CN110218771A - 一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法。该方法包括以下步骤：1)采集监测区域的海水样本；2)提取海水样本中的总DNA；3)利用特异性引物对总DNA进行qPCR扩增；4)根据扩增结果进行监测结果判定。所述特异性引物的序列为：正向引物，5'‑CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGC‑3'；反向引物，5'‑GCTGGTCGTCTCCGATAAGTGT‑3'。该方法可以快速准确的鉴定调查海域是否有中华白海豚的存在，克服了常规监测方法容易受到地形、天气、能见度和观测者经验的影响的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于环境DNA技术的生物检测方法，具体涉及一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法。
背景技术
种群分布监测是评估某物种生存状况的重要手段，是对其时空分布变化、种群趋势变化、核心栖息地变化做出重要判断的依据，也是实施种群管理和保育措施的基础。目前，中华白海豚的种群监测方法主要是目视观测法和声纳观测法。这两种方法的工作量大，调查成本高，同时会受到地形、天气、能见度和观测者经验等的影响，难以提供充分和全面的证据，为濒危物种的调查研究与保护进展推进增加了挑战。因此，亟待寻找一种高效、便捷、成本低廉和受限小的技术，以方便中华白海豚种群分布的检测工作并推进白海豚保育工作的快速进展。
发明内容
本发明的目的是提供一种干扰因素少、准确可靠的监测中华白海豚种群分布的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法。该方法包括以下步骤：
1)采集监测区域的海水样本；
2)提取海水样本中的总DNA；
3)利用特异性引物对总DNA进行qPCR扩增；
4)根据扩增结果进行监测结果判定。
利用环境DNA(eDNA)测量生物多样性是近年兴起的新技术。该技术常用于淡水领域的物种检测，主要针对淡水环境中某一类群体的多样性检测。相比于淡水环境，海洋环境的盐离子浓度高而且伴随着潮汐洋流而形成更大的稀释度。其次，中华白海豚作为珍稀濒危物种，其种群密度低，释放到海洋中基因识别片段过少，容易导致采集水样过程中目的识别片段的收集量被削减。本申请针对性地提供一种采集方法，即在监测区域的取样点等量采集表层、中层以及底层海水并混合，混合总量以2.5L为宜。水样用消毒后的采集器收集，采集后先用普通滤网(或消毒后的纱绢等)过滤，再用混合纤维素滤膜过滤，滤膜折叠沉没无水乙醇中冷冻保存。采集器的消毒方法为：先用次氯酸消毒，然后用无菌水冲洗，最后用紫外线灭菌。
提取总DNA可选择多种方法，本申请可提供下述方法：其一，将滤膜用无菌剪刀剪碎，通过珠磨式组织研磨器匀浆，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA；其二，将滤膜放入无菌水中高速震荡10min，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA；其三，将滤膜用无菌剪刀剪碎，CTAB缓冲液浸泡后，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA。其中，所述提取试剂盒优选为DNeasy Blood&Tissue Kit，或者TIANamp MarineAnimals DNA Kit。
优选的，所述特异性引物的序列为：
正向引物，5'-CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGC-3'；
反向引物，5'-GCTGGTCGTCTCCGATAAGTGT-3'。
针对上述特异性引物，在qPCR扩增过程中，所述反应体系为：TB Green Premix ExTaqGC 10μL，模板DNA 2μL，正向引物与反响引物各0.5μL，ddH2O 7.2μL，总体系23.2μL。所述反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。扩增温度以0.2℃的增幅从65℃递增到95℃，通过连续测定扩增对象的荧光强度以获得溶解曲线。
所述监测结果判断的具体方法为：当海水样本的Ct值小于25，溶解曲线的峰值在82℃而且峰型尖锐无锯齿，说明海水样本中含有中华白海豚的eDNA。
本申请在监测结果判定后还进行二次验证。二次验证的过程为：将扩增产物纯化，导入载体，再转入感受态细胞克隆，提取质粒，将提取的质粒进行测序，将测序结构与核苷酸序列数据库进行对比。具体的，所述克隆的过程为：选用DH5α作为感受态细胞，将导入载体的感受态细胞先接种在SOC培养基上，37℃摇床培养1小时，然后接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12-16小时，最后挑取白色菌落接种在SOC培养基上，37℃摇床培养24小时。优选的，纯化所用试剂盒为TaKaRa MiniBEST DNA Fragment PurificationKit；克隆时选用的试剂盒为pMDTM19-T Vector Cloning Kit，以提供克隆用的载体。
本发明的有益效果是：
1)本发明可以快速准确的鉴定调查海域是否有中华白海豚的存在，克服了常规监测方法容易受到地形、天气、能见度和观测者经验的影响的缺陷，有效降低了经济成本；2)在大面积采样的基础上，本发明可帮助确定中华白海豚的核心分布区、分布边界及潜在的迁徙廊道，为相关政府部门进行保护区的划定，保护区的管理提供了有效手段；3)本发明从大的空间尺度上有效评估中华白海豚种群为封闭种群或开放交流种群，快速便捷地解决以往考察手段所不能解决的问题。综上所述，本发明在中华白海豚这种“国家一级重点保护野生动物”的保护管理上起到重要作用，对目前中华白海豚的研究大有裨益。
附图说明
图1为本发明实施例的PCR扩增产物的电泳图。
具体实施方式
从NCBI数据库(EU557091.1)下载中华白海豚的线粒体全基因序列，使用PrimerPremier6.0进行设计，对比筛选后得到较优的特异性引物，其序列为：
正向引物(Forward Primer)，5'-CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGC-3'；
反向引物(Reverse Primer)，5'-GCTGGTCGTCTCCGATAAGTGT-3'。
上述特异性引物的目标基因为cytochrome c oxidase subunit I。以Tursiopsaduncus(瓶鼻海豚)为非目的片段的物种进行差异性比较，该目标基因在NCBI Blast上的Prec.Ident为97.75％。相对应的，针对该目标基因的PCR目的序列为CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGCACCGGCCTAAGTTTGTTAATTCGTGCTGAATTAGGTCAACCTGGCACACTTATCGGAGACGACCAGC，其碱基数为89。上述正向引物的Tm值为59.4℃，GC含量为59.1％；反向引物的Tm值为58.2℃，GC含量为54.5％。该特异性引物相对保守，扩增产物短(89bp)，差异性较大；而且不存在PCR产物二聚体过多，跑胶拖尾等现象，PCR效果稳定。
利用上述特异性引物进行中华白海豚种群监测，方法具体如下：
以广西壮族自治区钦州市三娘湾海域(21°33′23.47″北，108°50′57.68″东)为检测水域，使用2.5L的有机玻璃采水器等量收集采集点表层、中层以及底层海水并混合，共2.5L，设置5个平行样。首先利用已消毒的纱绢对海水过滤以除去大颗粒泥沙，然后使用砂芯过滤装置进行过滤，将海水中的悬浮物物质截留在0.45μm的混合纤维素滤膜上。将滤膜折叠后放入装有无水乙醇的1.5mL EP管中，放入液氮冷冻；之后转移到实验室超低温冰箱中，-20℃存储。
将滤膜取出，用无菌剪刀剪碎后放回EP管，并向EP管中加入研磨玻璃珠，以2500rpm的速度，用珠磨式组织研磨器研磨直至全部匀浆。将匀浆后的产物，使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Marine Animals DNA Kit(TIANGEN))提取样本中的总DNA。
利用上述引物以及使用TB Green Premix Ex TaqGC试剂盒，对总DNA进行qPCR扩增。使用的扩增仪为BIO-RAD CFX Connect Real-Time System。其中，反应体系为：TBGreen Premix Ex TaqGC 10μL，模板DNA 2μL，正向引物与反响引物各0.5μL，ddH2O 7.2μL，总体系23.2μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。扩增温度以0.2℃的增幅从65℃递增到95℃，通过连续测定扩增对象的荧光强度以获得溶解曲线。当所得海水样本的Ct值小于25，溶解曲线的峰值在82℃而且峰型尖锐无锯齿，说明海水样本中含有中华白海豚的eDNA。
将PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳。如图1的电泳结果所示，产物条带正好在89bp左右。表明PCR扩增至所需要的目的片段。
将PCR扩增产物使用试剂盒TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit(TaKaRa)进行纯化。将纯化后的扩增产物使用试剂盒pMDTM19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)插入到载体pMD 19-T Vector上，随后导入到DH5α感受态细胞进行克隆。克隆的培养过程为：将导入载体的感受态细胞先接种在SOC培养基上，37℃摇床培养1小时，然后接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时，最后挑取白色菌落接种在SOC培养基上，37℃摇床培养24小时。抽取6mL的培养菌液，使用快速质粒小提试剂盒(TIANprepRapid Mini Plasmid Kit)提取质粒。使用核酸测定仪确定质粒浓度以及纯度，达标后(浓度>100ng/μl，A260/A280≈1.8)，再送样测序。所得测序结果去除载体序列后的最终测序结果为：
CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGCACCGGCCTAAGTTTGTTAATTCGTGCTGAATTAGGTCAACCTGGCACACTTATCGGAGACGACCAGC。
利用NCBI数据库的BLAST功能，对最终测序结果进行比。验证了所得结果与中华白海豚线粒体全基因组细胞色素b区域序列片段(ID:EU557091；5434bp--5522bp)存在一致性。也进一步验证了，钦州三娘湾海域(21°33′23.47"北，108°50′57.68"东)确实存在中华白海豚的活动痕迹。
序列表
<110> 北部湾大学
<120> 一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcttgggca ggaatagtag gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctggtcgtc tccgataagt gt 22
<210> 3
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcttgggca ggaatagtag gcaccggcct aagtttgtta attcgtgctg aattaggtca 60
acctggcaca cttatcggag acgaccagc 91
Claims (9)
1.一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法，包括以下步骤:
1)采集监测区域的海水样本；
2)提取海水样本中的总DNA；
3)利用特异性引物对总DNA进行qPCR扩增；
4)根据扩增结果进行监测结果判定。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述特异性引物的序列为：
正向引物：5'-CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGC-3'；
反向引物：5'-GCTGGTCGTCTCCGATAAGTGT-3'。
3.如权利要求1的方法，其中，所述海水样本的采集方法为：用消毒后的采集器收集水样，水样用普通滤网过滤后，再用混合纤维素滤膜过滤，滤膜折叠沉没无水乙醇中冷冻保存。
4.如权利要求3的方法，其中，所述消毒的方法为先用次氯酸消毒，然后用无菌水冲洗，最后用紫外线灭菌。
5.如权利要求1的方法，其中，所述总DNA的提取方法为：将滤膜用无菌剪刀剪碎，通过珠磨式组织研磨器匀浆，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA；
或者，将滤膜放入无菌水中高速震荡10min，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA；
或者，将滤膜用无菌剪刀剪碎，CTAB缓冲液浸泡后，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA。
6.如权利要求1的方法，在qPCR扩增过程中，
反应体系为：TB Green Premix Ex TaqGC 10μL，模板DNA 2μL，正向引物与反响引物各0.5μL，ddH2O 7.2μL，总体系23.2μL；
反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存；
扩增温度以0.2℃的增幅从65℃递增到95℃，通过连续测定扩增对象的荧光强度以获得溶解曲线。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述监测结果判定的方法为：当海水样本的Ct值小于25，溶解曲线的峰值在82℃而且峰型尖锐无锯齿，说明海水样本中含有中华白海豚的eDNA。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述监测结果判定后还进行二次验证，二次验证的过程为：将步骤3)中获得扩增产物纯化，导入载体，再转入感受态细胞克隆，提取质粒，将提取的质粒进行测序，将测序结构与核苷酸序列数据库进行对比。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述克隆的过程为：选用DH5α作为感受态细胞，将导入载体的感受态细胞先接种在SOC培养基上，37℃摇床培养1小时，然后接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12-16小时，最后挑取白色菌落接种在SOC培养基上，37℃摇床培养24小时。
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