CN112180007A - 基于代谢组学的泛发性脓疱型银屑病诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于代谢组学的泛发性脓疱型银屑病诊断标志物及其应用。所述诊断标志物包含以下35种化合物中的一种或多种：丙酮酸、α‑酮异戊酸、2‑羟基丁酸、3‑羟基丁酸、甲烷硫代磷酸、脯氨酸、尿嘧啶、氨甲环酸、4‑氨基丁酸、苏氨酸、东莨菪内酯、十二烷醇、N‑甲基‑L‑亮氨酸、L‑半胱氨酸‑甘氨酸、L‑犬尿氨酸、3‑羟基苯甲酸、尿囊素、δ‑生育酚、木呋喃木糖、葡萄糖‑1‑磷酸、焦磷酸盐、牛磺酸、L‑天冬酰胺、邻苯二甲酸、4‑(二甲氨基)偶氮苯、5‑叔丁基‑1h‑吲哚‑2,3‑二酮、奎宁酸、葡萄糖、组氨酸、赖氨酸、棕榈酸、7‑甲基鸟嘌呤、油酸和巨头鲸鱼酸。该标志物可准确区分泛发性脓疱型银屑病患者与健康人群。

Description

基于代谢组学的泛发性脓疱型银屑病诊断标志物及其应用

技术领域

本发明属于临床检验诊断领域，涉及一种基于代谢组学的泛发性脓疱型银屑病诊断标志物及其应用。

背景技术

泛发性脓疱型银屑病(generalized pustular psoriasis，GPP)是银屑病中病情最严重的类型，临床上以红斑基础上发生粟粒大小的无菌性脓疱为特征，常伴有高热及白细胞升高和低蛋白血症，甚至危及生命。脓疱型银屑病除皮肤损害以外，还可累及眼、肝脏、肺、胃肠道、心血管、肾脏和骨等多个组织器官。由于其GPP发病机制未完全明确，诊疗难度大。虽然近年来针对银屑病的生物制剂进展迅速，也在脓疱型银屑病的治疗中有较好的效果，但一方面生物制剂价格昂贵目前还无法大规模推广，另一方面目前的治疗手段对GPP系统症状的治疗和控制未取得令人满意的效果。因此，预防、早期诊断、早期治疗是临床上的一项重大和艰巨的医疗任务。

我们期待有一种或一组生物标记物可以用来对泛发性脓疱型银屑病进行更精确的病因学诊断。生物标志物作为一种定量指标，在泛发性脓疱型银屑病急性加重的辅助量化诊断、严重程度评估及判断急性加重的病因和预后方面的作用是目前泛发性脓疱型银屑病研究的热点领域。

鉴于泛发性脓疱型银屑病的异质性，单一的生物标志物难以准确反映，而代谢组学的建立和发展为解決这一问题提供了有效手段。代谢组学主要通过检测小分子代谢物(MWK<1000)的变化来获得生物体内代谢产物随时间以及病理生理进程的动态变化信息，包括糖、脂质、氨基酸、维生素等。代谢物作为细胞生理活动的最终产物，能真实灵敏地反映细胞的功能状态。代谢组学改变了单一标志物检测的传统思路，以一组代谢物群体作为“模式标记物”来诊断疾病，具有独特的优势。虽然代谢组学起步较晚，但与传统诊断方法和研究手段相比已显示出强大优势。泛发性脓疱型银屑病急性加重在发生和发展的过程中必然引起内源性小分子代谢产物的特征性改变，而借助于先进的分离、分析及计算手段的代谢组学，恰好具有从整体上区分不同病理生理条件下的特征代谢物的能力和优势，用代谢组学研究泛发性脓疱型银屑病的特征代谢物，可以从整体上探讨这一复杂的临床综合征的发病机制。

发明内容

为克服现有技术不足，针对泛发性脓疱型银屑病缺乏可靠的生物标志物这一现状，本发明通过高效液相色谱-质谱技术对患者血清进行代谢组学分析，找到泛发性脓疱型银屑病的特异性差异代谢产物，即泛发性脓疱型银屑病的诊断分子。本发明提供了一种适合于泛发性脓疱型银屑病诊断的诊断标志物，以及该诊断标志物在泛发性脓疱型银屑病诊断中的应用。

本发明对24例泛发性脓疱型银屑病患者和12例健康志愿者血浆样本进行分析，使用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)获得了小分子代谢物的指纹图谱，经过对泛发性脓疱型银屑病及健康正常对照的小分子代谢物的指纹图谱进行基于单变量和多变量分析与特征筛选，得到适合于泛发性脓疱型银屑病的诊断标志物，具有较高临床使用和推广价值。

实现本发明的具体技术方案为：本发明提供了基于代谢组学的泛发性脓疱型银屑病的诊断标志物，所述诊断标志物包含以下35种化合物中的一种或多种：酪胺(tyramine)、丙酮酸(pyruvic acid)、α-酮异戊酸(alpha-ketoisovaleric acid)、2-羟基丁酸(2-hydroxybutyric acid)、3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid)、甲烷硫代磷酸(methanephosphonothioic acid)、脯氨酸(L-proline)、尿嘧啶(uracil)、氨甲环酸(tranexamic acid)、4-氨基丁酸(4-aminobutyric acid)、苏氨酸(L-threonine)、东莨菪内酯(scopoletin)、十二烷醇(dodecanol)、N-甲基-L-亮氨酸(N-methyl-l-leucine)、L-半胱氨酸-甘氨酸(L-cysteine-glycine)、L-犬尿氨酸(L-kynurenine)、3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid)、尿囊素(allantoin)、δ-生育酚(delta-tocopherol)、木呋喃木糖(xylofuranose)、葡萄糖-1-磷酸(glucose-1-phosphate)、焦磷酸盐(pyrophosphate)牛磺酸(taurine)L-天冬酰胺(L-asparagine)、邻苯二甲酸(phthalic acid)、4-(二甲氨基)偶氮苯(4-(dimethylamino)azobenzene)、5-叔丁基-1h-吲哚-2,3-二酮(5-tert-butyl-1h-indole-2,3-dione)、奎宁酸(quinic acid)、葡萄糖(glucose)、组氨酸(L-histidine)、赖氨酸(L-lysine)、棕榈酸(palmitelaidic acid)、7-甲基鸟嘌呤(7-methylguanine)、油酸(oleic acid)和巨头鲸鱼酸(cis-gondoic acid)。

其中，较佳的是以下5种化合物中的任意一种或多种：苏氨酸(L-threonine)、L-半胱氨酸-甘氨酸(L-cysteine-glycine)、焦磷酸盐(pyrophosphate)、葡萄糖(glucose)和组氨酸(L-histidine)。这5种化合物中的任意一种和泛发性脓疱型银屑病严重程度相关。

本发明还提供所述的诊断标志物在制备泛发性脓疱型银屑病诊断制剂中的应用。

其中，较佳的，所述的泛发性脓疱型银屑病诊断制剂是诊断泛发性脓疱型银屑病血清代谢物的制剂。

较佳的，所述的诊断标志物是血浆代谢标志物。

较佳的，所述的诊断标志物被作为气相色谱-质谱(Gas Chromatography-MassSpectrometer，GC-MS)联用仪的标准品。

本发明还提供了上述各种适合于泛发性脓疱型银屑病诊断的诊断标志物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)收集泛发性脓疱型银屑病患者及健康志愿者的血清样本作为分析样品；

(2)采用GC-MS联用技术对每个分析样本进行非靶向代谢组学分析，得到各血清样本的原始代谢指纹图谱；

(3)对所获血清代谢组学指纹图谱进行数据前处理、多元统计分析筛选差异代谢物，并通过分析差异代谢物与疾病严重程度评分的Pearson相关性分析进一步筛选标志代谢物；

(4)通过ROC曲线分析获得AUC值均大于0.9的差异代谢物，即得适合于泛发性脓疱型银屑病诊断的血清代谢标志物。

本发明的优点是采用血清代谢组学技术对泛发性脓疱型银屑病患者及健康正常对照进行分析，得到适合于泛发性脓疱型银屑病的诊断标志物，该标志物对泛发性脓疱型银屑病与健康人群的代谢组数据分类很好，可准确区分泛发性脓疱型银屑病患者与健康人群。

附图说明

图1为血清样本OPLS-DA模型得分图，显示健康人(CON)和泛发性脓疱型银屑病患者(GPP)之间可以较好地区分；

图2为置换检验方法评估血清样本OPLS-DA模型可靠性；

图3为ROC曲线法评估血清苏氨酸(L-threonine)、L-半胱氨酸-甘氨酸(L-cysteine-glycine)、焦磷酸盐(pyrophosphate)、葡萄糖(glucose)和组氨酸(L-histidine)的诊断效果。其中纵坐标为灵敏度，横坐标为特异性。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐释本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

实施例1：健康人和泛发性脓疱型银屑病患者患者之间差异代谢物的筛选表征

一.对象和方法

1.标本来源

在取得患者同意后，收集12例健康志愿者和24例泛发性脓疱型银屑病患者的血清样本，健康志愿者和患者均来自上海市皮肤病医院，且健康志愿者的年龄、性别、体重指数与患者相匹配，以排除饮食习惯差异、性别、年龄和体重指数导致的代谢差异。采血时间均为清晨空腹状态。所有样品均保存在-80℃待用。

2.主要试剂

乙腈、甲醇、甲酸(色谱级别)购于Sigma-Aldrich公司；分析纯氯仿、吡啶、无水硫酸钠购于中国医药集团总公司；L-2-氯苯丙氨酸、甲氧基胺、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)、十七烷酸、亮氨酸-脑啡肽购于Sigma-Aldrich公司；去离子水由Millipore公司的MIlli-Q超纯水系统制备。

3.血清差异代谢物的表征

3.1.GC-MS筛选表征

3.1.1.样品制备

样品处理：取100μL血清于1.5mL离心管中，加入10μL L-2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL，水溶解)和10μL十七烷酸(1mg/mL，甲醇溶解)作为内参，涡旋10秒混匀；然后加入300μL甲醇/氯仿混合液(体积比3：1)，涡旋30秒混匀，将样本置于-20℃孵育10分钟后，12000g离心10分钟(4℃)；取300μL上清于玻璃取样瓶中，在室温下用氮吹仪吹干，加入80μL甲氧基胺(15mg/mL，吡啶溶解)，30℃孵育90分钟，然后加入80μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(含体积百分比1％三甲基氯硅烷)，70℃孵育60分钟即得。

3.1.2.检测表征

GC-MS条件：色谱分离采用超高效气相色谱，质谱分析采用四级杆-飞行时间质谱。色谱柱为DB-5ms毛细柱(30m×250μm i.d.，0.25μm)；载气为高纯氦气，流速1.0mL/min；进样量1μL；程序升温：80℃恒温2分钟，80℃-180℃(10℃/min)，180℃-240℃(5℃/min)，240℃-290℃(25℃/min)，290℃恒温9分钟；不分流，进样温度260℃；接口温度270℃；离子源温度200℃；电子能量70eV；采用全扫描模式，扫描质量范围：m/z30-600道尔顿，光谱采集率为20光谱/s。

4.数据处理和分析

采用JiaLibTM代谢数据库对GC-MS非靶向检测到的血清代谢物进行注释，然后对检测数据进行多变量和单变量分析。首先将数据导入SIMCA软件(version14.0.1，Umetrics)进行正交偏最小二乘法-判别分析(Orthogonal projections to latentstructures-Discrimination Analysis，OPLS-DA)，过滤与模型分类不相关信号，获得OPLS-DA模型，对模型的质量用交叉验证法进行检验，并用交叉验证后获得的R2Y和Q2(Y的可解释变量和模型的可预测变量)对模型有效性进行评估，R2Y和Q2越接近1模型质量越好，Q2大于0.5表明模型较好。对OPLS-DA模型进行置换检验获得R2和Q2进一步评估模型，Q2小于0表明模型较好。计算OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要性指标(VariableImportance in the Projection,VIP)，然后利用在线分析软件MetaboAnalys(http://www.metaboanalyst.ca/)对代谢数据进行单变量分析，计算泛发性脓疱型银屑病患者与健康志愿者之间代谢物差异倍数，进行Student t检验获得错误发现率(False DiscoveryRate,FDR)，筛选FDR值小于0.05的代谢物。结合多变量和单变量分析结果筛选VIP>1.5且FDR<0.05的代谢物，并将其定义为泛发性脓疱型银屑病候选代谢标志物。

二.结果

1.血清差异代谢物筛选。

GC-MS在血清样本中共检测到123个可注释的代谢物，采用SIMCA软件进行OPLS-DA分析获得OPLS-DA模型(图1)，交叉验证法检验模型的质量获得R2Y＝0.984，Q2＝0.893(图2)。结合多变量和单变量分析结果，血清样本中共筛选到35个差异代谢物(VIP>1.5且FDR<0.05)。见表1，这些标志物是酪胺(tyramine)、丙酮酸(pyruvic acid)、α-酮异戊酸(alpha-ketoisovaleric acid)、2-羟基丁酸(2-hydroxybutyric acid)、3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid)、甲烷硫代磷酸(methanephosphonothioic acid)、脯氨酸(L-proline)、尿嘧啶(uracil)、氨甲环酸(tranexamic acid)、4-氨基丁酸(4-aminobutyricacid)、苏氨酸(L-threonine)、东莨菪内酯(scopoletin)、十二烷醇(dodecanol)、N-甲基-L-亮氨酸(N-methyl-l-leucine)、L-半胱氨酸-甘氨酸(L-cysteine-glycine)、L-犬尿氨酸(L-kynurenine)、3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid)、尿囊素(allantoin)、δ-生育酚(delta-tocopherol)、木呋喃木糖(xylofuranose)、葡萄糖-1-磷酸(glucose-1-phosphate)、焦磷酸盐(pyrophosphate)、牛磺酸(taurine)、L-天冬酰胺(L-asparagine)、邻苯二甲酸(phthalic acid)、4-(二甲氨基)偶氮苯(4-(dimethylamino)azobenzene)、5-叔丁基-1h-吲哚-2,3-二酮(5-tert-butyl-1h-indole-2,3-dione)、奎宁酸(quinicacid)、葡萄糖(glucose)、组氨酸(L-histidine)、赖氨酸(L-lysine)、棕榈酸(palmitelaidic acid)、7-甲基鸟嘌呤(7-methylguanine)、油酸(oleic acid)、巨头鲸鱼酸(cis-gondoic acid)。经查阅已发表文献，这35个血浆代谢标志物均为首次在泛发性脓疱型银屑病早期诊断中发现，对于泛发性脓疱型银屑病的诊断与治疗具有十分重要的意义。

表1.

2.与疾病严重程度相关的代谢物筛选。

在上一步筛选出的35个血清差异代谢物的基础上，将其与泛发性脓疱型银屑病疾病严重程度评分(JDA评分)进行Pearson相关性分析，按照P<0.05筛选出与疾病严重程度相关的5个代谢物，分别是：苏氨酸(L-threonine)、L-半胱氨酸-甘氨酸(L-cysteine-glycine)、焦磷酸盐(pyrophosphate)、葡萄糖(glucose)和组氨酸(L-histidine)(表2)。

表2.

ROC曲线分析结果显示5个代谢物AUC值均大于0.9，分别为：苏氨酸(L-threonine)：AUC＝0.93，95％CI：0.85-1.00，P<0.0001，L-半胱氨酸-甘氨酸(L-cysteine-glycine)：AUC＝0.94，95％CI：0.88-1.00，P<0.0001，焦磷酸盐(pyrophosphate)：AUC＝0.98，95％CI：0.95-1.00，P<0.0001，葡萄糖(glucose)：AUC＝1.00，95％CI：1.00-1.00，P<0.0001，组氨酸(L-histidine)：AUC＝0.96，95％CI：0.90-1.00，P<0.0001，见图3，表明这5个代谢物对泛发性脓疱型银屑病患者与健康人群的代谢组数据分类很好，可准确区分患者与健康人群。

35个代谢物可以准确区分患者和健康人群，从中筛选出5个代谢物，这5个代谢物含量单独都与与泛发性脓疱型银屑病严重程度相关，从ROC曲线也进一步判断这5个代谢物可分别单独预测患病状态。

本发明的诊断标志物可以有效将泛发性脓疱型银屑病患者与健康正常对照区分开，有利于临床上辅助诊断泛发性脓疱型银屑病，对于改善泛发性脓疱型银屑病的临床诊治和评估有很大帮助，具有良好的临床使用和推广价值。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，基于本发明专利思想的其他实施方式也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.基于代谢组学的泛发性脓疱型银屑病的诊断标志物，其特征在于，所述诊断标志物包含以下35种化合物中的一种或多种：酪胺(tyramine)、丙酮酸(pyruvic acid)、α-酮异戊酸(alpha-ketoisovaleric acid)、2-羟基丁酸(2-hydroxybutyric acid)、3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid)、甲烷硫代磷酸(methanephosphonothioic acid)、脯氨酸(L-proline)、尿嘧啶(uracil)、氨甲环酸(tranexamic acid)、4-氨基丁酸(4-aminobutyricacid)、苏氨酸(L-threonine)、东莨菪内酯(scopoletin)、十二烷醇(dodecanol)、N-甲基-L-亮氨酸(N-methyl-l-leucine)、L-半胱氨酸-甘氨酸(L-cysteine-glycine)、L-犬尿氨酸(L-kynurenine)、3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid)、尿囊素(allantoin)、δ-生育酚(delta-tocopherol)、木呋喃木糖(xylofuranose)、葡萄糖-1-磷酸(glucose-1-phosphate)、焦磷酸盐(pyrophosphate)、牛磺酸(taurine)、L-天冬酰胺(L-asparagine)、邻苯二甲酸(phthalic acid)、4-(二甲氨基)偶氮苯(4-(dimethylamino)azobenzene)、5-叔丁基-1h-吲哚-2,3-二酮(5-tert-butyl-1h-indole-2,3-dione)、奎宁酸(quinicacid)、葡萄糖(glucose)、组氨酸(L-histidine)、赖氨酸(L-lysine)、棕榈酸(palmitelaidic acid)、7-甲基鸟嘌呤(7-methylguanine)、油酸(oleic acid)和巨头鲸鱼酸(cis-gondoic acid)。

2.根据权利要求1所述的诊断标志物，其特征在于，所述诊断标志物是以下5种化合物中的任意一种或多种：苏氨酸(L-threonine)、L-半胱氨酸-甘氨酸(L-cysteine-glycine)、焦磷酸盐(pyrophosphate)、葡萄糖(glucose)和组氨酸(L-histidine)。

3.根据权利要求1或2所述的诊断标志物在制备泛发性脓疱型银屑病诊断制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的泛发性脓疱型银屑病诊断制剂是诊断泛发性脓疱型银屑病血清代谢物的制剂。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的诊断标志物是血浆代谢标志物。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的诊断标志物被作为气相色谱-质谱联用仪的标准品。

7.权利要求1所述的泛发性脓疱型银屑病的诊断标志物的筛选方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)收集泛发性脓疱型银屑病患者及健康志愿者的血清样本作为分析样品；

(2)采用GC-MS联用技术对每个分析样本进行非靶向代谢组学分析，得到各血清样本的原始代谢指纹图谱；

(3)对所获血清代谢组学指纹图谱进行数据前处理、多元统计分析筛选差异代谢物，并通过分析差异代谢物与疾病严重程度评分的Pearson相关性分析进一步筛选标志代谢物；

(4)通过ROC曲线分析获得AUC值均大于0.9的差异代谢物，即得适合于泛发性脓疱型银屑病诊断的血清代谢标志物。

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