧｌｕＧｌｕＧｌｙＧｌｙＧｌｕＡｒｇＡｓｐＡｒｇＡｓｐＡｒｇＳｓｒＡＴＴＣＧＡＴＴＡＧ’ｌ’ＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＣＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＡＴＣＴＧＣＧＧＡＧＣ２２４６Ｘ　ｌａＡｒｇＬａ　ｕＶａ　ＩＡｓ　ｎＧｌ　ｙＳ　ｅｒＬａ　ｕＡｌ　ａＬｅｕ　Ｘ　１ｅＴｒｐＡｓ　ｐＡｓ　ｐＬｅｕＡｒｇｓｅ　■ ＬａｕＬｅｕＡｓ　ｎＡｌａＴｈｒＡｌａ　Ｘ　１ｓＡｌ　ａＶａ　１ＡｌａＧｌｕＧｌｙ？ｈｒＡｓｐＡｒｇＶａｌ　工１ｅＦｉ　ｕｒｅ　３　（１！き）乙ユ凹１ｊＣＧＣＦｌｕｒｅ　５　（続１つ０ＴＧ２６２５Ｌよ扛１ｊＯＴＧ２６２４Ｆ工ｕｒｅ　６　（続き）ＣＴＴＧＧＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴわユ■ＬユＦ工ｕｒｅ　７　（続き）ムユ扛Ｌ１ｒｉｕｒｅ８　続き）ＯＴＧ２６２５ＣＡＴＣＧＴＧＧＧＴＧＧＧＣＣＣＧＴＴＴＣ要　約　書ハイブリッドの前駆体、非制限および可溶性のｇｐ１６０変異体、およびそれにより得られる新規変異体をコードするＤＮＡユニットからなる発現カセットを構築する新規方法を開示する。

Claims

【特許請求の範囲】

１．非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体の前駆体、または非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法であって、該ｇｐ１６０変異体が；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在（ｌｏｃａｔｅｄ）し、Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数である第１領域；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡの非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域；からなるアミノ酸配列を有し；前記ＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための該方法が；ａ）前記第１領域をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング工程；及びｂ）前記ａ）工程でクローン化されたＤＮＡフラグメントをカセットの１つの部位（ｓｉｔｅ）に挿入する工程を含み、該カセットは；ｍ）該部位の上流が以下の配列；ｉ）プロモーターｉｉ）翻訳開始コドンｉｉｉ）必要により、シグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ領域、およびｉｖ）Ｘが１以外の前記のものであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第３領域をコードする第２ＤＮＡ領域を有し；並びにｎ）該部位の下流が以下の配列；ｉ）Ｙが前記の通りであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第２領域をコードする第３のＤＮＡ領域、およびｉｉ）翻訳終末コドンを有することからなる方法。
２．非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体の前駆体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法であって、該ハイプリッドｇｐ１６０変異体が；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在し、Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数である第１領域；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られる非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域；からなるアミノ酸配列を有し；前記ＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための前記方法が；ａ）前記第１領域をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング工程；及びｂ）前記ａ）工程でクローン化されたＤＮＡフラグメントをカセットの１つの部位に挿入する工程を含み、該カセットは；ｍ）該部位の上流が以下の配列；ｉ）プロモーター、ｉｉ）翻訳開始コドン、ｉｉｉ）シグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ領域、およびｉｖ）Ｘが１以外の前記のものであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第３領域をコードする第２ＤＮＡ領域を有し；並びにｎ）該部位の下流が以下の配列；ｉ）Ｙが前記の通りであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第２領域をコードする第３ＤＮＡ領域、およびｉｉ）翻訳終末コドンを有することからなる請求項１に記載の方法。
３．非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体の前駆体、または非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法であって、該ｇｐ１６０変異体が；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在し、Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４７６の数である第１領域；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡ−の非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域；からなるアミノ酸配列を有し；前記ＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための前記方法が；ａ）前記第１領域をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング工程；及びｂ）前記ａ）工程でクローン化されたＤＮＡフラグメントをカセットの１つの部位に挿入する工程を含み、該カセットが；ｍ）該部位の上流が以下の配列；ｉ）プロモーター、ｉｉ）翻訳開始コドン、ｉｉｉ）必要により、シグナルペプチドをコードする第１ＤＮＡ領域、およびｉｖ）Ｘが１以外の前記のものであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第３領域をコードする第２ＤＮＡ領域を有し；並びにｎ）該部位の下流が以下の配列；ｉ）Ｙが前記の通りであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第２領域をコードする第３ＤＮＡ領域、およびｉｉ）翻訳終末コドンを有することからなる請求項１に記載の方法。
４．非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体の前駆体、または非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法であって、該変異体が；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在し、Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数である第１領域；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡの非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りであり、前記第２株が株ＨＩＶ１−Ｂｒｕである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域；からなるアミノ酸配列を有し；前記ＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための前記方法が；ａ）前記第１領域をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング工程；及びｂ）前記ａ）工程でクローン化されたＤＮＡフラグメントをカセットの１つの部位に挿入する工程を含み、該カセットは；ｍ）該部位の上流が以下の配列；ｉ）プロモーター、ｉｉ）翻訳開始コドン、ｉｉｉ）必要により、シグナルペプチドをコードする第１ＤＮＡ領域、およびｉｖ）Ｘが１以外の前記のものであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第３領域をコードする第２ＤＮＡ領域を有し；並びにｎ）該部位の下流が以下の配列；ｉ）Ｙが前記の通りであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第２領域をコードする第３ＤＮＡ領域、およびｉｉ）翻訳終末コドンを有することからなる請求項１または３に記載の方法。
５．非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体の前駆体、または非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法であって、該変異体が；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数であり、かつ前記第１株がＨＩＶ−１ＭＮ、ＨＩＶ−１Ｅｌｉ、ＨＩＶ−１ＲＦ、ＨＩＶ−１ＳＦ２ＣおよびＨＩＶ−１ＳＣの株から選ばれる）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡの非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域；からなるアミノ酸配列を有し；前記ＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための前記方法が：ａ）前記第１領域をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング工程；及びｂ）前記ａ）工程でクローン化されたＤＮＡフラグメントをカセットの１つの部位に挿入する工程を含み、該カセッドは；ｍ）該部位の上流が以下の配列；ｉ）プロモーターｉｉ）翻訳開始コドンｉｉｉ）必要により、シグナルペプチドをコードする第１ＤＮＡ領域、およびｉｖ）Ｘが１以外の前記のものであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第３領域をコードする第２ＤＮＡ領域を有し；並びにｎ）該部位の下流が以下の配列；ｉ）Ｙが前記の通りであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第２領域をコードする第３ＤＮＡ領域、およびｉｉ）翻訳終末コドンを有することからなる請求項１、３および４のいずれかに記載の方法。
６．非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体の前駆体、または非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法であって、該変異体が；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数であり、前記第１株がＨＩＶ−１ＭＮ株である）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡの非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域；からなるアミノ酸配列を有し；前記ＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための前記方法が；ａ）前記第１領域をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング工程；及びｂ）前記ａ）工程でクローン化されたＤＮＡフラグメントをカセットの１つの部位に挿入する工程を含み、該カセットは；ｍ）該部位の上流が以下の配列；ｉ）プロモーターｉｉ）翻訳開始コドンｉｉｉ）必要により、シグナルペプチドをコードする第１ＤＮＡ領域、およびｉｖ）Ｘが１以外の前記のものであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第３領域をコードする第２ＤＮＡ領域を有し；並びにｎ）該部位の下流が以下の配列；ｉ）Ｙが前記の通りであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第２領域をコードする第３ＤＮＡ領域、およびｉｉ）翻訳終末コドンを有することからなる請求項５に記載の方法。
７．非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体の前駆体、または非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法であって、該変異体が；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが４５０〜４８２の数である）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡ−の非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域；からなるアミノ酸配列を有し；前記ＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための前記方法が；ａ）前記第１領域をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング工程；及びｂ）前記ａ）工程でクローン化されたＤＮＡフラグメントをカセットの１つの部位に挿入する工程を含み、該カセットは；ｍ）該部位の上流が以下の配列；ｉ）プロモーター、ｉｉ）翻訳開始コドン、ｉｉｉ）必要により、シグナルペプチドをコードする第１ＤＮＡ領域、およびｉｖ）Ｘが１以外の前記のものであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第３領域をコードする第２ＤＮＡ領域を有し；並びにｎ）該部位の下流が以下の配列；ｉ）Ｙが前記の通りであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第２領域をコードする第３ＤＮＡ領域、およびｉｉ）翻訳終末コドンを有することからなる請求項１および３〜６のいずれかに記載の方法。
８．非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体の前駆体、または非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法であって、該変異体が；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜９７の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数である）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡ−の非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇＰ１６０に由来し、このｇＰ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域；からなるアミノ酸配列を有し；前記ＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための前記方法が；ａ）前記第１領域をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング工程；及びｂ）前記ａ）工程でクローン化されたＤＮＡフラグメントをカセットの１つの部位に挿入する工程を含み、該カセットは；ｍ）該部位の上流が以下の配列；ｉ）プロモーターｉｉ）翻訳開始コドンｉｉｉ）必要により、シグナルペプチドをコードする第１ＤＮＡ領域、およびｉｖ）Ｘが１以外の前記のものであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第３領域をコードする第２ＤＮＡ領域を有し；並びにｎ）該部位の下流が以下の配列；ｉ）Ｙが前記の通りであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第２領域をコードする第３ＤＮＡ領域、およびｉｉ）翻訳終末コドンを有することからなる請求項１および３〜７のいずれかに記載の方法。
９．非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体の前駆体、または非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットを含む発現カセットを構築する方法であって、該変異体が；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇＰ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜９７の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数である）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡ−の非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域；からなるアミノ酸配列を有し；前記ＤＮＡユニットを含む発現カセットを得るための前記方法が；ａ）ＨＩＶウイルスの前記第２株に感染した細胞のゲノムＤＮＡから始まるＰＣＲ技術による前記第１領域をコードするＤＮＡフラグメントのクローニング工程（ａｃｔ）；及びｂ）前記ａ）工程でクローン化されたＤＮＡフラグメントをカセットの１つの部位に挿入する工程を含み、該カセットは；ｍ）該部位の上流が以下の配列；ｉ）プロモーターｉｉ）翻訳開始コドンｉｉｉ）必要により、シグナルペプチドをコードする第１ＤＮＡ領域、およびｉｖ）Ｘが１以外の前記のものであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第３領域をコードする第２ＤＮＡ領域を有し；並びにｎ）該部位の下流が以下の配列；ｉ）Ｙが前記の通りであるとき、前記ハイプリッドｇｐ１６０変異体のアミノ酸配列の前記第２領域をコードする第３ＤＮＡ領域、およびｉｉ）翻訳終末コドンを有することからなる請求項１および３〜８のいずれかに記載の方法。
１０．以下のものからなるアミノ酸配列を有する非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体；ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数である）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡの非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域。
１１．ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４７６の数である）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡ−の非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域からなるアミノ酸配列を有する請求項１０に記載の非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体。
１２．ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数である）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡの非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りであり、前記第２株がＨＩＶ−１Ｂｒｕ株である第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域からなるアミノ酸配列を有する請求項１０または１１に記載の非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体。
１３．ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数であり、前記第１株がＨＩＶ−１ＭＮ、ＨＩＶ−１Ｅｌｉ、ＨＩＶ−１ＲＦ、ＨＩＶ−１ＳＦ２ＣおよびＨＩＶ−１ＳＣの各株から選ばれる）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡの非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域からなるアミノ酸配列を有する請求項１０〜１２のいずれかに記載の非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体。
１４．ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数であり、前記第２株が株ＨＩＶ−１ＭＮである）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡの非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域からなるアミノ酸配列を有する請求項１３に記載の非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体。
１５．ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜２７１の数であり、Ｙが４５０〜４８２の数である）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡ−の非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域からなるアミノ酸配列を有する請求項１０〜１４のいずれかに記載の非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体。
１６．ｉ）ＨＩＶウイルスの第１株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸Ｘ位からアミノ酸Ｙ位に局在する第１領域（Ｘが１〜９７の数であり、Ｙが３０６〜４８２の数である）；ｉｉ）ＨＩＶウイルスの第２株から得られるタイプＡ−の非開裂性かつ可溶性のｇｐ１６０変異体に由来し、このｇｐ１６０変異体のアミノ酸Ｙ＋１位からＣ末端に局在し、Ｙが前記の通りである第２領域；及びｉｉｉ）Ｘが１以外のとき、ＨＩＶウイルスの前記第２株のｇｐ１６０に由来し、このｇｐ１６０のアミノ酸１位からアミノ酸Ｘ−１位（Ｘは前記に同じ）に局在する第３領域からなるアミノ酸配列を有する請求項１０〜１５のいずれかに記載の非開裂性かつ可溶性のハイプリッドｇｐ１６０変異体。
１７．請求項１〜９のいずれかに記載の方法により得られる発現カセット。
１８．請求項１０〜１６のいずれかに記載のｇｐ１６０変異体の前駆体、または請求項１０〜１６のいずれかに記載のｇｐ１６０変異体をコードするＤＮＡユニットおよび前記ＤＮＡユニットの発現に必要な要素を含む発現カセット。
１９．請求項１７または１８に記載の発現カセットで形質転換された細胞。
２０．請求項１７または１８に記載の発現カセットをゲノム中に挿入してなるウイルスベクター。
２１．請求項１９に記載の細胞を培養する工程および該培養物から前記変異体を収穫する工程を含む請求項１０〜１６のいずれかに記載のｇｐ１６０変異体の製造方法。
２２．細胞培養物を請求項２０に記載のウイルスベクターで感染させる工程および該培養物から前記変異体を収穫する工程を含む請求項１０〜１６のいずれかに記載のｇｐ１６０変異体の製造方法。
２３．治療剤として請求項１０〜１６のいずれかに記載のｇｐ１６０変異体を含むＡＩＤＳの予防または治療を目的とする医薬組成物。
２４．治療剤として請求項２０に記載のウイルスベクターを含むＡＩＤＳの予防または治療を目的とする医薬組成物。