CN113584118A - 一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法 - Google Patents

一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药敏检测技术领域，特别涉及一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法。该方法包括：将血液阳性样本与表面活性剂溶液混合，离心后弃去上清；清洗后得到沉淀的菌体；配制菌悬液；将菌悬液加至药敏芯片靶板上，使药敏芯片靶板上每个点样位置上菌体的数量低于质谱检测阈值，然后进行孵育，孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质的进行质谱检测；根据质谱检测结果进行药敏结果判读，确定敏感、中介、耐药信息。本发明可对经过预处理的临床报阳血瓶直接进行药敏试验，无需再次转接纯化等操作，与现有方法相比，不仅可以节约时间，同时操作相对简单快速，无需很高的动手能力，对人员的专业程度要求较低。

Description

一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法
技术领域
本发明涉及药敏检测技术领域，特别涉及一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法。
背景技术
近年来菌血症或真菌血症的发病率持续增加，在各种感染中居首位，且死亡率高(20％-50％)，危害严重，有文献报道，血流感染病原菌鉴定报告时间每延迟1h，患者存活率降低7.6％。临床医师做到对血流感染快速诊断和及时用药是提高存活率的关键因素。血培养是诊断血流感染的主要手段。血培养是采集患者血液标本并接种到培养瓶中，经过24h-5d的培养进行增菌，用以发现、识别引起菌血症或真菌血症的病原微生物，该方法是诊断菌血症和真菌血症的主要方法。血培养结果对感染性疾病的诊断、治疗和预后都有极为重要的临床意义。
目前血培养阳性标本检测的主要步骤是先用一次性无菌注射器抽取培养液至血平板、巧克力平板进行转接培养，同时进行革兰染色镜检，根据染色反应及菌株形态特征，将染色结果作危急值报告；转接培养好的平板挑取菌落做革兰染色，根据染色结果选择鉴定步骤及药敏试验，出鉴定及药敏结果后对临床发最终报告。按照常规步骤，获取血培养阳性标本鉴定结果最快需要18-48h，获得药敏结果最快需要20-48h。
目前常用的微生物检测方法为形态学特征、生理生化反应、血清学反应和测序，形态学和生化是目前临床上最常用的方法，形态学法是根据微生物在固/液体培养基上的生长状态及染色反应、显微镜下观察结果来初步进行物种鉴定，该方法成本较低、检测速度相对较快，但对操作者的专业要求较高，且大部分微生物形态无明显种特异性，很容易出现误判，鉴定种类有限。生理生化反应法流程比较繁琐，需要先判断是革兰氏阳性菌还是阴性菌，然后再根据形态、酶反应、显色等不同方法，将具体微生物种类鉴定出来。血清学反应是利用已知菌种的抗血清，观察与待鉴定菌是否发生特异性的血清学反应来鉴定其种类，该技术检测速度较快，但该方法只是其他鉴定方法的一个补充手段，且操作繁琐，对操作人员要求较高，且血清检测需要购买专用的试剂盒，成本较高，技术受限程度较大，而能通过血清学检测的临床菌种一般只有大概确定菌种名称之后才能进行血清学检验，常见的有沙门氏菌、志贺菌等，适用的菌种较少。测序技术是从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，不依赖菌种本身特点，对所有菌种均可使用，鉴定准确率高，是目前微生物鉴定技术的金标准。但由于测序技术检测成本高，耗时长，现阶段难以在临床大规模推广，临床仍以传统微生物检测方法(形态/生化)为主。随着感染微生物的复杂程度不同，传统微生物检测时间长到几天，短到几小时都有可能，且能鉴定出来的种类有限，准确度一般。相比传统方法而言，MALDI-TOF MS质谱仪具有鉴定速度快、准确和低成本等绝对优势，已经成为临床微生物检验领域最富有生命力的新技术之一。
目前国内外学者也有尝试将质谱技术应用于临床样本的直接检测，并取得了显著的进展，针对不同标本各专家有不一样的前处理技术，离心、过滤、表面活性剂等，且通过质谱对临床样本进行直接检测这一技术正逐步获得临床和微生物实验室的认可，这大大缩短了临床报告的时间。
但是，在医学领域不仅需要快速鉴定，还需要检测出对常用抗生素的耐药性。由于近年来抗生素的滥用，导致耐药菌的大量增加，临床在不知道其耐药性的情况下将无法有效控制并治疗疾病，因此，不仅有必要对血液或其他体液感染性微生物进行快速鉴定，还有必要快速确定其对不同抗生素的耐药性，这对临床的抗感染治疗具有非常重要的意义。
常规药敏检测的方法较多，主要有纸片扩散法、微量肉汤稀释法(金标准)、E-test法和全自动药敏仪法。(1)纸片扩散法，是将配制好的菌悬液均匀涂布在MH琼脂培养基上，室温干燥后，将含药纸片紧贴于培养基表面，孵育16-24h，根据测量的抑菌圈直径，然后按照CLSI标准判读，报告敏感(S)、中介(I)和耐药(R)；(2)微量肉汤稀释法，是一定浓度的抗菌药物与待测菌的培养液进行一系列的双倍稀释，恒温培养16-24h后，通过观察培养液中细菌生长现象来判断药物对待测菌的最低抑制浓度，及MIC值；(3)E-test法，是将配制好的菌悬液均匀涂布在MH琼脂培养基上，室温干燥后，将含药纸片紧贴于培养基表面，孵育16-24h，通过观察MH琼脂培养基上的细菌生长现象直接测定药物对待测菌的MIC值；(4)全自动微生物药敏检测系统，是一套微生物药敏检测的智能系统，其原理是微量肉汤稀释法，操作相对简单，只需配制一定麦氏单位的菌悬液，插到药敏卡上上机自动检测，10-24h左右查看耐药结果及MIC值。
前三种方法是CLSI上推荐的方法，其中微量肉汤稀释法被视为金标准，但其操作步骤比较繁琐，且耗时长达16-24小时，很难满足临床危重病人的检测需求。纸片扩散法对药敏纸片的质量、MH琼脂培养基上菌液的涂布、抑菌圈的测量等手工操作要求较高，因对人员依赖较大，导致检测结果准确性不好，且鉴定耗时长达16-24小时，很难满足临床危重病人的检测需求。全自动微生物药敏检测系统操作简便，上手较快，但其对药敏板卡的依赖性较大，目前市面上采用的药敏板卡种类比较单一，药物浓度梯度范围较窄，临床上根据需求可能还需要加测，也不利于耐药性的长期监测，耗时也较长，这些方法均不能及时的给患者做一个全面的药敏检测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法。该方法操作简单，可大大缩短了血液感染性微生物的鉴定和药敏检测时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法，包括以下步骤：
菌体富集：将血液阳性样本与表面活性剂溶液混合，离心后弃去上清；所得沉淀与清洗液混合并离心，弃去上清，得到沉淀的菌体；
药敏检测：配制菌悬液；将菌悬液加至药敏芯片靶板上，使药敏芯片靶板上每个点样位置上菌体的数量低于质谱检测阈值，然后进行孵育，孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质的进行质谱检测；根据质谱检测结果进行药敏结果判读，药敏芯片靶板上质谱检测出微生物的位置认为有微生物生长，而无法检测出微生物的点认为微生物生长被抑制，依据该信息得到MIC值，再依据CLSI、专家共识、EUCAST指南确定敏感、中介、耐药信息。
作为优选，药敏芯片靶板包括阳性药敏芯片靶板和阴性药敏芯片靶板，阳性药敏芯片靶板上包被有阳性菌适用的抗生素药物，阴性药敏芯片靶板上包被有阴性菌适用的抗生素药物；
药敏检测步骤之前还包括血液革兰氏染色步骤，根据革兰氏染色步骤确定菌为阳性菌或阴性菌；
药敏检测步骤包括：根据菌种不同选用不同的药敏芯片靶板：
当菌为阳性菌时，选择阳性菌药敏芯片靶板进行药敏检测；
当菌为阴性菌时，选择阴性菌药敏芯片靶板进行药敏检测。
作为优选，阳性药敏芯片靶板包括质谱检测常用的96孔平面靶板和包被在平面靶板上的抗生素，在96孔平面靶板上的96个孔位内分别添加的抗生素和主要浓度为：
孔位1-4：阿米卡星(AN)：4，16，32，64
孔位5-9：庆大霉素(GM)：1，2，4，8，16
孔位10-16：左氧氟沙星(LEV)：0.125，0.25，0.5，1，2，4，8
孔位17-19：氨曲南(ATM)：4，8，16
孔位20-25：亚胺培南(IPM)：0.5，1，2，4，8，16
孔位26-31：美罗培南(MEM)：0.25，0.5，1，2，4，8
孔位32-37：替加环素(TGC)：0.5，1，2，4，8，16
孔位38-41：头孢呋辛(CXM)：1，4，8，16
孔位42-47：头孢他啶(CAZ)：1，2，4，8，16，32
孔位48-54：头孢曲松(CRO)：1，2，4，8，16，32，64
孔位55-60：头孢吡肟(FEP)：1，2，4，8，16，32，
孔位61-64：头孢西丁(FOX)：8，16，32，64
孔位65-69：多粘菌素B(PB)：0.5，1，2，4，8
孔位70-73：米诺环素(MI)：2，4，8，16
孔位74-76：氨苄西林/舒巴坦(SAM)：8/4，16/8，32/16
孔位77-81：复方新诺明(SXT)：1/19，2/38，4/76，8/152，16/304
孔位82-85：头孢他啶/阿维巴坦(CZA)：0.5/4，8/4，16/4，32/4
孔位86-91：哌拉西林/他唑巴坦(TZP)：4/4，8/4，16/4，32/4，64/4，128/4
孔95：阴性对照
孔96：阳性对照。
作为优选，阴性药敏芯片靶板包括质谱检测常用的96孔平面靶板和包被在平面靶板上的抗生素，在96孔平面靶板上的96个孔位内分别添加的抗生素和主要浓度为：
孔位1-4：环丙沙星(CIP)：0.5，1，2，4，
孔位5-8：替加环素(TGC)：0.12，0.25，0.5，1
孔位9-12：氨苄西林(AM)：2，3，8，16
孔位13-16：利福平(RA)：0.5，1，2，4，
孔位17-20：头孢西丁(FOX)：2，4，8，16，
孔位21-24：利奈唑胺(LNZ)：1，2，4，8
孔位25-29：克林霉素(CC)：0.25，0.5，1，2，4
孔位30-34：庆大霉素(GM)：1，2，4，8，16
孔位35-40：红霉素(E)：0.25，0.5，1，2，4，8
孔位41-46：米诺环素(MI)：0.5，1，2，4，8，16
孔位47-50：复方新诺明(SXT)：0.5/9.5，1/19，2/38，4/76
孔位51-56：苯唑西林(OXA)：0.25，0.5，1，2，4，8
孔位57-62：替考拉宁(TEC)：1，2，4，8，16，32
孔位63-67：莫西沙星(MXF)：0.125，0.25，0.5，1，2
孔位68-75：青霉素(P)：0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16
孔位76-80：左氧氟沙星(LEV)：0.5，1，2，4，8
孔位81-88：万古霉素(VA)：0.25，0.5，1，2，4，8，16，32
孔95：阴性对照
孔96：阳性对照。
作为优选，在药敏检测之前还包括菌种检测步骤，菌种检测包括：取部分菌体富集步骤获得的菌体进行菌种鉴定，得出菌名。
优选地，选用质谱仪进行菌种鉴定。
作为优选，药敏检测步骤中，菌悬液的制备包括：
当菌为A类菌时，采用稀释液将其稀释配制成0.5麦氏浊度的菌悬液后使用微生物液体培养基稀释100-200倍；其中，A类菌为肠杆菌科；
当菌为B类菌或C类菌时，用稀释液将其稀释配制成0.5麦氏浊度的菌悬液后使用微生物液体培养基稀释倍数为A类菌的0.5倍；其中，B类菌为葡萄球菌属、肠球菌属；C类菌为单胞菌属、不动杆菌属；
优选地，稀释液为生理盐水；
优选地，微生物液体培养基为MH液体培养基或BHI液体培养基。
作为优选，药敏芯片靶板包括阳性药敏芯片靶板和阴性药敏芯片靶板，阳性药敏芯片靶板上包被有阳性菌适用的抗生素药物，阴性药敏芯片靶板上包被有阴性菌适用的抗生素药物；
当菌为A或C类菌时，选择阴性菌药敏芯片靶板进行药敏检测；
当菌为B类菌时，选择阳性菌药敏芯片靶板进行药敏检测。
作为优选，在菌体富集步骤中，表面活性剂为皂苷，皂苷溶液的质量百分浓度为2.5％～8％；血液阳性样本与表面活性剂溶液的体积比为(0.1～0.5):1。
作为优选，菌体富集步骤具体包括：
将血液阳性样本与皂苷溶液混合，在2500～2700rpm条件下离心3～12min，弃去上清；所得沉淀与生理盐水混合，离心不低于1min，弃去上清；所得沉淀再与生理盐水混合，离心不低于1min，弃去上清，得到菌体。
作为优选，在菌体富集步骤中，
A类菌包括：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌；B类菌包括：金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌
C类菌包括：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌。
本发明提供了一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法。该方法包括以下步骤：①菌体富集：将血液阳性样本与表面活性剂溶液混合，离心后弃去上清；所得沉淀与清洗液混合并离心，弃去上清，得到沉淀的菌体；②药敏检测：配制菌悬液；将菌悬液加至药敏芯片靶板上，使药敏芯片靶板上每个点样位置上菌体的数量低于质谱检测阈值，然后进行孵育，孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质的进行质谱检测；根据质谱检测结果进行药敏结果判读，药敏芯片靶板上质谱检测出微生物的位置认为有微生物生长，而无法检测出微生物的点认为微生物生长被抑制，依据该信息得到MIC值，再依据CLSI、专家共识、EUCAST指南确定敏感、中介、耐药信息。本发明具有的技术效果为：
本发明可对经过预处理的临床报阳血瓶直接进行药敏试验，无需再次转接纯化等操作，与现有方法相比，不仅可以节约时间(至少节约24h)，同时操作相对简单快速，无需很高的动手能力，对人员的专业程度要求较低。节约的宝贵时间为临床医生合理精确用药，减少耐药菌的出现，挽救病人的生命争取最大的可能。
本发明与现有的质谱检测耐药菌技术相比，本发明可以获得细菌对多种药物的MIC值，不依赖于任何耐药机制，抗菌药物种类和浓度梯度可根据需求选取，适用范围广，而不仅仅只是判断细菌是否耐药。
本发明基于质谱平台，鉴定结果与药敏结果可同步输出，能获得细菌蛋白指纹图谱图。
本发明的方法将不同种类、不同浓度的抗生素包被在质谱仪的样品靶上，并在质谱仪的样品靶空白点位点样待检物，从而实现一次鉴定，在鉴定出微生物的种类的同时鉴定出该微生物对各种抗生素的MIC值，整个鉴定过程操作流程简单，对操作人员的依赖较低，整个鉴定过程仅需2-5小时。为血流感染病特别是危重病人的临床治疗及选药用量具有重要的指导意义。
同时，由于质谱鉴定通用靶板上的点位直径仅2.5mm，面积较小，滴加菌悬液和抗生素溶液时会导致液体过多，而样品点位过小，无法乘载过多的液体，轻微的晃动或转移会导致样品点的液体溢出，相邻的样品点交叉污染，导致试验失败；样本板为平面，滴加抗生素溶液后再滴加菌悬液后无法吹打混匀，体积比较大且混匀不彻底，菌体无法与抗生素溶液充分接触，结果可能出现假阳性(即药物实际抑菌，但因未充分接触而使菌生长)。本发明将抗生素包埋在药敏芯片上并干燥，在滴加菌悬液后，干燥后的抗生素可以溶解在菌悬液中，同时菌落沉淀至药敏芯片的点位表面，与抗生素充分接触，从而使点样简单方便，药敏检测准确性大大提高。
具体实施方式
本发明公开了一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
MALDI-TOF MS作为一种新兴的软电离质谱技术，主要是通过采集未知微生物的蛋白质指纹图谱并与已知数据库中的蛋白图谱进行比对，从而确定其分类学种属地位。
本发明将临床报阳的血瓶加入皂苷等表面活性剂后，进行离心，富集菌体，挑取部分菌体涂抹在一个空白样本板上，进行鉴定确定菌种后，选择合适的抗生素样本板，鉴定完成后可根据质谱鉴定结果选择其药敏所需的抗生素种类及所需配制的浓度范围，并将配制好的抗生素包埋于质谱仪样品靶板上，进行干燥，将富集到的菌体使用生理盐水重悬，并配制成一定浊度的菌悬液，使用肉汤进行稀释后，稀释后的浓度小于质谱检测阈值，将稀释后的菌悬液点在包被好抗生素的样本板上，进行孵育，孵育完成后弃肉汤，加微生物样本前处理试剂，干燥后即可利用MALDI TOF MS技术进行微生物耐药检测，生长点微生物蛋白达到了质谱检测阈值，可鉴定出来，为耐药，抑制生长点微生物蛋白低于质谱检测阈值，无鉴定结果，为敏感，从而得到微生物的药敏结果和准确的MIC值。
该发明直接省略了对血培养阳性标本进行转接培养待其长出单菌落的步骤，在此可为临床节约5-18h；本发明操作相对简单，最重要的是大大缩短了血液感染性微生物的鉴定和药敏检测时间，并能够快速准确的给出鉴定和药敏结果，给临床及时指导合理用药提供一定的参考。
作为优选，微生物液体培养基为MH液体培养基或BHI液体培养基。
优选地，微生物液体培养基为MH液体培养基。
在本发明中，药敏芯片靶板上的抗生素选自但不限于阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、替加环素、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢西丁、多粘菌素B、米诺环素、氨苄西林舒巴坦、复方新诺明、头孢他啶阿维巴坦、哌拉西林他唑巴坦、头孢哌酮舒巴坦、环丙沙星、替加环素、氨苄西林、利福平、头孢西丁、利奈唑胺、克林霉素、庆大霉素、红霉素、米诺环素、孔复方新诺明、苯唑西林、替考拉宁、莫西沙星、青霉素、左氧氟沙星、万古霉素。
本发明提供了一种血流感染中微生物的快速鉴定和快速药敏试验方法，使用本方法可以在血培养瓶报阳后，经过快速的预处理分离出纯形式的微生物，得到的菌体使用生理盐水重悬，并制备成一定浊度的菌悬液，使用肉汤进行稀释后，点在包被了不同种类和浓度的抗生素的板上，孵育一段时间后，使用质谱进行检测，利用质谱可通过检测微生物核糖体蛋白进行鉴定的原理，生长点有微生物蛋白，可鉴定出来，抑制生长点不能被检测出菌体蛋白，无鉴定结果，从而得到微生物的药敏结果和准确的MIC值。
本发明可突破血培养阳性标本必须再转接固体培养基培养后才能进行药敏检测的固有模式，同时也可突破细菌/真菌培养时间长的瓶颈，检测时间短，操作步骤简单，可以得出准确的MIC值，为临床及时快速用药提供一定的参考，为临床病情危重的血流感染患者争取了宝贵的治疗时间。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本发明提供的一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法，主要包括以下步骤：
(1)菌体富集
从报阳血瓶中抽取血液样本加入表面活性剂混匀；然后采用不同的离心速度进行多次离心，每次离心后吸弃上清并加生理盐水继续离心，直至离心完成。该处表面活性剂的作用是将破碎血细胞菌体富集，表面活性剂可以采用2.5％-8％的皂苷。具体操作为：
第一，从报阳血瓶中抽取1mL血液至1.5mL EP管中；按0.2:1(即单位体积的血液样品中添加0.2单位体积的皂苷溶液)比例加入4％皂苷溶液，混匀；
第二，将离心管2600rpm离心5min，弃去上清。加1mL生理盐水，吹打混匀；13000rmp离心2min，弃去上清；所得沉淀再与生理盐水混合，在13000rpm条件下离心2min，弃去上清，得到沉淀在离心管底部的菌体。
(2)药敏检测
首先，配制菌悬液，使药敏芯片靶板上每个点样位置上菌体的数量低于质谱检测阈值，即此时稀释后的菌体按照正常质谱点样的溶液体积滴加到靶板后，菌体的数量是低于质谱检测阈值的，其直接进行质谱检测时会因菌体数量过少而不能检测到菌。具体操作为：将富集得到的菌体使用生理盐水配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，再使用MH液体培养基(又称MH营养肉汤)稀释100倍。
其次，制备药敏芯片靶板，包括：①抗生素选择：根据临床不同标本如血标本、尿标本、灌洗液标本、痰标本等中的阴性菌、阳性菌、真菌的不同，以及不同药物的抗菌谱不同，选择合适的抗生素，选择阿米卡星(AN)、庆大霉素(GM)、左氧氟沙星(LEV)、氨曲南(ATM)、亚胺培南、美罗培南、替加环素、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢西丁、多粘菌素B、米诺环素、氨苄西林舒巴坦、复方新诺明、头孢他啶阿维巴坦、哌拉西林他唑巴坦、头孢哌酮舒巴坦作为阳性药敏板使用的药物；选择环丙沙星、替加环素、氨苄西林、利福平、头孢西丁、利奈唑胺、克林霉素、庆大霉素、红霉素、米诺环素、孔复方新诺明、苯唑西林、替考拉宁、莫西沙星、青霉素、左氧氟沙星、万古霉素作为阴性药敏板的药物。
②抗生素溶液制备：将抗生素加入溶剂内，配制成不同浓度的抗生素溶液具体为上述阴性药敏版和阳性药敏板上各孔位的浓度，各孔位之间的顺序可互换；具体操作为依据抗生素种类不同，选择不同的溶剂例如水、DMSO、乙醇溶液、丙磺酸溶液、乙磺酸溶液等，并依据抗生素性质调至合适的PH值；在制备抗生素溶液的时候还要添加抗生素保护剂，从而保护抗生素，避免其在保质期内失效；抗生素保护剂可以采用有机硅表面活性剂、西司他丁钠等。
③抗生素包被：采用包被机或移液枪将配制好的抗生素溶液包被在芯片上，该芯片可以为金属板、硅板、塑料板、纸板等，本实施例优选芯片为质谱鉴定使用的靶板。然后根据抗生素的特性选择合适的干燥方法进行干燥，干燥方式例如(1)加热鼓风干燥；(2)低温真空干燥；(3)低温吸附干燥；(4)常温低湿度干燥等，对一些光敏的抗生素或高温易降解的抗生素，应进行避光处理，或选择低温干燥方式，干燥时间为2-48h。
④保存：干燥后的芯片装入包装盒，真空避光处理，备用。
再次，滴加菌悬液，孵育后检测
将菌悬液加至药敏芯片靶板上，菌悬液的滴加体积与药敏芯片靶板上的抗生素标注体积相同，该菌悬液的体积优选3μl，然后置于37℃恒温，99.9％相对湿度的环境中孵育4小时，孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质并按照质谱检测前处理方法进行处理，并上质谱仪检测。具体操作为：孵育完成后，使用吸弃装置弃去药敏芯片上多余的培养基，由于菌体生长过程中会沉淀至药敏芯片底部，在吸弃培养基的时候注意只吸弃药敏芯片上方的液体，不会将菌体带离，吸弃培养基后对药敏芯片及其上方的菌体和参与培养基进行干燥，干燥后，滴加预处理试剂，待预处理试剂干燥后用质谱仪进行检测。本步骤中吸弃多余的液体营养基是为了避免营养基直接干燥后其内部的大量营养成分影响质谱鉴定结果，将肉汤大部分吸弃后，残余在药敏芯片表面的微量肉汤中含有的营养成分较少，不会影响质谱鉴定结果的准确性。
最后，根据质谱检测结果进行药敏结果判读，药敏芯片靶板上质谱鉴定出微生物的点样位置判定耐药(即菌对该点样位置上的相应浓度的抗生素不敏感，耐药而继续生长，其数量增加了，所以可以被质谱仪检测出菌)，药敏芯片靶板上质谱检测出微生物的位置认为有微生物生长，而无法检测出微生物的位置认为微生物生长被抑制，其数量维持原有数量或增长极慢，难以在固定的孵育时间内数量达到质谱检测阈值(质谱检测阈值为104-106CFU/ml)，所以质谱仪检测不出菌。依据该信息得到MIC值，再依据CLSI、专家共识、EUCAST等指南确定敏感、中介、耐药信息。
本实施例中采用菌体富集方法，快速富集阳性血瓶中的菌体，将菌体配置菌悬液滴加至药敏芯片靶板上，进行孵育检测，利用质谱仪的检测灵敏度高的优点，对于菌体生长情况进行检测，从而大大降低了药敏检测时间，为临床危重病人的临床用药提供精确指导。
实施例2
本发明提供的一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法，主要包括以下步骤：
(1)菌体富集
从报阳血瓶中抽取血液样本加入表面活性剂混匀；然后采用不同的离心速度进行多次离心，每次离心后吸弃上清并加生理盐水继续离心，直至离心完成。该处表面活性剂的作用是将破碎血细胞菌体富集，表面活性剂可以采用2.5％-8％的皂苷。具体操作为：
第一，从报阳血瓶中抽取1mL血液至1.5mL EP管中；按0.2:1(即单位体积的血液样品中添加0.2单位体积的皂苷溶液)比例加入4％皂苷溶液，混匀；
第二，将离心管2600rpm离心5min，弃去上清。加1mL生理盐水，吹打混匀；13000rmp离心2min，弃去上清；所得沉淀再与生理盐水混合，在13000rpm条件下离心2min，弃去上清，得到沉淀在离心管底部的菌体。
(2)革兰氏染色判断
将报阳血瓶中的血液样本进行革兰氏染色，判定菌为阳性菌或阴性菌。
(3)药敏检测
配制菌悬液：
具体操作为：将富集得到的菌体使用生理盐水配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，再使用MH液体培养基稀释100倍即可。
点样孵育检测：
在本实施例中，药敏芯片靶板包括阳性药敏芯片靶板和阴性药敏芯片靶板，阳性药敏芯片靶板上包被有阳性菌适用的抗生素药物，阳性药敏芯片靶板包括质谱检测常用的96孔平面靶板和包被在平面靶板上的抗生素药物，在96孔平面靶板上的96个孔位内分别添加的抗生素和主要浓度为：
孔位1-4：阿米卡星(AN)：4，16，32，64
孔位5-9：庆大霉素(GM)：1，2，4，8，16
孔位10-16：左氧氟沙星(LEV)：0.125，0.25，0.5，1，2，4，8
孔位17-19：氨曲南(ATM)：4，8，16
孔位20-25：亚胺培南：0.5，1，2，4，8，16
孔位26-31：美罗培南：0.25，0.5，1，2，4，8
孔位32-37：替加环素：0.5，1，2，4，8，16
孔位38-41：头孢呋辛：1，4，8，16
孔位42-47：头孢他啶：1，2，4，8，16，32
孔位48-54：头孢曲松：1，2，4，8，16，32，64
孔位55-60：头孢吡肟：1，2，4，8，16，32，
孔位61-64：头孢西丁：8，16，32，64
孔位65-69：多粘菌素B：0.5，1，2，4，8
孔位70-73：米诺环素：2，4，8，16
孔位74-76：氨苄西林/舒巴坦：8/4，16/8，32/16
孔位77-81：复方新诺明：1/19，2/38，4/76，8/152，16/304
孔位82-85：头孢他啶/阿维巴坦：0.5/4，8/4，16/4，32/4
孔位86-91：哌拉西林/他唑巴坦：4/4，8/4，16/4，32/4，64/4，128/4。
阴性药敏芯片靶板上包被有阴性菌适用的抗生素药物；阴性药敏芯片靶板包括质谱检测常用的96孔平面靶板和包被在平面靶板上的抗生素，在96孔平面靶板上的96个孔位内分别添加的抗生素和主要浓度为：
孔位1-4：环丙沙星：0.5，1，2，4，
孔位5-8：替加环素：0.12，0.25，0.5，1
孔位9-12：氨苄西林：2，3，8，16
孔位13-16：利福平：0.5，1，2，4，
孔位17-20：头孢西丁：2，4，8，16，
孔位21-24：利奈唑胺：1，2，4，8
孔位25-29：克林霉素：0.25，0.5，1，2，4
孔位30-34：庆大霉素：1，2，4，8，16
孔位35-40：红霉素：0.25，0.5，1，2，4，8
孔位41-46：米诺环素：0.5，1，2，4，8，16
孔位47-50：复方新诺明：0.5/9.5，1/19，2/38，4/76
孔位51-56：苯唑西林：0.25，0.5，1，2，4，8
孔位57-62：替考拉宁：1，2，4，8，16，32
孔位63-67：莫西沙星：0.125，0.25，0.5，1，2
孔位68-75：青霉素：0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16
孔位76-80：左氧氟沙星：0.5，1，2，4，8
孔位81-88：万古霉素：0.25，0.5，1，2，4，8，16，32。
根据革兰氏染色判定的结果，选择合适的药敏芯片靶板(具体为阳性菌悬液滴加至阳性药敏芯片靶板，阴性菌悬液滴加至阴性药敏芯片靶板)，将菌悬液加至药敏芯片靶板上，菌悬液的滴加体积与药敏芯片靶板上的抗生素标注体积相同，该菌悬液的体积优选3μl，然后置于37℃恒温，99.9％相对湿度的环境中孵育4小时，孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质的进行质谱检测。
根据质谱检测结果进行药敏结果判读，本实施例中的药敏结果判读与实施例1相同，在此不再赘述。
本实施例中通过添加革兰氏染色步骤，快速判定菌为阳性菌或阴性菌，从而便于针对性的选择药敏芯片靶板，避免浪费抗生素药敏芯片靶板。
实施例3
本发明提供的一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法，主要包括以下步骤：
(1)菌体富集
从报阳血瓶中抽取血液样本加入表面活性剂混匀；然后采用不同的离心速度进行多次离心，每次离心后吸弃上清并加生理盐水继续离心，直至离心完成。该处表面活性剂的作用是将破碎血细胞菌体富集，表面活性剂可以采用2.5％-8％的皂苷。具体操作为：
第一，从报阳血瓶中抽取1mL血液至1.5mL EP管中；按0.2:1(即单位体积的血液样品中添加0.2单位体积的皂苷溶液)比例加入6％皂苷溶液，混匀；
第二，将离心管2600rpm离心5min，弃去上清。加1mL生理盐水，吹打混匀；13000rmp离心2min，弃去上清；所得沉淀再与生理盐水混合，在13000rpm条件下离心2min，弃去上清，得到沉淀在离心管底部的菌体。
(2)菌种检测
具体为取富集得到的菌涂抹于样本板上，加入预处理试剂，干燥，上质谱进行鉴定，确定菌名；此时的菌体中含有微量的杂质，且无菌体的形态，不能进行形态学观察确定菌名，质谱鉴定对菌的形态无要求，少量杂质与菌的蛋白分子不在一个分子量水平，也不会影响质谱鉴定，因此采用质谱可以快速鉴定菌名，节约了常规的培养纯化时间。整个菌种鉴定过程仅需十分钟左右即可完成。
(3)药敏检测
配制菌悬液：
根据检测结果，将菌分为A类菌、B类菌、C类菌；其中，A类菌为肠杆菌科；B类菌为葡萄球菌属、肠球菌属；C类菌为单胞菌属、不动杆菌属。
当菌为A类菌时，采用生理盐水将其稀释配制成0.5麦氏浊度的菌悬液后使用MH液体培养基稀释200倍备用。
当菌为B类菌或C类菌时，用生理盐水将其稀释配制成0.5麦氏浊度的菌悬液后使用MH液体培养基稀释100倍备用。
点样孵育检测：
在本实施例中，药敏芯片靶板包括阳性药敏芯片靶板和阴性药敏芯片靶板，阴性药敏芯片靶板信息和阳性药敏芯片靶板与实施例2中相同，在此不再赘述。
根据菌种检测的结果，当菌为A或C类菌时，选择阴性菌药敏芯片靶板进行药敏检测；当菌为B类菌时，选择阳性菌药敏芯片靶板进行药敏检测，具体为：将菌悬液加至药敏芯片靶板上，菌悬液的滴加体积与药敏芯片靶板上的抗生素标注体积相同，该菌悬液的体积优选3μl，然后置于37℃恒温，99.9％相对湿度的环境中孵育，当菌为A类菌时，孵育3小时，当菌为B或C类菌时，孵育4小时。在本实施例中，A类菌包括：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌；所述B类菌包括：人葡萄球菌、头状葡萄球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌；所述C类菌包括：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌。
由于B类菌和C类菌的生长周期均慢于A类菌，而质谱仪可检测的蛋白灵敏度(即质谱检测阈值、菌体密度)是基本相同的，因此需要降低B类菌和C类菌的稀释倍数，使其密度与A类菌相当，从而减少温育时间。
孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质的进行质谱检测。
根据质谱检测结果进行药敏结果判读，根据质谱检测结果进行药敏结果判读，本实施例中的药敏结果判读与实施例1相同，在此不再赘述。
本实施例中通过添加菌种检测步骤，快速判定菌名，从而根据菌的形态以及生长习性，选择合适的稀释倍数，以尽可能缩短孵育时间，进而缩短药敏检测时间，且便于针对性的选择药敏芯片靶板，避免浪费抗生素药敏芯片靶板。
本发明中所有实施例均采用郑州安图实验仪器有限公司生产的Autofms1000质谱仪进行质谱鉴定。
试验例1皂苷浓度考察
取临床报阳血瓶10份，序号分别为1、2、3、……10；每份血瓶中的血取出6mL均分，装入编号为A、B、C、D、E、F的EP管中，分别加入0.2mL浓度为1.5％、2.5％、3.5％、5％、6％、7％的皂苷溶液并混匀，皂苷采用sigma公司的10-25％纯度的产品。然后将上述样品分别2600rpm离心5min，弃去上清，加1mL生理盐水，吹打混匀；13000rmp离心2min，弃去上清；重复该操作一次，得到沉淀在离心管底部的菌体。将得到的菌体分别进行质谱前处理后利用飞行时间质谱仪进行菌种检测，检测结果如下：
表1
Figure BDA0003179610750000161
Figure BDA0003179610750000171
备注：鉴定得分说明：
[9.5，10.0]：种水平置信，可能的亚种；
[9.0，9.5)：种水平置信；
[6.0，9.0)：属水平置信；
[0.0，6.0)：不可置信。
本实验采用安图实验仪器(郑州)公司生产的型号Autofms 1000的质谱仪进行菌种检测。质谱鉴定得分代表鉴定准确性，得分越高，说明鉴定准确性越高，当鉴定得分低于某一阈值，该鉴定结果不可信。
由上述检测结果可知，皂苷浓度在2.5％-7％时，鉴定准确率最高，在浓度为1.5％、2.5％时，鉴定准确率较低，这是因为皂苷是一种表面活性剂，主要作用是裂解血细胞、白细胞、血小板等作用，当皂苷浓度较低时，加入的皂苷不足以裂解目标细胞，导致下一步离心得到的沉淀还含有部分杂质细胞，影响了鉴定准确率。
试验例2
使用另一表面活性剂SDS溶液代替皂苷进行菌体富集：
取临床报阳血瓶10份，序号分别为1、2、3、……10；每份血瓶中的血取出6mL均分，装入编号为A、B、C、D、E、F的EP管中，分别加入0.2mL浓度为5％、10％、15％、20％的SDS溶液并混匀。然后将上述样品分别2600rpm离心5min，弃去上清，加1mL生理盐水，吹打混匀；13000rmp离心2min，弃去上清；得到的沉淀中加1mL生理盐水，吹打混匀；13000rmp离心2min，弃去上清，得到沉淀在离心管底部的菌体。将得到的菌体分别进行质谱前处理后利用飞行时间质谱仪进行菌种检测，检测结果如下：
表2
Figure BDA0003179610750000181
试验例3
使用另一表面活性剂tritonX-100溶液代替皂苷进行菌体富集：
取临床报阳血瓶10份，序号分别为1、2、3、……10；每份血瓶中的血取出6mL均分，装入编号为A、B、C、D、E、F的EP管中，分别加入0.2mL浓度为0.1％、0.5％、1.0％、1.5％的triton X-100溶液并混匀。然后将上述样品分别2600rpm离心5min，弃去上清，加1mL生理盐水，吹打混匀；13000rmp离心2min，弃去上清；得到的沉淀中加1mL生理盐水，吹打混匀；13000rmp离心2min，弃去上清，得到沉淀在离心管底部的菌体。将得到的菌体分别进行质谱前处理后利用飞行时间质谱仪进行菌种检测，检测结果如下：
表3
Figure BDA0003179610750000191
由上述试验例1至3可知，表面活性剂中，2.5％-7％的皂苷溶液富集后的菌体质谱鉴定得分高于SDS溶液和triton X-100溶液富集后的菌体，这是因为2.5％-7％的皂苷溶液能更好的裂解血细胞，从而通过清洗离心使富集得到的菌体更纯净。
试验例4菌悬液稀释倍数与滴加体积考察
在实施例1皂苷浓度3.5％的基础上，以阴性菌中的大肠埃希菌为例，参考CLSIM100的常规药敏试验方法-肉汤稀释法，同时兼顾药敏芯片和质谱检测阈值。本发明选取临床报阳血瓶(n＝50)，使用生理盐水配制成0.5麦氏比浊度(约1.5×108CFU/mL)后采用MH肉汤分别稀释50倍、100倍、150倍、200倍和300倍这5个梯度。滴加体积设置1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL这10个梯度。37℃孵育4h。具体结果如下：
表4
Figure BDA0003179610750000201
结果判定方法：依据CLSI和M52等指南，每种菌的每种抗生素CA和EA大于90％，VME<3％；ME<3％认为符合要求。其中各参数的意义为：
(1)分类一致(Category agreement，CA)：评估方法和参考方法药敏结果依据折点判定的敏感、中介、剂量依赖型敏感和耐药一致。
(2)基本一致(Essential agreement，EA)评估方法测得细菌MIC与参考方法差异在1个对倍稀释度之内。
(3)小误差(minor error,mE)：参考方法和评估方法的药敏结果，一种为中介另一种为敏感或耐药。
(4)重大误差(major error,ME)：参考方法药敏结果为敏感，评估方法药敏结果为耐药。
(5)非常重大误差(verymajor error,VME)：参考方法药敏结果为耐药，评估方法药敏结果为敏感。
结果分析：本试验以单药物CA为评价指标，在84％-98％之间，其最低与最高的组合分别为：稀释倍数300倍+滴加体积10μL，稀释倍数150倍+滴加体积9μL。相同或优于目前的自动化药敏法和纸片法。
试验例5药物敏感性准确率
采用上述最优值，根据临床血流感染常见细菌，例如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌等6种细菌采用本发明进行药敏试验。具体结果如下：
表5阳性菌评价结果汇总
Figure BDA0003179610750000211
表6阴性菌药敏试验结果汇总
Figure BDA0003179610750000212
Figure BDA0003179610750000221
该准确评价方法与试验例4相同，在此不再赘述。
本发明对目前血流感染常见的6种病原菌药敏试验各抗生素准确率均在标准要求内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速检测血液中感染性微生物药敏的方法，其特征在于，包括以下步骤：
菌体富集：将血液阳性样本与表面活性剂溶液混合，离心后弃去上清；所得沉淀与清洗液混合并离心，弃去上清，得到沉淀的菌体；
药敏检测：配制菌悬液；将菌悬液加至药敏芯片靶板上，使药敏芯片靶板上每个点样位置上菌体的数量低于质谱检测阈值，然后进行孵育，孵育完成之后吸弃上部液体，对药敏芯片靶板上点样位置上的物质的进行质谱检测；根据质谱检测结果进行药敏结果判读，药敏芯片靶板上质谱检测出微生物的位置认为有微生物生长，而无法检测出微生物的点认为微生物生长被抑制，依据该信息得到MIC值，再依据CLSI、专家共识、EUCAST指南确定敏感、中介、耐药信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述药敏芯片靶板包括阳性药敏芯片靶板和阴性药敏芯片靶板，所述阳性药敏芯片靶板上包被有阳性菌适用的抗生素药物，所述阴性药敏芯片靶板上包被有阴性菌适用的抗生素药物；
所述药敏检测步骤之前还包括血液革兰氏染色步骤，根据所述革兰氏染色步骤确定菌为阳性菌或阴性菌；
所述药敏检测步骤包括：根据菌种不同选用不同的药敏芯片靶板：
当菌为阳性菌时，选择阳性菌药敏芯片靶板进行药敏检测；
当菌为阴性菌时，选择阴性菌药敏芯片靶板进行药敏检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阳性药敏芯片靶板包括96孔平面靶板和包被在平面靶板上的抗生素，在96孔平面靶板上的96个孔位内分别添加的抗生素和主要浓度为：
孔位1-4：阿米卡星(AN)：4，16，32，64
孔位5-9：庆大霉素(GM)：1，2，4，8，16
孔位10-16：左氧氟沙星(LEV)：0.125，0.25，0.5，1，2，4，8
孔位17-19：氨曲南(ATM)：4，8，16
孔位20-25：亚胺培南(IPM)：0.5，1，2，4，8，16
孔位26-31：美罗培南(MEM)：0.25，0.5，1，2，4，8
孔位32-37：替加环素(TGC)：0.5，1，2，4，8，16
孔位38-41：头孢呋辛(CXM)：1，4，8，16
孔位42-47：头孢他啶(CAZ)：1，2，4，8，16，32
孔位48-54：头孢曲松(CRO)：1，2，4，8，16，32，64
孔位55-60：头孢吡肟(FEP)：1，2，4，8，16，32，
孔位61-64：头孢西丁(FOX)：8，16，32，64
孔位65-69：多粘菌素B(PB)：0.5，1，2，4，8
孔位70-73：米诺环素(MI)：2，4，8，16
孔位74-76：氨苄西林/舒巴坦(SAM)：8/4，16/8，32/16
孔位77-81：复方新诺明(SXT)：1/19，2/38，4/76，8/152，16/304
孔位82-85：头孢他啶/阿维巴坦(CZA)：0.5/4，8/4，16/4，32/4
孔位86-91：哌拉西林/他唑巴坦(TZP)：4/4，8/4，16/4，32/4，64/4，128/4
孔95：阴性对照
孔96：阳性对照。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阴性药敏芯片靶板包括96孔平面靶板和包被在平面靶板上的抗生素，在96孔平面靶板上的96个孔位内分别添加的抗生素和主要浓度为：
孔位1-4：环丙沙星(CIP)：0.5，1，2，4，
孔位5-8：替加环素(TGC)：0.12，0.25，0.5，1
孔位9-12：氨苄西林(AM)：2，3，8，16
孔位13-16：利福平(RA)：0.5，1，2，4，
孔位17-20：头孢西丁(FOX)：2，4，8，16，
孔位21-24：利奈唑胺(LNZ)：1，2，4，8
孔位25-29：克林霉素(CC)：0.25，0.5，1，2，4
孔位30-34：庆大霉素(GM)：1，2，4，8，16
孔位35-40：红霉素(E)：0.25，0.5，1，2，4，8
孔位41-46：米诺环素(MI)：0.5，1，2，4，8，16
孔位47-50：复方新诺明(SXT)：0.5/9.5，1/19，2/38，4/76
孔位51-56：苯唑西林(OXA)：0.25，0.5，1，2，4，8
孔位57-62：替考拉宁(TEC)：1，2，4，8，16，32
孔位63-67：莫西沙星(MXF)：0.125，0.25，0.5，1，2
孔位68-75：青霉素(P)：0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16
孔位76-80：左氧氟沙星(LEV)：0.5，1，2，4，8
孔位81-88：万古霉素(VA)：0.25，0.5，1，2，4，8，16，32
孔95：阴性对照
孔96：阳性对照。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，在药敏检测之前还包括菌种检测步骤，所述菌种检测包括：取部分所述菌体富集步骤获得的菌体进行菌种鉴定，得出菌名。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述药敏检测步骤中，菌悬液的制备包括：
当菌为A类菌时，采用稀释液将其稀释配制成0.5麦氏浊度的菌悬液后使用微生物液体培养基稀释100-200倍；其中，A类菌为肠杆菌科；
当菌为B类菌或C类菌时，用稀释液将其稀释配制成0.5麦氏浊度的菌悬液后使用微生物液体培养基稀释倍数为A类菌的0.5倍；其中，B类菌为葡萄球菌属、肠球菌属；C类菌为单胞菌属、不动杆菌属。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述药敏芯片靶板包括阳性药敏芯片靶板和阴性药敏芯片靶板，所述阳性药敏芯片靶板上包被有阳性菌适用的抗生素药物，所述阴性药敏芯片靶板上包被有阴性菌适用的抗生素药物；
当菌为A或C类菌时，选择阴性菌药敏芯片靶板进行药敏检测；
当菌为B类菌时，选择阳性菌药敏芯片靶板进行药敏检测。
8.根据权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于，在菌体富集步骤中，表面活性剂为皂苷，皂苷溶液的质量百分浓度为2.5％～8％；血液阳性样本与表面活性剂溶液的体积比为(0.1～0.5):1。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，菌体富集步骤具体包括：
将血液阳性样本与皂苷溶液混合，在2500～2700rpm条件下离心3～12min，弃去上清；所得沉淀与生理盐水混合，离心不低于1min，弃去上清；所得沉淀再与生理盐水混合，离心不低于1min，弃去上清，得到菌体。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在菌体富集步骤中，
所述A类菌包括：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌；所述B类菌包括：金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌；
所述C类菌包括：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌。
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