CN101246158A - 测定血细胞中白细胞的溶血剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定血细胞中白细胞的溶血剂。采用的技术方案是：每1000ml的溶血剂中含有：聚氧乙烯型非离子表面活性剂6～22g、固定剂1～6g、助溶剂1～9g、缓冲液11～16g和余量的去离子水。本发明材料易得，制造成本低，检测结果与绝对准确率偏差不大于9％。本发明在不含氰化钾的情况下达到了白细胞的分类和计数及血红蛋白测定的准确性和稳定性。

Description

测定血细胞中白细胞的溶血剂

技术领域：

本发明涉及一种医学试剂领域，特别涉及一种用于血细胞分析仪中血细胞检测用医学试剂。

背景技术：

人的血细胞中含有WBC(白细胞)、RBC(红细胞)及血小板等成份，WBC分为：粒细胞、单核细胞和淋巴细胞；粒细胞又分为中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞。健康的人血液对于以上的成分都在一定的数量范围内。但是，有些疾患和生理性改变，例如，感染、发烧、妊辰情况时，就要发生一定程度的数量或体积形态的改变。所以，检测血细胞对于疾病诊断和治疗有很重要的意义。

国内使用的血细胞分析仪无论是进口还是国产的，原来多采用的是阻抗法。阻抗法计数细胞的原理是根据细胞通过微孔时产生的脉冲大小与仪器设定的阈值比较而得出的数据。脉冲的大小除与细胞本身的大小(如白细胞中粒细胞体积最大，淋巴细胞最小)有关外，还与溶血剂的种类、浓度、溶血剂的加入量与溶血时间及稀释液的渗透压、离子强度、电导率、仪器出厂时固定的阈电压、孔电流和脉冲的增益等有关。

在血细胞分析仪测定过程中，稀释液，溶血剂和清洗剂三种试剂通常配套使用。良好的试剂对保证仪器的正常运行和日常维护及获得准确的测试结果至关重要。

在目前市场上使用的血细胞分析仪诊断试剂中，溶血剂存在两种情况，一是含有氰化钾，不利于环境保护，但溶血效果好，白细胞计数和分类及血红蛋白结果稳定；二是不含氰化钾，但进行血红蛋白测定时结果偏低往往需要调整仪器校正系数到高值使误差增加，有的试剂对白细胞进行分类时单核细胞值在正常范围内相对偏高等不足。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种原料环保，能提高白细胞的分类和计数及血红蛋白测定的准确性和稳定性的溶血剂。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的：一种测定血细胞中白细胞的溶血剂，每1000ml的溶血剂中含有：

聚氧乙烯型非离子表面活性剂    6～22g

固定剂                        1～6g

助溶剂                        1～9g

缓冲液                        11～16g

去离子水                      余量

其中，

聚氧乙烯型非离子表面活性剂的分子式为(I)

R₁-R₂-(CH₂CH₂O)n-H    (I)

R₁表示碳原子数为10～25的烷基、链烯基或炔基，

R₂表示O、COO、或

n表示9～40的整数；

固定剂是甲醛或戊二醛；

助溶剂为季胺盐类，其分子式为(II)

R₃(CH₃)m XN    (II)

R₃为烷基，m为2～3，X为氯或溴；

助溶剂优选十六烷基三甲基氯化铵或十六烷基三甲基溴化铵。

缓冲液是：将磷酸盐或硼酸盐溶于去离子水中，加入氢氧化钠或盐酸对PH进行调整，使缓冲液的PH值为5.2～9.1，加入氯化钠或硫酸钠调节剂，使缓冲液的渗透压为140～650mOsm/kg。

本发明的主要理化指标如表1

                                        表1

参数名称	pH	渗透压	电导率	比重
					范围值	5.2～9.1	140～650mOsm/kg	6.2～9.1mS/cm	0.9～1.22

本发明中各原料的主要作用是：

聚氧乙烯型非离子表面活性剂，可以保持和固定血液标本中白细胞的细胞质和细胞膜具有一定形态，并对试剂的成分均匀分布起一定作用。

固定剂可以对细胞膜起固定作用。对细胞膜有外部或内部固定作用的物质均可选用。本发明选用了对细胞膜有外部固定作用的醛类物质，如甲醛或戊二醛。

助溶剂可以让红细胞溶解充分，并使白细胞收缩的同时，在体积上使淋巴细胞最小，单核细胞稍大，中性粒细胞最大的形式存在。血红蛋白与其结合能形成稳定的复合物，通过测其吸光度得血红蛋白含量。经过试验，比较合适的助溶剂是十六烷基三甲基氯(或溴)化铵。

本发明的有益效果是：在PH5.0～8.0的条件下，使用聚氧乙烯型非离子表面活性剂时，红细胞膜受损并立即溶解。白细胞膜受损细胞浆溢出。聚氧乙烯型非离子表面活性剂侵入到细胞内，固定剂醛类物质从细胞膜外部协同把白细胞固定。这样的结果，能保持对白细胞进行分类时能有一定的让血细胞分析仪可识别的差异性，同时，还能对这种情形维持必要的时间，故利于对白细胞进行分类和计数。助溶剂能溶解血红细胞，打破红细胞，以利于白细胞计数；又通过助溶剂季胺盐和聚氧乙烯型非离子表面活性剂的协同作用，可让红细胞溶解完全，不让红细胞碎片发生聚集和粘连，防止干扰白细胞计数；血红蛋白与季胺盐结合形成稳定的复合物，快速形成稳定的Fe³⁺(血红蛋白是Fe²⁺)用于比色换算出血红蛋白含量。本发明材料易得，制造成本低。检测结果与绝对准确率偏差不大于9％。

附图说明：

图1为正常健康人血样的检测白细胞直方图；

图2为生理性贫血患者血样的检测白细胞直方图；

图3为感染患者血样的检测白细胞直方图；

具体实施方式：

实施例1

1)缓冲液的制备【0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 6.2)】：称取磷酸氢二钠·12水8.82g，用去离子水溶解并定容至1L，用氢氧化钠和盐酸对PH进行调整，使缓冲液的PH值为6.2，加入氯化钠调节剂，使缓冲液的渗透压为150mOsm/kg。

2)一种测定血细胞中白细胞的溶血剂，其制备方法如下：

将C₁₂H₂₅-O-(CH₂CH₂O)₉-H                16g和

戊二醛                                 1.0g和

十六烷基三甲基氯化铵C₁₆H₃₃(CH₃)₃ClN    3.1g和

缓冲液                                 14g

用去离子水定容至1000ml，即得测定血细胞中白细胞的溶血剂。

用此组分和配比而完成的溶血剂，在血细胞分析仪中对血样进行检测。把血样加入到血细胞分析仪中，用稀释液(稀释液采用现有技术中的稀释液)稀释(WBC256倍\RBC5056倍)，然后进入白细胞和血红蛋白的检测通道，在此通道内与本发明的溶血剂混合，在PH为7.1、渗透压为356mOsm/kg、电导率为7.5mS/cm、溶液温度为30℃的条件下，对正常健康人、生理性贫血者和细菌感染者的血样进行检测，采用常规检测方法，可在1分钟内检测完毕。检测结果见表2和图1、图2和图3。

                      表2检测结果

项目	正常健康人	生理性贫血者	细菌感染患者
				白细胞	8.1 10E3/uL	6.7  10E3/uL	13.8  10E3/uL
中性粒细胞	59％	65％	79％
				单核细胞	4％	6％	3％
淋巴细胞	37％	29％	18％
				红细胞	4.30 10E3/uL	3.80 10E3/uL	4.10 10E3/uL
血小板	310 10E3/uL	263  10E3/uL	281  10E3/uL
				血红蛋白	153g/L	103g/L	137g/L

从表2的检测结果可以看到，本发明的溶血剂已达到原来的设计目的。并通过与镜检分类和计数及国际血红蛋白检测标准方法比较，结果一致性良好。

实施例2

1)缓冲液的制备【0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 6.3)】：称取磷酸二氢钠·2水27.34g，用去离子水溶解并定容至1L。用氢氧化钠和盐酸对PH进行调整，使缓冲液的PH值为6.3，加入氯化钠调节剂，使缓冲液的渗透压为250mOsm/kg。

2)一种测定血细胞中白细胞的溶血剂，其制备方法如下：

将C₁₂H₂₅-O-(CH₂CH₂O)₉-H                6.0g和

甲醛                                   1.0g和

十六烷基三甲基溴化铵C₁₆H₃₃(CH₃)₃BrN    2.6g和

缓冲液                                 11g

用去离子水定容至1000ml，即得测定血细胞中白细胞的溶血剂。

实施例3

1)缓冲液的制备：【硼酸盐缓冲液(pH9.1)】：称54.64g带有10个结晶水的四硼酸钠，用去离子水稀释至1000ml。用氢氧化钠和盐酸对PH进行调整，使缓冲液的PH值为9.1，加入硫酸钠调节剂，使缓冲液的渗透压为550mOsm/kg。

2)一种测定血细胞中白细胞的溶血剂，其制备方法如下：

将

     22.0g和

戊二醛                                       6.0g和

十六烷基三甲基氯化铵C₁₆H₃₃(CH₃)₃BrN            9.0g和

缓冲液                                       16.0g

用去离子水定容至1000ml，即得测定血细胞中白细胞的溶血剂。

实施例4

1)缓冲液的制备：【硼酸盐缓冲液(pH9.1)】：称54.64g带有10个结晶水的四硼酸钠，用去离子水稀释至1000ml。用氢氧化钠和盐酸对PH进行调整，使缓冲液的PH值为9.1，加入硫酸钠调节剂，使缓冲液的渗透压为550mOsm/kg。

2)一种测定血细胞中白细胞的溶血剂，其制备方法如下：

将3-C₂₅H₄₉-COO-(CH₂CH₂O)₄₀-H           20.0g和

甲醛                                   4.0g和

十六烷基三甲基溴化铵C₁₆H₃₃(CH₃)₃BrN    5.0g和

缓冲液                                 15.0g

用去离子水定容至1000ml，即得测定血细胞中白细胞的溶血剂。

实施例5

1)缓冲液的制备【0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 6.2)】：称取磷酸氢二钠·12水8.82g，用去离子水溶解并定容至1L，用氢氧化钠和盐酸对PH进行调整，使缓冲液的PH值为6.2，加入氯化钠调节剂，使缓冲液的渗透压为150mOsm/kg。

2)一种测定血细胞中白细胞的溶血剂，其制备方法如下：

将C₁₂H₂₅-O-(CH₂CH₂O)₉-H                10.0g

戊二醛                                 3.0g和

十六烷基三甲基氯化铵C₁₆H₃₃(CH₃)₃ClN    7.0g和

缓冲液                                 13.0g

用去离子水定容至1000ml，即得测定血细胞中白细胞的溶血剂。

对比实验：

分别用法国进口溶血剂(MS-9全自动血液分析仪自带)和本发明实施例5的溶血剂在血细胞分析仪(MS-9型，法国莫奈，希洛琴公司)上对血液测试，方法同实施例1。把血液质控吸入血细胞分析仪中，用稀释液(稀释液采用现有技术中的稀释液)稀释(WBC256倍\RBC5056倍)，然后进入白细胞和血红蛋白的检测通道，在此通道内分别与本发明的溶血剂或进口溶血剂混合，溶液温度为30℃的条件下，对血样进行检测。对比情况及检测结果分别见表3、表4。

                                    表3检测质控测量参数比较

类别	WBC×109/L	LY％	MO％	GRA％	RBC×1012/L	HGBg/L	PLT×109/L
								低值质控进口溶血剂实施例5溶血剂	2.22.332.30	62.059.860.9	6.06.16.0	32.030.123.1	2.362.402.40	616260	535252
中值质控进口溶血剂实施例5溶血剂	6.97.17.1	30.033.831.0	7.16.87.1	62.959.461.9	4.654.644.64	137137136	240242242
								高值质控进口溶血剂实施例5溶血剂	17.917.817.9	16.016.416.6	4.64.94.4	79.478.779.0	5.655.665.67	186187185	510513513

从表3的检测结果可见，用本发明溶血剂与进口溶血剂测试同一份标本，两种试剂所测WBC基本一致。

用同一份抗凝血，分别用本发明溶血剂与进口溶血剂，连续测定十次，精密度测试结果比较见表4。可见，用本发明的溶血剂与进口溶血剂相比，检测结果一致。本发明的溶血剂不含有氰化钾，而部分机型进口和国产的溶血剂含有氰化钾，本发明在不含氰化钾的情况下达到了白细胞的分类和计数及血红蛋白测定的准确性和稳定性。

                          表4

Claims (2)

1、一种测定血细胞中白细胞的溶血剂，其特征在于每1000ml的溶血剂中含有：聚氧乙烯型非离子表面活性剂    6～22g

固定剂                              1～6g

助溶剂                              1～9g

缓冲液                              11～16g

去离子水                            余量

其中，

聚氧乙烯型非离子表面活性剂的分子式为(I)

R₁-R₂-(CH₂CH₂O)n-H    (I)

R₁表示碳原子数为10～25的烷基、链烯基或炔基，

R₂表示O、COO、或

n表示9～40的整数；

固定剂是甲醛或戊二醛；

助溶剂为季胺盐类，其分子式为(II)

R₃(CH₃)m XN    (II)

R₃为烷基，m为2～3，X为氯或溴；

缓冲液是：将磷酸盐或硼酸盐溶于去离子水中，加入氢氧化钠或盐酸对PH进行调整，使缓冲液的PH值为5.2～9.1，加入氯化钠或硫酸钠调节剂，使缓冲液的渗透压为140～650mOsm/kg。

2、按照权利要求1所述的测定血细胞中白细胞的溶血剂，其特征在于所述的助溶剂是十六烷基三甲基氯化铵或十六烷基三甲基溴化铵。

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