CN108226127B - 测定疟原虫含量的方法和检测疟原虫含量的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种测定疟原虫含量的方法和检测疟原虫含量的系统。上述测定疟原虫含量的方法包括如下步骤：用细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液，细胞处理液中含有4.0g/L～6.0g/L的聚氧乙烯醚和4.0g/L～5.5g/L的4‑羟基哌嗪乙磺酸；将细胞悬液固液分离，收集沉降物，若待测样品含有携带疟原虫的细胞，则携带疟原虫的细胞未裂解且固液分离后置于沉降物中；采用拉曼光谱检测沉降物，获得沉降物对应的拉曼光谱；对拉曼光谱进行分析，若拉曼光谱在拉曼位移为1368cm‑1～1378cm‑1存在拉曼峰，则待测样品含有疟原虫。上述测定方法无需提取疟色素即可测定疟原虫含量，准确度高。

Description

测定疟原虫含量的方法和检测疟原虫含量的系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种测定疟原虫含量的方法和检测疟原虫含量的系统。
背景技术
疟原虫为疟疾的病原体，为一种引起疟疾的专性胞内寄生虫。疟原虫能够侵入红细胞并消化血红蛋白，产生黑色不溶的疟色素。疟原虫在培养条件下的虫血率约为0.1％～5％，对疟原虫进行准确定位是疟原虫基础研究和疫苗研究中重要的一项内容。
目前，主要通过涂片染色镜检法或疟色素检测法等方法进行疟原虫的检测。其中，涂片染色镜检法操作繁琐，且检测准确度较低。而疟色素检测法需要将包括携带疟原虫的细胞和未携带疟原虫的细胞在内的所有细胞裂解，并将疟色素提取出来，操作繁琐，提取操作容易造成疟色素被破坏而影响后续的检测，同时，疟色素检测法的准确较低，当待测细胞中疟原虫的感染量较少或疟色素积累量较少时，无法有效检测。
发明内容
基于此，有必要提供一种无需提取疟色素即可测定疟原虫含量的方法和检测疟原虫含量的系统。
一种测定疟原虫含量的方法，包括如下步骤：
用细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液，其中，所述细胞处理液中含有聚氧乙烯醚和4-羟基哌嗪乙磺酸，所述聚氧乙烯醚的浓度为4.0g/L～6.0g/L，所述4-羟基哌嗪乙磺酸的浓度为4.0g/L～5.5g/L；
将所述细胞悬液进行固液分离，收集沉降物，若所述待测样品含有携带疟原虫的细胞，则所述携带疟原虫的细胞未裂解且固液分离后置于所述沉降物中；
采用拉曼光谱检测所述沉降物，获得所述沉降物对应的拉曼光谱；及
对所述拉曼光谱进行分析，若所述拉曼光谱在拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1存在拉曼峰，则所述待测样品中含有疟原虫。
上述测定疟原虫含量的方法中，通过特定的细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液。在细胞处理液的作用下，携带疟原虫的细胞未发生裂解，而未携带疟原虫的细胞(正常细胞)发生裂解。经固液分离后，被裂解的细胞位于上清中，携带疟原虫的细胞位于沉降物中，从而将携带疟原虫的细胞富集和分离，进而避免大量的正常细胞对疟原虫含量测定的干扰，进而保证检测结果的准确度。之后通过对沉降物的拉曼光谱检测，操作简单，灵敏度高。经试验验证，含有疟原虫的红细胞在拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1存在特异性的拉曼峰，通过拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1存在拉曼峰来确定待测样品中含有疟原虫，有利于提高检测结果的准确度。上述测定疟原虫含量的方法结合特异性的细胞处理液和拉曼光谱技术，无需提取疟色素即能够测定疟原虫的含量，操作简单，准确度高，灵敏度高。此外，通过上述测定疟原虫含量的方法能够对实验用血液制品进行实验前产品质量的验证，以利于该实验用血液制品应用于后续的科学研究。
在其中一个实施例中，所述细胞处理液还含有0.2g/L～0.35g/L的磷酸二氢钾、1.0g/L～2.0g/L的磷酸氢二钠、6.5g/L～9.5g/L的氯化钠、0.1g/L～0.5g/L的氯化钾、4g/L～8g/L的牛血清白蛋白及0.5g/L～1.0g/L的EDTA二钠。
在其中一个实施例中，所述用细胞处理液处理待测样品的操作中，按照所述待测样品中每1.0×1012个～1.0×1013个细胞添加1mL～2mL的所述细胞处理液的比例加入所述细胞处理液，处理温度为22℃～30℃，处理时间为0.5分钟～2分钟。
在其中一个实施例中，所述用细胞处理液处理待测样品的操作之前，还包括调整所述待测样品中的细胞浓度，以使所述待测样品中细胞浓度为1.0×1012个/mL～1.0×1013个/mL。
在其中一个实施例中，所述用细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液的操作具体如下：
将所述待测样品与所述细胞处理液混合进行第一次处理，分离得到第一上清和第一沉降物；及
将所述第一沉降物与所述细胞处理液混合进行第二次处理，得到所述细胞悬液。
在其中一个实施例中，所述将所述待测样品与所述细胞处理液混合进行第一次处理的操作中，按照所述待测样品中每1.0×1012个～1.0×1013个细胞添加0.5mL～2mL的所述细胞处理液的比例加入所述细胞处理液；所述将所述第一沉降物与所述细胞处理液混合进行第二次处理的操作中，所述第一沉降物与所述细胞处理液的质量比为1：100～1：300。
在其中一个实施例中，所述将所述细胞悬液进行固液分离的操作中，所述固液分离的方式为离心，所述离心的转速为3000g～5000g，所述离心的时间为5分钟～15分钟。
在其中一个实施例中，所述采用拉曼光谱检测所述沉降物，获得所述沉降物对应的拉曼光谱的操作中，激发光波长为532nm～782nm，激发光频率为1.6秒/次～10秒/次。
在其中一个实施例中，所述对所述拉曼光谱进行分析的操作中，若所述拉曼光谱在拉曼位移为750cm-1～760cm-1存在拉曼峰，则所述沉降物为红细胞。
一种检测疟原虫含量的系统，包括：
处理装置，用于通过细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液，其中，所述细胞处理液中含有聚氧乙烯醚和4-羟基哌嗪乙磺酸，所述聚氧乙烯醚的浓度为4.0g/L～6.0g/L，所述4-羟基哌嗪乙磺酸的浓度为4.0g/L～5.5g/L
分离装置，用于固液分离所述细胞悬液，收集沉降物，若所述待测样品含有携带疟原虫的细胞，则所述携带疟原虫的细胞未裂解且固液分离后置于所述沉降物中；
检测装置，用于以拉曼光谱的方式检测所述沉降物，获得所述沉降物对应的拉曼光谱；及
分析装置，用于对所述拉曼光谱进行分析，若所述拉曼光谱在拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1存在拉曼峰，则所述待测样品中含有疟原虫。
附图说明
图1为一实施方式的检测疟原虫含量的系统的结构示意图；
图2为实施例1的未处理的阳性细胞液的显微镜成像图；
图3为实施例1的处理后的阳性细胞液的显微镜成像图；
图4为实施例1的阴性对照样本及阳性对照样本的拉曼光谱对比图；
图5为实施例2的阴性对照样本及阳性对照样本的拉曼光谱对比图；
图6为实施例3的阴性对照样本及阳性对照样本的拉曼光谱对比图；
图7为实施例4的阴性对照样本及阳性对照样本的拉曼光谱对比图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的测定疟原虫含量的方法，包括如下操作S110～S140：
S110、用细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液，其中，细胞处理液中含有聚氧乙烯醚和4-羟基哌嗪乙磺酸，聚氧乙烯醚的浓度为4.0g/L～6.0g/L，4-羟基哌嗪乙磺酸的浓度为4.0g/L～5.5g/L。
优选地，细胞处理液中聚氧乙烯醚的浓度为5.0g/L，4-羟基哌嗪乙磺酸的浓度为4.76g/L。
由于携带疟原虫的细胞的细胞结构发生改变，在特定的细胞处理液的作用下，携带疟原虫的细胞未发生裂解，而未携带疟原虫的细胞(正常细胞)发生裂解，以便于将携带疟原虫的细胞富集和分离。
在其中一个实施方式中，细胞处理液还含有0.2g/L～0.35g/L的磷酸二氢钾、1.0g/L～2.0g/L的磷酸氢二钠、6.5g/L～9.5g/L的氯化钠、0.1g/L～0.5g/L的氯化钾、4g/L～8g/L的牛血清白蛋白及0.5g/L～1.0g/L的EDTA二钠。。
在其中一个实施方式中，在用细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液的操作中，按照待测样品中每1.0×1012个～1.0×1013个细胞添加1mL～2mL的细胞处理液的比例加入细胞处理液，处理温度为22℃～30℃，处理时间为0.5分钟～2分钟。
在其中一个实施方式中，细胞处理液处理待测样品的操作之前，还包括调整待测样品中的细胞浓度，以使待测样品中的细胞浓度为1.0×1012个/mL～1.0×1013个/mL。
具体地，用稀释液稀释待测样品，以使待测样品中的细胞浓度为1.0×1012个/mL～1.0×1013个/mL。
在其中一个实施方式中，稀释液为生理盐水。
在其中一个实施方式中，稀释液含有0.27g/L的KH2PO4、1.42g/L的Na2HPO4·12H2O、8g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、5g/L的牛血清白蛋白及0.8g/L的EDTA二钠，且稀释液的pH为7.2。
在其中一个实施方式中，待测样品为实验用血液制品或带血食品。其中，带血食品例如可以是市场出售的猪血等，通过对带血食品进行疟原虫含量的测定，有利于控制带血食品的质量。
在其中一个实施方式中，若待测样品中含有携带疟原虫的细胞，则该疟原虫为处于裂殖体阶段的疟原虫或处于环状体阶段的疟原虫。
在其中一个实施方式中，细胞处理液处理待测样品的操作之前，还包括培养待测样品，以使待测样品中的疟原虫处于环状体阶段。
在其中一个实施方式中，细胞处理液处理待测样品的操作之前，还包括对待测样品进行抗凝处理。
在其中一个实施方式中，用细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液的操作具体如下：
S111、将待测样品与细胞处理液混合进行第一次处理，分离得到第一上清和第一沉降物。
在其中一个实施方式中，将待测样品与细胞处理液混合进行第一次处理的操作中，按照待测样品中每1.0×1012个～1.0×1013个细胞添加0.5mL～2mL的细胞处理液的比例加入细胞处理液。
在其中一个实施方式中，将待测样品与细胞处理液混合进行第一次处理的操作中，处理温度为22℃～30℃，处理时间为0.5分钟～3分钟。
在其中一个实施方式中，分离得到第一上清和第一沉降物的操作中，分离的方式为离心，离心的转速为3000g～5000g，离心的时间为5分钟～15分钟。当然，需要说明的是，分离得到第一上清和第一沉降物的方式不限于上述指出的方式，还可以为其他分离方式，例如可以是过滤，只要能够将第一上清和第一沉降物分离即可。
S112、将第一沉降物与细胞处理液混合进行第二次处理，得到细胞悬液。
在其中一个实施方式中，将第一沉降物与细胞处理液混合进行第二次处理的操作中，第一沉降物与细胞处理液的质量比为1：100～1：300。
在其中一个实施方式中，将第一沉降物与细胞处理液混合进行第二次处理的操作中，处理温度为22℃～30℃，处理时间为0.5分钟～3分钟。
通过S111～S112的分步操作，能够保证未携带疟原虫的细胞能够裂解，避免未携带疟原虫的细胞大量残留而对疟原虫含量检测的干扰，保证检测结果的准确度。
S120、将细胞悬液进行固液分离，收集沉降物，若待测样品含有携带疟原虫的细胞，则携带疟原虫的细胞未裂解且固液分离后置于沉降物中。
细胞悬液中含有未裂解的携带疟原虫的细胞和已裂解的未携带疟原虫的细胞，经固液分离后，被裂解的细胞位于上清中，携带疟原虫的细胞位于沉降物中，从而将携带疟原虫的细胞和未携带疟原虫的细胞分离，既能够富集携带疟原虫的细胞，又能够避免正常细胞对疟原虫含量测定的干扰，进而保证检测结果的准确度。
在其中一个实施方式中，将细胞悬液进行固液分离的操作中，固液分离的方式为离心，离心的转速为3000g～5000g，离心的时间为5分钟～15分钟。当然，需要说明的是，固液分离的方式不限于上述指出的方式，还可以为其他固液分离方式，例如可以是过滤。
S130、采用拉曼光谱检测沉降物，获得沉降物对应的拉曼光谱。
在其中一个实施方式中，采用拉曼光谱检测沉降物，获得沉降物对应的拉曼光谱的操作中，激发光波长为532nm～782nm，激发光频率为1.6秒/次～10秒/次。
在其中一个实施方式中，采用拉曼光谱检测沉降物的操作具体为：将沉降物置于拉曼显微镜下，在50倍物镜下检测长度为6微米～10微米的细胞，用激光照射6微米～10微米的细胞，获得该细胞对应的拉曼光谱。
在其中一个实施方式中，选用英国Renishaw的型号为inVia的拉曼光谱仪检测沉降物。
在其中一个实施方式中，S120之后，S130之前，还包括清洗沉降物。
具体地，用清洗液清洗S120得到的沉降物，分离得到清洗后的沉降物。
在其中一个实施方式中，清洗液为生理盐水。
在其中一个实施方式中，清洗液含有0.27g/L的KH2PO4、1.42g/L的Na2HPO4·12H2O、8g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、5g/L的牛血清白蛋白及0.8g/L的EDTA二钠，且稀释液的pH为7.2。
在其中一个实施方式中，用清洗液清洗S120得到的沉降物，分离得到清洗后的沉降物的操作中，分离方式为离心，离心的转速为3000g～5000g，离心的时间为5分钟～15分钟。当然，需要说明的是，分离的方式不限于上述指出的方式，还可以为其他分离方式，例如可以是过滤。
S140、对拉曼光谱进行分析，若拉曼光谱在拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1存在拉曼峰，则待测样品中含有疟原虫。
通过拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1存在拉曼峰来确定待测样品中含有疟原虫，有利于提高检测结果的准确度。此外，拉曼检测所需时间较短，约为10秒钟，能够节省检测时间，有利于快速检测疟原虫含量。
在其中一个实施方式中，采用Vancouver Raman Algorithm软件去除荧光信号及基底信号，然后采用origin 9.1分析比对拉曼光谱，从而判断待测样品中的疟原虫的含量。当然，需要说明的是，对拉曼光谱进行分析的操作中，若拉曼光谱在拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1存在拉曼峰，还可以获取该拉曼峰的强度，以定量检测待测样品中疟原虫的含量。
在其中一个实施方式中，对拉曼光谱进行分析的操作中，还包括判定拉曼光谱在拉曼位移为750cm-1～760cm-1是否存在拉曼峰，进而判定沉降物是否为红细胞。
具体地，若拉曼光谱在拉曼位移为750cm-1～760cm-1存在拉曼峰，则沉降物为红细胞。
上述检测疟原虫含量的方法结合特异性的细胞处理液和拉曼光谱技术，无需提取疟色素即能够测定疟原虫的含量，操作简单，准确度高，灵敏度高。同时，还可以通过获取拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1下的拉曼峰的强度，以定量检测待测样品中疟原虫的含量。此外，通过上述测定疟原虫含量的方法能够对实验用液血制品进行实验前产品质量的验证，以利于该实验用血液制品应用于后续的科学研究。
如图1所示，一实施方式的检测疟原虫含量的系统100，包括：处理装置110、分离装置120、检测装置130及分析装置140。
处理装置110用于通过细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液，其中，所述细胞处理液中含有聚氧乙烯醚和4-羟基哌嗪乙磺酸，所述聚氧乙烯醚的浓度为4.0g/L～6.0g/L，所述4-羟基哌嗪乙磺酸的浓度为4.0g/L～5.5g/L。
处理装置110包括预处理机构(图未示)、配液机构(图未示)、待测样品处理机构(图未示)及分离机构(图未示)。预处理机构用于对待测样品进行抗凝处理等预处理。
配液机构用于配制细胞处理液。进一步地，细胞处理液还含0.2g/L～0.35g/L的磷酸二氢钾、1.0g/L～2.0g/L的磷酸氢二钠、6.5g/L～9.5g/L的氯化钠、0.1g/L～0.5g/L的氯化钾、4g/L～8g/L的牛血清白蛋白及0.5g/L～1.0g/L的EDTA二钠。
在其中一个实施方式中，配液机构还可以用于配制稀释液。
在其中一个实施方式中，稀释液为生理盐水。
在其中一个实施方式中，稀释液含有0.27g/L的KH2PO4、1.42g/L的Na2HPO4·12H2O、8g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、5g/L的牛血清白蛋白及0.8g/L的EDTA二钠，且稀释液的pH为7.2。
待测样品处理机构用于通过细胞处理液处理待测样品。待测样品处理机构包括处理组件及温度控制组件。
处理组件用于收容细胞处理液及待测样品。在其中一个实施方式中，处理组件还能够对细胞处理液及待测样品的混合液进行搅拌，以使细胞处理液与待测样品混合均匀。
温度控制组件用于在细胞处理液处理待测样品的过程中，控制细胞处理液即待测样品的混合液的温度。
分离机构用于分离得到第一上清液和第一沉降物。当然，需要说明的是，当仅需要对待测样品进行一步处理时，分离机构可以省略。
在其中一个实施方式中，分离机构为离心机构或过滤机构。
分离装置120用于固液分离细胞悬液，收集沉降物，若待测样品含有携带疟原虫的细胞，则携带疟原虫的细胞未裂解且固液分离后置于沉降物中。
在其中一个实施方式中，分离装置120为离心装置或过滤装置。
检测装置130用于以拉曼光谱的方式检测沉降物，获得沉降物对应的拉曼光谱。
在其中一个实施方式中，检测装置130为拉曼光谱仪。
进一步地，检测装置130为英国Renishaw的型号为inVia的拉曼光谱仪。
分析装置140用于对拉曼光谱进行分析，若拉曼光谱在拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1存在拉曼峰，则待测样品中含有疟原虫。
在其中一个实施方式中，分析装置140采用Vancouver Raman Algorithm软件去除荧光信号及基底信号，然后采用origin 9.1分析比对拉曼光谱，从而判断待测样品中的疟原虫的含量。
通过上述测定疟色素含量的系统100，无需提取疟色素即能够测定疟原虫的含量，操作简单，准确度高，灵敏度高，能够被广泛应用于对实验用血液制品进行实验前产品质量的验证，以利于该实验用血液制品应用于后续的科学研究。
以下为具体实施例。
以下实施例中，如未特别说明，拉曼光谱测定沉降物的过程中均采用英国Renishaw的型号为inVia的拉曼光谱，疟原虫虫种来自感染恶性疟原虫3D7的红细胞。采用拉曼光谱检测沉降物的操作中，将沉降物置于拉曼显微镜下，在50倍物镜下检测长度为6微米～10微米的细胞，用激光照射6微米～10微米的细胞，获得该细胞对应的拉曼光谱。
实施例1
(1)在完全培养基中加入红细胞得到疟原虫培养基即为阴性对照样本，将疟原虫接种于疟原虫培养基中培养，在培养5天后，收集细胞培养液，分别得到阳性对照样本。其中，完全培养基的配方为10.4g/L的RPMI 1640干粉培养基、2g/L的葡萄糖、0.30g/L的L-谷氨酰胺、5.98g/L的HEPES、2.1g/L的AlbumaxⅡ、4.2g/L的次黄嘌呤及8万单位/L的庆大霉素，疟原虫培养基中红细胞的浓度为1.0×1011个/mL，红细胞来自于昆明小鼠的红细胞。
(2)按照每1.0×1012个细胞添加1mL的细胞处理液分别向阴性对照样本及阳性对照样本中加入细胞处理液，并于22℃下处理2分钟，得到阴性细胞悬液及阳性细胞悬液。其中，细胞处理液中含有4.0g/L的聚氧乙烯醚、4.0g/L的4-羟基哌嗪乙磺酸。
(3)接着将阴性细胞悬液及阳性细胞悬液均于3000g离心15分钟，得到阴性沉降物及阳性沉降物。取未处理的阳性对照样本用无菌水稀释2倍，得到未处理的阳性细胞液，通过奥林巴斯光学显微镜于100倍下观察，得到对应的显微镜成像图。取阳性沉降物用无菌水稀释2倍，得到处理后的阳性细胞液，并用瑞姬染液染色，携带疟原虫的细胞能够被染色，再通过奥林巴斯光学显微镜于100倍下观察，得到对应的显微镜成像图。测定结果详见图2和图3。
(4)用拉曼光谱分别检测上述沉降物，获得对应的拉曼光谱。其中，激发光波长为532nm，激发光频率为1.6秒/次，激发光功率衰减为1％。
(5)对步骤(4)的拉曼光谱进行分析。其中，采用Vancouver Raman Algorithm软件去除荧光信号及基底信号，然后采用origin 9.1分析比对上述拉曼光谱。检测结果详见图4，其中图4a)为阴性对照样本的拉曼光谱，图4b)为阳性对照样本的拉曼光谱。
从图2可以看出，未处理的阳性细胞液中含有大量的完整细胞。从图3可以看出，处理后的阳性细胞液为将阳性对照样本经细胞液处理并离心富集，其中主要为携带疟原虫的细胞(例如箭头3-1所示的染色后呈紫色的细胞)，说明细胞处理液能够裂解正常细胞，进而能够使携带疟原虫的细胞富集和分离。
从图4a)可以看出，阴性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移750cm-1～760cm-1处存在拉曼峰(如箭头4a-1所示)，说明阴性沉降物中检测的细胞为红细胞，且阴性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1处不存在拉曼峰，说明阴性沉降物中不含有携带疟原虫的细胞，主要为正常细胞。从图4b)可以看出，阳性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为750cm-1～760cm-1处存在拉曼峰(如箭头4b-1所示)，说明阳性沉降物中检测的细胞为红细胞，且阳性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1处存在拉曼峰(如箭头4b-2所示)，说明阳性沉降物中含有携带疟原虫的细胞。
实施例2
(1)在完全培养基中加入红细胞得到疟原虫培养基即为阴性对照样本，将疟原虫接种于疟原虫培养基中培养，在培养5天后，收集细胞培养液，分别得到阳性对照样本。其中，完全培养基的配方为10.4g/L的RPMI 1640干粉培养基、2g/L的葡萄糖、0.30g/L的L-谷氨酰胺、5.98g/L的HEPES、2.1g/L的AlbumaxⅡ、4.2g/L的次黄嘌呤及8万单位/L的庆大霉素，疟原虫培养基中红细胞的浓度为1.0×1011个/mL，红细胞来自于昆明小鼠的红细胞。
(2)按照每1.0×1013个细胞添加2mL的细胞处理液分别向阴性对照样本及阳性对照样本中加入细胞处理液，并于30℃下处理0.5分钟，得到阴性细胞悬液及阳性细胞悬液。其中，细胞处理液中含有6.0g/L的聚氧乙烯醚、5.5g/L的4-羟基哌嗪乙磺酸、0.2g/L的磷酸二氢钾、1.0g/L的磷酸氢二钠、6.5g/L的氯化钠、0.1g/L的氯化钾、4g/L的牛血清白蛋白及0.5g/L的EDTA二钠。
(3)接着将阴性细胞悬液及阳性细胞悬液均于3000g离心15分钟，得到阴性沉降物及阳性沉降物，用清洗液分别清洗阴性沉降物及阳性沉降物，再于5000g离心5分钟，收集沉淀，得到清洗后的阴性沉降物及清洗后的阳性沉降物，其中，清洗液含有0.27g/L的KH2PO4、1.42g/L的Na2HPO4·12H2O、8g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、5g/L的牛血清白蛋白及0.8g/L的EDTA二钠，且pH为7.2。
(4)用拉曼光谱分别检测阴性沉降物及阳性沉降物，获得阴性沉降物对应的拉曼光谱及阳性沉降物对应的拉曼光谱。其中，激发光波长为782nm，激发光频率为10秒/次，激发光功率衰减为1％。
(5)对阴性沉降物对应的拉曼光谱及阳性沉降物对应的拉曼光谱进行分析。其中，采用Vancouver Raman Algorithm软件去除荧光信号及基底信号，然后采用origin 9.1分析比对上述拉曼光谱。结果详见图5，其中图5a)为阴性对照样本的拉曼光谱，图5b)为阳性对照样本的拉曼光谱。
从图5a)可以看出，阴性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移750cm-1～760cm-1处存在拉曼峰(如箭头5a-1所示)，说明阴性沉降物中检测的细胞为红细胞，且阴性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1处不存在拉曼峰，说明阴性沉降物中不含有携带疟原虫的细胞，主要为正常细胞。从图5b)可以看出，阳性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为750cm-1～760cm-1处存在拉曼峰(如箭头5b-1所示)，说明阳性沉降物中检测的细胞为红细胞，且阳性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1处存在拉曼峰(如箭头5b-2所示)，说明阳性沉降物中含有携带疟原虫的细胞。
实施例3
(1)在完全培养基中加入红细胞得到疟原虫培养基即为阴性对照样本，将疟原虫接种于疟原虫培养基中培养，分别在培养5天后，收集细胞培养液，分别得到阳性对照样本。其中，完全培养基的配方为10.4g/L的RPMI 1640干粉培养基、2g/L的葡萄糖、0.30g/L的L-谷氨酰胺、5.98g/L的HEPES、2.1g/L的AlbumaxⅡ、4.2g/L的次黄嘌呤及8万单位/L的庆大霉素，疟原虫培养基中红细胞的浓度为1.0×1011个/mL，红细胞来自于昆明小鼠的红细胞。
(2)按照每1.0×1013个细胞添加2mL的细胞处理液分别向阴性对照样本及阳性对照样本中加入细胞处理液，并于30℃下处理3分钟，得到阴性细胞悬液及阳性细胞悬液。其中，细胞处理液中含有6g/L的聚氧乙烯醚、5.5g/L的4-羟基哌嗪乙磺酸、0.35g/L的磷酸二氢钾、2.0g/L的磷酸氢二钠、9.5g/L的氯化钠、0.5g/L的氯化钾、8g/L的牛血清白蛋白及1.0g/L的EDTA二钠。
(3)将阴性细胞悬液及阳性细胞悬液均于3000g离心5分钟，得到第一阴性沉降物及第一阳性沉降物，将第一阴性沉降物及第一阳性沉降物分别与细胞处理液混合，并于22℃下处理0.5分钟，处理结束后于5000g离心15分钟，得到阴性沉降物及阳性沉降物，用清洗液分别清洗阴性沉降物及阳性沉降物，再于3000g离心5分钟，收集沉淀，得到清洗后的阴性沉降物及清洗后的阳性沉降物，其中，第一阴性沉降物与细胞处理液的质量比为1:100，第二阴性沉降物与细胞处理液的质量比为1:100，清洗液含有0.27g/L的KH2PO4、1.42g/L的Na2HPO4·12H2O、8g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、5g/L的牛血清白蛋白及0.8g/L的EDTA二钠，且pH为7.2。
(4)用拉曼光谱分别检测清洗后的阴性沉降物及清洗后的阳性沉降物，获得清洗后的阴性沉降物对应的拉曼光谱及清洗后的阳性沉降物对应的拉曼光谱。其中，激发光波长为782nm，激发光频率为10秒/次，激发光功率衰减为1％。
(5)对清洗后的阴性沉降物对应的拉曼光谱及清洗后的阳性沉降物对应的拉曼光谱进行分析。其中，采用Vancouver Raman Algorithm软件去除荧光信号及基底信号，然后采用origin 9.1分析比对上述拉曼光谱。结果详见图6其中图6a)为阴性对照样本的拉曼光谱，图6b)为阳性对照样本的拉曼光谱。
从图6a)可以看出，阴性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移750cm-1～760cm-1处存在拉曼峰(如箭头6a-1所示)，说明阴性沉降物中检测的细胞为红细胞，且阴性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1处不存在拉曼峰，说明阴性沉降物中不含有携带疟原虫的细胞，主要为正常细胞。从图6b)可以看出，阳性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为750cm-1～760cm-1处存在拉曼峰(如箭头6b-1所示)，说明阳性沉降物中检测的细胞为红细胞，且阳性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1处存在拉曼峰(如箭头6b-2所示)，说明阳性沉降物中含有携带疟原虫的细胞。
实施例4
(1)在完全培养基中加入红细胞得到疟原虫培养基即为阴性对照样本，将疟原虫接种于疟原虫培养基中培养，分别在培养5天后，收集细胞培养液，分别得到阳性对照样本。其中，完全培养基的配方为10.4g/L的RPMI 1640干粉培养基、2g/L的葡萄糖、0.30g/L的L-谷氨酰胺、5.98g/L的HEPES、2.1g/L的AlbumaxⅡ、4.2g/L的次黄嘌呤及8万单位/L的庆大霉素，疟原虫培养基中红细胞的浓度为1.0×1011个/mL，红细胞来自于昆明小鼠的红细胞。
(2)按照每1.0×1013个细胞添加1.5mL的细胞处理液分别向阴性对照样本及阳性对照样本中加入细胞处理液，并于22℃下处理0.5分钟，得到阴性细胞悬液及阳性细胞悬液。其中，细胞处理液中含有5g/L的聚氧乙烯醚、4.76g/L的4-羟基哌嗪乙磺酸、0.27g/L的磷酸二氢钾、1.5g/L的磷酸氢二钠、8g/L的氯化钠、0.3g/L的氯化钾、6g/L的牛血清白蛋白及0.75g/L的EDTA二钠。
(3)将阴性细胞悬液及阳性细胞悬液均于4000g离心10分钟，得到第一阴性沉降物及第一阳性沉降物，将第一阴性沉降物及第一阳性沉降物分别与细胞处理液混合，并于30℃下处理0.5分钟，处理结束后于5000g离心5分钟，得到阴性沉降物及阳性沉降物，用生理盐水分别清洗阴性沉降物及阳性沉降物，再于3000g离心15分钟，收集沉淀，得到清洗后的阴性沉降物及清洗后的阳性沉降物，其中，第一阴性沉降物与细胞处理液的质量比为1:200，第二阴性沉降物与细胞处理液的质量比为1：200。
(4)用拉曼光谱分别检测清洗后的阴性沉降物及清洗后的阳性沉降物，获得清洗后的阴性沉降物对应的拉曼光谱及清洗后的阳性沉降物对应的拉曼光谱。其中，激发光波长为532nm，激发光频率为1.6秒/次，激发光功率衰减为1％。
(5)对清洗后的阴性沉降物对应的拉曼光谱及清洗后的阳性沉降物对应的拉曼光谱进行分析。其中，采用Vancouver Raman Algorithm软件去除荧光信号及基底信号，然后采用origin 9.1分析比对上述拉曼光谱。结果详见图7，其中图7a)为阴性对照样本的拉曼光谱，图7b)为阳性对照样本的拉曼光谱。
从图7a)可以看出，阴性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移750cm-1～760cm-1处存在拉曼峰(如箭头7a-1所示)，说明阴性沉降物中检测的细胞为红细胞，且阴性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1处不存在拉曼峰，说明阴性沉降物中不含有携带疟原虫的细胞，主要为正常细胞。从图7b)可以看出，阳性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为750cm-1～760cm-1处存在拉曼峰(如箭头7b-1所示)，说明阳性沉降物中检测的细胞为红细胞，且阳性沉降物的拉曼光谱中拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1处存在拉曼峰(如箭头7b-2所示)，说明阳性沉降物中含有携带疟原虫的细胞。
综上所述，上述检测疟原虫含量的方法无需提取疟色素即可测定疟原虫含量。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种测定疟原虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：
用细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液，其中，所述细胞处理液中含有聚氧乙烯醚和4-羟基哌嗪乙磺酸，所述聚氧乙烯醚的浓度为4.0g/L～6.0g/L，所述4-羟基哌嗪乙磺酸的浓度为4.0g/L～5.5g/L，所述用细胞处理液处理待测样品的操作中，按照所述待测样品中每1.0×1012个～1.0×1013个细胞添加0.5mL～2mL的所述细胞处理液的比例加入所述细胞处理液，处理温度为22℃～30℃，处理时间为0.5分钟～2分钟；
将所述细胞悬液进行固液分离，收集沉降物，若所述待测样品含有携带疟原虫的细胞，则所述携带疟原虫的细胞未裂解且固液分离后置于所述沉降物中；
采用拉曼光谱检测所述沉降物，获得所述沉降物对应的拉曼光谱；及
对所述拉曼光谱进行分析，若所述拉曼光谱在拉曼位移为1368cm-1～1378cm-1存在拉曼峰，则所述待测样品中含有疟原虫。
2.根据权利要求1所述的测定疟原虫的方法，其特征在于，所述细胞处理液还含有0.2g/L～0.35g/L的磷酸二氢钾、1.0g/L～2.0g/L的磷酸氢二钠、6.5g/L～9.5g/L的氯化钠、0.1g/L～0.5g/L的氯化钾、4g/L～8g/L的牛血清白蛋白及0.5g/L～1.0g/L的EDTA二钠。
3.根据权利要求2所述的测定疟原虫的方法，其特征在于，细胞处理液中含有6.0g/L的聚氧乙烯醚、5.5g/L的4-羟基哌嗪乙磺酸、0.2g/L的磷酸二氢钾、1.0g/L的磷酸氢二钠、6.5g/L的氯化钠、0.1g/L的氯化钾、4g/L的牛血清白蛋白及0.5g/L的EDTA二钠。
4.根据权利要求1所述的测定疟原虫的方法，其特征在于，所述用细胞处理液处理待测样品的操作之前，还包括调整所述待测样品中的细胞浓度，以使所述待测样品中细胞浓度为1.0×1012个/mL～1.0×1013个/mL。
5.根据权利要求1所述的测定疟原虫的方法，其特征在于，所述用细胞处理液处理待测样品，得到细胞悬液的操作具体如下：
将所述待测样品与所述细胞处理液混合进行第一次处理，分离得到第一上清液和第一沉降物；及
将所述第一沉降物与所述细胞处理液混合进行第二次处理，得到所述细胞悬液。
6.根据权利要求5所述的测定疟原虫的方法，其特征在于，所述将所述待测样品与所述细胞处理液混合进行第一次处理的操作中，按照所述待测样品中每1.0×1012个～1.0×1013个细胞添加0.5mL～2mL的所述细胞处理液的比例加入所述细胞处理液；所述将所述第一沉降物与所述细胞处理液混合进行第二次处理的操作中，所述第一沉降物与所述细胞处理液的质量比为1：100～1：300。
7.根据权利要求1所述的测定疟原虫的方法，其特征在于，所述将所述细胞悬液进行固液分离的操作中，所述固液分离的方式为离心，所述离心的时间为5分钟～15分钟。
8.根据权利要求1所述的测定疟原虫的方法，其特征在于，所述采用拉曼光谱检测所述沉降物，获得所述沉降物对应的拉曼光谱的操作中，激发光波长为532nm～782nm，激发光频率为1.6秒/次～10秒/次。
9.根据权利要求1所述的测定疟原虫的方法，其特征在于，所述对所述拉曼光谱进行分析的操作中，若所述拉曼光谱在拉曼位移为750cm-1～760cm-1存在拉曼峰，则所述沉降物为红细胞。
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