ES2622127T3 - Metodos de determinación de resistencia a antibioticos en microorganismos - Google Patents

Metodos de determinación de resistencia a antibioticos en microorganismos Download PDF

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Abstract

Un método para establecer si un microorganismo es potencialmente resistente a un antibiótico betalactámico, que consta de los siguientes pasos: (a) proporcionar un espectro de masa de referencia del antibiótico betalactámico o su producto de modificación enzimática; (b) exponer un microorganismo, un lisado celular del mismo o el sobrenadante de un medio de cultivo del mismo a dicho antibiótico betalactámico en líquido acuoso para, de ese modo, obtener una muestra expuesta; (c) adquirir un espectro de masas de la muestra expuesta; (d) comparar el espectro de masa obtenido en el paso (c) con el espectro de masa de referencia del paso (a) y (e) determinar a partir de dicha comparación si se ha producido una modificación de dicho antibiótico betalactámico tras dicha exposición, y establecer si dicho microorganismo es potencialmente resistente a dicho antibiótico betalactámico cuando se observa dicha modificación, donde tras el paso (b) dicha muestra expuesta se coloca, junto con un material de matriz, en un soporte de muestras para espectrometría de masas para obtener una muestra de espectrometría de masas para la espectrometría de masas mediante desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS).

Description

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DESCRIPCION
Metodos de determinacion de resistencia a antibioticos en microorganismos Campo de la invencion
La presente invencion pertenece al campo del diagnostico bacteriano y se refiere en particular a un metodo para determinar la resistencia a los antibioticos de un microorganismo.
Antecedentes de la invencion
La resistencia a los antibioticos es la capacidad de un microorganismo para resistir los efectos de un antibiotico. Esta resistencia se desarrolla a traves de mutaciones geneticas e intercambio de plasmidos entre microorganismos. La resistencia a los antibioticos tiene ya unas consecuencias considerables en la medicina, y estas no dejaran de aumentar en los proximos anos.
Uno de los grupos de microorganismos oportunistas que han suscitado un renovado interes por mostrar resistencia a los antibioticos son las enterobacteriaceas. Esta especie bacteriana (que incluye, por ejemplo, Klebsiella y Escherichia coli) comprende patogenos oportunistas que se han asociado, entre otros, a infecciones urinarias, septicemia, infecciones respiratorias y diarrea. La resistencia de estas especies a cefalosporinas de tercera generacion como los oximinobetalactamicos es conocida desde hace 30 anos, pero desde entonces se ha registrado un aumento potencial de la resistencia. Las cepas adquieren la resistencia sintetizando las denominadas betalactamasas de espectro extendido (BLEE), que son betalactamasas de clase molecular A capaces de inactivar cefalosporinas de tercera generacion (ceftazidima, cefotaxima y cefpodoxima), asf como monobactamicos (aztreonam). Las BLEE son derivados de las betalactamasas comunes (p. ej., las betalactamasas de tipo TEM y SHV) que han sido objeto de una o mas sustituciones de aminoacidos cerca del sitio activo de la enzima, aumentando con ello su afinidad por y la actividad hidrolttica contra las cefalosporinas de tercera generacion y los monobactamicos. La extendida utilizacion de cefalosporinas de nueva generacion impulsa el desarrollo de una gama cada vez mas amplia de nuevas BLEE. Las BLEE son codificadas por plasmidos conjugativos transferibles, que son responsables de la propagacion de la resistencia a otras bacterias gramnegativas.
Las BLEE se clasifican en mas de 450 tipos sobre la base de sus propiedades ffsicas, y presentan una inhibicion variable por clavulanato, sulbactam y tazobactam, propiedad esta que se ha utilizado para detectarlas en el laboratorio. Actualmente, en el laboratorio de microbiologfa clmica unicamente se realizan pruebas fenotfpicas de deteccion de BLEE. Se estan desarrollando pruebas moleculares (genotfpicas). No obstante, un problema de las pruebas moleculares es la ausencia de una correlacion absoluta entre el genotipo y el fenotipo. Por lo tanto, el valor predictivo de las pruebas moleculares para cualquier fenotipo bacteriano, incluidas las bacterias que sintetizan BLEE, es limitado.
En general, las pruebas de laboratorio fenotfpicas actuales son mas sensibles y espedficas que las pruebas genotfpicas confirmatorias de BLEE. Todas las pruebas de deteccion fenotfpica de BLEE se basan en el mismo principio: las pruebas evaluan la variacion en la inhibicion de crecimiento bacteriano en presencia de antibioticos betalactamicos o combinaciones de antibioticos betalactamicos e inhibidores de betalactamasas. Existen diversas pruebas manuales y plataformas automatizadas en el mercado para realizar estas pruebas fenotfpicas. Las pruebas manuales utilizan discos o tiras impregnadas con antibioticos betalactamicos o combinaciones de antibioticos betalactamicos e inhibidores de betalactamasas. El material impregnado se coloca sobre un medio solido en donde se ha inoculado previamente una suspension bacteriana de densidad conocida. Se incuba durante toda la noche y, al dfa siguiente, se determina visualmente la inhibicion del crecimiento, que se puede cuantificar sobre la base del diametro de las zonas de inhibicion. Los sistemas automatizados tambien se basan en la medicion del crecimiento bacteriano en presencia de paneles de antibioticos betalactamicos o combinaciones de antibioticos betalactamicos e inhibidores de betalactamasas con diferentes concentraciones. Los resultados de estos sistemas se obtienen tras 418 horas.
Un artfculo de Yazawa et al. («Inactivation Of Kanamycin A by
Phosphorylation in Pathogenic Nocardia», Microbiology and Immunology, vol. 35, n.° 1, 1991, pags. 39-48) da a conocer un metodo para caracterizar la resistencia a los antibioticos de un microorganismo, donde los productos de modificacion del antibiotico kanamicina A, originado por la puesta en contacto de la kanamicina A con el lisado celular de cinco especies nocardiaceas patogenas diferentes, se identifican mediante ensayos y espectroscopia de masas y de RMN.
Un artfculo de Mosher et al. («Inactivation of chloramphenicol by 0-phosphorylation: A novel resistance mechanism in Streptomyces venezuelae ISP5230, a chloramphenicol producer», Journal of Biological Chemistry, vol. 270, n.° 45, 1995, pags. 27 000-27 006) da a conocer un metodo para caracterizar la resistencia a los antibioticos de un microorganismo, donde el producto de modificacion del antibiotico cloranfenicol, originado al poner en contacto el cloranfenicol y el medio de cultivo celular de Streptomyces lividans, se detecta mediante espectrometna de masas.
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Actualmente se necesitan medios y metodos capaces de diagnosticar con mayor rapidez bacterias sintetizadoras de BLEE. Tambien es necesaria una prueba de deteccion de BLEE que pueda utilizarse en el laboratorio de microbiologfa clmica para caracterizar las enzimas BLEE en terminos de cinetica enzimatica, con el fin de realizar un seguimiento de las tendencias evolutivas y evaluar y predecir la dosis eficaz para el tratamiento antibiotico. Estos medios se utilizan preferentemente para caracterizar la resistencia a antibioticos en microorganismos en general.
Resumen de la invencion
La presente invencion da a conocer ahora metodos para un rapido diagnostico de microorganismos sintetizadores de enzimas que modifican la accion de los antibioticos, en particular (en preparaciones preferidas de) microorganismos que sintetizan BLEE.
En primer lugar, la presente invencion da a conocer un metodo para establecer si un microorganismo es potencialmente resistente a un antibiotico betalactamico, que se compone de los siguientes pasos:
a) proporcionar un espectro de masas de referencia del antibiotico betalactamico o su producto de modificacion enzimatica;
b) exponer un microorganismo, un lisado celular del mismo o el sobrenadante de un medio de crecimiento del mismo a dicho antibiotico betalactamico en lfquido acuoso para, de ese modo, obtener una muestra expuesta;
c) adquirir un espectro de masas de la muestra expuesta;
d) comparar el espectro de masa obtenido en el paso c) con el espectro de masa de referencia del paso a) y
e) determinar a partir de dicha comparacion si se ha producido una modificacion del antibiotico betalactamico y establecer si dicho microorganismo es potencialmente resistente a dicho antibiotico betalactamico cuando se observa dicha modificacion, donde tras el paso b) dicha muestra expuesta se coloca, junto con un material de matriz, en un soporte de muestras para espectrometna de masas y donde dicha muestra se seca para obtener una muestra de espectrometna de masas para la espectrometna de masas mediante desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI-MS).
En una preparacion preferida de dicho metodo, la modificacion comprende la inactivacion enzimatica o la degradacion enzimatica del mencionado antibiotico betalactamico. Mas preferentemente, la degradacion enzimatica esta causada por una betalactamasa. El antibiotico betalactamico se selecciona preferentemente del grupo formado por penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas y carbapenemicos, mas preferentemente seleccionados del grupo formado por ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, cefpodoxima y aztreonam.
En otra preparacion preferida de un metodo de la invencion, el metodo se realiza exponiendo dicho microorganismo a multiples compuestos antimicrobianos simultaneamente, caracterizando de este modo la resistencia a los antibioticos de dicho microorganismo para multiples compuestos antibioticos.
En preparaciones especialmente preferidas, la enzima betalactamasa se puede seleccionar del grupo formado por cefalosporinasas (incluidas las cefalosporinasas de espectro extendido), penicilinasas, carbenicilinasas, cloxacilinasas y carbapenemasas.
En otra preparacion aun mas preferida del metodo de la invencion, la enzima betalactamasa es una betalactamasa de espectro extendido (BLEE).
En otra preparacion aun mas preferida de dicho metodo, el microorganismo es sospechoso de sintetizar BLEE y es preferentemente una bacteria gramnegativa, y mas preferentemente una bacteria gramnegativa seleccionada de entre Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca y Proteus mirabilis.
Las muestras utilizadas en aspectos de la invencion comprenden microorganismos o productos de la lisis de los mismos. Las muestras de microorganismos pueden ser muestras de cultivos de microorganismos. No es necesario que estos cultivos sean cultivos puros. Alternativamente, la muestra puede obtenerse a partir de medios de cultivo o material clmico directo.
Preferentemente, el metodo de caracterizacion de dicha enzima de acuerdo con la invencion comprende la determinacion del grado de modificacion, preferentemente degradacion, de dicho antibiotico betalactamico con o sin presencia de inhibidores enzimaticos espedficos y/o la velocidad de produccion del producto de modificacion enzimatica de dicho compuesto o sustrato o la velocidad de superproduccion de la diana molecular de dicho compuesto para, de esta forma, determinar la constante Michaelis-Menten (Km) y la velocidad maxima de reaccion (Vmax) de dicha enzima.
En otra preparacion preferida de dicho metodo, los espectros de masas se obtienen mediante espectrometna de masas MALDI con analizador de triple cuadrupolo.
En otra preparacion preferida de dicho metodo, la muestra expuesta es un lisado celular crudo expuesto de dicho microorganismo.
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En otra preparacion preferida de dicho metodo, el metodo comprende ademas el paso de cuantificacion del microorganismo. Preferentemente, el microorganismo se cuantifica contando en dichas muestras una o mas biomoleculas estructurales o metabolitos derivados de dicho microorganismo. En preparaciones preferidas, las biomoleculas estructurales o los metabolitos se seleccionan del grupo de acidos nucleicos, preferentemente ADN (genomico). El ADN esta presente dentro de la celula como una unica molecula y se puede cuantificar utilizando, por ejemplo, tecnologfas con sondas de ADN y/o PCR.
Se describe un programa de ordenador que comprende medios de codigo para realizar todos los pasos del metodo de la invencion, tal y como se ha descrito arriba, cuando dicho programa se ejecuta en un ordenador.
Se describe un programa de ordenador que comprende medios de codigo almacenados en un medio legible por un ordenador para realizar el metodo de la invencion, tal y como se ha descrito, cuando dicho programa se ejecuta en un ordenador.
Descripcion detallada de la invencion Definiciones
Los terminos «antibiotico» y «compuesto antimicrobiano» se utilizan aqrn de forma intercambiable y se emplean para describir un compuesto que reduce la viabilidad de un microorganismo, o que inhibe el crecimiento o reproduccion de un microorganismo. «Inhibe el crecimiento o reproduccion» significa que aumenta la duracion del ciclo de generacion a un periodo que es al menos dos veces superior, preferentemente al menos diez veces superior, mas preferentemente al menos 100 veces superior, y aun mas preferente aumenta indefinidamente, como en la muerte celular total. Tal y como se utiliza en esta memoria, se preve ademas que el antibiotico incluya una sustancia antibacteriana, bacterioestatica o bactericida. Algunos ejemplos de antibioticos utiles en aspectos de la invencion son las penicilinas, cefalosporinas, aminoglucosidos, sulfonamidas, macrolidas, tetraciclinas, lincosamidas, quinolonas, cloranfenicol, glucopeptidos, metronidazol, rifampicina, isoniazida, espectinomicina, inhibidores de folato, sulfametoxazol y otros antibioticos.
El termino «antibiotico betalactamico» se utiliza para designar compuestos con propiedades antibioticas que incluyan un grupo funcional betalactamico. Un anillo betalactamico (p-lactamico) es una amida dclica que comprende una estructura anular heteroatomica formada por tres atomos de carbono y uno de nitrogeno. Algunos ejemplos de antibioticos betalactamicos utiles en aspectos de la invencion son las penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, penemicos, carbapenemicos y monobactamicos. Los antibioticos betalactamicos son eficaces (si no hay resistencia) frente a una amplia gama de infecciones bacterianas. El termino «antibiotico betalactamico», tal y como se utiliza aqrn, incluye cualquier antibiotico que experimente cambios de masa o estructura tras ser inactivado por un microorganismo resistente a los antibioticos, siempre que dicho cambio de masa o estructura pueda detectarse mediante espectrometna de masas.
El termino «cefalosporina de tercera generacion» se refiere a este tipo de compuestos e incluye, de forma no exhaustiva: cefixima, ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, cefcapene, cefdaloxima, cefdinir, cefditoren, cefetamet, cefmenoxima, cefodizima, cefoperazona, cefotaxima, cefpimizol, cefpiramida, cefpodoxima, cefsulodina, cefteram, ceftibuteno, ceftioleno, ceftizoxima y oxacefem.
El termino «betalactamasa» hace referencia a una enzima (EC 3.5.2.6) sintetizada por un microorganismo, preferentemente una bacteria, que tiene la capacidad de hidrolizar el anillo betalactamico de los antibioticos betalactamicos. Estas enzimas a menudo se clasifican en cuatro clases principales (clases A, B, C y D) de acuerdo con un sistema de clasificacion denominado Ambler, basado principalmente en la homologfa protemica. Entre los ejemplos de betalactamasas se incluyen la cefalosporinasa, penicilinasa, carbenicilinasa, cloxacilanasa, carbapenemasa y ceftazidimasa. Esto significa que el termino incluye la betalactamasa «normal», la betalactamasa de espectro extendido (BLEE) y la betalactamasa AmpC. Las betalactamasas preferidas en aspectos de la presente invencion son las betalactamasas de los grupos A y D de acuerdo con la clasificacion Ambler o enzimas betalactamicas pertenecientes al grupo 2 de acuerdo con la clasificacion de Bush (Bush et al., Antimicrob Agents Chemother, vol. 39, 1995, pags. 1211-33). Las betalactamasas de la clase A de Ambler son las clasicas betalactamasas con serina en su sitio activo y las de la clase D son un grupo espedfico de serino-betalactamasas que presentan una reducida similitud secuencial con las betalactamasas de clase A y que se conocen coloquialmente como el grupo OXA (oxacilinasa). Tambien la metalo-carbapenemasa es una betalactamasa preferida.
El termino «betalactamasa de espectro extendido» (abr. BLEE), tal y como se emplea aqrn, inicialmente denominada «betalactamasa de amplio espectro extendido», fue acunado por primera vez para derivados de enzimas TEM y SHV capaces de hidrolizar oximino-cefalosporinas. Todas ellas pertenecen al grupo funcional de betalactamasas 2be. Posteriormente el termino se ha ampliado para incluir: (i) enzimas con espectros parecidos a los de los mutantes TEM y SHV pero derivados de otras fuentes, p. ej. los tipos CTX-M y VEB; (ii) mutantes TEM y SHV con actividad BLEE en el lfmite, p. ej. TEM-12; y (iii) diversas betalactamasas que proporcionan una resistencia mas amplia que sus tipos originarios pero que no cumplen la definicion del grupo 2be, p. ej. los derivados de OXA y los
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tipos AmpC mutantes con una mayor actividad contra la cefepima.
Los terminos «resistente» y «resistencia», tal y como se utilizan aqm, se refieren al fenomeno de que un microorganismo no presente una viabilidad reducida o una inhibicion de crecimiento o reproduccion cuando se expone a concentraciones de la sustancia antimicrobiana que pueden alcanzarse con las pautas posologicas terapeuticas normales en humanos. Implica que una infeccion causada por este microorganismo no puede tratarse satisfactoriamente con esta sustancia antimicrobiana.
El termino «microorganismo», tal y como se utiliza aqm, se refiere concretamente a microorganismos patogenos, como las bacterias, levaduras, hongos y parasitos intra o extracelulares. En aspectos preferidos de la presente invencion, el termino se refiere a bacterias patogenas u oportunistas. Estas incluyen tanto a bacterias grampositivas como gramnegativas. Como bacterias gramnegativas cabe mencionar las bacterias de los siguientes generos: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Pasteurella, Providencia, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedecea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas y Legionella. Como bacterias grampositivas cabe mencionar las bacterias de los siguientes generos: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria y Corynebacteria. En cuanto a las levaduras y hongos, se pueden mencionar las levaduras de los siguientes generos: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces y Trichosporon.
El termino «espectro de masa», tal y como se utiliza aqm, se refiere a una representacion grafica cuya variable independiente sea la masa molecular o una funcion de esta (p. ej. el cociente de masa/carga [m/z], la masa de iones, etc.). La variable dependiente suele ser una medida cuantitativa, como la abundancia, la abundancia relativa, la intensidad, la concentracion, el numero de iones, el numero de moleculas, el numero de atomos, cuentas/milivoltio, cuentas, etc. Por ejemplo, en el contexto de los iones, un espectro de masa suele presentar el cociente de masa/carga (m/z) como variable independiente, donde m es la masa de la especie ionica y z es la carga de la especie ionica, y la variable dependiente es generalmente una abundancia de cada ion molecular y/o sus fragmentos ionicos. El termino «ion» se refiere a un atomo o un grupo de atomos que ha adquirido una carga electrica neta mediante la ganancia o perdida de uno o mas electrones o la ganancia o perdida de uno o mas protones. Un ion puede formarse de numerosos modos, incluida la ruptura de una molecula de gas por la accion de una corriente electrica, de rayos ultravioleta y otros rayos determinados, y/o de temperaturas elevadas.
El termino «espectro de masa de referencia», como se utiliza aqm, se refiere a un espectro de masa de control utilizado como referencia para el analisis comparativo.
El termino «sustrato de una enzima modificadora», tal y como se utiliza aqm, se refiere a cualquier compuesto (antibiotico o no) que pueda ser hidrolizado por una enzima modificadora de antibioticos. La modificacion enzimatica de dicho sustrato dara lugar a un producto de reaccion con un cociente de masa/carga (o espectro de masa) diferente al del sustrato original. El producto de reaccion, en caso de que la conversion enzimatica sea una degradacion, puede mencionarse aqm como «producto de degradacion».
El termino «enzima modificadora», tal y como se utiliza aqm, se refiere de manera amplia a una enzima modificadora de compuestos antimicrobianos, como por ejemplo una betalactamasa.
«Modificacion», tal y como se utiliza aqm, se refiere a una alteracion qmmica o ffsica (preferentemente qmmica) del compuesto antimicrobiano que lo inactiva en lo que respecta a su actividad antimicrobiana. La modificacion puede incluir una degradacion, que se refiere a la eliminacion de fracciones de la molecula del compuesto, lo cual resulta en una masa molecular mas reducida, opcionalmente en combinacion con un cociente de masa/carga alterado. De forma alternativa, la modificacion puede incluir la sustitucion o adicion de fracciones qmmicas en la molecula del compuesto, inactivando asf el compuesto en lo que respecta a su actividad antimicrobiana, modo este de modificacion que altera la masa de la molecula, opcionalmente en combinacion con un cociente de masa/carga alterado.
El termino «lisado celular», tal y como se utiliza aqm, se refiere a suspensiones celulares o fracciones de las mismas obtenidas por disrupcion o lisado de las celulas. El lisado celular crudo contiene todas las protemas, glucoprotemas, polisacaridos, lfpidos y acidos nucleicos. En los aspectos de la presente invencion, el lisado celular puede comprender celulas enteras, pero consiste principalmente en partes de celulas o cualquier fraccion o mezcla de las mismas obtenidas tras una fase de lisis. No obstante, las disoluciones de lisado celular pueden incluir, entre otros, una disolucion de celulas lisadas tratada de tal forma que las moleculas seleccionadas son eliminadas o inactivadas. La consecuencia es que esta disolucion permanece esencialmente «cruda» en lo que respecta a la mayona de componentes celulares purificados. Por ejemplo, un lisado celular puede ser una disolucion de celulas lisadas tratada con una sustancia que inactive o elimine los inhibidores de la polimerasa. Ademas, un lisado celular puede ser una disolucion de celulas lisadas tratada con un anticoagulante. Se puede utilizar cualquier metodo para realizar la lisis celular en una muestra celular. Por ejemplo, el choque osmotico, la sonicacion, el calentamiento, la ruptura ffsica, el tratamiento con microondas y la lisis enzimatica y/o alcalina son metodos aplicables para llevar a cabo la
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lisis celular.
El termino «medio de cultivo», tal y como se utiliza aqrn, se refiere a un medio que comprende todos los elementos necesarios para la expresion de un metabolismo y/o para el cultivo de microorganismos. El medio de cultivo puede ser solido, semisolido o Kquido. El medio de cultivo puede comprender uno o mas elementos en combinacion, como aminoacidos, peptonas, hidratos de carbono, nucleotidos, minerales, vitaminas, moleculas activas como antibioticos, enzimas, tensioactivos, tampones qmmicos, sales de fosfatos, sales de amonio, sales de sodio, sales metalicas, uno o mas sustratos que posibiliten la deteccion de la actividad de una enzima, etc.
El termino «sobrenadante», tal y como se utiliza aqrn, se refiere a la suspension lfquida que permanece una vez se retiran las celulas que han crecido en un medio lfquido (p. ej. un caldo) mediante centrifugacion, filtrado, sedimentacion u otros metodos habituales en este campo, y que contiene material disuelto y suspendido.
Los terminos «material de matriz» y «material de matriz para MALDI», tal y como se utilizan aqrn, son intercambiables y se refieren a un compuesto, ya sea en disolucion o solido, que puede usarse para formar una matriz para su uso en la espectrometna de masas MALDI. Para MALDI, el analito debe estar incrustado en un exceso considerable de moleculas con un alto nivel de absorcion a la longitud de onda a la que emite el laser. Estas moleculas de la matriz son generalmente compuestos organicos pequenos, principalmente acidos. Los materiales de matriz adecuados para cada tipo de laser utilizado en MALDI son conocidos en este campo, y el termino «material de matriz para MALDI» sera entendido claramente por un experto en la materia. Sin limitar el alcance de la presente invencion, algunos ejemplos de materiales de matriz utilizados habitualmente son el acido sinapmico (SA), el acido a-ciano-4-hidroxicinamico (HCCA), el acido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB), la 7-hidroxi-4-(trifluorometil)cumarina (HFMC), el acido 3-hidroxipicolmico (3-HPA), el 5-(trifluorometil)uracilo, el acido cafeico, el acido succmico, el acido antramlico, el acido 3-aminopiracina-2-carboxflico, la tetraquis(pentafluorfenil)porfirina y el acido felurico. Las matrices se disuelven adecuadamente en acetonitrilo/agua/acido formico (500:500:1; v/v/v), u otro cociente adecuado en funcion de la matriz utilizada.
El termino «muestra», tal y como se utiliza aqrn, se refiere a una sustancia que contiene o que se sospecha que contiene un analito, como un microorganismo o una betalactamasa por caracterizar, un sustrato de la betalactamasa o el producto de degradacion de la betalactamasa. Una muestra util en un metodo de la invencion puede ser un lfquido o un solido, puede estar disuelta o suspendida en un lfquido, puede estar en una emulsion o gel, y puede estar unida a o absorbida por un material. Una muestra puede ser una muestra biologica, una muestra ambiental, una muestra experimental, una muestra diagnostica o cualquier otro tipo de muestra que contenga o se sospeche que contiene el analito de interes. Como tal, una muestra puede ser, o puede contener, un organismo, organo, tejido, celula, fluido corporal, muestra de biopsia o fraccion de los mismos. Una muestra util en un metodo de la invencion puede ser cualquier material que se sospeche que contiene analitos, como sustratos de betalactamasas y BLEE. En un contexto biologico, una muestra puede incluir fluidos biologicos, organismos enteros, organos, tejidos, celulas, microorganismos, sobrenadantes de cultivo, organulos subcelulares, complejos protemicos, protemas individuales, protemas recombinadas, protemas de fusion, virus, partmulas vmicas, peptidos y aminoacidos.
El termino «soporte de la muestra», tal y como se utiliza aqrn, se refiere a todos los soportes que son aptos para recibir una muestra para el analisis de espectrometna de masas MALDI. Es habitual el uso de placas de acero inoxidable de 10xl0 (PerSeptive Biosystems, Framingham [MA, EE.UU.]); si fuera necesario, las placas pueden tener un revestimiento hidrofobico.
El termino «constante de Michaelis-Menten», a menudo denominada «Km», se refiere, tal y como se utiliza aqrn, a la concentracion del sustrato a la que la velocidad de reaccion enzimatica alcanza la mitad de su valor maximo. El termino «velocidad maxima de reaccion», a menudo referida como «Vmax», se refiere a la velocidad maxima de una reaccion enzimatica a concentraciones de saturacion de sustrato. La cinetica de Michaelis-Menten describe la velocidad de produccion de moleculas causada por reacciones qrnmicas enzimaticas. Para determinar la velocidad maxima de una reaccion enzimatica, la concentracion del sustrato se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formacion de producto. Esta es la velocidad maxima (Vmax) de la enzima. En este estado, los sitios activos de la enzima estan saturados con sustrato. Puesto que la concentracion de sustrato a Vmax no se puede medir con exactitud, las enzimas pueden caracterizarse por la concentracion de sustrato a la que la velocidad de reaccion es la mitad de su valor maximo. Esta concentracion de sustrato se denomina constante de Michaelis- Menten (Km). En el caso de reacciones enzimaticas que presenten una cinetica de Michaelis-Menten simple, esta constante constituye la constante de disociacion (afinidad por el sustrato) del complejo enzima-sustrato (ES). Los valores bajos indican una elevada afinidad.
El termino «espectrometna de masas MALDI con analizador de triple cuadrupolo», tal y como se utiliza aqrn, se refiere a una tecnica de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz en la que el espectrometro de masas tiene tres cuadrupolos paralelos a la trayectoria de los iones entrantes. El primer cuadrupolo actua como filtro de masa. El segundo cuadrupolo actua como celda de colision, en donde los iones seleccionados se rompen en fragmentos. Los fragmentos resultantes son escaneados por un tercer cuadrupolo. Los analizadores de masa de cuadrupolos utilizan campos electricos oscilantes para estabilizar o desestabilizar selectivamente las trayectorias de los iones que atraviesan un campo cuadrupolar de radiofrecuencia (RF). En cada momento, a traves del sistema pasa un unico
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cociente de masa/carga, pero las variaciones de los potenciales en las lentes magneticas permiten que se cubra rapidamente una amplia gama de valores m/z, bien sea de forma continua o en una sucesion de saltos discontinuos. Un analizador de masa de cuadrupolo actua como filtro de masa.
El termino «cuantificacion», tal y como se utiliza aqm, se refiere a cualquier metodo para obtener una medida cuantitativa. Por ejemplo, la cuantificacion de un microorganismo puede comprender la determinacion de su abundancia, abundancia relativa, intensidad, concentracion y/o recuento, etc.
El termino «biomolecula estructural», tal y como se utiliza aqm, se refiere a cualquier protema celular, glucoprotema, polisacarido, lfpido, acido nucleico, etc., cuya cantidades es esencialmente constante entre cada una de las celulas de un cultivo de microorganismos, y que se puede utilizar para cuantificar esos microorganismos. Si, por ejemplo, se utiliza ADN, la cuantificacion se puede realizar mediante la amplificacion de ADN o el uso de sondas de acidos nucleicos (identificables mediante espectrometna de masas). Estos metodos de cuantificacion pueden utilizar, por ejemplo, curvas de calibracion estandar en donde el contenido de ADN se representa en funcion del numero de celulas u otro parametro de biomasa (como la absorbancia en el cultivo o la masa total de carbono).
El termino «metabolito», tal y como se utiliza aqm, se refiere a un compuesto generado como resultado de una reaccion bioqmmica en una celula u organismo, cuya cantidad es esencialmente constante entre cada una de las celulas de un cultivo de microorganismos, y que se puede utilizar para cuantificar esos microorganismos.
Preparaciones preferidas
La invencion da a conocer un metodo para caracterizar la resistencia a los antibioticos de un microorganismo. Un primer paso de ese metodo es el suministro de uno o mas espectros de masa de referencia de compuestos antibioticos o sustratos mimeticos adecuados de los mismos, o de dianas moleculares del compuesto antibiotico cuya resistencia se vaya a caracterizar. Se pueden obtener espectros de referencia aplicando cualquier tecnica de espectrometna de masas que se vaya a utilizar en el analisis de las muestras. Una tecnica de espectrometna de masas preferida es MALDI-MS.
Cualquier antibiotico betalactamico constituye un sustrato de betalactamasa adecuado. De forma alternativa se pueden utilizar derivados betalactamicos o mimeticos que induzcan la expresion de la betalactamasa en el microorganismo, y/o que sean hidrolizados por la actividad enzimatica de la betalactamasa. Los sustratos mimeticos utilizados en los aspectos de la invencion pueden, pero no tienen por que, mostrar alguna actividad antibiotica.
Preferentemente, el sustrato de la betalactamasa es un compuesto del cual se puede diferenciar facilmente el producto de degradacion de la betalactamasa mediante espectrometna de masas, preferentemente de tal forma que el sustrato y su producto de degradacion posean diferentes cocientes de masa/carga.
El siguiente paso de un metodo preferido para caracterizar la resistencia a los antibioticos betalactamicos de un microorganismo implica la exposicion de un microorganismo, un lisado celular del mismo o el sobrenadante de un cultivo de crecimiento del mismo, al compuesto del sustrato en lfquido acuoso para asf obtener una muestra expuesta.
Una muestra expuesta adecuada puede ser una muestra de fluido corporal o de tejido corporal de un sujeto, es decir, un humano o un animal, del que se sospecha que sea portador de un microorganismo cuya resistencia a los antibioticos betalactamicos se vaya a caracterizar. Una muestra de sangre, de heces o de orina constituyen muestras de fluidos corporales adecuadas.
La exposicion del microorganismo al compuesto del sustrato puede, por tanto, implicar una exposicion in vivo o in vitro.
La exposicion puede comprender, en ciertas preparaciones, una fase de incubacion en donde el microorganismo es incubado durante un breve periodo de tiempo, por ejemplo entre 1-5 minutos y 1-3 horas en una disolucion que contenga las sustancias antimicrobianas de interes. Adicionalmente se pueden utilizar lisados de microorganismos y sobrenadantes de cultivos microbianos. Cuando las enzimas espedficas estan presentes, las sustancias antimicrobianas o sus sustratos mimeticos se modifican o inactivan, lo que resulta en una composicion de elementos diferente en comparacion con la forma activa del farmaco. Esto conduce a un cambio en la masa de la sustancia antimicrobiana que puede detectarse mediante espectrometna de masas.
Una ventaja de la presente invencion es el hecho de que los lisados celulares crudos tambien se pueden utilizar para obtener una muestra expuesta. Por lo tanto, no es necesario que el microorganismo que se va a caracterizar siga siendo viable, ni es preciso purificar antes la muestra expuesta para poder detectar en ella alguna actividad de la betalactamasa.
Cuando un microorganismo contiene un gen de betalactamasa pero no sintetiza la propia enzima bajo las condiciones de crecimiento actuales, se puede inducir la smtesis de betalactamasa en ese organismo mediante el
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cultivo del microorganismo en presencia de un antibiotico betalactamico o un compuesto que sintetice betalactamasa. Preferentemente se lleva a cabo un paso opcional de induccion o activacion de la smtesis de betalactamasa antes de la lisis celular bacteriana.
En general, es posible detectar la capacidad de la muestra expuesta para modificar un compuesto antibiotico mediante la deteccion de un descenso del sustrato antibiotico (o su mimetico) o de un aumento del producto de reaccion de la hidrolisis que tiene lugar entre la enzima modificadora y el compuesto del sustrato. Por lo tanto, es posible detectar la actividad de la betalactamasa en la muestra expuesta mediante la deteccion de un descenso del sustrato de la betalactamasa o un aumento del producto de reaccion de la hidrolisis que tiene lugar entre la betalactamasa y el sustrato.
De manera alternativa, se puede detectar la capacidad de la muestra expuesta para modificar un compuesto antibiotico mediante la deteccion de una modificacion en la diana molecular del compuesto antibiotico. Por ejemplo, la resistencia a la eritromicina, la ciprofloxacina, la vancomicina, la meticilina y la tetraciclina se basa en la modificacion de la diana, como la metilacion de ARN. Estas modificaciones de la diana tambien se pueden detectar mediante espectrometna de masas, tal y como se describe aqrn. Por lo tanto, la presente invencion no se limita a la deteccion de betalactamasas como enzimas modificadoras y, por tanto, la caracterizacion de resistencia a los antibioticos betalactamicos. Aplicando aspectos de la presente invencion se puede caracterizar tambien otra resistencia a compuestos antibioticos que no se basa en la modificacion del farmaco. Aunque habitualmente las betalactamasas inactivan los antibioticos por hidrolisis, tambien se pueden detectar y determinar otros tipos de modificacion enzimatica aplicando medios y metodos de la presente invencion. Por ejemplo, los aminoglucosidos se modifican por la adicion de una fraccion de fosfato. Estas modificaciones del sustrato de la enzima modificadora tambien se pueden detectar con los metodos de la presente invencion.
Un importante hallazgo de los presentes inventores es que se puede medir con gran precision el cambio en la (cantidad de) reaccion o compuestos objetivo mediante espectroscopia de masas. Por lo tanto, tras el paso de incubacion, la muestra expuesta se prepara para la espectrometna de masas aplicando los protocolos genericos de preparacion de la muestra de espectrometna de masas, como la precipitacion de protemas con disolventes organicos, la extraccion en fase solida (SPE) o la extraccion lfquido-lfquido (LLE). Aproximadamente 1 pl de la disolucion preparada se utiliza para el analisis mediante espectrometna de masas. En preparaciones preferidas de la presente invencion, se utiliza espectrometna de masas mAlDI y, mas preferentemente, la espectrometna de masas MALDI con analizador cuadrupolar. Si se utiliza la espectrometna de masas MALDI, los compuestos de la reaccion se pueden medir con tal precision que los tiempos de exposicion (periodos de incubacion) pueden ser muy breves. Se han logrado resultados satisfactorios con un tiempo de incubacion de aproximadamente 5 minutos.
La espectrometna de masas MALDI implica la colocacion de la muestra expuesta junto con un material de matriz en un soporte de muestras para espectrometna de masas y el secado de la muestra sobre el soporte para producir una muestra para espectrometna de masas. Arriba se indican materiales de matriz adecuados, no siendo la naturaleza del material de matriz particularmente restrictiva. La preparacion de la muestra para espectrometna de masas a partir de la muestra expuesta se puede llevar a cabo mediante metodos conocidos por los expertos en el campo de la espectrometna de masas.
Una vez la muestra se ha montado en el espectrometro de masas, el espectro de masa de la muestra se obtiene mediante procedimientos estandar que dependen del tipo de equipamiento y los metodos de espectrometna de masas utilizados.
En un metodo de la invencion, el paso de deteccion de modificacion del sustrato o de la diana (como la degradacion del sustrato de la betalactamasa o la metilacion de ARN) se lleva a cabo utilizando la espectrometna de masas, preferentemente mediante espectrometna de masas en tandem (MS-MS) o mediante desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI). La espectrometna de masas proporciona un potente medio para determinar la estructura e identidad de moleculas organicas complejas, incluidas protemas y peptidos. En la espectrometna de masas, un compuesto de muestra es bombardeado con electrones de alta energfa que provocan que se fragmente de una forma caractenstica. Los fragmentos, que poseen pesos y cargas diversas, atraviesan a continuacion un campo magnetico y se separan de acuerdo con sus cocientes de masa/carga. El patron de fragmentacion caractenstico resultante del compuesto de muestra (el espectro de masa) se utiliza para identificar y cuantificar ese compuesto. Un procedimiento habitual de espectrometna de masas comprende los siguientes pasos:
1. Carga de una muestra en el espectrometro de masas, aplicando opcionalmente (en caso de una forma especial de espectrometna de masas denominada MALDI) la muestra junto con una matriz sobre un soporte de muestras para espectrometna de masas y secando la muestra o la mezcla sobre el soporte por evaporacion de los disolventes.
2. Ionizacion de los componentes de la muestra mediante uno de los diversos metodos posibles (p. ej. dirigiendo hacia ellos un haz de electrones), lo que resulta en la formacion de partmulas cargadas (iones).
3. Aceleracion de los iones positivos mediante un campo electrico.
4. Calculo del cociente de masa/carga (m/z) de las partmulas a partir de los detalles del movimiento de los iones cuando atraviesan los campos electromagneticos.
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5. Deteccion de los iones, que han sido clasificados en el paso 4 conforme a m/z.
En la espectrometna de masas MALDI, la matriz esta formada por moleculas cristalizadas, tres ejemplos adecuados de las cuales son el acido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinamico (acido sinapmico), el acido a-ciano-4-hidroxicinamico (a- ciano o a-matriz) y el acido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB). La disolucion de la matriz se mezcla con la muestra expuesta. El disolvente organico permite que las moleculas hidrofobicas se disuelvan en la disolucion, mientras que el agua permite que las moleculas solubles en agua (hidrofflicas) hagan lo mismo. Se aplica una gota de esta disolucion en una placa o soporte de MALDI (generalmente una placa metalica disenada para este fin). Los disolventes se evaporan, dejando unicamente la matriz recristalizada junto con las moleculas de la muestra dispersas por todos los cristales de la matriz.
Entre las aplicaciones de la espectrometna de masas adecuadas que se pueden utilizar en aspectos de la invencion se incluye la espectrometna de masas MALDI-TOF, la espectrometna de masas MALDI-FT, la espectrometna de masas MALDI-FT-ICR y la espectrometna de masas MALDI con analizador de triple cuadrupolo. Cuando se utiliza la espectrometna de masas MALDI-TOF se calcula un rendimiento de 1 minuto por muestra. Cuando se utiliza la espectrometna de masas MALDI con analizador de triple cuadrupolo, la duracion de la prueba se puede reducir a aproximadamente 5 segundos por muestra sin perder sensibilidad ni especificidad.
Tras la obtencion de los espectros de masa, los espectros de masa derivados de la muestra se comparan con los espectros de masa de referencia del compuesto antimicrobiano, de su producto de modificacion enzimatica, de su diana molecular o de un sustrato de su enzima modificadora de una forma cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa. Mediante esta comparacion se puede determinar la presencia cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa de modificacion del sustrato o la diana y/o la produccion de productos de modificacion.
Tanto el antibiotico inactivado o modificado (p. ej. el producto de degradacion) como el sustrato antibiotico intacto (o el sustrato mimetico), asf como la diana molecular, se pueden medir simultaneamente por espectrometna de masas, y el cociente de producto/sustrato puede, por ejemplo, tomarse como medida de la capacidad del microorganismo para inactivar o modificar los sustratos probados. De forma alternativa o adicional, se puede tomar un descenso de la concentracion del sustrato unicamente o un aumento de la concentracion del producto unicamente, en la muestra, como medida de la capacidad del microorganismo para inactivar o modificar el antibiotico. Alternativamente, se puede tomar un aumento de la concentracion de la diana molecular o un aumento de la concentracion de la diana modificada (resistente) como indicacion de la resistencia del microorganismo. En caso de que se caracterice una resistencia a los antibioticos que afecte a farmacos que conlleven una modificacion de la diana como mecanismo de resistencia, el paso de exposicion de un microorganismo, un lisado celular del mismo o el sobrenadante de un medio de cultivo del mismo, a un compuesto antimicrobiano en lfquido acuoso equivale al suministro de una muestra del microorganismo, un lisado celular del mismo o el sobrenadante de un medio de cultivo del mismo, y la deteccion con ello de dianas modificadas.
Por lo tanto, en una preparacion de aspectos de la invencion, la modificacion del sustrato antimicrobiano se toma como prueba de la smtesis de, por ejemplo, una betalactamasa por parte del microorganismo, e indica que el microorganismo probablemente sea resistente a los compuestos antibioticos betalactamicos que han sido inactivados, por ejemplo mediante degradacion, por esa betalactamasa espedfica para la que se ha suministrado un sustrato antimicrobiano o un sustrato mimetico adecuado. De esta forma se puede caracterizar la resistencia de dicho microorganismo a, por ejemplo, un antibiotico betalactamico.
Se da a conocer que la presencia de una modificacion (en la cantidad relativa o en la composicion qmmica) de la diana molecular del compuesto antimicrobiano en la celula microbiana se toma como indicador de que el microorganismo probablemente sea resistente al compuesto antibiotico de interes. De esta forma, se puede caracterizar la resistencia de dicho microorganismo a, por ejemplo, la eritromicina, la ciprofloxacina, la vancomicina, la meticilina y la tetraciclina.
Se da a conocer un metodo para el diagnostico rapido de microorganismos que producen enzimas que inactivan o modifican la estructura de sustancias antimicrobianas. El metodo puede utilizarse para una rapida deteccion de actividad de BLEE. Esto es necesario especialmente en el ambito hospitalario, ya que el uso de cefalosporinas de tercera generacion esta muy extendido en el tratamiento empmco de pacientes con infecciones gravemente enfermos. La rapida deteccion de actividad de BLEE en la muestra de un paciente es importante para iniciar lo antes posible el tratamiento antibiotico apropiado para ese paciente. Los metodos pueden utilizarse para una rapida deteccion de actividad de BLEE. Ademas, los metodos pueden aplicarse sobre sobrenadantes de cultivos microbianos o en microorganismos aislados directamente a partir de una muestra del paciente, p. ej. tras centrifugacion de muestras de orina. De esta forma, debena ser posible detectar actividad de BLEE incluso antes de detectar las propias bacterias (cultivadas).
La espectrometna de masas no se ha utilizado para detectar la inactivacion enzimatica o la modificacion qmmica de antibioticos mediante la monitorizacion del descenso de la intensidad del sustrato y/o el aumento de la intensidad del producto. Ademas, la espectrometna de masas no se ha utilizado para analizar la actividad enzimatica en muestras complejas como microorganismos lisados. Mas concretamente, nunca se ha informado sobre la deteccion y
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caracterizacion espedfica de enzimas BLEE mediante espectrometna de masas.
Un metodo diagnostico para la deteccion rapida de actividad de BLEE comprende liberar de los microorganismos las enzimas betalactamasas que inhiben los antimicrobianos mediante el lisado de la muestra utilizando un reactivo lttico. Posteriormente estos lisados se pueden transferir, preferentemente utilizando un pipetor automatico, a una tira multipocillos, como las tiras ATBtm o Rapidec™, tiras estas que contienen pocillos con reactivos para provocar diferentes reacciones basadas en diferentes compuestos antimicrobianos. Algunos pocillos contienen una cierta cantidad de uno o varios sustratos de la betalactamasa, por ejemplo en una forma seca o inmovilizada (pegada). Algunos pocillos podnan tambien contener uno o varios patrones internos para facilitar la cuantificacion. Algunos pocillos tambien podnan utilizarse a modo de referencia, sin sustratos, para la autodegradacion de los compuestos antimicrobianos.
Tras la transferencia a los pocillos y la incubacion ad durante un breve periodo de tiempo tal y como se ha indicado aqrn, la muestra expuesta de cada pocillo puede colocarse de forma adecuada sobre una placa de MALDI o cualquier otro soporte de espectrometna de masas. En el caso de MALDI, se anade al soporte un material de matriz adecuado. A continuacion se obtienen los espectros de masa. El analisis de espectros se debe realizar utilizando algoritmos de analisis espedficos. Los espectros, tal y como se obtienen a partir de la muestra expuesta, se comparan a continuacion con espectros de referencia utilizando un software informatico, con el fin de determinar la presencia de degradacion del sustrato para cada pocillo. En caso de degradacion, el software disenado al efecto puede proporcionar los resultados de la prueba en un informe, el cual puede incluir, por ejemplo: (1) la identidad (nombre de la especie) del microorganismo (identificacion que puede realizarse mediante pruebas de referencia, disponibles opcionalmente en la misma tira reactiva o en una paralela), (2) una lista de los antimicrobianos analizados, tal y como se suministra en la tira reactiva multipocillos, (3) una lista de antimicrobianos inhibidos o degradados por el microorganismo, (4) el mecanismo o mecanismos de resistencia a los que se atribuye la inhibicion del antimicrobiano, (5) interpretaciones espedficas de los resultados.
Alternativamente, el paso de exponer un microorganismo, un lisado celular del mismo o el sobrenadante de un medio de cultivo del mismo, a dicho sustrato en lfquido acuoso (para asf obtener una muestra expuesta) puede realizarse sobre el soporte de la muestra para espectrometna de masas. Tras permitir que las enzimas betalactamicas, presentes de forma opcional, degraden el sustrato de una betalactamasa sobre el soporte de muestras, la matriz de MALDI puede anadirse directamente a la muestra expuesta.
Se puede aplicar un metodo de la presente invencion utilizando muestras complejas, incluidos lisados celulares crudos o muestras de pacientes. El metodo permite la evaluacion precisa de moleculas en la gama de tamanos de las sustancias antimicrobianas (normalmente entre 200 y 1000 Da) y se puede usar para determinar la actividad de la enzima que inactiva o modifica el antibiotico, por ejemplo al utilizar farmacos antimicrobianos como sustratos.
Un metodo de la presente invencion puede utilizarse ademas como prueba confirmatoria de BLEE. En la mayona de laboratorios de microbiologfa clmica las bacterias se someten en primer lugar a un cribado para determinar el fenotipo de BLEE y, a continuacion, el fenotipo de BLEE se confirma utilizando una prueba confirmatoria fenotfpica de BLEE independiente. Algunos aspectos de la presente invencion pueden utilizarse para confirmar el fenotipo de BLEE en bacterias. El beneficio potencial de un metodo de la presente invencion sobre las pruebas fenotfpicas actuales es que el metodo aqrn propuesto no solo funciona con suspensiones bacterianas sino tambien con lisados de bacterias. El uso de lisados de bacterias neutraliza el sesgo potencial originado por la resistencia basada en otros mecanismos, en particular una reduccion de la entrada o un aumento de la salida de farmacos. El uso de lisados bacterianos es incompatible con las pruebas confirmatorias fenotfpicas de BLEE actuales, ya que estas pruebas se basan en el crecimiento bacteriano.
Un metodo de la presente invencion puede utilizarse tambien como metodo de cribado de alto rendimiento para nuevos inhibidores de betalactamasa en el sector farmaceutico. Actualmente el acido clavulanico y el tazobactam, inhibidores de betalactamasa, se combinan con la amoxicilina y la piperacilina respectivamente para superar el problema de las bacterias que sintetizan betalactamasa. El acido clavulanico o el tazobactam inhiben la actividad de las betalactamasas mientras que la amoxicilina o la piperacilina eliminan las bacterias. Teniendo en cuenta el problema creciente de las BLEE, el sector farmaceutico necesita herramientas de cribado para identificar nuevos compuestos que inhiban las BLEE. La presente invencion es muy apropiada para este objetivo.
Ejemplos
Hemos detectado actividad de betalactamasas en lisados crudos de E. coli que sintetizan CTX-M-1 y CTX-M-9 y en K. pneumoniae que sintetiza SHV-2 utilizando la bencilpenicilina como sustrato. Hemos sido capaces de monitorizar la cinetica enzimatica de la penicilinasa pura (de B. cereus) utilizando la bencilpenicilina como sustrato.

Claims (11)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para establecer si un microorganismo es potencialmente resistente a un antibiotico betalactamico, que consta de los siguientes pasos:
    (a) proporcionar un espectro de masa de referencia del antibiotico betalactamico o su producto de modificacion enzimatica;
    (b) exponer un microorganismo, un lisado celular del mismo o el sobrenadante de un medio de cultivo del mismo a dicho antibiotico betalactamico en lfquido acuoso para, de ese modo, obtener una muestra expuesta;
    (c) adquirir un espectro de masas de la muestra expuesta;
    (d) comparar el espectro de masa obtenido en el paso (c) con el espectro de masa de referencia del paso (a) y
    (e) determinar a partir de dicha comparacion si se ha producido una modificacion de dicho antibiotico betalactamico tras dicha exposicion, y establecer si dicho microorganismo es potencialmente resistente a dicho antibiotico betalactamico cuando se observa dicha modificacion, donde tras el paso (b) dicha muestra expuesta se coloca, junto con un material de matriz, en un soporte de muestras para espectrometna de masas para obtener una muestra de espectrometna de masas para la espectrometna de masas mediante desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI-MS).
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en donde dicha modificacion comprende la inactivacion enzimatica o la degradacion enzimatica de dicho antibiotico betalactamico.
  3. 3. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho microorganismo es sospechoso de sintetizar betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y se ha seleccionado de entre Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca y Proteus mirabilis.
  4. 4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichos espectros de masas se obtienen utilizando la espectrometna de masas MALDI con analizador de triple cuadrupolo, la espectrometna de masas MALDI-TOF o la espectrometna de masas MALDI-FT-ICR.
  5. 5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha muestra expuesta es un lisado celular crudo de dicho microorganismo expuesto a un antibiotico betalactamico.
  6. 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde en el paso (b) dicho microorganismo se cuantifica contando en dichas muestras una o mas biomoleculas estructurales o metabolitos derivados de dicho microorganismo.
  7. 7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha muestra expuesta es una muestra de fluido corporal o de tejido corporal de un sujeto humano o animal del que se sospecha que sea portador de un microorganismo cuya resistencia a los antibioticos betalactamicos se tiene que caracterizar.
  8. 8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antibiotico betalactamico se selecciona del grupo formado por penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbapenemicos, ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona, cefpodoxima y aztreonam.
  9. 9. Metodo segun las reivindicaciones 1 a 8, en donde se mide mediante espectrometna de masas una reduccion de la concentracion de antibiotico betalactamico unicamente o un aumento de la concentracion de un producto de reaccion unicamente y se utiliza como medida de la modificacion.
  10. 10. Metodo segun las reivindicaciones 1 a 8, en donde tanto el antibiotico betalactamico inactivado o modificado como el antibiotico betalactamico intacto se miden simultaneamente mediante espectrometna de masas y el cociente de producto/sustrato se utiliza como medida de la modificacion.
  11. 11. Un metodo para establecer si un microorganismo es potencialmente resistente a un antibiotico betalactamico, que consta de los siguientes pasos:
    (a) proporcionar un espectro de masa de referencia del antibiotico betalactamico o su producto de modificacion enzimatica;
    (b) exponer un microorganismo, un lisado celular del mismo o el sobrenadante de un medio de cultivo del mismo a dicho antibiotico betalactamico en lfquido acuoso para, de ese modo, obtener una muestra expuesta;
    (c) adquirir un espectro de masas de la muestra expuesta;
    (d) comparar el espectro de masa obtenido en el paso (c) con el espectro de masa de referencia del paso (a) y
    (e) determinar a partir de dicha comparacion si se ha producido una modificacion de dicho antibiotico betalactamico tras dicha exposicion, y establecer si dicho microorganismo es potencialmente resistente a dicho antibiotico betalactamico cuando se observa dicha modificacion, donde el paso de exposicion del microorganismo, el lisado celular del mismo o el sobrenadante de un medio de cultivo del mismo a dicho antibiotico betalactamico en lfquido acuoso se realiza en el soporte de muestras para espectrometna de masas y
    donde dicha muestra se seca en el soporte de muestras para obtener una muestra para espectrometna de masas para la espectrometna de masas mediante desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI-MS).
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