CN108624585A - 一种长江江豚环境dna提取方法及其应用 - Google Patents

一种长江江豚环境dna提取方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108624585A
CN108624585A CN201810233266.9A CN201810233266A CN108624585A CN 108624585 A CN108624585 A CN 108624585A CN 201810233266 A CN201810233266 A CN 201810233266A CN 108624585 A CN108624585 A CN 108624585A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
finless porpoise
yangtze finless
yangtze
extracting method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810233266.9A
Other languages
English (en)
Inventor
唐永凯
吴昀晟
俞菊华
徐跑
刘凯
李建林
李红霞
于凡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Original Assignee
Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences filed Critical Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority to CN201810233266.9A priority Critical patent/CN108624585A/zh
Publication of CN108624585A publication Critical patent/CN108624585A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用，所述方法包括采集待鉴定区域的水样品，过滤处理，采用试剂盒提取DNA，进行real time PCR扩增，并根据溶解曲线的峰值确定鉴定区域是否有长江江豚生存。本发明所述方法具有效率高、特异性强、相关系数高、线性范围广等优点；本发明所述方法能够快速、准确鉴定调查水域是否存在长江江豚。

Description

一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种资源调查或种质资源保护的方法，具体为一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用。
背景技术
长江江豚(Neophocaena phocaenoides asiaeorientalis)是一种小型齿鲸，被列为国家二级保护动物，主要分布于长江中下游干流、洞庭湖和鄱阳湖及其主要支流，是一个相对独立的淡水亚种。2006年底开展的长江豚类国际联合考察结果表明,当时其数量约为1800头，且以每年至少5％的速度持续下降，因此采取进一步的举措来保护野生生物是迫在眉睫的。保护长江江豚首先得获得长江江豚在时间和空间上分布的精确数据。传统的物种监测方法通过视觉听觉等方式进行实地调查，耗费大量的人力和物力，而且受天气影响因素较大，很难做到长期监测，因此迫切需要采取一种新的方法来进行长江江豚活动范围及其规律的调查。目前一个从环境中提取DNA并作分析鉴定生物的技术已经成熟，可用于长江江豚资源的调查。
环境DNA是指可以直接从有目标生物的环境样本(如土壤、水、空气等)之中直接提取得到的全部DNA。既包括这些活细胞组织的胞内DNA，也包括在环境中死亡，随后因为膜的降解，细胞结构破坏，释放到环境中的胞外DNA；既含有许多不同生物的基因组DNA的混合物，也含有其降解后的DNA片段。环境DNA技术是利用各种分子手段识别从环境样品提取来的eDNA中所包含的信息，从而确定生物在环境中的分布情况。通过对调查水域进行采样、提取环境DNA、分析样本信息，可以来获取长江江豚在调查水域中的信息，进一步完善长江江豚的资源调查。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种有助于快速、准确鉴定调查水域是否存在长江江豚的方法，本发明提供了一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用。
技术方案：一种长江江豚环境DNA提取方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在长江调查水域采集水样，采集设备每次使用前经过漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥；
(2)采用孔径为10μm的尼龙材质滤膜抽滤水样，抽滤后折叠滤膜浸没在装有95％乙醇的1.5mL EP管中，-20℃长期保存；
(3)将各个水样的滤膜单独提取DNA，提取的DNA置于-20℃冷冻保存；
(4)从长江江豚线粒体D-Loop区域设计1对特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，其中：
正向引物(SEQ ID NO:1)，5’-TATGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTA-3’；
反向引物(SEQ ID NO:2)，5’-AGATCATTATTTAGCTACCCCCACAAGC-3’)；
(5)将长江江豚DNA依次稀释，形成100～10-5 6个浓度梯度的DNA模板，进行realtime PCR，荧光染料为SYBR Green I，建立标准曲线，检测所设计引物的特异性；
(6)以步骤(3)提取的环境DNA为模板，进行real time PCR，判断检测样品。
优选的，PCR扩增反应的体系为SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，模板DNA 2μL，正反引物各0.8μL，ddH2O 6.4μL。
优选的，PCR扩增反应的条件为95℃预变性3min；45个循环：95℃变性10s，60℃退火20s；最后72℃3min，4℃保存；溶解曲线，扩增温度以0.2℃的增幅从65℃递增到95℃。
优选的，步骤(6)中当扩增曲线Ct值小于40，且溶解曲线为一个尖峰，则检测样品为阳性，即含有长江江豚DNA。
以上所述的一种长江江豚环境DNA提取方法在长江江豚的资源调查中的应用。
以上所述的一种长江江豚环境DNA提取方法在长江江豚的种质资源保护中的应用。
有益效果：(1)本发明所述方法具有效率高、特异性强、相关系数高、线性范围广等优点；(2)本发明所述方法能够快速、准确鉴定调查水域是否存在长江江豚。
附图说明
图1是本发明所述real time PCR扩增标准曲线；
图2是本发明所述real time PCR扩增曲线；
图3是本发明所述real time PCR扩增溶解曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
在长江南通段(32°1′37.21″N，120°26′50.68″E)调查水域，用全新的1L可密封的广口瓶采集水样800mL，设置6个平行样。为防止水样中大颗粒泥沙堵塞滤膜，先用一次性医用纱布过滤水样，过滤后更换纱布。采样设备在每次使用前经过10％漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥。
样品冷藏运回实验室，选择孔径为10μm直径的尼龙材质滤膜抽滤水样500mL。抽滤后，折叠滤膜浸没在装有95％乙醇的1.5mL EP管中，-20℃保存。
每个水样的滤膜使用E.Z.N.A.TM Water DNA Kit(OMEGA bio-tek,USA)独立提取DNA。将滤膜取出干燥后，提取严格遵照试剂盒说明，90℃水浴溶解难溶细胞，在最后一步加入50μL Elution Buffer来提高提取的eDNA浓度。提取的DNA置于-20℃冷冻保存。
从长江江豚线粒体D-Loop区域设计1对特异的引物，正向引物(YFPDLoop)，5’-TATGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTA-3’；反向引物(YFPDLoop)，5’-AGATCATTATTTAGCTACCCCCACAAGC-3’)，进行实时荧光定量PCR扩增。
优化real time PCR扩增反应。扩增反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，模板DNA 2μL，正反引物(10μM)各0.8μL，ddH2O 6.4μL。扩增反应条件：95℃预变性3min；45个循环包括：95℃变性10s，60℃退火20s；最后72℃3min，4℃保存。溶解曲线，扩增温度以0.2℃的增幅从65℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取融解曲线。
将长江江豚DNA依次稀释，形成6个浓度的(100～10-5)DNA模板，进行real timePCR，荧光染料为SYBR Green I，建立标准曲线，标准曲线方程为Y＝-3.409Xlog(X)+39.74，其相关系数为r2＝0.992。扩增标准曲线见图1。
以提取的环境DNA为模板，进行real time PCR。所检测样品Ct值小于40，6个平行样Ct值为24.77±0.34(图2)，而且溶解曲线为一尖峰，Tm值为87.2(图3)，可判断检测样品为阳性，长江南通段(32°1′37.21″N，120°26′50.68″E)区域有长江江豚活动的痕迹。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatgtccact agcccttcat aaccatta 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agatcattat ttagctaccc ccacaagc 28

Claims (5)

1.一种长江江豚环境DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)在长江调查水域采集水样，采集设备每次使用前经过漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥；
(2)采用孔径为10μm的尼龙材质滤膜抽滤水样，抽滤后折叠滤膜浸没在装有95％乙醇的1.5mL EP管中，-20℃长期保存；
(3)将各个水样的滤膜单独提取DNA，提取的DNA置于-20℃冷冻保存；
(4)从长江江豚线粒体D-Loop区域设计1对特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，其中：
正向引物，5’-TATGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTA-3’；
反向引物，5’-AGATCATTATTTAGCTACCCCCACAAGC-3’；
(5)将长江江豚DNA依次稀释，形成100～10-56个浓度梯度的DNA模板，进行real timePCR，荧光染料为SYBR Green I，建立标准曲线，检测所设计引物的特异性；
(6)以步骤(3)提取的环境DNA为模板，进行real time PCR，判断检测样品。
2.根据权利要求1所述的一种长江江豚环境DNA提取方法，其特征在于，PCR扩增反应的体系为SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，模板DNA 2μL，正反引物各0.8μL，ddH2O6.4μL。
3.根据权利要求1所述的一种长江江豚环境DNA提取方法，其特征在于，PCR扩增反应的条件为95℃预变性3min；45个循环：95℃变性10s，60℃退火20s；最后72℃3min，4℃保存；溶解曲线，扩增温度以0.2℃的增幅从65℃递增到95℃。
4.根据权利要求1所述的一种长江江豚环境DNA提取方法，其特征在于，步骤(6)中当扩增曲线Ct值小于40，且溶解曲线为一个尖峰，则检测样品为阳性，即含有长江江豚DNA。
5.权利要求1所述的一种长江江豚环境DNA提取方法在长江江豚的资源调查中的应用。
CN201810233266.9A 2018-03-21 2018-03-21 一种长江江豚环境dna提取方法及其应用 Pending CN108624585A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810233266.9A CN108624585A (zh) 2018-03-21 2018-03-21 一种长江江豚环境dna提取方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810233266.9A CN108624585A (zh) 2018-03-21 2018-03-21 一种长江江豚环境dna提取方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108624585A true CN108624585A (zh) 2018-10-09

Family

ID=63696144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810233266.9A Pending CN108624585A (zh) 2018-03-21 2018-03-21 一种长江江豚环境dna提取方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108624585A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109486915A (zh) * 2018-12-29 2019-03-19 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种基于环境dna检测草鱼产卵场方法
CN110218771A (zh) * 2019-06-28 2019-09-10 北部湾大学 一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法
CN113151500A (zh) * 2021-04-30 2021-07-23 南京大学 一种基于环境dna的长江江豚检测试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104531879A (zh) * 2015-01-06 2015-04-22 上海海洋大学 用于鱼类群落结构研究的环境dna鉴定方法
CN106591462A (zh) * 2016-12-29 2017-04-26 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种用于鉴定长江江豚个体间亲缘关系的引物、试剂盒及鉴别方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104531879A (zh) * 2015-01-06 2015-04-22 上海海洋大学 用于鱼类群落结构研究的环境dna鉴定方法
CN106591462A (zh) * 2016-12-29 2017-04-26 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种用于鉴定长江江豚个体间亲缘关系的引物、试剂盒及鉴别方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JERDE, CL等: ""Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA", 《CONSERVATION LETTERS》 *
KATHRYN STEWART等: "Using environmental DNA to assess population-wide spatiotemporal reserve use", 《CONSERV BIOL》 *
吴昀晟等: "环境DNA在长江江豚检测中的应用研究", 《2017年中国水产学会学术年会》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109486915A (zh) * 2018-12-29 2019-03-19 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种基于环境dna检测草鱼产卵场方法
CN110218771A (zh) * 2019-06-28 2019-09-10 北部湾大学 一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法
CN110218771B (zh) * 2019-06-28 2022-03-08 北部湾大学 一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法
CN113151500A (zh) * 2021-04-30 2021-07-23 南京大学 一种基于环境dna的长江江豚检测试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108624585A (zh) 一种长江江豚环境dna提取方法及其应用
CN103966358B (zh) 一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
Ma et al. Detection of Cryptosporidium and Giardia in agricultural and water environments in the Qinghai area of China by IFT and PCR
Staggs et al. The development and implementation of a method using blue mussels (Mytilus spp.) as biosentinels of Cryptosporidium spp. and Toxoplasma gondii contamination in marine aquatic environments
CN103710433A (zh) 用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量pcr试剂盒
CN109628608A (zh) 一种放流中国对虾资源的调查方法
Koloren et al. Detection of Cryptosporidium species in the sea and tap water samples of Black Sea, Turkey
Wefferling et al. Cytogeography of the subalpine marsh marigold polyploid complex (Caltha leptosepala sl, Ranunculaceae)
Drakulovski et al. Use of RNAlater® as a preservation method for parasitic coprology studies in wild-living chimpanzees
CN103468806A (zh) 扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法
Maddock et al. Non-lethal DNA sampling for caecilian amphibians
CN104946798A (zh) 烟草花叶病毒lamp检测用的引物及方法
Nagle et al. Real-time PCR-based assay for quantitative detection of Hematodinium sp. in the blue crab Callinectes sapidus
CN100363502C (zh) 螺原体病原微生物的pcr快速检测技术
CN104962660A (zh) 一种杂色蛤物种实时荧光pcr特异性检测体系及应用
CN101892308B (zh) 用于检测苹果褐斑病菌的特异扩增引物及检测方法
CN115011678A (zh) 一种鱼类多样性和相对丰度的评估方法
CN111926088B (zh) 一种检测图丽鱼种群的引物组、试剂盒和方法
CN101875965A (zh) TaqMan探针实时荧光PCR检测广州管圆线虫感染性螺类
CN103397106A (zh) 杂交鳢弹状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN1614396A (zh) 一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针
CN109988848B (zh) 一种鉴定小茶尺蠖的引物、试剂盒及方法
CN106701898A (zh) 螺原体病原微生物的pcr快速检测技术
CN108504751B (zh) 微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法及其应用
CN111926090A (zh) 用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination