TWI774454B - 抗藥性微生物預測方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種抗藥性微生物預測方法，包含下述步驟。提供一待測樣品。進行一樣品前處理步驟，以得一處理後樣品。進行一分析步驟，其係以一質譜分析法偵測處理後樣品，以得一目標質譜圖譜資料。進行一圖譜前處理步驟，以得一標準化目標質譜圖譜資料。進行一特徵提取步驟，以得一圖譜特徵值。進行一判斷步驟，其係利用抗藥性預測演算分類器根據圖譜特徵值輸出一抗藥性微生物預測結果。藉此，本發明之抗藥性微生物預測方法可大幅縮短微生物培養與鑑定和抗生素敏感性試驗所需的時間，並具有相關市場的應用潛力。

Description

抗藥性微生物預測方法
本發明是有關於一種生物醫學訊號分析方法，特別是一種抗藥性微生物預測方法。
微生物抗藥性是一種自然發生的現象，但濫用或錯用抗生素將會加速微生物對抗生素之抗藥性的發生。再者，多重抗藥性細菌和泛抗藥性細菌(俗稱超級細菌)已在全球快速傳播，並逐漸成為世界上相關領域所急迫解決之共通議題。
常見的細菌性感染，如敗血症、腦膜炎、肺炎、尿道感染等，常以急性症狀表現於臨床上，是以正確判斷引起感染之微生物種類及其可能之抗生素敏感性表現遂特別重要。現行臨床診斷細菌性感染的黃金標準是依據實驗室的微生物培養與鑑定和抗生素敏感性試驗的結果作為施用抗生素治療的依據。然而，現行檢體之微生物培養與鑑定以及抗生素敏感性試驗需花費至少72小時以上，始可順利發出完整的微生物培養報告，如此一來不僅有延宕治療之虞，對於病情的預後亦不甚理想。
為了解決上述問題，臨床上進一步使用基質輔助雷射脫附游離/飛行時間 (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight, MALDI-TOF)質譜分析法鑑定引起感染之微生物種類，以縮短利用生化方式鑑定菌種的時間，然而，在確認菌種之後，其後續之微生物抗生素敏感性試驗仍須耗時至少24小時以上，如此一來，對於治療細菌性感染所引起之急性症狀上亦緩不濟急。
有鑑於此，如何提供一種可快速且準確地鑑定誘發細菌性感染之微生物及其抗生素感受性測試結果，以對抗生素的使用提供更可靠的依據，遂成為相關學界及業界所致力發展的目標。
本發明之一態樣是在於提供一種抗藥性微生物預測方法，其係用以判斷一待測微生物是否為一抗藥性微生物，包含下述步驟。提供一待測樣品，其中待測樣品包含所述之待測微生物。進行一樣品前處理步驟，其係以一常規樣品處理方法或一快速樣品處理方法處理待測樣品，以得一處理後樣品。進行一分析步驟，其係以一質譜分析法偵測處理後樣品，以得一目標質譜圖譜資料。進行一圖譜前處理步驟，其係對目標質譜圖譜資料進行前處理，以得一標準化目標質譜圖譜資料。進行一特徵提取步驟，其係將標準化目標質譜圖譜資料以一抗藥性預測演算分類器進行訓練至收斂，以得一圖譜特徵值。進行一判斷步驟，其係利用抗藥性預測演算分類器根據所述之圖譜特徵值輸出一抗藥性微生物預測結果，且所述之抗藥性微生物預測結果係判斷待測微生物是否為抗藥性微生物。
依據前述實施方式之抗藥性微生物預測方法，其中快速樣品處理方法可以一逐步離心法處理待測樣品，且逐步離心法包含下述步驟。進行一離心步驟，其係對待測樣品進行多次離心，以得一離心後樣品，其中離心後樣品包含所述之待測微生物。進行一反應步驟，其係於離心後樣品中加入一反應試劑並充分混合，以得一反應後樣品。進行一最終離心步驟，其係離心反應後樣品，以得所述之處理後樣品。其中，反應試劑包含巰基乙酸肉湯(Thioglycolate broth)、乙醇、甲酸或乙腈。
依據前述實施方式之抗藥性微生物預測方法，其中圖譜前處理步驟可包含下述步驟。進行一校正步驟，其係移除目標質譜圖譜資料的一背景雜訊，以得一第一處理後目標質譜圖譜資料。進行一採樣標準化步驟，其係調整第一處理後目標質譜圖譜資料的一時間解析率數值，以得一第二處理後目標質譜圖譜資料。進行一圖譜轉換步驟，其係對第二處理後目標質譜圖譜資料進行一質荷比轉換，以得一轉換後質譜圖譜資料。進行一數據分箱(binning)步驟，其係調整轉換後質譜圖譜資料的一資料間隔數值，以得所述之標準化目標質譜圖譜資料。
依據前述實施方式之抗藥性微生物預測方法，其中所述之標準化目標質譜圖譜資料的一質荷比可為2,000至14,000道爾頓。
依據前述實施方式之抗藥性微生物預測方法，其中所述之標準化目標質譜圖譜資料的一質荷比可為4,000至12,000道爾頓。
依據前述實施方式之抗藥性微生物預測方法，其中所述之抗藥性微生物可為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)、抗萬古黴素腸球菌(Vancomycin-Resistant Enterococci, VRE)、抗碳青黴烯類抗生素鮑氏不動桿菌(Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)、抗碳青黴烯類抗生素綠膿桿菌(Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa, CRPA)、抗碳青黴烯類抗生素克雷伯氏肺炎桿菌(Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)、抗碳青黴烯類抗生素大腸桿菌(Carbapenem-Resistant Escherichia coli, CREC)、抗碳青黴烯類抗生素共泄腔腸桿菌(Carbapenem-Resistant Escherichia cloacae, CRECL)或抗碳青黴烯類抗生素摩氏摩根氏菌(Carbapenem-Resistant Morganella morganii, CRMM)。
依據前述實施方式之抗藥性微生物預測方法，其中所述之質譜分析法可為基質輔助雷射脫附游離/飛行時間(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight, MALDI-TOF)質譜分析法。
依據前述實施方式之抗藥性微生物預測方法，可更包含進行一建模步驟，包含下述步驟。提供一抗藥性資料庫，其中抗藥性資料庫包含複數個參照質譜圖譜資料，且參照質譜圖譜資料是偵測經過一常規樣品處理方法或一快速樣品處理方法處理之一處理後參照樣品而得。進行一參照圖譜前處理步驟，包含下述步驟：進行一參照校正步驟，其係移除各參照質譜圖譜資料的一背景雜訊，以得複數個第一處理後參照質譜圖譜資料；進行一參照採樣標準化步驟，其係調整各第一處理後參照質譜圖譜資料的一時間解析率數值，以得複數個第二處理後參照質譜圖譜資料；進行一參照圖譜轉換步驟，其係對各第二處理後參照質譜圖譜資料進行一質荷比轉換，以得複數個轉換後參照質譜圖譜資料；進行一參照數據分箱(binning)步驟，其係調整各轉換後參照質譜圖譜資料的一參照資料間隔數值，以得一標準化參照質譜圖譜資料。進行一模型訓練步驟，其係將複數個參照質譜圖譜資料對應之複數個標準化參照質譜圖譜資料以一演算分類器進行訓練至收斂，以得所述之抗藥性預測演算分類器。
依據前述實施方式之抗藥性微生物預測方法，其中所述之演算分類器可為集成學習(Boosting)演算分類器。
依據前述實施方式之抗藥性微生物預測方法，其中各標準化參照質譜圖譜資料的一質荷比可為4,000至12,000道爾頓。
藉此，本發明之抗藥性微生物預測方法係透過常規樣品處理方法或快速樣品處理方法處理而得處理後樣品，並對處理後樣品所對應之目標質譜圖譜資料進行前處理後，再以抗藥性預測演算分類器進行訓練至收斂而輸出抗藥性微生物預測結果，不僅可大幅縮短臨床上微生物培養與鑑定和抗生素敏感性試驗所需的時間，更可對後續臨床上抗生素的使用提供一個更可靠的測試結果，進而使本發明之抗藥性微生物預測方法具有相關市場的應用潛力。
下述將更詳細討論本發明各實施方式。然而，此實施方式可為各種發明概念的應用，可被具體實行在各種不同的特定範圍內。特定的實施方式是僅以說明為目的，且不受限於揭露的範圍。
[本發明之抗藥性微生物預測方法]
請參照第1圖，其係繪示本發明一實施方式之抗藥性微生物預測方法100的示意圖。抗藥性微生物預測方法100係用以判斷一待測微生物是否為一抗藥性微生物，且抗藥性微生物預測方法100包含步驟110、步驟120、步驟130、步驟140、步驟150以及步驟160。
步驟110為提供一待測樣品，其中所述之待測樣品包含前述之待測微生物。待測樣品可為罹患細菌性感染之患者的血液、體液、細胞組織、排泄物、排遺物等檢體，但本發明並不以此為限。
步驟120為進行一樣品前處理步驟，其係以一常規樣品處理方法或一快速樣品處理方法處理前述之待測樣品，以得一處理後樣品。詳細而言，在現行臨床上診斷細菌性感染的流程是先對患者的檢體進行培養，以取其中之微生物進行品種鑑定，而後再取所述之微生物進行增量培養而供抗生素敏感性試驗或質譜分析法偵測之用。然而，微生物培養與鑑定和抗生素敏感性試驗需花費至少72小時以上，對於病程進展相當快速之細菌性感染而言恐會延誤治療的最佳時機。反之，在本發明之抗藥性微生物預測方法100中，待測樣品不僅可用一般的常規樣品處理方法進行處理，並以處理而得之處理後樣品進行後續分析，亦可以快速樣品處理方法進行處理，如此一來，本發明之抗藥性微生物預測方法100不僅適用於對經過現行臨床處理流程所得之處理後樣品進行後續分析，並可在依據快速樣品處理方法進行處理的前提下有效地進行轉換與分析。藉此，本發明之抗藥性微生物預測方法100可有效免去習知微生物培養、鑑定和抗生素敏感性試驗所需的時間，使其具有優異的應用廣度。另外，前述之常規樣品處理方法為本發明所屬技術領域所周知的專業醫學知識與檢驗步驟，是以相關的內容將不加以贅述。
另外，在本發明之抗藥性微生物預測方法100中，快速樣品處理方法可以一逐步離心法處理待測樣品，且逐步離心法包含下述步驟。進行一離心步驟，其係對待測樣品進行多次離心，以得一離心後樣品，其中離心後樣品包含待測微生物。進行一反應步驟，其係於離心後樣品中加入一反應試劑並充分混合，以得一反應後樣品。進行一最終離心步驟，其係離心反應後樣品，以得所述之處理後樣品。其中，反應試劑可包含巰基乙酸肉湯(Thioglycolate broth)、乙醇、甲酸或乙腈。詳細而言，逐步離心法係根據Léa Ponderand等人於2020所發表之期刊的內容所提及之快速微生物鑑定方法(Table 1)與Ni Tien等人於2020所發表之期刊的內容所提及之快速微生物鑑定方法(C&W method)進行適應性調整而得，並透過不同離心轉速與不同離心時間而逐步從陽性血培養液或腹膜透析液中回收待測微生物，而後於包含待測微生物的離心後樣品中加入含有乙醇、甲酸與乙腈的試劑(Léa Ponderand等人)或巰基乙酸肉湯(Ni Tien等人)並使其反應後，再次進行離心即可得所述之處理後樣品。
另外，在本發明之抗藥性微生物預測方法100中，快速樣品處理方法亦可以一商業套件並依照其所附之使用手冊處理待測樣品，以供後續質譜分析法之用。詳細而言，在以所述之商業套件處理待測樣品時，待測樣品係加入商業套件的裂解液並充分混合後，進一步依據使用手冊的指引而以不同離心轉速與不同離心時間進行處理，以得包含待測微生物的離心後樣品，並於其中加入商業套件的潤洗液或其他試劑後再次進行離心，即可得所述之處理後樣品。另外，在本發明中，所述之商業套件可選用MBT Sepsityper ®IVD kit、Vitek MS Blood culture kit ®、Rapid BACpro ®II kit、Rapid BACpro ®II kit、Rapid Sepsityper ®protocol或Complete Sepsityper ®protocol，但本發明並不以此為限。
步驟130為進行一分析步驟，其係以一質譜分析法偵測所述之處理後樣品，以得一目標質譜圖譜資料。詳細而言，本發明所使用之質譜分析法為基質輔助雷射脫附游離/飛行時間(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight, MALDI-TOF)質譜分析法(後續將以「MALDI-TOF質譜分析法」簡稱之)。具體來說，在臨床微生物鑑定的應用方面，MALDI-TOF質譜分析法可將不同型態(液體或固體)的樣品與偵測試劑(基質)混合，並以雷射光激發樣品形成氣相之離子形式，再以質譜分析儀偵測氣相離子之質量與電子比後而轉換為質譜圖譜呈現，並根據相同物種的質譜圖譜一致性原則而將樣品的質譜圖譜與已知的微生物質譜圖譜進行比對，以完成微生物菌株鑑定，是以本發明之抗藥性微生物預測方法100採用MALDI-TOF質譜分析法偵測處理後樣品，可貼近現行臨床上用以鑑定微生物的流程，在後續應用上不僅具有較高的市場接受度，並同時具有高度的判讀準確率。
請同時參照第1圖與第2圖，其中第2圖係繪示第1圖之抗藥性微生物預測方法100的步驟140的步驟流程圖。步驟140為進行一圖譜前處理步驟，其包含步驟141、步驟142、步驟143以及步驟144。
步驟141為進行一校正步驟，其係移除目標質譜圖譜資料的一背景雜訊，以得一第一處理後目標質譜圖譜資料。詳細而言，在執行步驟141之前將對處理後樣品所偵測而得之目標質譜圖譜資料進行初步檢查，若其中包含空值或格式不符的質譜圖譜資料，該等質譜圖譜將會被剔除而不用以進行後續分析。接著，將對目標質譜圖譜資料的訊號進行平滑化處理，以將背景雜訊去除。
步驟142為進行一採樣標準化步驟，其係調整第一處理後目標質譜圖譜資料的一時間解析率數值，以得一第二處理後目標質譜圖譜資料。詳細而言，採樣標準化步驟將檢視第一處理後目標質譜圖譜資料的原始訊號解析度與採樣頻率是否存有不一致的情形，若有，第一處理後目標質譜圖譜資料將會進行重新採樣而使其時間解析率數值一致，並進一步以禮帽法(top-hat method)進行基線校正(baseline correction)後，再以下述式(I)進行計算以使訊號強度歸一化，使訊號解析度符合一致，以得第二處理後目標質譜圖譜資料。前述之式(I)如下： z = (x- µ)/ σ    式(I)； 其中z代表z-score，x代表第一處理後目標質譜圖譜資料中每個點的質荷比強度，µ代表第一處理後目標質譜圖譜資料的平均訊號強度，而σ則是代表第一處理後目標質譜圖譜資料之強度的標準偏差。在對第一處理後目標質譜圖譜資料的強度進行歸一化後，z-score為負值的質荷比強度數據代表細微的信號或雜訊，並會被進一步刪除。
步驟143為進行一圖譜轉換步驟，其係對第二處理後目標質譜圖譜資料進行一質荷比轉換，以得一轉換後質譜圖譜資料。較佳地，轉換後質譜圖譜資料的一質荷比可為2,000至20,000道爾頓(Da)。
步驟144為進行一數據分箱(binning)步驟，其係調整轉換後質譜圖譜資料的一資料間隔數值，以得一標準化目標質譜圖譜資料。詳細而言，質譜分析法中常會因同位素問題導致轉換後質譜圖譜資料的峰值發生偏移，因此，為了使避免轉換後質譜圖譜資料中峰值偏移的問題，本發明之抗藥性微生物預測方法100將以適當的資料間隔數值對轉換後質譜圖譜資料進行數據分箱處理，以得資料間隔數值標準化之標準化目標質譜圖譜資料。較佳地，所述之資料間隔數值可為10道爾頓，而標準化目標質譜圖譜資料的一質荷比則可為2,000至14,000道爾頓。或者，標準化目標質譜圖譜資料的一質荷比可為4,000至12,000道爾頓，以進行後續的分析。
另外，在本發明中，「第一」、「第二」係用於命名，並非用於表示品質優劣或其他意義，特此先敘明。
步驟150為進行一特徵提取步驟，其係將所述之標準化目標質譜圖譜資料以一抗藥性預測演算分類器進行訓練至收斂，以得一圖譜特徵值。詳細而言，特徵提取步驟將直接自動地分析標準化目標質譜圖譜資料的時間維度資料，並輸出對應的圖譜特徵值，而不須以人工或其他方式截取圖譜特徵值，使其使用上更為方便。
步驟160為進行一判斷步驟，其係利用抗藥性預測演算分類器根據所述之圖譜特徵值輸出一抗藥性微生物預測結果，且抗藥性微生物預測結果係判斷待測微生物是否為抗藥性微生物。再者，在本發明之抗藥性微生物預測方法100中，抗藥性微生物可為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)、抗萬古黴素腸球菌(Vancomycin-Resistant Enterococci, VRE)、抗碳青黴烯類抗生素鮑氏不動桿菌(Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)、抗碳青黴烯類抗生素綠膿桿菌(Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa, CRPA)、抗碳青黴烯類抗生素克雷伯氏肺炎桿菌(Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)、抗碳青黴烯類抗生素大腸桿菌(Carbapenem-Resistant Escherichia coli, CREC)、抗碳青黴烯類抗生素共泄腔腸桿菌(Carbapenem-Resistant Escherichia cloacae, CRECL)或抗碳青黴烯類抗生素摩氏摩根氏菌(Carbapenem-Resistant Morganella morganii, CRMM)，但本發明並不以此為限。
請參照第3圖，其係繪示本發明另一實施方式之抗藥性微生物預測方法100a的架構示意圖。抗藥性微生物預測方法100a包含步驟110a、步驟120a、步驟130a、步驟140a、步驟150a、步驟160a以及步驟170，其中步驟110a、步驟120a、步驟130a、步驟140a、步驟150a、步驟160a與第1圖的步驟110、步驟120、步驟130、步驟140、步驟150、步驟160相同，在此將不再贅述，而以下將進一步說明本發明之抗藥性預測演算分類器的建構細節。
步驟170為進行一建模步驟，其包含步驟171、步驟172以及步驟173。
步驟171提供一抗藥性資料庫，其中所述之抗藥性資料庫包含複數個參照質譜圖譜資料，且參照質譜圖譜資料是偵測經過一常規樣品處理方法或一快速樣品處理方法處理之一處理後參照樣品而得。另外，抗藥性資料庫可進一步包含一抗生素資料集、一藥物敏感反應資料集與一菌種資料集。菌種資料集包含不同細菌之菌種名稱、革蘭氏染色類別、細菌型態等資訊，且各個參照質譜圖譜資料可分別對應一致病微生物資訊、一藥物敏感反應報告或一抗生素資訊，但本發明並不以此為限。再者，所述之參照質譜圖譜資料可為MALDI-TOF質譜圖譜資料，以更貼近現行臨床上的微生物鑑定流程。
步驟172為進行一參照圖譜前處理步驟，其包含步驟1721、步驟1722、步驟1723及步驟1724。
步驟1721為進行一參照校正步驟，其係移除各參照質譜圖譜資料的一背景雜訊，以得複數個第一處理後參照質譜圖譜資料。詳細而言，在執行步驟1721之前將對各個參照質譜圖譜資料進行初步檢查，若其中包含空值或格式不符的質譜圖譜資料，該參照質譜圖譜資料將不會用以建立本發明之抗藥性預測演算分類器。接著，各個參照質譜圖譜資料的訊號將會進行平滑化處理，以將背景雜訊去除。
步驟1722為進行一參照採樣標準化步驟，其係調整各第一處理後參照質譜圖譜資料的一時間解析率數值，以得複數個第二處理後參照質譜圖譜資料。詳細而言，參照採樣標準化步驟將檢視不同第一處理後參照質譜圖譜資料的原始訊號解析度與採樣頻率是否存有不一致的情形，若有，所有的第一處理後參照質譜圖譜資料將會進行重新採樣而使其時間解析率數值一致。再者，各第一處理後參照質譜圖譜資料將進一步以禮帽法進行基線校正並以前述之式(I)進行強度歸一化計算，使不同的第一處理後參照質譜圖譜資料的訊號解析度符合一致。而關於式(I)的計算細節請參前段所述，在此將不再贅述。
步驟1723為進行一參照圖譜轉換步驟，其係對各第二處理後參照質譜圖譜資料進行一質荷比轉換，以得複數個轉換後參照質譜圖譜資料。較佳地，轉換後參照質譜圖譜資料的一質荷比可為2,000至20,000道爾頓。
步驟1724為進行一參照數據分箱(binning)步驟，其係調整各轉換後參照質譜圖譜資料的一參照資料間隔數值，以得一標準化參照質譜圖譜資料。詳細而言，為了使避免各轉換後參照質譜圖譜資料中或不同轉換後參照質譜圖譜資料之間的峰值偏移的問題，在參照數據分箱步驟中將以適當的參照資料間隔數值對各個轉換後參照質譜圖譜資料進行數據分箱處理，以得參照資料間隔數值相同之複數個標準化參照質譜圖譜資料。較佳地，所述之參照資料間隔數值可為10道爾頓，而標準化參照質譜圖譜資料的一質荷比則可為2,000至14,000道爾頓。或者，標準化參照質譜圖譜資料的一質荷比可為4,000至12,000道爾頓，以進行後續的分析。
步驟173為進行一模型訓練步驟，其係將複數個參照質譜圖譜資料對應之複數個標準化參照質譜圖譜資料以一演算分類器進行訓練至收斂，以得所述之抗藥性預測演算分類器。較佳地，所述之演算分類器可為集成學習(Boosting)演算分類器。或者，所述之演算分類器可為LightGBM(Light Gradient Boosting Machine)演算分類器、CatBoost演算分類器、XGBoost(Extreme Gradient Boosting)演算分類器、Gradient Boosting演算分類器或其他以決策樹演算法為基礎之集成學習演算分類器，但本發明並不以此為限。
藉此，本發明之抗藥性微生物預測方法100與抗藥性微生物預測方法100a透過快速樣品處理方法處理而得處理後樣品，並依序以校正步驟、採樣標準化步驟、圖譜轉換步驟與數據分箱步驟處理所述之處理後樣品所對應之目標質譜圖譜資料後，再以抗藥性預測演算分類器進行訓練至收斂而輸出抗藥性微生物預測結果，不僅可大幅縮短現行臨床上微生物培養與鑑定和抗生素敏感性試驗所需的時間，更可對後續臨床上抗生素的使用提供一個更可靠的測試結果，進而使本發明之抗藥性微生物預測方法100與抗藥性微生物預測方法100a具有相關市場的應用潛力。
[試驗例]
一、抗藥性資料庫
本發明之抗藥性資料庫係用以建構本發明之抗藥性預測演算分類器。詳細而言，抗藥性資料庫的參照質譜圖譜資料為中國醫學大學暨附設醫院所蒐集的檢體之質譜圖譜資料，為經中國醫藥大學暨附設醫院研究倫理委員會(China Medical University & Hospital Research Ethics Committee)核准之臨床試驗計劃，其編號為：CMUH109-REC3-098。前述之質譜圖譜資料係以臨床檢驗實驗室中常規的樣品處理方法處理檢體後而得，其中包含耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)、抗萬古黴素腸球菌(以下簡稱為VRE)、抗碳青黴烯類抗生素鮑氏不動桿菌(以下簡稱為CRAB)、抗碳青黴烯類抗生素綠膿桿菌(以下簡稱為CRPA)、抗碳青黴烯類抗生素克雷伯氏肺炎桿菌(以下簡稱為CRKP)、抗碳青黴烯類抗生素大腸桿菌(以下簡稱為CREC)、抗碳青黴烯類抗生素共泄腔腸桿菌(以下簡稱為CRECL)與抗碳青黴烯類抗生素摩氏摩根氏菌(以下簡稱為CRMM)等相關細菌性感染之檢體的質譜圖譜資料，而上述各種抗藥性細菌樣品數目列於表一。
表一
抗藥性 微生物 MRSA VRE CRAB CRPA CRKP CREC CRECL CRMM
樣品數量 (千筆) 16 10 8 15 18 44 4 2
同時，各個參照質譜圖譜資料分別對應其受測檢體的一致病微生物資訊、一藥物敏感反應報告或一抗生素資訊，且前述資訊將以JSON(JavaScript Object Notation)格式匯入抗藥性資料庫中，以進行後續抗藥性預測演算分類器的建立。
二、參照圖譜前處理
在本試驗例中係以Python (version 3.6)軟體作為本發明之圖譜前處理方法之操作模組來處理抗藥性資料庫的參照質譜圖譜資料的原始訊號。
首先，操作模組將先對各個參照質譜圖譜資料進行初步檢查來確認各個參照質譜圖譜資料的原始訊號狀態，以剔除包含空值或格式不符的參照質譜圖譜資料。接著，操作模組將對各個參照質譜圖譜資料的訊號進行平滑化處理，以將背景雜訊去除，以得複數個第一處理後參照質譜圖譜資料。
接著，操作模組將檢視不同之第一處理後參照質譜圖譜資料的原始訊號解析度與採樣頻率是否存有不一致的情形，若有，所有的第一處理後參照質譜圖譜資料將會進行重新採樣而使其時間解析率數值一致，並以禮帽法進行基線校正後，以前述之式(I)進行計算以使訊號強度歸一化，使不同第一處理後參照質譜圖譜資料的訊號解析度符合一致，以得複數個第二處理後參照質譜圖譜資料。
最後，操作模組將會對經過校正與採樣標準化的第二處理後參照質譜圖譜資料進行一質荷比轉換，以得複數個轉換後參照質譜圖譜資料，而後再以資料間隔數值為10道爾頓的基礎進行資料間隔數值的調整，進而避免各轉換後參照質譜圖譜資料中或不同轉換後參照質譜圖譜資料之間的峰值偏移的問題。
在完成前述之參照圖譜前處理後，各參照質譜圖譜資料將進一步標註其對應之致病微生物資訊、藥物敏感反應報告或抗生素資訊，以做為後續抗藥性微生物預測分析的基礎。
三、本發明之抗藥性微生物預測方法的可信度分析
1. 本發明之抗藥性預測演算分類器的預測準確率分析
本試驗係將抗藥性資料庫中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的MALDI-TOF質譜圖譜資料以不同集成學習演算分類器進行訓練，並進行不同方式的正規化處理後而分析所得之抗藥性預測演算分類器的預測準確率。
本試驗中用以分析之集成學習演算分類器包含LightGBM演算分類器、CatBoost演算分類器、XGBoost演算分類器、Gradient Boosting演算分類器，同時，本試驗亦以其他類型之學習演算分類器訓練抗藥性資料庫中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的MALDI-TOF質譜圖譜資料，以進一步說明本發明之抗藥性預測演算分類器的預測準確率。其他類型之學習演算分類器包含Extra Trees演算分類器、Logistic Regression演算分類器、Random Forest演算分類器、Ada Boost演算分類器、Decision Tree演算分類器、Linear Discriminant Analysis演算分類器、K Neighbors演算分類器、Naive Bayes演算分類器與Quadratic Discriminant Analysis演算分類器。
請參表二、表三與表四，其中表二係將參照質譜圖譜資料進行z-score正規化處理後再行以不同演算分類器進行訓練而得之分析數據，表三係將參照質譜圖譜資料進行最小值最大值(MinMax)正規化處理後再行以不同演算分類器進行訓練而得之分析數據，表四係將參照質譜圖譜資料進行z-score正規化處理與最小值最大值正規化處理後再行以不同演算分類器進行訓練而得之分析數據。
表二
演算分類器 準確率 AUC 召回率 精確度 F1-sore Kappa 係數
CatBoost 0.8134 0.8981 0.7909 0.8367 0.8131 0.6272
Light GBM 0.8108 0.8928 0.7919 0.8315 0.8111 0.6219
XGBoosting 0.7872 0.8757 0.7504 0.8199 0.7834 0.5751
Gradient Boosting 0.787 0.8728 0.7510 0.8192 0.7834 0.5747
Extra Trees 0.7849 0.8712 0.7374 0.8250 0.7787 0.5708
Logistic Regression 0.7744 0.8294 0.7698 0.7862 0.7779 0.5488
Random Forest 0.7445 0.8264 0.6815 0.7917 0.7324 0.4905
Ada Boost 0.7440 0.822 0.7299 0.7613 0.7451 0.4882
Decision Tree 0.6951 0.6963 0.7135 0.6988 0.7060 0.3895
Linear Discriminant Analysis 0.6584 0.6785 0.6743 0.6650 0.6694 0.3160
K Neighbors 0.6213 0.6691 0.6518 0.6258 0.6384 0.2412
Naive Bayes 0.5341 0.5792 0.4385 0.6048 0.4015 0.0730
Quadratic Discriminant Analysis 0.5207 0.5306 0.1525 0.6818 0.2297 0.0600
表三
演算分類器 準確率 AUC 召回率 精確度 F1-sore Kappa 係數
CatBoost 0.7973 0.8851 0.7657 0.8266 0.7949 0.5952
Light GBM 0.7917 0.8773 0.7633 0.8186 0.7900 0.5840
XGBoosting 0.7714 0.8586 0.7336 0.8038 0.7671 0.5436
Gradient Boosting 0.7692 0.8577 0.7234 0.8067 0.7627 0.5393
Extra Trees 0.7566 0.8317 0.7173 0.7892 0.7515 0.514
Logistic Regression 0.7900 0.8481 0.7732 0.8090 0.7906 0.5802
Random Forest 0.7268 0.7985 0.6521 0.7795 0.7101 0.4556
Ada Boost 0.7284 0.8073 0.7200 0.7430 0.7312 0.4568
Decision Tree 0.6731 0.6743 0.6828 0.681 0.6818 0.3457
Linear Discriminant Analysis 0.7203 0.7466 0.7292 0.7268 0.7280 0.4402
K Neighbors 0.6127 0.6492 0.6364 0.6195 0.6278 0.2243
Naive Bayes 0.5422 0.5351 0.8496 0.5339 0.6556 0.0689
Quadratic Discriminant Analysis 0.5259 0.5251 0.5597 0.5660 0.4511 0.0505
表四
演算分類器 準確率 AUC 召回率 精確度 F1-sore Kappa 係數
CatBoost 0.7945 0.8814 0.7595 0.8262 0.7912 0.5897
Light GBM 0.7921 0.8785 0.7650 0.8181 0.7905 0.5846
XGBoosting 0.7683 0.8552 0.7241 0.8047 0.7621 0.5375
Gradient Boosting 0.7665 0.8536 0.7237 0.8021 0.7607 0.5340
Extra Trees 0.7599 0.8360 0.7234 0.7911 0.7556 0.5205
Logistic Regression 0.7898 0.8505 0.7688 0.8117 0.7895 0.5799
Random Forest 0.7088 0.7825 0.6293 0.7624 0.6892 0.4199
Ada Boost 0.7254 0.8034 0.7166 0.7400 0.7281 0.4509
Decision Tree Classifier 0.6734 0.6749 0.6944 0.6776 0.6858 0.3460
Linear Discriminant Analysis 0.7240 0.7523 0.7374 0.7286 0.7327 0.4475
K Neighbors 0.6097 0.6478 0.6395 0.6152 0.6271 0.2181
Naive Bayes 0.5439 0.5355 0.8418 0.5356 0.6545 0.0729
Quadratic Discriminant Analysis 0.5135 0.5181 0.3407 0.6133 0.3076 0.0361
由表二至表四的內容可見，當本發明之抗藥性預測演算分類器係選用集成學習演算分類器進行訓練而得時，其用以分析抗藥性資料庫中的參照質譜圖譜資料的準確率皆可達75%以上，其接收者操作特徵曲線之曲線下面積(Area Under the Receiver Operating Characteristic curve，AUC)亦可達85%以上，顯示本發明之抗藥性預測演算分類器可有效用以判斷待測微生物是否為抗藥性微生物，並具有相關市場的應用潛力。
2. 本發明之抗藥性預測演算分類器對不同抗藥性微生物的預測準確率分析
本試驗是以本發明之抗藥性預測演算分類器訓練抗藥性資料庫的參照質譜圖譜資料，以分析本發明之抗藥性預測演算分類器對不同抗藥性微生物的預測情形。
請參照第4圖，第4圖係本發明之抗藥性預測演算分類器用以分析不同抗藥性微生物的常規質譜圖譜資料所得之抗藥性微生物預測結果。如第4圖所示，當本發明之抗藥性預測演算分類器用以對不同抗藥性微生物之常規質譜圖譜資料進行訓練後，其對於不同抗藥性微生物的預測準確率皆可達70%以上，顯示本發明之抗藥性預測演算分類器可有效分析現行臨床上常見之抗藥性微生物的質譜圖譜資料，並進一步輸出具有高度準確率之抗藥性微生物預測結果。據此，本發明之抗藥性微生物預測方法將有潛力應用於分析經過快速樣品處理方法處理所得之質譜圖譜資料，並具有相關領域之應用潛力。
3. 本發明之抗藥性微生物預測方法之標準化目標質譜圖譜資料的質荷比最佳範圍分析
本試驗是以本發明之抗藥性微生物預測方法分析抗藥性資料庫的參照質譜圖譜資料，以確認標準化目標質譜圖譜資料的質荷比最佳範圍。在試驗方面係以滑動窗口演算法(Sliding Window Algorithm)分析本發明之抗藥性微生物預測方法用以訓練抗藥性資料庫的參照質譜圖譜資料所得的抗藥性微生物預測結果的準確率。具體來說，滑動窗口演算法係設定抗藥性微生物預測結果的準確率與其對應之質荷比數值的一滑動窗口範圍，並在滑動窗口每次選取的質荷比範圍內計算當前滑動窗口中AUC的結果，並以每次增加100道爾頓的頻率進行一次滑動和計算，直到各參照質譜圖譜資料的質荷比最大值(20,000道爾頓)為止。
本試驗是以實施例1至實施例10進行分析，而實施例1至實施例10的滑動窗口範圍的選擇則呈現於表五。
表五
  滑動窗口範圍 (道爾頓)
實施例1 1,000
實施例2 2,000
實施例3 3,000
實施例4 4,000
實施例5 5,000
實施例6 6,000
實施例7 7,000
實施例8 8,000
實施例9 9,000
實施例10 10,000
請參照第5A圖與第5B圖。第5A圖係本發明之實施例1至實施例5之抗藥性微生物預測方法的滑動窗口演算法分析結果，其中100 Da代表以每次增加100道爾頓的頻率進行一次滑動和計算，而第5B圖係本發明之實施例6至實施例10之抗藥性微生物預測方法的滑動窗口演算法分析結果，其中100 Da代表以每次增加100道爾頓的頻率進行一次滑動和計算。如第5A圖所示，當滑動窗口範圍介於1,000道爾頓至5,000道爾頓時，實施例1至實施例5的AUC分析結果的震動幅度較大，而如第5B圖所示，當以滑動窗口範圍為6,000道爾頓以上的範圍進行預測時，質荷比介於2,000至14,000道爾頓的AUC預測結果明顯提升，其中，參照質譜圖譜資料的質荷比最佳範圍為質荷比介於為4,000至12,000道爾頓，顯示本發明之抗藥性微生物預測方法選用質荷比為2,000至14,000道爾頓的標準化目標質譜圖譜資料時，可有效判斷待測微生物是否為抗藥性微生物，並具有相關市場的應用潛力。
4. 本發明之抗藥性微生物預測方法應用分析於經快速樣品處理方法處理以及常規樣品處理方法處理之檢體的質譜圖譜資料
在本試驗中進一步取受金黃色葡萄球菌感染之樣品以及受鮑氏不動桿菌感染之樣品以商業套件(MBT Sepsityper ®IVD kit)並依照其所附之使用手冊進行處理，並將所得之處理後樣品以MALDI-TOF質譜分析法進行分析而得質譜圖譜資料(以下簡稱「快速質譜圖譜資料」)，並同時依照常規樣品處理方法處理受金黃色葡萄球菌感染之樣品以及受鮑氏不動桿菌感染之樣品，並將所得之處理後樣品以MALDI-TOF質譜分析法進行分析而得質譜圖譜資料(以下簡稱「常規質譜圖譜資料」)，以進行後續分析。
請參照第6A圖、第6B圖、第6C圖與第6D圖，其中第6A圖係呈現受鮑氏不動桿菌感染之樣品的快速質譜圖譜資料，第6B圖係呈現受鮑氏不動桿菌感染之樣品的常規質譜圖譜資料，第6C圖係呈現受金黃色葡萄球菌感染之樣品的快速質譜圖譜資料，而第6D圖係呈現受金黃色葡萄球菌感染之樣品的常規質譜圖譜資料。如第6A圖至第6D圖所示，受鮑氏不動桿菌感染之樣品的快速質譜圖譜資料與常規質譜圖譜資料以及受金黃色葡萄球菌感染之樣品的快速質譜圖譜資料與常規質譜圖譜資料在圖譜資料的波峰分布範圍與趨勢具有明顯的差異，且不同種類之細菌的快速質譜圖譜資料與常規質譜圖譜資料亦不盡相同。然而，在經本發明之圖譜前處理方法進行前處理並進一步進行分析後，其接收者操作特徵曲線之曲線下面積皆可大於0.8，顯示本發明之抗藥性微生物預測方法可同時對經過常規樣品處理方法以及快速樣品處理方法所取得對應之常規質譜圖譜資料與快速質譜圖譜資料進行分析與訓練，以進一步輸出正確的抗藥性微生物預測結果。據此，本發明之抗藥性微生物預測方法不僅可大幅縮短現行臨床上微生物培養與鑑定和抗生素敏感性試驗所需的時間，更可對後續臨床上抗生素的使用提供一個更可靠的測試結果，以期降低患者因微生物感染所引發之併發而造成的傷害。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
100,100a:抗藥性微生物預測方法 110,110a,120,120a,130,130a,140,140a,141,142,143,144,150,150a,160,160a,170,171,172,1721,1722,1723,1724,173:步驟
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖係繪示本發明一實施方式之抗藥性微生物預測方法的示意圖； 第2圖係繪示第1圖之抗藥性微生物預測方法的步驟140的步驟流程圖； 第3圖係繪示本發明另一實施方式之抗藥性微生物預測方法的示意圖； 第4圖係本發明之抗藥性預測演算分類器用以分析不同抗藥性微生物的常規質譜圖譜資料所得之抗藥性微生物預測結果； 第5A圖係本發明之實施例1至實施例5之抗藥性微生物預測方法的滑動窗口演算法分析結果，其中100 Da代表以每次增加100道爾頓的頻率進行一次滑動和計算； 第5B圖係本發明之實施例6至實施例10之抗藥性微生物預測方法的滑動窗口演算法分析結果，其中100 Da代表以每次增加100道爾頓的頻率進行一次滑動和計算； 第6A圖係呈現受鮑氏不動桿菌感染之樣品的快速質譜圖譜資料； 第6B圖係呈現受鮑氏不動桿菌感染之樣品的常規質譜圖譜資料； 第6C圖係呈現受金黃色葡萄球菌感染之樣品的快速質譜圖譜資料；以及 第6D圖係呈現受金黃色葡萄球菌感染之樣品的常規質譜圖譜資料。
100:抗藥性微生物預測方法
110,120,130,140,150,160:步驟

Claims (8)

  1. 一種抗藥性微生物預測方法，其係用以判斷一待測微生物是否為一抗藥性微生物，包含：進行一建模步驟，包含下述步驟：提供一抗藥性資料庫，其中該抗藥性資料庫包含複數個參照質譜圖譜資料，該些參照質譜圖譜資料是偵測經過一常規樣品處理方法或一快速樣品處理方法處理之一處理後參照樣品而得，且各該參照質譜圖譜資料為該抗藥性微生物的一基質輔助雷射脫附游離/飛行時間(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight,MALDI-TOF)質譜圖譜資料；進行一參照圖譜前處理步驟，其係對該些參照質譜圖譜資料進行前處理，以得複數個標準化參照質譜圖譜資料，其中各該標準化參照質譜圖譜資料的一質荷比為2,000至14,000道爾頓；及進行一模型訓練步驟，其係將該些參照質譜圖譜資料對應之該些標準化參照質譜圖譜資料以一演算分類器進行訓練至收斂，以得一抗藥性預測演算分類器；提供一待測樣品，其中該待測樣品包含該待測微生物；進行一樣品前處理步驟，其係以一常規樣品處理方法或一快速樣品處理方法處理該待測樣品，以得一處理後樣品；進行一分析步驟，其係以一質譜分析法偵測該處理後樣品，以得一目標質譜圖譜資料，其中該目標質譜圖譜資料為該待測微生物的一質譜圖譜資料，且該質譜分析法為基 質輔助雷射脫附游離/飛行時間質譜分析法；進行一圖譜前處理步驟，其係對該目標質譜圖譜資料進行前處理，以得一標準化目標質譜圖譜資料，其中該標準化目標質譜圖譜資料的一質荷比為2,000至14,000道爾頓；進行一特徵提取步驟，其係將該標準化目標質譜圖譜資料以該抗藥性預測演算分類器進行訓練至收斂，以得一圖譜特徵值；以及進行一判斷步驟，其係利用該抗藥性預測演算分類器根據該圖譜特徵值輸出一抗藥性微生物預測結果，且該抗藥性微生物預測結果係判斷該待測微生物是否為該抗藥性微生物。
  2. 如請求項1所述之抗藥性微生物預測方法，其中該快速樣品處理方法係以一逐步離心法處理該待測樣品，且該逐步離心法包含：進行一離心步驟，其係對該待測樣品進行多次離心，以得一離心後樣品，其中該離心後樣品包含該待測微生物；進行一反應步驟，其係於該離心後樣品中加入一反應試劑並充分混合，以得一反應後樣品；以及進行一最終離心步驟，其係離心該反應後樣品，以得該處理後樣品；其中，該反應試劑包含巰基乙酸肉湯(Thioglycolate broth)、乙醇(Ethanol)、甲酸(Formic acid)或乙腈 (Acetonitrile)。
  3. 如請求項1所述之抗藥性微生物預測方法，其中該圖譜前處理步驟包含：進行一校正步驟，其係移除該目標質譜圖譜資料的一背景雜訊，以得一第一處理後目標質譜圖譜資料；進行一採樣標準化步驟，其係調整該第一處理後目標質譜圖譜資料的一時間解析率數值，以得一第二處理後目標質譜圖譜資料；進行一圖譜轉換步驟，其係對該第二處理後目標質譜圖譜資料進行一質荷比轉換，以得一轉換後質譜圖譜資料；以及進行一數據分箱(binning)步驟，其係調整該轉換後質譜圖譜資料的一資料間隔數值，以得該標準化目標質譜圖譜資料。
  4. 如請求項1所述之抗藥性微生物預測方法，其中該標準化目標質譜圖譜資料的一質荷比為4,000至12,000道爾頓。
  5. 如請求項1所述之抗藥性微生物預測方法，其中該抗藥性微生物為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、抗萬古黴素腸球菌(Vancomycin-Resistant Enterococci,VRE)、抗碳青黴烯類抗生素鮑氏不動桿菌(Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)、抗碳青黴烯類抗生素綠膿桿菌(Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA)、抗碳青黴烯類抗生素克雷伯氏肺炎桿菌(Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)、抗碳青黴烯類抗生素大腸桿菌(Carbapenem-Resistant Escherichia coli,CREC)、抗碳青黴烯類抗生素共泄腔腸桿菌(Carbapenem-Resistant Escherichia cloacae,CRECL)或抗碳青黴烯類抗生素摩氏摩根氏菌(Carbapenem-Resistant Morganella morganii,CRMM)。
  6. 如請求項1所述之抗藥性微生物預測方法，其中該參照圖譜前處理步驟包含下述步驟：進行一參照校正步驟，其係移除各該參照質譜圖譜資料的一背景雜訊，以得複數個第一處理後參照質譜圖譜資料；進行一參照採樣標準化步驟，其係調整各該第一處理後參照質譜圖譜資料的一時間解析率數值，以得複數個第二處理後參照質譜圖譜資料；進行一參照圖譜轉換步驟，其係對各該第二處理後參照質譜圖譜資料進行一質荷比轉換，以得複數個轉換後參照質譜圖譜資料；以及 進行一參照數據分箱(binning)步驟，其係調整各該轉換後參照質譜圖譜資料的一參照資料間隔數值，以得一該標準化參照質譜圖譜資料。
  7. 如請求項1所述之抗藥性微生物預測方法，其中該演算分類器為集成學習(Boosting)演算分類器。
  8. 如請求項1所述之抗藥性微生物預測方法，其中各該標準化參照質譜圖譜資料的一質荷比為4,000至12,000道爾頓。
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