JPH01502931A - 全血試料から白血球を単離、同定および／または分析する方法および試薬系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 全血試料から白血球を単離、同定および／または分析する方法および試薬系 ■−員−肢一歪 艮五立互 本発明は、溶菌試薬系の組成物及び１種以上のこれら組成物を用いる方法に関す るものである。更に特に、本発明は全血の赤血球画分を迅速に溶血させ、これに より生（ｎａｔｉｖｅ）又は生に近い状態の白血球を単離することを可能にする 新規な溶菌試薬系に関するものである。この際、白血球画分を種々の環境にて更 に研究するか又は分析することができる０本発明の溶菌試薬は、少なくとも部分 的に水性媒体に解離し、これによりプロトン及び対イオンを放出する水溶性化合 物から本質的に成る。適当な濃度のかかる化合物を全血に添加する場合、解離の 程度は、試料を酸性化しく２．６〜約４．０のｐＨ）、この間試料のオスモル濃 度を約１０ｍＯｓ以下に維持するに効果的なものである。この溶菌試薬系の好ま しい用途の１つとして、赤血球画分の溶血を迅速かつほぼ完全に行うための全血 試料の予備処理がある。

また、かかる予備処理は白血球画分に微妙な変化を生じ、か（して、白血球画分 が少なくとも５種（５）の別々の副集団に分化するのを促進する。即ち、この試 薬系は、フォーカストフロー分析システム（ｆｏｃｕｓｅｄ　ｆｌｏｗ　ａｎａ ｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ）　、例えばＶＣＳ全血分析器及びＥｐｉｃｓ　Ｍｏｄ ｅｌ　Ｃ並びにＰＲＯＦＩＬＥフロー血球計算器〔これらは全てクールターエレ クトロニクス、インコーポレーテッド、ヒアレー、フロリダ（Ｃｏｕｌｔｅｒ　 Ｉｌ：１ｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　１ｎｃ、１Ｈｉａｌｅａｈ、　Ｆｌｏｒｉｄａ ）から入手し得る。〕による９分のための全血試料の調製試料（ｐｒｅｐａｒａ ｔｉｏｎ）に適している。

先丘茨歪皇註更 −Ｃに、複雑な生理学流体（即ち、全血）を、その成分部分を研究及び分析する 前に種々の成分に分離することは、かかる研究及び分析に用いられる計装及び／ 又は多くの確立された分析手順に望ましくまたしばしば本質的な要求である。試 料の流体画分のかかる研究又は分析に主として関心がある場合、細胞の両分は、 細胞生存率又は膜の完全への維持を考慮することなく試料から分離される。逆に 、研究者又は臨床医にとって細胞画分が第１の関心である場合、全血試料を種々 の細胞成分に分配することには、適当に調整した試料処理／処理技術が要求され る。全血試料を種々の細胞成分に分離するための従来法は、遠心分離によるもの であった。この方法は有効であるが、手間がかかり比較的効率的でなく試料の細 胞画分を物理的に操作する必要がある。

試料の細胞画分のかかる分離／分配を化学薬剤を用いて行わんとする場合、種々 の理由に対して全体的に余り適当でない結果が得られる。更に特に、インビボ又 はインビト！における細胞集団の生命力及び生存率は、物理的細胞構造及び細胞 内における化学平衡の保存と一致する正確な生理学環境を維持することに左右さ れる。どの平衡は細胞膜の透過性及び輸送特性（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｃｈａｒ ａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）により制御される。生理学環境の変化は順次細胞膜の 応答又は変化を生じさせる。実際、膜の応答は「防御的」であり、即ち膜の生理 学応答を計算して細胞内の化学平衡を維持し、かくして細胞の継続し阻止されな い生命力を維持する。

細胞の理想的な生理学環境のかかる変化はある限度内でのみ許容され得り、かか る限度を越える場合には細胞に対する永久的な損傷を生じ得ることが十分に認め られている。

更に、当該技術分野で認められているように、環境のかかる変化（！ｐち、希釈 媒体の毒性−蒸留水を用いてさえ）は細胞の溶血を生じさせ辱る。

これら生理学環境の変化に対する全血中の種々の細胞の許容の程度は、広く研究 され報告されている。全血の細胞画分の生理学環境の種々の見地における変化の 作用は、微妙でまた著しく、食餌代謝産物（ｄｉｅｔａｒｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉ ｔｅ）及び／又は外来物質を介して生じることができる。これら研究には、種々 の薬剤、ダ　コスタ、エージニーら（ＤａＣｏｓｔａ、　Ａ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ） 、　）ランスフュージョン（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）　＋（１９７３）、　１ ３，３０５；食餌不平衡（ｄｉｅｔａｒｙ　ｉｍｂａｌａｎｃｅ）、コバヤシ、 テ４　＋、（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、　Ｔ）ら、ジャーナル　オプバイオケミスト リー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　（１９８３）９３ 、６７５　；及びｐｉ（の変化、ローサー、ニー（Ｒａｔｈｅｒ、　Ｕ、）ら、 ツェット、イミュノロジー　ホルシュングスゲマインシャフト（Ｚ＋Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｉｅ　Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｇｅｍｅｉｎｓｃｈａｆｔ）（１９７８） 　１５５．１１８及びシュエティニ、エフ（Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ、　Ｆ、）ら、 アクタ　バエジアド、スカンド、（Ａｃｔａ　Ｐａｅｄｉａｔ。

５ｃａｎｔ、）（１９７１）、　６０．１？、に対する細胞調製試料の反応を監 視するものが含まれる。

上記各文献において、薬剤９食餌代謝産物又はｐＨの変化は、血液の生理学環境 を赤血球の溶血が生じる程度に著しく変化させる。

更に特に、上記ローサーの文献には、ＥＤＴＡの存在下に無感作赤血球を溶菌し た塩化水素酸を用いて酸性化（ｐＨ６，４）することによる血清の活性化が報告 されている。この文献では、かかる酸性化と次いでインシュリンを用いる血清の 活性化で観察された「逸脱？８菌（ｄｅｖｉａｔｅｄ　１ｙｓｉｓ）　Ｊ活性と を比較している。シュエティニ及びシェエテイニの協力者による独立及び無関係 な研究では、幼児及び若い子供からの赤血球が年長の個体からの赤血球より酸溶 血に一層敏感であると論じている。

現在化学処理は、全血試料を生菌性細胞画分に迅速で効率的に分配するのに有効 ではない、全血試料の１種以上の化学処理を（白血球細胞の分化を実行するため の全血の調製又は予備処理に）用いる場合、かかる処理の焦点は、試料を変化さ せて細胞成分を、（ｉ）かかる処理の後に残留する細胞残滓（即ち、核）　：　 （ｉｉ）かかる化学処理による細胞の固定；又は（ｉｉｉ）最後にはこれら成分 を極限に分解するかかる処理の比較的苛酷な変化に基づいて相互から分化するこ とを可能にすることにある。しかし、全血試料の比較的苛酷で崩壊的な化学処理 は、比較的複雑な計装と組合せた場合には首尾よく行うことができる。更に特に 、盃：？／竺上！における細胞集団の生理学環境を変化させるための能力を用い て、ある種の細胞パラメータの測定を有利にし、個々の集団を計測する０個々の 細胞集団夫々の生理学環境の変化に対する該細胞集団の特異的な反応は、全血細 胞の個々の白血球側集団を同定するのに特に有利である。

血液の白血球集団は、予めリンパ系及び骨髄系画分の２種の主要な両分に分類さ れている。リンパ系画分はリンパ球（Ｂ及びＴ細胞）から成る。骨髄系画分は単 球及び顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）から成る。全血の細胞集団の生理学 環境を変化させるための１つの受け入れられている技術は、ある種のいわゆる「 溶菌試薬（ｌｙｔｔｃ　ｒｅａｇｅｎｔ）　Ｊを血液試料に添加することを介す るものである。ある種の試薬系の開発により、臨床医は全血の赤血球集団から白 血球集団（以下、白血球と称する。）を効率よく単離する能力を得た。血液試料 中の白血球の相対濃度及びこれら細胞のある等級の総形態学上の様子は、臨床上 重要である。

かくして、白血球集団を更に分化するためのこの能力は、種々の疾病の研究及び 処置に著しく貴重な診談器臭を提供する。更に認められるように、同定できる白 血球の副集団の数が増加すればする程、任意のかかる副集団の同定が正確で信頼 性の高いものとなる。

白血球の分化を行う自動計装の能力を向上するための種々の試薬系及び技術を開 示している最近の特許文献に、若干の文献が記載されている。次の文献は当該技 術分野の適当な特許文献を代表するものである。即ち、米国特許第３．８７４． ８５２　；４，２Ｂ６．９６３　；４，３４６．０１８　；４．４８５，１７５ 　；４．５２０，２７４　；４，５２９，７０４　；及び米国特許出願第６１５ ．９６１号（１９８５年１２月１９日に公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８ ５１００９５４号に対応する。）：並びに米国特許出願第６１５．９６６号（１ ９８５年１２月１９日に公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／００８６８ 号に対応する。）があり、参考のためこれらの内容を記載する。

’　−３，８７４，８５２”明細書〔ハミル（Ｈａｍｉｌｌ）　）には、全血の 白血球及びヘモグロビンの測定を実施するのに有用な試薬系及び方法が記載され ている。この試薬系はほぼ第四級アンモニウム塩及びシアン化物イオンのフェロ シアン化物無水溶液から成る。この試薬系は、全血の赤血球と血小板細胞の双方 をストロマ溶解しくｓｔｒｏｍａｔｏｌｙｚｅ）及び遊離ヘモグロビンをクロマ ゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）に転化スるのに有効である。この系は、白血球及び ヘモグロビンの診談的精度の測定に有効であると記載されている。しかし、この 系に有用な白血球集団プロフィールは、この細胞画分を更に別々の副集団に分化 することはなく総白血球の計算に限定される。

−４２８６９６３”明細書には〔レゾイス（Ｌｅｄｉｓ）ら〕には、溶菌希釈剤 及び全血中の赤血球を迅速に溶菌する方法が記載されている。この希釈剤により 、白血球のリンパ先側集団と骨髄系副集団の分化測定（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ ｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）及びヘモグロビンの定量測定を行うための自動 計装の能力が向上される。レゾイスの特許により記載されている溶菌希釈剤は、 水性緩衝媒体（ｐｌ’ｌ　３．５〜５．０）に溶解した置換短鎖アルコール及び 少なくとも１種の第四級アンモニウム塩の混合物から成る。しかし、レゾイス特 許の溶菌希釈剤は、白血球集団を２種（２）の主要な副集団、即ちリンパ系及び 骨髄系画分に分化する能力に限定される。

”　”　４３４６０１８　”明細書〔カルター（Ｃａｒｔｅｒ）　ら〕には、多 目的血液希釈及びこの希釈剤をヘモグロビン測定及び白血球のリンパ系と骨髄系 副集団への分化を行うために弱い溶菌試薬系と組合せて使用する方法が記載され ている。この希釈剤は、他の成分のうち、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ詐 酸（ＡＤＡ）を血液安定化側として含む、この溶菌剤は少なくとも１種の第四級 アンモニウム塩水溶液を含有する。しかし、このカルター特許の希釈／溶菌剤は 、白血球集団を２種（２）の主要副集団即ちリンパ系及び骨髄系画分に分化する 能力に限定される。更に、ＡＤＡが、寸法分布、細胞形状及び最も重要には他の 化合物を用いて観察されたことのない程等級の高い赤血球と血小板の細胞分散を 安定化する補助をすることが見出されている。

困Ｅ溢」」■」即」ぷ■号明細書（レゾイスら）には、白血球を自動細胞計数装 置を用いて３種（３）の副集団に分化測定するための試薬及び方法が記載されて いる。この試薬系は血液希釈剤及び溶菌剤を含む。溶菌剤（第四級アンモニウム 塩を含む）は、希釈した血液試料に濃度の穏和な条件下に比較的緩徐な速度で添 加する場合には、種々の白血球側集団に予期し得ない容量変化を生ぜしめる。レ ゾイスらによる白血球集団の分化の程度を達成するのを許容する知見は、顆粒球 側集団の溶菌剤に対する比較的大きな選択性の観察に基づくものである。リンパ 球集団を溶菌剤にさらす速度を制御することにより、顆粒球集団は一層保護され る。しかし、レゾイスらのこの特許の試薬系は、白血球集団を３種の副集団、即 ちリンパ球、単球及び顆粒球に分化する能力に限定される。

上記全ての溶菌剤及び試薬系は血液試料の白血球画分の分化を促進（大きいか又 は小さい程度に）するが、各々共通の欠如、即ちかかる分化を、かかる処理を行 われる細胞の化学平衡を不利に変化させることなく行うことができないというこ とを被る。化学平衡のかかる変化が誘発される場合、細胞集団への作用は比較的 小さな変化（即ち、ｌＩＩ脹）から溶菌に亘ることができる。また、白血球集団 の生理学環境における多大な化学変化は、白血球表面標識（ｓｕｒｆａｃｅｍａ ｒｋｅｒ）の免疫化学応答を変化させる。即ち、かかる従来の溶菌試薬系を用い る白血球の処理は、これら白血球の他の免疫化学研究と本質的に矛盾するもので ある。即ち、従来、この制限は、各かかる細胞集団の夫々の表面標識の免疫化学 応答の差異に基づく溶菌試薬単独又は他の手段との組合せの使用を種々の疾病の 診断方法における他の精製のために妨げていた。

Ｈの　・ 従って、本発明の目的は、従来技術の上述した欠点を除去することにある。

更に特に、本発明の主目的は、全血の如き複雑な生理学流体試料に存在する１種 以上の細胞集団の後の単離、同定及び／又は分析を促進する該試料の化学処理又 は予備処理を提供することにある。

本発明の他の目的は、全血試料の分配を促進し、これにより生の又は生に近い状 態の白血球画分の物理的、生理学的及び／又は免疫化学特性に基づくかかる画分 の後の単離。

同定及び／又は分析を促進する全血試料の化学処理又は予備処理を提供すること にある。

本発明の他の目的は、全血試料の細胞成分の１種のみに対して選択的な化学処理 又は予備処理を提供することにある。

本発明の他の目的は、全血試料をほぼ無損傷な白血球画分と溶菌した赤血球画分 に迅速かつ効果的に分化することができる試薬系を提供することにある。

本発明の他の目的は、全血の白血球側集団の分化測定に使用するための溶菌試薬 系を提供することにある。

本発明の他の目的は、全血の白血球側集団の分化測定に使用するための溶菌試薬 及びコンパニオン抑制剤（ｃｏｍｐａｎｉｏｎｑｕｅｎｃｈ）の双方を含む新規 な試薬系を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、（ａ）白血球側集団の物理及び／又は光学特性の測定 、及び／又は（ｂ）かかる副集団と各かかる細胞側集団の１種以上の表面標識に 特異的な免疫試薬（即ち、抗血清）との相互作用又は免疫応答の観察による白血 球側集団の分化測定に使用するのに有効な新規な溶菌試薬系を提供することにあ る。

本発明の他の目的は、白血球側集団を、（ａ）これらの物理及び／又は光学特性 の測定、と（ｂ）上記各副集団の１種以上の表面標識に特異的な抗血清に対する かかる副集団の免疫化学応答との双方により分化測定する方法を提供することに ある。

■　の　六 上記目的は、複雑な生理学的流体の種々の細胞成分との相互作用において選択的 な化学試薬系を提供することにより達成される。使用しようとする種々の環境に おいて、この試薬系は、選択性を基礎として、少なくとも１種の試薬成分を提供 して、複雑な流体試料の１種以上の細胞成分を意図する細胞成分の後の単離、同 定及び／又は分析を可能にするに必要な程度に効率よく変化させる。更に、この 試薬系は、試料の細胞成分の化学処理を、試料の細胞集団における細胞変化用試 薬の作用を抑制又は低減させるように設計した別々の試薬を供給することにより 調整する能力を意図するものである。

本発明の原理及び概念は、白血球細胞の分化分析より前に全血試料の処理に都合 よく通用される０本発明の化学試薬系の基本的成分は、「溶菌試薬」及び「抑制 剤（ｑｕｅｎｓｈ）　Ｊと称する溶菌試薬用のコンパニオン試薬（ｃｏｍｐａｎ ｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ）を含む、抑制剤の主な作用は、溶菌試薬の活性を低減 させ溶菌試薬との処理の後に試料のイオン平衡を維持することにある。

従って、本発明の溶菌試薬系及び方法は、目的で広く述べた如く、全血試料の赤 血球集団を選択的に溶血し、これと同時に同一試料の１種以上の白血球側集団の 後の単離。

同定及び／又は分析を、意図する副集団を示す１個以上の物理、生理学及び／又 は免疫化学応答に基づいて促進する。

本発明の溶菌試薬は、水性媒体に少なくとも部分的に解離し、これによりプロト ン及び対イオンを放出する水溶性化合物から本質的に成るものである。適当な濃 度のかかる化合物を全血試料に添加する場合、かかる化合物の解離の程度は、試 料を酸性化（２，６〜約４．０の範囲のｐＨ）する一方ｎ表千１−５０２９３１ （５） で試料のオスモル濃度を約Ｌｏｏｍ’ｓに維持するのに効果的なものである０本 発明の目的を達成する溶菌試薬として適す□ることが見出された化合物には、少 なくとも３種の等級がある。これら等級には低分子量のカルボン酸、スルホン酸 及び活性化フェノールが含まれる。

本発明の溶菌試薬として通するカルボン酸は次式％式％ （式中のＲは、Ｈ，１〜３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基；１〜３個の 炭素原子を有するカルボニル置換脂肪族炭化水素基；１〜３個の炭素原子を有す る水酸基置換脂肪族炭化水素基；又は１〜３個の炭素原子及び複数のカルボニル 及び／又は水酸基置換基を有する脂肪族炭化水素基を示す、）で表すことができ る。

上式のカルボン酸の例としては、ギ酸。メタンカルボンＨ（酢酸）、２−ヒドロ キシ−エタン−２−カルボン酸（乳酸）ｉｌ、２−エタンジカルボン酸（コハク 酸）；及び２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパン−トリカルボン酸（クエン酸 ）；並びにこれらの混合物がある。

本発明の溶菌試薬として通するスルホン酸は、次式％式％ （式中のＲは、水酸基、１〜３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基又はアリ ール基を示す。）で表すことができる。

上式のスルホン酸の例としては、硫酸；メタスルホン酸：エタンスルホン酸；ベ ンゼンスルホン酸；Ｐ−トルエンスルホン酸；ニトロベンゼンスルホン酸；及び これらの混合物がある。

本発明の溶菌試薬として適する活性化フェノールは、次式 （式中のＲは、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基の如き電子吸引基又はかかる 電子吸引基の任意の組合せ；及びｎは１〜３を示す、）で表すことができる。

上式の活性化フェノールの例としては、ｐ−二トロフェノール；ｍ−ニトロフェ ノール；０−ニトロフェノール：２．４−ジニトロフェノール：ｐ−クロロフェ ノール；及び１−クロロ−２，４−ジニトロフェノール；並びにこれらの混合物 がある。

上述のものは、本発明の目的と一致する溶菌試薬として使用することができる等 級の物質の例である。比較的弱い酸が試料内に解離しない化合物として及び解離 状態の双方で存在すると考えられる。勿論、強酸は試料中でほぼ完全に解離する 。ある種の非解離酸及び解離した酸からの対イオンは、試料中でのこれらの相対 濃度及び酸及び／又は対イオンの意図する細胞検体（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎａ ｌｙｔｅｓ）する生理学的認識（存在する場合）に依存して白血球画分の分化の 程度に影響を及ぼすことが明らかである０例えば、リン酸は、一般に適当なｐＨ でさえ、白血球を５種（５）の副集団に分化するのを行うことを許容することが できない。対イオン（リン酸イオン）の相溶性は許容されず、かくして白血球集 団の分化は明らかに一層困難であるという仮説が生じる。

本発明の範囲の好適例において、新規な溶菌試薬系は、ギ酸、酢酸及びこれらの 混合物から成る群から選ばれた溶菌試薬の分化有効量を含有する水溶液を含む、 これら混合物において、ギ酸が主要な作用成分であり酢酸は極（少量存在するの が好ましい。「分化有効量（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｉｖ ｅ　ａｍｏｕｎｔ）　Ｊと称するは、赤血球を溶菌するのに有効であるのみなら ず、白血球画分に微妙な変化を与えて後の単離、同定及び／又は少なくとも５種 （５）の白血球の副集団の分化分析及び同定を行うための計装能力を含むこの白 血球画分の分析を促進するのに有効な溶菌試薬の濃度を示すものとする。溶菌試 薬中のギ酸の好ましい範囲の濃度は、約０．１０〜約０．２５％（ν／ν）の範 囲にある。上記の基準を満足するように決定したかかる好適溶菌試薬の濃度は、 全血の−当り約０．００９〜約０．０２０ａ　Ｒのギ酸である。溶菌試薬による 白血球画分のこの微妙な変化は、白血球の各５種の細胞側集団の表面標識の免疫 化学応答を維持する間に行う、上述の如く、白血球画分をほぼ生の状態に維持す る間に赤血球のストロマ溶菌を行う溶菌試薬を用いる全血試料のこの処理が本発 明の主目的である。

本発明の一例の好適例において、溶菌試薬系は、溶菌試薬に加えてサポニンを含 有することができる。「サポニン」と称するは、化学薬品等級のキラヤ皮サポニ ン粉末をいうものとする。試薬系へのサポニンの添加は、随意及び一般に、臨床 医が光学写真（ｐｈｏｔｏｏｐｔｉｃａｌ）又は免疫化学技術以外の技術により 白血球副集団のある種のパラメータを監視する場合にのみ適当である。溶菌試薬 系に適当量のサポニンを添加することは、赤血球断片の寸法を低減する能力゛　 に有効であり、ある種の白血球パラメータを電気不透明度の測定及び／又はクー ルター（Ｃｏｕｌ　ｔｅｒ）米国特許第２．６５６゜５０８及び３，５０２，９ ７４号（参考のため記載する。）に記載されている技術を使用するクールター容 量（Ｃｏｕ　ｌ　ｔｅｒνｏｌｕｓ＋ｅ）の測定により決定する場合に、赤血球 の妨害を回避する。

赤血球断片を低減するに有効であると決定されたサポニンの好ましい濃度の範囲 は、全血のｄ当り約０．００６〜約０．０１２ｇの範囲である。簡単に言えば、 この技術は、無線周波数電流（ＲＦ）及び直流（ＤＣ）電界励起を用いる細胞容 量の測定を包含するものである。低周波又は直流電流励起と無線周波数（ＲＦ） 電流励起との双方を用いる粒子検出電界を発生することにより、２個以上の相関 出力信号を電界を介する単一粒子（即ち、白血球）の通過から誘導することがで きる。

この出力信号から誘導した値は、「相対不透明度（ｒｅｌａｔｉｖｅｏｐａｃｉ 　ｔｙ）　Ｊと称し、これは白血球の各副集団に対して特徴的なものである。溶 菌試薬へのサポニンの添加は、赤血球断片の寸法を、赤血球断片がある種の白血 球を示す出力信号の誘導を妨げないか又はこれら自体が引起さない程度に低減す る。

細胞分化が光散乱測定に基づくものである場合〔参考のため記載するフルワイラ −（Ｆｕｌｗｙｌｅｒ）の米国特許第３．９８９゜３８１号及び／又はアー（Ａ ｕｅｒ）　らの米国特許第４，０３８，５５６号明細書に記載されている技術を 用いる場合〕、赤血球断片は白血球の種々の光度分化（ｐｈｏｔｏｍｅｒｉｃ　 ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ）を妨げないか又は悪影響を及ぼさない、従って 、溶菌試薬系へのサポニンの添加はかかる分化が光度分析に基づく場合には必要 ではない。

血液試料を溶菌試薬系にさらす時間の長さは、本発明の分化方法に対して臨界的 である。この曝露時間は、以下の実施例に説明する如く、１０秒（１０）を越え ないべきであり、最も好ましくは約６秒（６）以下であることが必要である。

これら曝露時間の双方は室温（約１８〜約２８℃）に対するものである。夫々の 場合、溶菌試薬の作用は、適当な濃度の塩を簡単に添加して細胞を生の生理学環 境に戻すことにより抑制される。更に、抑制剤は、固定液の添加を必要とするこ となく白血球における溶菌試薬の活性を効率よ（低減させる。溶菌試薬の抑制剤 は、後の白血球画分の分析に溶菌試薬の活性の低減が必要とされる場合には溶菌 試薬に対する本質的な補助となる。白血球は、ｐｎ及びオスモル濃度をかなり狭 い範囲内（ｐＨ約６．００〜約７．２５．約３００〜約３３０■Ｏｓ　）に制御 することによってこの抑制剤により安定化される。また、抑制剤を配合してフォ ーカスドフローアパーチ中分析システム（ｆｏｃｕｓｅｄ　ｆｌｏｗ　ａｐｅｒ ｔｕｒｅ　ａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅ腸）に使用する選定した「シース（ｓｈ ｅａｔｈ）　Ｊ流体の伝導率と調和させることができる。抑制剤の組成及び容量 を調整して、クールターらの米国特許第３，５０２．２７４号（参考のため上述 した）に記載されている技術に従って分析する場合に５種（５）の主要な白血球 副集団の随意の分離を行う。上記の方法で処理した試料の白血球画分は、複数の パラメータ粒子（細胞）の測定が可能な血液分析器；及び各白血球細胞側集団の 細胞上の１種以上の標識に特異的な抗血清（即ち、抗体、結合タンパク質）との 免疫化学的相互作用により少なくとも５種（５）の副集団に容易に分化すること ができる。

Ｕ引ｌ肌 第１．２及び３図は、実施例■の血液試料の白血球分化分析を示す散乱図（ｓｃ ａｔｔｅｒｇｒａｍ）であり、各図面のＸ軸は相互に異なるものである。

第４図は、実施例Ｉの血液試料の白血球分化分析を示す散乱図である。

第５図は、実施例■の血液試料の白血球分化分析を示す散乱図である。

第６図は、実施例■の血液試料の白血球分化分析を示す散乱図である。

るための　の／ｌ： 本発明の溶菌試薬系は、極めて低濃度の溶菌試薬（好ましくは、１．０容量％以 下）を含有する水溶液を含む。一般に、本発明の試薬系の溶菌試薬は、水性媒体 に少な（とも部分的に解離する水溶性酸性化合物とすることができる。

上記発明の開示に記載した如く、若干の相関因子は、かかる化合物が本発明が意 図する種々の環境中で作用するのに本質的なことであると考えられる。これらの 因子には、ｐＨ。

オスモル濃度及び対イオンの相溶性が含まれる。試料の酸性化が赤血球の所望溶 菌を行うのに必要である。しかし、この試料のｐＨが好適範囲約２．６〜約４． ０からはずれている場合には、白血球画分を５種（５）の別々の副集団に分化す る能力は明らかに妨げられる。

また、白血球集団を種々の副集団に効率よ（分化する能力は溶菌された試料が約 １００ｍＯｓ以下に維持されない場合には妨げられる。従って、溶菌された試料 のｐｎ又はオスモル濃度が上記パラメータ内に維持されない場合には、白血球の 種々の副集団間を効率よく分化する能力は著しく損われる。

ある場合において、解離した酸性化合物の対イオンは、白血球画分の分化を行う ことができる程度に作用することが示された０例えば、リン酸は、適当なｐＨ及 びオスモル濃度を生ずる濃度でさえこの白血球画分を種々の副集団に分化するの にを効でない、この酸（リン酸）の対イオンは、若干の知られていない方法で白 血球画分と相互作用するか又は相互作用せず、これにより他の水溶性酸性化合物 により生ずる範囲の分化を供給しないという仮説が得られる。

また、溶菌試薬の試料における作用に固有の他の因子及び機構が存在し、これは 本発明の驚くべき予期し得ない結果を説明するものである。現在、上記３個の烈 挙した変数が確認されているが、他のものが存在しないか又は本発明が有効性に 対して上記確認されている変数にのみ左右されるということを意味せんとするも のではない。

本発明の溶菌試薬は、ギ酸、酢酸又はギ酸が主要作用成分であるギ酸と酢酸との 混合物の水溶液であるのが好ましい、この水溶液は、溶菌試薬を脱イオン水に単 に添加することにより製造する。この希釈剤に添加する溶菌試薬の量は、約０． ０５〜約０．５％（ν／ν）溶液を含む溶液を製造するに十分な量である０本発 明の好通例においては、溶菌試薬の濃度は約０．１〜約０．２５％（ν／ν）に 亘る。

溶菌試薬がギ酸と酢酸の双方を含む混合物を含有する場合、酢酸は規定量のギ酸 を部分的に交換するものとして存在し、この際約０．０５〜０．１０％（ν／ｖ ）の濃度で存在するのが好ましい。

また、溶菌試薬系は溶菌試薬に加えて少なくとも極めて少量のサポニン（少なく とも約０．０５〜約０．２重量％が好ましい。）を随意に含有することができる 。十分認識されるように、溶菌試薬としてのサポニンの有効性は著しく濃度に依 存する。サポニンを低濃度で用いる場合には、−１にこの目的に対して有効では ない、サポニンを溶菌剤として使用すべき場合には、サポニンを少なくとも約２ ．０重量％以上の濃度で存在させて赤血球のほぼ完全なストロマ溶解を行わなけ ればならない、望ましくないことに、サポニンが溶菌有効量で存在する場合には 、白血球の溶菌も引き起こし得る。即ち、サポニンを溶菌剤として使用し自動計 装による後の分化を用い白血球集団に誘発された任意の変化は、白血球集団の夫 々の核の認識し得る別々の特徴に基づくものでなければならない、しかし、本発 明の溶菌試薬系におけるサポニンの存在は、臨床医が物理的及び／又は電気特性 の特異性に基づく分化測定を妨げるいわゆる「ゴースト」に関与した場合には望 ましいものである。上述の如く、サポニンは、分化測定が純粋に光学的計装及び ／又は符表千１−５０２９３１（８） 免疫化学分析により行われる場合には、溶菌試薬に対する必須の添加剤ではない 。

また、溶菌試薬系は、他の従来の添加剤の存在が系の主要な作用成分と相溶性で なくなる程度まで他の従来の添加剤（即ち、消毒保存剤、例えばナトリウムオマ ジン（ｓｏｄｉｕｍｏｍａｄｉｎｅ）を含有することができる。

本発明の溶菌試薬系は簡易な手動又は自動添加により全血試料と組合せることが でき、溶菌試薬と試料は簡単に相互作用することができ、溶菌試薬の作用は適当 な抑制剤を添加することにより実質的に低減される。従って、この環境で有効な 抑制剤は、血液試料及び溶菌試薬に含まれる水性混合物に添加した際に溶菌試薬 の溶菌活性を迅速に低減させることができねばならない。抑制剤の精密な配合は 、溶菌試薬系の組成及びフォーカーストフローアパーチャ分析システムに用いら れるシース流体に依存して変化し得る。

代表的に、抑制剤は、溶菌試薬の溶菌活性を実質的に低減及び／又は中和し試料 に封するイオン平衡を維持するのに有効な可溶塩を含有する水溶液である。イオ ン平衡のこの維持は、生存している細胞の寿命を延長し、例えば、クールターカ ウンター■（Ｃｏｕｌｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒ■）全血分析器を用いる場合のよう に試料が電気伝導性であるのを必要とする装置における後の分析を可能にする。

通常、本発明の溶菌試薬組成物とともに使用するのに適する抑制剤は、次の４種 の成分：保存剤としての塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、 炭酸ナトリウム；及び更にアジ化ナトリウムの少なくとも２種の任意の混合物を 含有する０本発明の範囲の溶菌試薬における抑制剤の効率は、溶菌試薬系に使用 するために選定したカルボン酸及び不揮発性ｉＸ酸の溶菌活性を迅速に低減する 能力により決定する。上述の如く、白血球副集団の分化に用いる方法及び装置は 、抑制剤の精密な配合にある種の要求を生じ得る。更に特に、かかる分化がフォ ーカスフローアパーチャ分析システムで行われる場合、抑制剤の組成及び容量は 、５種（５）の白血球副集団の相互からの最適な分離（分化）に対して臨界的で あり得る。この型の分析系においては、抑制剤のイオン平衡を調整して、シース 流体に対する溶菌した血液試料の適当な伝導率の調和を得る必要がある。好まし い抑制剤の配合においては、溶菌−抑制血液試料における主要なイオン種及びそ の相対比は、シース流体における主要イオン種及びその相対比とほぼ同じである べきである０本発明の溶菌試薬系とともに使用すべき抑制剤の作用成分の相対濃 度は、約１〜約３％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム、約０．２５〜約０．８％（ｗ ／ｖ）の炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム及び約２〜約４％（−／ν）の硫 酸ナトリウムである。一般に最適抑制剤の成分の正確な相対量は実験的に決定さ れ；かかる調整の目的は、溶菌した血液試料のｐＨを約６．０〜約７．５の範囲 内にし、安定化し溶菌した血液試料の最終オスモル濃度を約３００〜約３３０ｍ Ｏｓにすることである。フォーカストフローアパーチャシステムにおいては、白 血球副集団の最適の集落化（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）が最終血液試料のオスモル 濃度を約３１ｈＯｓに調整することにより達成されることが既に観察されている 。溶菌した試料の酸性度をアルカリ性抑制剤でほぼ完全に中和することは、フォ ーカストフローアパーチャ分析システムに対して臨界的であるとすることができ る。試料の成分（即ち、フィブリン及び血小板）はｐＨ怒受性であり、酸性条件 下で集塊を形成し、この集塊は分化分析を潜在的に妨害する（即ち、ノイズ）か 又はフォーカストフローアパーチャシステムの開口を物理的に遮断し得る。

抑制剤がサポニン（存在する場合）を必ず抑制又は中和することを意図するもの ではない。この理由は全く単純であって、意図する濃度において（約０．２重量 ％）、サポニンは溶菌試薬として比較的有効ではないからである。抑制剤が試料 への添加に際しサポニンの活性を抑制すべきであったのであれば、試料の適切な 清澄化（無損傷赤血球細胞膜の破壊）は生じないであろう、即ち、サポニンの活 性が、溶菌試薬の酸性度を抑制した後に約５〜１５秒間持続することが予想され る。若干の環境においては、サポニン用に独立した抑制剤を供給するのが適切で あるが、意図する濃度（０，１％以下）においては、本発明の目的を達成するか 又は促進するのに必要とは思われない、勿論、抑制剤の適切さは、溶菌試薬に対 する試料の細胞（意図する検体）の感受性に関するある仮定及び分析前における 溶菌試薬とこれら細胞検体との接触時間に基づくものである。上述の如く、抑制 剤は溶菌活性を低減させるが、試料の白血球画分における作用を完全に除去する ものではない、即ち、抑制剤の添加と試料の分析との間に十分な時間が経過する 場合には、′白血球画分を固定化して意図する細胞検体の特徴ある寸法及び形状 を保存するのが望ましい。

本発明の好適例においては、溶菌試薬と血液試料との効果的な接触時間（２個を 組合せた時間から抑制剤を添加した時間まで）は、１０秒（１０）以下、好まし くは６秒以下であ°　る必要がある。上述の如き溶菌試薬と血液試料との反応接 触時間により、かかる反応接触は室温（約１８〜２８°Ｃ）で起こると仮定され る。勿論、温度がこの水準より高い場合には、反応接触の時間は幾分短く反対に 変化し、温度がこの水準より低い場合には、反応接触の時間は幾分長い０本発明 の分化方法を首尾よ〈実施するために、犠牲的細胞集団（赤血球）と所望細胞画 分（白血球）とにおける溶菌試薬の相互作用の運動を注意深く正確に制御する。

溶菌試薬が双方の細胞画分と反応する機構は正確には知られていおらず、かかる 相互作用の効果のみ明らかである。即ち、分化分析におけるこれら改善をいかに 達成するかを説明するこの議論の見地を越えるものであり、かかる機構を説明す るか又は後で権利付与請求するに何ら努力を払っていない。

これら双方の細胞画分を溶菌試薬にさらすのを制限することにより、赤血球のス トロマ溶解は効率がよくまた効率よく行われ、一方付加的な微妙な変化がこれら の効率のよい分化を可能にする抑制剤により白血球中に誘発される。

これら現象の双方はほぼ同時に起こり、これと同時に分化した白血球画分の生の 免疫化学反応性が保存される。

上述の如く、溶菌試薬と血液との接触時間は、犠牲的細胞画分の選択的破壊応答 を行いこれと同時に白血球画分に分化応答を作用させるに十分な時間であり、予 想しなかったことには、かかる変化は白血球の少なくとも５種（５）の細胞側集 団の相互からの物理的分化を可能にする。従来型の溶菌剤（即ち、サポニン、第 四球アンモニウム塩）と明らかに対照的な溶菌試薬は、白血球側集団内の各細胞 の表面標識の生の免疫化学応答を悪く変化させない。この性質は、本発明の溶菌 試薬に独特であると考えられる。

上記試薬系にさらす血液試料は、この目的のために設計した計装による分化測定 で処理することができる。かかる分化は、米国特許第３，５４９．９９４　（参 考のため記載する。）、３．５０２．９７４及び３，９８９，３８１号明細書に 記載されている型の技術を用いる装置により行うことができる。上記特許文献に 記載されている発明の特徴は、商業的に実際の計装に具体化されている。簡単に 言えば、血液試料は、自動ピペッティング装置を用いて溶菌試薬と混合すること により初期処理される。犠牲的細胞集団（赤血球）における溶菌試薬の溶菌作用 は、迅速かつ効率のよい必要がある０次いで、抑制剤を同様のピペッティング手 段により添加して、残存細胞画分（白血球）における溶菌剤の活性を実質的に低 減させる。次いで、白血球画分を含有する試料を、個々の細胞副集団夫々の計数 及び／又はヒストグラム及び／又はこの方法から収集したデータにより得た散乱 図により処理する。

クールター容量測定の実施に包含される原理は「クールター原理」として当業者 に知られている。簡単に言えば、クールター原理を用いる計装の操作は、細胞の 存在により生ずる電圧降下を検出するように設計したセンサーを介する個々の細 胞の通過により生ずるインピーダンスの変化を測定することを包含する。この原 理を用いる計装は、夫々導電性電解質溶液を含有する２個の流体容器及び室を有 する６反対の極性を有する少なくとも２個の電極は電解質溶液に浸漬しており、 各流体区画室は配置した１個の電極を備える。血液細胞を懸濁して含む電解質溶 液の試料を、２個の流体区画室の間に介在するくびれた流体通路又はオリフィス を介して通過させる。くびれた通路は種々の形態をとることができるが、各装置 において、かかる通路は検出用帯域を画成し、この帯域では粒子の存在又は不存 在が通路の電気特性に検出し得る変化を生じさせる。例えば、比較的導電性に乏 しい血液細胞のこの通路を介する通過により、細胞容量とほぼ同じ電解質あ容量 が置換し、通路インピーダンスが増大することによる電圧降下を生じさせる。

電圧の降下により規定される抵抗パルスは粒子の計数及び粒子の容量測定に使用 される。クールター原理は米国特許第２．６５６，５０８号明細書に十分記載さ れている。特定の細胞集団を検出及び同定するためのこの技術は、クールター原 理測定と検出帯域内での無線周波数励起とを組合せることにより向上することが できる。簡単に言えば、この無線周波数増強は、血液学分析器の検出用帯域を介 して移動する粒子が検出用帯域内の無線周波数に相シフトを生ぜしめるという原 理において作用する。この相のシフトは細胞集団の物理的及び組成的特徴と相関 関係にあるとすることができる。細胞のＲＦ分化のための技術は米国特許第３， ５０２，９７４号明細書に十分記載されている。また、白血球の分化は米国特許 第３．３８０．５８４号明細書（参考のため記載する）に記載されているような 流血法計測の光学測定原理を用いて行うことができる。

本発明の溶菌試薬系は、自動細胞計数装置による５種（５）の別々の白血球の副 集団の分化を向上するための白血球画分における微妙な変化を誘発するのに効果 的である０例えば、米国特許第４．４１２．００４号明細書〔オルンステイン（ Ｏｒｎ−ｓｔｅｉｎ）ら、参考のため記載する。〕参照、上述の如く、これら５ 種（５）の別々の副集団には、リンパ球、単球及び３種の顆粒球（好酸球、好塩 基球、好中球）が含まれる。白血球のこれら副集団の夫々は、別々の表面標識を 有する。ある種の疾病状態において、１種以上のこれら副集団における表面標識 は特異的な免疫応答を供給し、かくして疾病の診断又は確認を疾病の発生の早期 状態で可能にする。勿論、１種以上の白血球のこれら副集団におけるこれら別々 の表面標識の検出は、特徴ある疾病状態表面標識を有するこれら細胞を作用され ていない細胞から単離し、試料の作用された細胞の相対濃度を分析することに依 存する。

本発明が意図する初期溶菌条件では、生残り相互から分化すべき細胞集団の寿命 を延長できる。大体、少なくとも約７２時間（７２）の細胞寿命がある種の型の 免疫化学分析に適当である。この分化法のある種の適用において、１種以上のこ れら副集団を４ｙＹ上三において数時間、又は場合によっては数日間維持するの が必要かつ適切である場合がある。かかる延長した安定性を達成するために、白 血球を溶菌試薬／抑制剤混合物を含有する流体画分から物理的に分離し、しかる 後かかる細胞を生理学媒体に再懸濁させるのが適切である。

以下の実施例により、本発明の溶菌試薬系の新規な利点を説明する。この溶菌試 薬系の製造及び評価に用いた装置及び技術は、標準的なものであるか又は上述の 如きものである。かかる実施例においては、特記しない限り、部及び％は重量部 及び重量％を示すものとする。

スー」［−側御」一 本発明の溶菌試薬系は試薬級の化学薬品から製造した。

０．１２％（ｖ、／ｖ）ギ酸溶液を、１．３＋ａ１の９０％ギ酸と９９８＋ａ　 ｌの脱イオン水を混合することにより初期製造した。５０μｌの全血試料（Ｋ、 ＥＤＴＡ）　と８００　ｍの０．１２％ギ酸溶液を、双方を室温（約２０°Ｃ） で５分間（５）ともにかき混ぜることにより緩徐に混合した。　０．５５％の重 炭酸ナトリウム、３．０％の塩化ナトリウム及び０．０１％のアジ化ナトリウム を含有する抑制剤溶液４００μｌを添加することにより、ギ酸の溶菌作用を約５ 秒後に低減させた。試料を適当に抑制し、抑制剤を添加した後約５〜１０秒内に 流血法計算法による分化分析の準備をした。かかる分化分析に用いる装置は、ヘ リウム／ネオンレーザ及び光散乱の測定用のケイ素ダイオード検出器を備える。

白血球を観察し、その個々のパラメータを、光パラメータ分析、即ち光励起〔０ °散乱（ｚｅｒｏ　ａｎｇｌｅｓｃａｔｔｅｒ）　）及び任意の１種の光散乱の 若干の角度範囲を測定することにより決定した。上記の方法において得られた試 料の散乱図を、第４図に示す、白血球の５種（５）の別々の副集団を、この散乱 図で同定し定量した。

スーＪＬＪＬｊＬ ０．０５％（ｗ／ｖ）のサポニン粉末を０．１２％ギ酸を含有する水溶液に添加 した以外は、実施例Ｉの操作を繰返した。次いで、全血試料（５０μりを（上述 の如＜　”）　６００μｌの溶菌試薬と混合した。溶菌試薬を、０．６０％の重 炭酸ナトリウム及び３．００％の塩化ナトリウムを含有する水溶液２６５μ！を 添加することにより６秒後に抑制した。

サポニンを溶菌剤に添加することは、クールター容量測定から赤血球断片の妨害 を有効に除去する。サポニンの有効性は温度に著しく左右される。赤血球断片に よる妨害のほぼ全体の除去には、試料の赤血球画分の溶菌を完了した後に追加の １０秒間（室温的１８〜２８’Ｃ）を必要とする。いずれにしても、試料を低温 （１８°Ｃ以下）で幾分長い時間維持することは、赤血球断片からの妨害をサポ ニンにより有効に除去するのに必要である。

試料は、抑制剤を添加した後約１０〜２０秒以内に分化分析する準備をした。試 料を、゛実施例１に記載した如く光学分析処理した。また、試料中の白血球はｌ ５ＯＴＯＮ　”ＩＩシース流体を用いてＤＣ及びＲＦ容量測定により観察し、得 られた散乱図を第１図に示した。４種の別々の白血球の副集団を、同時に得られ た第２図の光散乱対ＤＣ散乱図で同定し定量した。

白血球の５番目の副集団（好塩基球）は、「ゲーテッド（ｇａｔｅｄ）　Ｊ第２ 散乱図の発生により単離した。この好塩基球集団は、第３図に示した散乱図に示 す。

皇−旌一孤−ｌ 同様のギ酸／サポニン試薬組成物を用いて実施例■の操作を繰返した。ギ酸の溶 菌活性は、３．１３％（−／ν）の硫酸ナトリウム（無水）　、　１．４５％（ ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム及び０．６０％（−ν）の炭酸ナトリウム（無水）を 含有する抑制剤を用いて低減させた。試料は実施例■に記載した方法の電気光学 技術により分析し、得られた散乱図は第１，２及び３図と同様の結果を示した。

但し、シース流体はｌ５ＯＴＯＮ■■希釈剤に代えた。

裏−隻−ｔｊＺ 一層迅速なデータの取得のために濃厚溶菌−抑制血液試料を用いた以外は、実施 例■の操作を繰返した。溶菌試薬は０．１５％（ｖ／ｖ）のギ酸及び０．１０％ （ｗ／ｖ）サポニン粉末を含有する。ギ酸の溶菌活性は、２．６７％（ｗ／ｖ） の硫酸ナトリウム（無水）　、　１．２４％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム及び０． ５６％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウム（無水）を含有する抑制剤で低減させた。

この分化分析は、５０μｌの全血を３００ｕＩ２の溶菌試薬を含有するガラス培 地管に添加することにより行った。試料と溶菌剤は管の内容物を約６秒間かき混 ぜることにより混合し、ギ酸の溶菌活性は１６５μｌの上記抑制剤を添加するこ とにより低減させた。次いで、試料を実施例■に記載した方法の電気光学測定で 処理し、得られた分化分析は（第１．２及び３図に示すような）実施例■に匹敵 するものであった。

亥−ＪＬ」１−■ 溶菌試薬系中のギ酸の代わりに０．１％（ｖ／ν）の酢酸を用いた以外は、実施 例Ｉの操作を繰返した。試薬の溶菌活性は、２．０％の塩化ナトリウム溶液に溶 解した０、２５％の重炭酸ナトリウムを含有する抑制剤を用いて約５秒間の後に 低減させた。試料を適当に抑制し、抑制剤の添加後約５〜１０秒以内に流血法計 算法による分化分析の準備を行った。かかる分析に用いた装置及び分析技術は実 施例■とほぼ同じである。この試料において実施した分化分析は、第５図の散乱 図に示す。

皇−旌−１ 試料と溶菌剤との接触時間を抑制剤の添加前５秒から７秒に延長した以外は、実 施例■の操作を繰返した。抑制剤は、２．０％塩化ナトリウム溶液中の重炭酸ナ トリウムの濃度を０．２５％から０．３７５％に増大させることにより若干変形 した。白血球集団のこの分化分析の結果を第６図の散乱図白血球の種々の副集団 を免疫化学法により分離及び同定した以外は実施例１の操作を繰返した。溶菌剤 の作用を抑制するとすぐに、試料を等張緩衝液で希釈し、次いで、夫々を白血球 の１種のみの吸着に特異的な異なる抗血清で予備処置した一連の磁性粉末で、試 料をスラリー化した０次いで、吸着した細胞は、上述の文献に記載した従来の磁 性粉末分離法を用いて試料から分離することができた０次いで、分離した粒子は 、１種以上の疾病状態を示す表面標識用の付加的なスクリーニング（ｓｃｒｅｅ ｎｉｎｇ）を行うことができた。

亥二」Ｌ」１−■ 細胞を磁性粒子から分離し、コーラ−とミルスティン（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　 Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ネイチャー、第２５６巻、第４９５〜４９７頁（１９７５ 年）の方法に従う不死細胞ライン（ｉｍｍｏｒｔａｌｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）を用 いて培養した以外は、実施例■の操作を繰返した。この方法で生成したクローン を、意図する表面種゛　議に特異的な抗血清の生成のためにスクリーン（ｓｃｒ ｅｅｎ）した。

スー」Ｌ」１−■ 溶菌試薬系中の酢酸の代わりに０．１％（Ｖ／ν）のクエン酸を用いた以外は、 実施例■の操作を繰返した。この交換を行うと、実施例Ｖで得られた結果と同様 の結果を示した。

スー」Ｌ工区−Σ− 溶菌試薬系中の酢酸の代わりに０．１％（ｖ／ｖ）のコハク酸を用いた以外は、 実施例Ｖの操作を繰返した。この交換を行うと、実施例■で得られた結果と同様 の結果を示した。

スー」Ｌ工匠−」」− 溶菌試薬系中の酢酸の代わりに０．０５％（ｖ／ν）のスルホン酸を用いた以外 は、実施例■の方法を繰返した。この交換を行うと、実施例■で得られた結果と 同様の結果を示した。

上述の詳細な説明及び実施例は、本発明の溶菌試薬、試薬系及び方法の若干の好 適例を示すものである。これら特定例は本発明の範囲を示すものではないが、以 下の請求の範囲をむしろ簡単に補助するものである。

国際調査報告 ｔ＋＋＋−一−ｍｅｓｍａｔｓ＊　１１ｍ　Ｆ　：：　／　’：　５　ｅ　Ｅ　 ／　：：７　：：

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．水性媒体に少なくとも部分的に解離して遊離プロトン及び対イオンを発生す る水溶性化合物を含む溶菌試薬を含有する第１水溶液を含有し、全血試料をほぼ 無損傷の白血球画分と溶菌した赤血球画分の２種別々の画分に分配する化学処理 用の溶菌試薬系において、上記系は、上記第１水溶液が分化有効量の溶菌試薬を 含有し、この系が上記溶菌試薬に特異的な抑制剤を含む第２水溶液を含有し、 上記分化有効量の上記溶菌試薬は、全血試料に添加した場合に：（ｉ）試料のｐ Ｈを生理学的水準から約２．６〜約４．０の範囲のｐＨに低減し、この間試料の オスモル濃度を約１００ｍ０ｓ以下に維持し；（ｉｉ）上記赤血球画分の溶血を 迅速かつ実質的に完了し；及び（ｉｉｉ）上記白血球画分に微妙な変化を生じさ せて、分化分析を行うための計装及び白血球の少なくとも５種（５）の副集団の 同定の能力を向上し、上記微妙な変化を、上記白血球画分をほぼ生の生理学的及 び／又は免疫化学的状態に保存する間に生じさせ；及び 第２水溶液がアルカリ塩溶液を含有し、このアルカリ塩溶液は、上記溶菌試薬と 接触する際に試料における上記溶菌試薬の化学作用を効率的かつ迅速に低減させ 、溶菌した試料を約６〜約７．５の範囲のｐＨ及び約３００〜約３３０ｍ０ｓの 範囲のオスモル濃度に安定化させることにより生の生理学的環境を保存して、白 血球画分の分析を生又は生に近い条件下で可能にする ことを特徴する全血試料を２種の画分に分配する化学処理用溶菌試薬系。
2. ２．上記溶菌試薬が次式、 Ｒ−ＣＯＯＨ （式中のＲはＨ；１〜３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基；１〜３個の炭 素原子を有するカルボニル置換脂肪族炭化水素基；１〜３個の炭素原子を有する 水酸基置換脂肪族炭化水素基；又は１〜３個の炭素原子及び複数のカルボニル及 び／又は水酸基置換基を有する脂肪族炭化水素基を示す。）で表されることを特 徴とする請求項１記載の溶菌試薬系。
3. ３．上記溶菌試薬が、ギ酸；酢酸；クエン酸；コハク酸；乳酸；又はこれらの混 合物から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項１又は２記載の溶菌試薬系 。
4. ４．上記第１水溶液の溶菌試薬の上記濃度が、約０．０１〜約１．０％（ｖ／ｖ ）の範囲にあることを特徴とする請求項１又は２記載の溶菌試薬系。
5. ５．上記第１水溶液の溶菌試薬の上記濃度が、約０．０５〜約０．５％（ｖ／ｖ ）の範囲にあることを特徴とする請求項１又は２記載の溶菌試薬系。
6. ６．更に、上記第１水溶液が、サポニンを含み約０．０５〜約０．２０％（ｗ／ ｖ）の範囲の赤血球ストロマ清澄化有効量で存在する付加的活性成分を含有する ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つの項に記載の溶菌試薬系。
7. ７．上記溶菌試薬が、次式 Ｒ−ＳＯ３Ｈ （式中のＲは、水酸基，１〜３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基又はアリ ール基を示す。）で表されることを特徴とする請求項１記載の溶菌試薬系。
8. ８．上記溶菌試薬が、硫酸；メタンスルホン酸；エタンスルホン酸；ベンゼンス ルホン酸；ｐ−トルエンスルホン酸；ｍ−ニトロベンゼンスルホン酸；及びこれ らの混合物から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項７記載の溶菌試薬系 。
9. ９．上記溶菌試薬が、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲは、ハロゲン原子，シアノ基，ニトロ基の如き電子吸引基又はこれら 電子吸引基の任意の組合せ、ｎは１〜３を示す。）で表されることを特徴とする 請求項１記載の溶菌試薬系。
10. １０．上記溶菌試薬が、ｐ−ニトロフェノール；ｍ−ニトロフェノール；ｏ−ニ トロフェノール；２，４−ジニトロフェノール；ｐ−クロロフェノール；ｐ−シ アノフェノール；１−クロロ−２，４−ジニトロフェノール及びこれらの混合物 から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項９記載の溶菌試薬系。
11. １１．全血試料を、ほぼ無損傷の白血球画分と溶菌した赤血球画分の２種別々の 画分に分配するに当たり、（ａ）次の第１及び第２水溶液を有する溶菌試薬系を 供給し、 （ｉ）第１水溶液が希釈剤並びに水性媒体中に少なくとも部分的に解離して遊離 プロトン及び対イオンを発生する水溶性化合物を含有し、上記第１水溶液が分化 有効量の上記溶菌試薬を含有し、 上記分化有効量の上記化合物が、全血試料に添加した場合に：（ｉ）試料のｐＨ を生理学的水準から約２．６〜約４．０の範囲のｐＨに低減し、この間試料のオ スモル濃度を約１００ｍ０ｓ以下に維持し；（ｉｉ）赤血球画分の溶血を迅速か つ実費的に完了し；及び（ｉｉｉ）白血球画分に微妙な変化を生じさせて、分化 分析を行うための計装及び白血球の少なくとも５種（５）の副集団の同定の能力 を向上し、上記微妙な変化を、上記白血球画分をほぼ生の生理学的及び／又は免 疫化学的状態に保存する間に生じさせ；及び（ｉｉ）第２水溶液は抑制剤のアル カリ塩溶液から実質的に成り、このアルカリ塩溶液は、溶菌試薬と接触する際に 試料における上記溶菌試薬の化学作用を効率的かつ迅速に低減させ、溶菌した試 料を約６〜約７．５の範囲のｐＨ及び約３００〜約３３０ｍ０ｓの範囲のオスモ ル濃度に安定化させることにより生の生理学的環境を保存して、白血球画分の分 析を生又は生に近い条件下で可能にし、 （ｂ）上記全血試料を上記分化有効量の上記溶菌試薬系と接触させ、 （ｃ）上記溶菌試薬及び上記試料が、約１８〜２８℃の範囲の温度にて１０秒を 越えない時間で相互作用するのを可能にし、 （ｄ）試料の上記白血球画分における上記溶菌試薬の相互作用を、抑制剤を添加 することにより低減させ、上記抑制剤を、溶菌剤の溶菌活性を本質的に迅速に低 減させ試料中の上記白血球画分の生理学的環境を保存するに十分な濃度で存在さ せる ことを特徴とする全血試料の分配方法。
12. １２．請求項２記載の溶菌試薬系を使用することを特徴とする請求項１１記載の 方法。
13. １３．請求項７記載の溶菌試薬系を使用することを特徴とする請求項１１記載の 方法。
14. １４．請求項９記載の溶菌試薬系を使用することを特徴とする請求項１１記載の 方法。
15. １５．上記第１水溶液の溶菌試薬の上記濃度が、約０．０５〜約０．５％（ｖ／ ｖ）の範囲にあることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１つの項に記載 の方法。
16. １６．上記第１水溶液が、サポニンを含み約０．０５〜約０．２０％（ｗ／ｖ） の範囲の赤血球ストロマ清澄化有効量で存在する付加的活性成分を含有ことを特 徴とする請求項１１〜１５のいずれか１つの項に記載の方法。
17. １７．水性媒体に少なくとも部分的に解離して遊離プロトン及び対イオンを発生 する溶菌試薬を含む第１水溶液を含有し、全血試料をほぼ無損傷の白血球画分と 溶菌した赤血球画分の２種の画分に分配するための試験キットにおいて、 上記試験キットは２種別々の相補的溶液を有し、上記第１水溶液は分化有効量で 存在する場合に上記全血試料の上記赤血球画分を選択的に溶菌するに効果的であ り、上記第２相補的溶液は、適当量で存在する場合に試料での上記溶菌試薬の溶 菌活性を低減させるに効果的であり上記溶菌試案に特異的な抑制剤を含有し、上 記分化有効量の上記溶菌試案は、全血試料に添加した場合に：（ｉ）試料のｐＨ を生理学的水準から約２．６〜約４．０の範囲のｐＨに低減し、この間試料のオ スモル濃度を約１００ｍ０ｓ以下に維持し；（ｉｉ）上記赤血球画分の溶血を迅 速かつ実質的に完了し；（ｉｉｉ）上記白血球画分に微妙な変化を生じさせて、 分化分析を行うための計装及び白血球の少なくとも５種（５）の副集団の同定の 能力を向上し、上記微妙な変化を、上記白血球画分をほぼ生の生理学的及び／又 は免疫化学的状態に保存する間に生じさせ、 抑制剤は、試料に添加した場合に上記溶菌試薬の溶菌活性を迅速に低減させ、こ の間落菌した試料を約６〜約７．５の範囲のｐＨ及び約３００〜約３３０ｍ０ｓ の範囲のオスモル濃度に安定化するに効果的なアルカリ塩水溶液から実質的に成 る ことを特徴とする全血試料を２種の画分に分配するための試験キット。
18. １８．上記溶菌試薬が、次式 Ｒ−ＣＯＯＨ （式中のＲは、Ｈ；１〜３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基；１〜３個の 炭素原子を有するカルボニル置換脂肪族炭化水素基；１〜３個の炭素原子を有す る水酸基置換脂肪族炭化水素基；又は１〜３個の炭素原子及び複数のカルボニル 及び／又は水酸基置換基を有する脂肪族炭化水素基を示す。）で表されることを 特徴とする請求項１７記載の試験キット。
19. １９．上記溶菌試薬が、ギ酸；酢酸；クエン酸；コハク酸；乳酸；又はこれらの 混合物から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項１７又は１８記載の試験 キット。
20. ２０．上記第１水溶液の溶菌試薬の上記濃度が、約０．０１〜約１．０％（ｖ／ ｖ）の範囲にあることを特徴とする請求項１７又は１８記載の試験キット。
21. ２１．上記第１水溶液の溶菌試薬の上記濃度が、約０．０５〜約０．５％（ｖ／ ｖ）の範囲にあることを特徴とする請求項１７又は１８記載の試験キット。
22. ２２．更に、上記第１水溶液が、サポニンを含み約０．０５〜約０．２０％（ｖ ／ｖ）の範囲の赤血球ストロマ清澄化有効量で存在する付加的活性成分を含有す ることを特徴とする請求項１７〜２１のいずれか１つの項に記載の試験キット。
23. ２３．上記溶菌試薬が、次式 Ｒ−ＳＯ３Ｈ （式中のＲは、水酸基，１〜３個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基又はアリ ール基を示す。）で表されることを特徴とする請求項１７記載の試験キット。
24. ２４．上記溶菌試薬が、硫酸；メタンスルホン酸；エタンスルホン酸；ベンゼン スルホン酸；ｐ−トルエンスルホン酸；ｍ−ニトロベンゼンスルホン酸；及びこ れらの混合物から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項２３記載の試験キ ット。
25. ２５．上記溶菌試薬が、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲは、ハロゲン原子，シアノ基，ニトロ基の如き電子吸引基又はこれら 電子吸引基の任意の組合せ；及びｎは１〜３を示す。）で表されることを特徴と する請求項１７記載の試験キット。
26. ２６．上記溶菌試薬が、ｐ−ニトロフェノール；ｍ−ニトロフェノール；ｏ−ニ トロフェノール；２，４−ジニトロフェノール；ｐ−クロロフェノール；ｐ−シ アノフェノール；１−クロロ−２，４−ジニトロフェノール；及びこれらの混合 物から成る群から選ばれたことを特徴とする請求項２５記載の試験キット。