CN104897644A - 疟原虫的检测方法和检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种疟原虫的检测方法，包括如下步骤：提供待测样本，并且对待测样本进行处理得到红细胞悬液；配制含有皂素的裂解液；将红细胞悬液与裂解液混合并充分裂解后进行离心并保留第一沉淀，接着将第一沉淀充分裂解后进行离心并保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤第二沉淀至少三次后进行离心并保留第三沉淀；采用拉曼激光照射第三沉淀并且收集得到拉曼信号；以及对拉曼信号进行分析从而判断待测样本中是否含有疟原虫。这种疟原虫的检测方法通过皂素使疟原虫从红细胞内释放出来，再经过裂解疟原虫细胞膜从而获得疟色素，使疟色素浓缩起来，结合拉曼光谱技术，检测灵敏度较高。本发明还公开了一种疟原虫的检测系统。

Description

疟原虫的检测方法和检测系统
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，尤其涉及一种疟原虫的检测方法和检测系统。
背景技术
疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病，是一种严重危害人类健康的疾病，疟疾的早期诊断对疟疾的防治意义重大。疟色素是疟原虫感染人后，在宿主红细胞内消化血红蛋白产生的黑色不溶的副产物，可以用于判断是否存在疟原虫感染。
目前疟色素的检测是疟疾检测的一个重要方向，它不仅能用于诊断疟疾的感染，也是反应临床治疗效果的一个重要指标。但目前疟色素的检测方法存在检测信号弱且灵敏度较低的缺点，其原因很大一部分与疟色素在红细胞内含量少且缺乏很好的提取方案有关。
拉曼光谱技术作为一种集光学、物理学、信息学、光谱学及材料学等多学科的于一体的检测技术，在生命科学领域具有广泛的应用前景。疟色素在拉曼激光照射下会产生特异性的拉曼峰，即特征峰。拉曼激光检测疟色素的主要缺点在于疟色素含量少导致拉曼信号弱，从而导致检测灵敏度较低。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测灵敏度较高的疟原虫的检测方法和检测系统。
一种疟原虫的检测方法，包括如下步骤：
提供待测样本，并且对所述待测样本进行处理得到红细胞悬液；
配制含有浓度为0.1g/L～0.5g/L的皂素的裂解液；
将所述红细胞悬液与所述裂解液按照体积比为1：5～20混合并充分裂解后进行离心并保留第一沉淀，接着将所述第一沉淀充分裂解后进行离心并保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤所述第二沉淀至少三次后进行离心并保留第三沉淀；
采用拉曼激光照射所述第三沉淀并且收集得到拉曼信号；以及
对所述拉曼信号进行分析从而判断所述待测样本中是否含有疟原虫。
在一个实施例中，所述待测样本包括血液样本、阴性对照样本和阳性对照样本中的至少一种；
对所述待测样本进行处理得到红细胞悬液的操作为：对待测样本进行抗凝处理后3000rpm离心15min并弃去上清，将沉淀与生理盐水按照体积比为1：2～5混合得到所述红细胞悬液。
在一个实施例中，所述裂解液中还含有浓度为8g/L～10g/L的NaCl、浓度为0.1g/L～0.3g/L的KCl、浓度为3.5g/L～4.0g/L的Na2HPO4·12H2O以及浓度为0.2g/L～0.3g/L的K2HPO4。
在一个实施例中，将所述红细胞悬液与所述裂解液按照体积比为1：5～20混合并充分裂解的操作中，充分裂解的温度为36℃～38℃，充分裂解的时间为10min～15min；
将所述第一沉淀充分裂解的操作中，充分裂解的温度为37℃，充分裂解的时间为10min～15min。
在一个实施例中，所述进行离心并保留第一沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min；
所述进行离心并保留第二沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min；
所述进行离心并保留第三沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min。
一种疟原虫的检测系统，包括：
样本处理模块，用于对提供的待测样本进行处理得到红细胞悬液；
配制模块，用于配制含有浓度为0.1g/L～0.5g/L的皂素的裂解液；
裂解模块，用于将所述红细胞悬液与所述裂解液按照体积比为1：5～20混合并充分裂解后进行离心并保留第一沉淀，接着将所述第一沉淀充分裂解后进行离心并保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤所述第二沉淀至少三次后进行离心并保留第三沉淀；
信号收集模块，用于采用拉曼激光照射所述第三沉淀同时收集得到拉曼信号；以及
信号分析模块，用于对所述拉曼信号进行分析从而判断所述待测样本中是否含有疟原虫。
在一个实施例中，所述样本处理模块用于对所述待测样本进行抗凝处理后3000rpm离心15min并弃去上清，将沉淀与生理盐水按照体积比为1：2～5混合得到所述红细胞悬液；
所述待测样本包括血液样本、阴性对照样本和阳性对照样本中的至少一种。
在一个实施例中，所述配制模块用于配制含有浓度为0.1g/L～0.5g/L的皂素、浓度为8g/L～10g/L的NaCl、浓度为0.1g/L～0.3g/L的KCl、浓度为3.5g/L～4.0g/L的Na2HPO4·12H2O以及浓度为0.2g/L～0.3g/L的K2HPO4。
在一个实施例中，所述信号收集模块为拉曼光谱仪。
在一个实施例中，所述信号分析模块采用Vancouver Raman Algorithm软件去除所述拉曼信号中的荧光信号以及基底信号，然后采用original 8.0分析比对疟色素的拉曼光谱从而判断所述待测样本中是否含有疟原虫。
这种疟原虫的检测方法通过含有皂素的裂解液对红细胞悬液进行裂解，皂素能够在红细胞膜上产生永久性的小孔使其膜渗透性发生改变，从而使红细胞破裂；对于含有疟原虫的红细胞而言，皂素使疟原虫从红细胞内释放出来，再经过裂解疟原虫细胞膜从而获得疟色素，可使疟色素浓缩起来。通过结合含有皂素的裂解液提取疟色素和拉曼光谱技术，这种疟原虫的检测方法的检测灵敏度较高。
附图说明
图1为一实施方式的疟原虫的检测方法的流程图；
图2为一实施方式的疟原虫的检测系统的结构示意图；
图3为实施例1得到的阳性对照样本与疟色素的拉曼光谱对比图；
图4为实施例2得到的阴性对照样本与疟色素的拉曼光谱对比图；
图5为实施例3得到的疟疾感染者血液样本与阳性对照样本的拉曼光谱对比图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对疟原虫的检测方法作进一步详细的说明。
如图1所示的一实施方式的疟原虫的检测方法，包括如下步骤：
S10、提供待测样本，并且对待测样本进行处理得到红细胞悬液。
待测样本包括血液样本、阴性对照样本和阳性对照样本中的至少一种。
血液样本通过抽取血液得到。
阳性对照样本可以为在含有正常人红细胞的完全培养基中培养的疟原虫。
阴性对照样本可以为正常人红细胞。
对待测样本进行处理得到红细胞悬液的操作为：对待测样本进行抗凝处理后3000rpm离心15min并弃去上清，将沉淀与生理盐水按照体积比为1：2～5混合得到红细胞悬液。
具体的，对待测样本进行抗凝处理的操作可以为：将3mL～5mL的待测样本加入到EDTA抗凝管中混匀。
S20、配制含有浓度为0.1g/L～0.5g/L的皂素的裂解液。
具体的，裂解液中还含有浓度为8g/L的NaCl、浓度为0.2g/L的KCl、浓度为3.6g/L的Na2HPO4·12H2O以及浓度为0.24g/L的K2HPO4。
S30、将S10得到的红细胞悬液与S20得到的裂解液按照体积比为1：5～20混合并充分裂解后进行离心并保留第一沉淀，接着将第一沉淀充分裂解后进行离心并保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤第二沉淀至少三次后进行离心并保留第三沉淀。
将红细胞悬液与裂解液按照体积比为1：5～20混合并充分裂解的操作中，充分裂解的温度为36℃～38℃，充分裂解的时间为10min～15min；
将第一沉淀充分裂解的操作中，充分裂解的温度为37℃，充分裂解的时间为10min～15min。
进行离心并保留第一沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min。
进行离心并保留第二沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min。
进行离心并保留第三沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min。
S40、采用拉曼激光照射S30得到的第三沉淀并且收集得到拉曼信号。
将第三沉淀置于检测皿中，在拉曼光谱仪(LabRAM HR 800，法国HORIBAJobin Yvon公司)激光的照射下收集拉曼信号。
拉曼光谱仪的相关实验参数：半导体产生的532nm波长激光，积分时间10s，激光功率最大为70mW，衰减30％，仪器配有CCD数组检测器(512×122像素)和全息光栅(4×24微米)，选择在0～2000cm-1波数之间进行拉曼光谱扫描。
S50、对S40得到的拉曼信号进行分析从而判断S10的待测样本中是否含有疟原虫。
对S40得到的拉曼信号采用Vancouver Raman Algorithm软件去荧光信号以及基底信号，然后采用original 8.0分析比对疟色素的拉曼光谱从而判断待测样本中是否含有疟原虫。
疟色素在拉曼激光照射下会产生特异性的拉曼峰，即特征峰。如果S40得到的拉曼信号比对疟色素的拉曼信号发现也具有特征峰，则说明待测样本含有疟原虫；反之，则不含有。
这种疟原虫的检测方法通过含有皂素的裂解液对红细胞悬液进行裂解，皂素能够在红细胞膜上产生永久性的小孔使其膜渗透性发生改变，从而使红细胞破裂；对于还有疟原虫的红细胞而言，皂素使疟原虫从红细胞内释放出来，再经过裂解疟原虫细胞膜从而获得疟色素，可使疟色素浓缩起来。通过结合含有皂素的裂解液提取疟色素和拉曼光谱技术，这种疟原虫的检测方法的检测灵敏度较高。
此外，这种疟原虫的检测方法通过含有皂素的裂解液对红细胞悬液进行裂解，提取疟色素的操作步骤简单，可快速提取疟色素，且提取物可直接进行拉曼检测，无需进行任何处理，拉曼检测所需时间仅需10秒，所得拉曼信号特异性强，通过简单比对既可判断是否含有疟原虫，它具有快速、灵敏、准确和特异性强的优点，具有广泛的应用前景。
如图2所示的一实施方式的疟原虫的检测系统，包括：样本处理模块10、配制模块20、裂解模块30、信号收集模块40和信号分析模块50。
样本处理模块10用于对提供的待测样本进行处理得到红细胞悬液。
具体的，样本处理模块10用于对待测样本进行抗凝处理后3000rpm离心15min并弃去上清，将沉淀与生理盐水按照体积比为1：2～5混合得到红细胞悬液。
具体的，对待测样本进行抗凝处理的操作可以为：将3mL～5mL的待测样本加入到EDTA抗凝管中混匀。
待测样本包括血液样本、阴性对照样本和阳性对照样本中的至少一种。
血液样本通过抽取血液得到。
阳性对照样本可以为在含有正常人红细胞的完全培养基中培养的疟原虫。
阴性对照样本可以为正常人红细胞。
配制模块20用于配制含有浓度为0.1g/L～0.5g/L的皂素的裂解液。
具体的，配制模块20用于配制含有浓度为0.1g/L～0.5g/L的皂素、浓度为8g/L～10g/L的NaCl、浓度为0.1g/L～0.3g/L的KCl、浓度为3.5g/L～4.0g/L的Na2HPO4·12H2O以及浓度为0.2g/L～0.3g/L的K2HPO4。
裂解模块30用于将红细胞悬液与裂解液按照体积比为1：5～20混合，充分裂解后进行第一次离心，保留第一沉淀，接着重复一次所述充分裂解的操作，并进行第二次离心，保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤所述第二沉淀至少三次，并进行第三次离心，保留第三沉淀。
将红细胞悬液与裂解液按照体积比为1：5～20混合并充分裂解的操作中，充分裂解的温度为36℃～38℃，充分裂解的时间为10min～15min；
将第一沉淀充分裂解的操作中，充分裂解的温度为37℃，充分裂解的时间为10min～15min。
进行离心并保留第一沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min。
进行离心并保留第二沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min。
进行离心并保留第三沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min。
信号收集模块40用于采用拉曼激光照射所述第三沉淀同时收集得到拉曼信号。
本实施方式中，信号收集模块40为拉曼光谱仪。具体的，拉曼光谱仪的型号为LabRAM HR 800，由法国HORIBA Jobin Yvon公司生产。
拉曼光谱仪的相关实验参数：半导体产生的532nm波长激光，积分时间10s，激光功率最大为70mW，衰减30％，仪器配有CCD数组检测器(512×122像素)和全息光栅(4×24微米)，选择在0～2000cm-1波数之间进行拉曼光谱扫描。
信号分析模块50用于对拉曼信号进行分析从而判断待测样本中是否含有疟原虫。
具体的，信号分析模块50采用Vancouver Raman Algorithm软件去除拉曼信号中的荧光信号以及基底信号，然后采用original 8.0分析比对疟色素的拉曼光谱从而判断待测样本中是否含有疟原虫。
疟色素在拉曼激光照射下会产生特异性的拉曼峰，即特征峰。如果S40得到的拉曼信号比对疟色素的拉曼信号发现也具有特征峰，则说明待测样本含有疟原虫；反之，则不含有。
下面为具体实施例。
实施例1
以10.4g/LRPMI 1640、5.98g/LHEPES、2g/L葡萄糖、0.025g/L次黄嘌呤、4.2g/L Albumax II、2.56g/L NaHCO3和0.12g/L庆大霉素组成的完全培养基为基础，配以正常人新鲜红细胞悬液来培养疟原虫，疟原虫虫株来自感染恶性疟原虫3D7的红细胞。培养3天后，收集培养液作为阳性对照样本。
将0.10g的皂素、4g的NaCl、0.1g的KCl、1.8g的Na2HPO4·12H2O、0.12g的K2HPO4溶于去离子水中，配成500mL溶液，磁力搅拌器搅拌混匀，得到裂解液。
分别将阳性对照样本与裂解液按照体积比为1：10混合，充分裂解后3000rpm离心15min，保留第一沉淀，接着重复一次充分裂解的操作，并3000rpm离心15min，保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤第二沉淀三次，并3000rpm离心15min，保留第三沉淀。
将第三沉淀置于检测皿中，在拉曼光谱仪(LabRAM HR 800，法国HORIBAJobin Yvon公司)激光的照射下收集拉曼信号。拉曼光谱仪的相关实验参数：半导体产生的532nm波长激光，积分时间10s，激光功率最大为70mW，衰减30％，仪器配有CCD数组检测器(512×122像素)和全息光栅(4×24微米)，选择在0～2000cm-1波数之间进行拉曼光谱扫描。
对拉曼信号采用Vancouver Raman Algorithm软件去荧光信号以及基底信号，然后采用original 8.0分析比对疟色素的拉曼光谱，得到图3。
由图3可以看出，阳性对照样本与疟色素的拉曼光谱比对后发现，阳性对照样本也具有特征峰，因此认为，阳性对照样本中含有疟原虫。
实施例2
以正常人血液样本为阴性对照样本。
将0.10g的皂素、4g的NaCl、0.1g的KCl、1.8g的Na2HPO4·12H2O、0.12g的K2HPO4溶于去离子水中，配成500mL溶液，磁力搅拌器搅拌混匀，得到裂解液。
分别将阴性对照样本与裂解液按照体积比为1：10混合，充分裂解后3000rpm离心15min，保留第一沉淀，接着重复一次充分裂解的操作，并3000rpm离心15min，保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤第二沉淀三次，并3000rpm离心15min，保留第三沉淀。
将第三沉淀置于检测皿中，在拉曼光谱仪(LabRAM HR 800，法国HORIBAJobin Yvon公司)激光的照射下收集拉曼信号。拉曼光谱仪的相关实验参数：半导体产生的532nm波长激光，积分时间10s，激光功率最大为70mW，衰减30％，仪器配有CCD数组检测器(512×122像素)和全息光栅(4×24微米)，选择在0～2000cm-1波数之间进行拉曼光谱扫描。
对拉曼信号采用Vancouver Raman Algorithm软件去荧光信号以及基底信号，然后采用original 8.0分析比对疟色素的拉曼光谱，得到图4。
由图4可以看出，阴性对照样本与疟色素的拉曼光谱比对后发现，阴性对照样本不具有特征峰，因此认为，阴性对照样本中不含有疟原虫。
结合实施例1和实施例2可以看出，本发明公开的疟原虫检测方法可以准确的测定出待测样本中是否含有疟原虫，其可以应用于实际待测样本是否含有疟原虫的检测。
实施例3
将0.10g的皂素、4g的NaCl、0.1g的KCl、1.8g的Na2HPO4·12H2O、0.12g的K2HPO4溶于去离子水中，配成500mL溶液，磁力搅拌器搅拌混匀，得到裂解液。
将深圳国际旅行卫生保健中心医学实验室检测的既往疟疾感染者血液冰冻样本(经血涂片染色镜检和PCR检测两种方法确证为疟疾感染)1.0mL溶解后按照体积比为1：10与裂解液混合，充分裂解后3000rpm离心15min，保留第一沉淀，接着重复一次充分裂解的操作，并3000rpm离心15min，保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤第二沉淀三次，并3000rpm离心15min，保留第三沉淀。
将第三沉淀置于检测皿中，在拉曼光谱仪(LabRAM HR 800，法国HORIBAJobin Yvon公司)激光的照射下收集拉曼信号。拉曼光谱仪的相关实验参数：半导体产生的532nm波长激光，积分时间10s，激光功率最大为70mW，衰减30％，仪器配有CCD数组检测器(512×122像素)和全息光栅(4×24微米)，选择在0～2000cm-1波数之间进行拉曼光谱扫描。
对拉曼信号采用Vancouver Raman Algorithm软件去荧光信号以及基底信号，然后采用original 8.0分析比对实施例1得到的阳性对照样本的拉曼光谱，得到图5。
由图5可以看出，该样本与阳性对照样本相比，疟色素特征峰高度一致，因此认为，该样本中含有疟原虫。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种疟原虫的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供待测样本，并且对所述待测样本进行处理得到红细胞悬液；
配制含有浓度为0.1g/L～0.5g/L的皂素的裂解液；
将所述红细胞悬液与所述裂解液按照体积比为1：5～20混合并充分裂解后进行离心并保留第一沉淀，接着将所述第一沉淀充分裂解后进行离心并保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤所述第二沉淀至少三次后进行离心并保留第三沉淀；
采用拉曼激光照射所述第三沉淀并且收集得到拉曼信号；以及
对所述拉曼信号进行分析从而判断所述待测样本中是否含有疟原虫。
2.如权利要求1所述的疟原虫的检测方法，其特征在于，所述待测样本包括血液样本、阴性对照样本和阳性对照样本中的至少一种；
对所述待测样本进行处理得到红细胞悬液的操作为：对待测样本进行抗凝处理后3000rpm离心15min并弃去上清，将沉淀与生理盐水按照体积比为1：2～5混合得到所述红细胞悬液。
3.如权利要求1所述的疟原虫的检测方法，其特征在于，所述裂解液中还含有浓度为8g/L～10g/L的NaCl、浓度为0.1g/L～0.3g/L的KCl、浓度为3.5g/L～4.0g/L的Na2HPO4·12H2O以及浓度为0.2g/L～0.3g/L的K2HPO4。
4.如权利要求1所述的疟原虫的检测方法，其特征在于，将所述红细胞悬液与所述裂解液按照体积比为1：5～20混合并充分裂解的操作中，充分裂解的温度为36℃～38℃，充分裂解的时间为10min～15min；
将所述第一沉淀充分裂解的操作中，充分裂解的温度为37℃，充分裂解的时间为10min～15min。
5.如权利要求1所述的疟原虫的检测方法，其特征在于，所述进行离心并保留第一沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min；
所述进行离心并保留第二沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min；
所述进行离心并保留第三沉淀的操作中，离心的转速为3000rpm～5000rpm，离心的时间为10min～15min。
6.一种疟原虫的检测系统，其特征在于，包括：
样本处理模块，用于对提供的待测样本进行处理得到红细胞悬液；
配制模块，用于配制含有浓度为0.1g/L～0.5g/L的皂素的裂解液；
裂解模块，用于将所述红细胞悬液与所述裂解液按照体积比为1：5～20混合并充分裂解后进行离心并保留第一沉淀，接着将所述第一沉淀充分裂解后进行离心并保留第二沉淀，接着用生理盐水洗涤所述第二沉淀至少三次后进行离心并保留第三沉淀；
信号收集模块，用于采用拉曼激光照射所述第三沉淀同时收集得到拉曼信号；以及
信号分析模块，用于对所述拉曼信号进行分析从而判断所述待测样本中是否含有疟原虫。
7.如权利要求6所述的疟原虫的检测系统，其特征在于，所述样本处理模块用于对所述待测样本进行抗凝处理后3000rpm离心15min并弃去上清，将沉淀与生理盐水按照体积比为1：2～5混合得到所述红细胞悬液；
所述待测样本包括血液样本、阴性对照样本和阳性对照样本中的至少一种。
8.如权利要求6所述的疟原虫的检测系统，其特征在于，所述配制模块用于配制含有浓度为0.1g/L～0.5g/L的皂素、浓度为8g/L～10g/L的NaCl、浓度为0.1g/L～0.3g/L的KCl、浓度为3.5g/L～4.0g/L的Na2HPO4·12H2O以及浓度为0.2g/L～0.3g/L的K2HPO4。
9.如权利要求6所述的疟原虫的检测系统，其特征在于，所述信号收集模块为拉曼光谱仪。
10.如权利要求6所述的疟原虫的检测系统，其特征在于，所述信号分析模块采用Vancouver Raman Algorithm软件去除所述拉曼信号中的荧光信号以及基底信号，然后采用original 8.0分析比对疟色素的拉曼光谱从而判断所述待测样本中是否含有疟原虫。
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