KR20060064619A - 샘플 제조 방법 및 장치 - Google Patents

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KR20060064619A
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니콜라스 프리랜드 주드손
크리스티나 마리 루드진스키
라리타 파레메스와란
테오도레 페디니신
캐써린 카브레라
로라 티. 볼토린
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매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 발명은 유기규소-코팅된 물질을 포함하는, 생물학적, 환경학적 또는 화학적 샘플로부터 표적을 분리하고(하거나) 검출하기 위한 개선된 방법, 조성물, 및 장치를 제공한다.
표적, 기재, 검출, 오염, 기재-표적 복합체, 친화도 프로토콜, 친화도 자기 프로토콜

Description

샘플 제조 방법 및 장치 {Sample Preparation Methods and Devices}
관련 출원
본 출원은 2003년 8월 12일 출원된 미국 출원 제60/494,702호를 우선권으로 주장하며, 상기 미국 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국 국방부 내 연구 및 엔지니어링 국(Defense Directorate of Research and Engineering)으로부터의 링컨 협약(Lincoln Contract) 번호 제F19628-95-C-0002호에 의해 전부 또는 일부를 지원받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
배경기술
생물학, 화학 및 환경학 연구는 흔히 물질의 이종 집단으로부터 특정 표적을 분리할 것을 요구한다. 흔히, 특정 표적의 분리 및 그의 추가의 분석은 (a) 물질의 이종 출발 혼합물 내 표적의 매우 낮은 농도, (b) 표적을 분해하는 제제(agent)의 존재, (c) 표적의 단리를 방해하는 제제의 존재, 및 (d) 단리 후의 표적의 분석을 방해하는 제제의 존재를 비롯한 요인들에 의해 방해받는다. 가장 유리한 방법 및 조성물은 비-표적 물질의 이종 혼합물을 함유하는 다양한 액체 또는 고체 샘플로부터 저농도의 표적을 분리하는 것을 용이하게 한다. 이러한 방법 및 조성물을 더 변형하거나 또는 종래의 방법과 조합함으로써 표적의 무결성(integrity)을 유지 (예를 들어, 표적의 분해 또는 오염을 방지)하고(하거나) 표적의 추가의 분석을 방해하는 제제 (예, DNA 샘플의 PCR 분석을 방해하는 제제, 단백질 샘플의 질량 분광 분석을 방해하는 제제, 또는 세균 또는 바이러스의 세포학적 분석을 방해하는 제제)의 활성을 억제할 수 있다.
세포 생물학, 분자 생물학, 화학, 독성학 및 약리학을 비롯한 분야에서의 진보에 의해, DNA, RNA, 단백질, 세균 세포 및 포자 (그람 양성 및 그람 음성 포함), 바이러스 (DNA계 및 RNA계 포함), 소 유기 분자 및 거대 화학적 화합물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 생물학적 물질, 화학적 물질 및 환경학적 물질을 분석하는 다양한 기술이 개발되었다. 그러나, 샘플 내에 함유된 물질들의 이종 집단으로부터 해당 표적 물질을 분리하는 능력의 부재는 수많은 효과적인 분석 도구들을 효율적으로 적용하는데 있어서 방해가 된다. 본 발명은 환경학적, 생물학적 및 화학적 샘플들로부터 표적의 분리 및(또는) 확인을 용이하게 하는 방법, 조성물 및 기기를 제공한다.
개요
본 발명은 제제들의 이종 혼합물로부터 표적을 분리하고(하거나) 확인하는데 사용될 수 있는 방법, 조성물 및 기기를 제공한다. DNA, RNA, 단백질, 세균 세포 또는 포자, 바이러스, 소 유기 분자 또는 화학적 화합물일 수 있는 표적의 분리는 표적의 추가의 분석 및 확인을 용이하게 한다. 본 발명은 다양한 법의학적, 의학적, 환경학적, 산업적, 공중 보건 및 생화학테러 방지 용도를 가지며, 다양한 기 체, 액체 및 고체 샘플로부터 표적을 분리하는데 사용하기에 적합하다.
제1 측면에서, 본 발명은 이종 샘플로부터 표적을 분리하는 개선된 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 해당 표적을 함유하는 샘플을, 비-표적 물질에 대한 기재의 친화도보다 더 높은 친화도로 표적과 결합할 수 있는 기재와 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 특정 표적에 대한 기재의 친화도를 더 증가시키는 개질제로 기재 표면을 코팅한다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 하나 이상의 아민 함유 개질제로 기재를 코팅한다. 하나 이상의 간단한 개질제로 코팅된 자성 또는 비-자성 기재를 사용하는 것은, 특정 표적과 면역반응성인 항체로 코팅된 비드를 사용한 표적의 분리 또는 검출에 의존하는 분리 기술에 비해 상당히 앞선 것이다. 본원에 개시된 간단한 개질제는 항체 코팅된 비드보다 더 저렴하고 제조하기가 더 쉬울 뿐만 아니라, 더 일반적으로 이용되며 각각의 모든 가능한 해당 표적과 면역반응성인 항체의 확인 및 제조를 필요로 하지 않는다. 가능한 표적에 대한 이러한 광범위한 정보의 필요성은 기존의 이용가능한 기술의 일반적인 적용성 및 비용 유효성에 대한 상당한 제한이 된다.
표적은 DNA, RNA, 단백질, 세균 세포 또는 포자, 바이러스, 소 유기 분자 또는 화학적 화합물일 수 있다. 또한, 표적 DNA, RNA 또는 단백질은 인간 또는 비-인간 동물, 식물, 세균, 바이러스, 진균 또는 원생동물로부터 유도될 수 있다. 본 발명은, 표적 핵산의 추가의 분석을 억제하는 제제에 의한 핵산의 분해 또는 핵산 샘플의 오염을 억제하는 조건하에서, 본 발명의 방법을 단독으로 사용하거나 또는 본 발명의 방법을 핵산의 분리 및 분석을 위한 종래 기재된 SNAP 방법과 조합하여 사용하는 것을 고려한다.
각 방법을 사용하여 표적을 분리한 다음, 세포 생물학, 분자 생물학, 화학 또는 독성학의 통상의 기술을 이용하여 표적을 추가로 분석할 수 있다. 표적을 기준으로 특정 기술을 선택할 수 있으며, 당업자라면 적절한 기술(들)을 쉽게 선택할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적은 특정 생물학적 또는 환경학적 샘플로부터 얻은 DNA이며, DNA의 추가의 분석은 DNA의 PCR 분석을 포함할 수 있다. DNA는 특정 적용 기술에 따라 인간, 동물, 세균, 식물, 진균, 원생동물 또는 바이러스 기원의 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적은 특정 생물학적 또는 환경학적 샘플로부터 얻은 RNA이며, RNA의 추가의 분석은 RNA의 RT-PCR 분석 또는 RNA의 계내(in situ) 혼성화 분석을 포함할 수 있다. RNA는 인간, 동물, 세균, 식물, 진균, 원생동물 또는 바이러스 기원의 것일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 특정 생물학적 또는 환경학적 샘플로부터 얻은 세균 세포 또는 포자이다. 추가의 분석은 세균 세포 또는 포자 자체의 분석을 포함할 수 있다. 세포 또는 포자를 분석하는 방법의 예는 현미경, 배양, 세포학적 시험, 및 세균 세포 표면 마커의 분석을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 추가로, 표적 세균 세포 또는 포자의 분석은 표적 세포 또는 포자로부터 제조된 DNA 또는 RNA의 분석, 및 세포 또는 포자 자체와 표적 세포 또는 포자로부터 제조된 DNA 또는 RNA 둘 다의 분석을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 특정 생물학적 또는 환경학적 샘플로부터 얻은 단백질이다. 단백질은 특정 적용 기술에 따라 인간, 동물, 세균, 식물, 진균, 원생동물 또는 바이러스 기원의 것일 수 있다. 단백질의 추가의 분석은 펩티드 서열분 석, 질량 분광법, 및 1- 또는 2-차원 겔 전기영동을 포함할 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 기재의 표면에 커플링될 수 있는 특정 표면 개질제를 제공한다. 하나 이상의 표면 개질제로 개질된 기재는 개질되지 않은 기재 또는 다른 표면 개질제로 개질된 기재에 비해 특정 표적에 대해 증가된 친화도를 갖는다. 본 발명은 플레이트, 칩, 커버슬립, 배양 용기, 튜브, 비드, 프로브, 광섬유, 필터, 카트리지 및 스트립 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 다양한 기재의 개질을 고려한다. 또한, 본 발명은, 이러한 기재가 플라스틱, 유리, 금속 및 실리카를 포함하나, 이에 한정되지는 않는 다양한 물질들 중 임의의 것으로 구성될 수 있으며 물질들이 또한 자성 또는 상자성 특징을 보유할 수 있음을 고려한다. 예시적인 기재의 목록으로부터 이해될 수 있는 바와 같이, 적합한 기재는 사실상 임의의 크기 또는 형태일 수 있으며, 당업자라면 특정 표적, 및 분석해야 하는 표적이 존재하는 특정 물질을 기준으로 적합한 기재를 용이하게 선택할 수 있다.
한 실시양태에서, 기재는 하나의 표면 개질제로 개질된다. 다른 실시양태에서, 기재는 2개 이상의 표면 개질제로 개질된다. 또 다른 실시양태에서, 기재로부터 개질제를 방출시킬 수 있는 절단가능한 링커를 통해 표면 개질제를 기재에 커플링시킨다. 복수개의 표면 개질제를 사용하는 경우, 개질제들이 각각 동일한 표적에 대해 증가된 친화도를 가질 수 있거나, 또는 개질제들이 상이한 표적에 대해 증가된 친화도를 가질 수 있어서 개질된 기재가 하나 초과의 표적들을 분리할 수 있다. 또한, 복수개의 표면 개질제를 사용하는 경우, 개질제들은 각각 특정 표적에 대해 동일한 친화도를 가질 수 있거나 또는 개질제들은 특정 표적에 대해 다양한 친화도를 가질 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은 생물학적, 화학적 또는 환경학적 샘플로부터 표적을 분리하는데 사용될 수 있는 기기를 제공한다. 본 발명은 두 가지 부류의 기기를 포함한다. 제1 부류는 기재와 샘플 사이의 상호작용을 용이하게 하는 기기를 포함한다. 이러한 기기는 본 발명의 방법을 대규모로 수행하는데 있어서 특히 중요하다. 예를 들어, 토양, 물, 공기 또는 체액의 작은 샘플로부터 표적을 분리하는 경우, 개질된 기재를 표적을 함유하는 샘플에 효율적으로 전달하는 것은 간단하다. 이러한 상황에서, 전체 샘플을 기재와 접촉시킴으로써 기재가 전체 샘플 전반에서 표적과 상호작용하는 기회를 보장하는 것은 비교적 용이하다. 그러나, 더 큰 샘플이 포함되는 경우, 기재가 큰 샘플의 전반에 균일하게 또는 불균일하게 분포될 수 있는 표적과 접촉하도록 보장하는 것은 그리 간단하지 않은 공정이다. 이 경우, 본 발명은 표적을 함유하는 큰 샘플의 전반에 기재를 균일하게 혼합하는 것을 용이하게 하는 장치를 제공한다. 이러한 기기의 적용을 예시하는 한 예는 산업적 식품-가공 설비에 있다. 식품, 음료, 또는 다양한 식품 또는 음료의 제조를 위한 성분들을 함유하는 큰 용기는 가공 또는 보관 동안 세균, 바이러스, 또는 화학물질들로 오염될 수 있다. 그러나, 샘플의 부피가 크면 잠재적으로 유해한 이러한 오염물질을 효율적으로 검출하는데 방해가 될 수 있다. 이러한 제1 부류의 기기의 한가지 적용 분야는 식품-가공 산업에서의 경우인데, 상기 장치를 사용하여 큰 부피의 식품 또는 성분의 양을 일정하게 효율적으로 평가할 수 있다.
제2 부류의 기기는 다른 코팅된 기재, 예를 들어 필터 및 카트리지를 제공하 며, 표적을 함유하는 샘플을 용이하게 처리하는데 사용될 수 있다. 이러한 기기는 다양한 생물학적, 환경학적 및 산업적 용도를 가지며, 고체, 액체 또는 기체 샘플을 효과적으로 분석하는데 사용될 수 있다. 특히, 친화도 프로토콜을 기초로 샘플을 분석하는 필터 및 카트리지는 단독으로 사용될 수 있거나 또는 다른 이용가능한 필터 및 카트리지와 조합되어 사용될 수 있다. 필터 및 카트리지는 임의의 다양한 상황에서 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 방법, 조성물 및 기기는 전통적인 실험실 또는 병원 환경에서 또는 다른 실험실 장비 및 물품에 대한 이용이 제한될 수 있는 분야에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물 및 기기를 이용해서, 다른 전통적인 분리 방법보다 더 짧은 시간으로 본 발명의 분리 방법을 수행할 수 있다. 샘플의 신속한 분석을 수행하는 능력은 다수의 실험 및 분야의 임의의 용도에서 중요하다. 예를 들어, 샘플 분석 시간의 단축으로 의사 및 병원은 진단 시험의 결과를 환자에게 즉시 제공할 수 있다. 이는 치료를 시작할 수 있는 시점 이전의 시간을 단축시켜 환자의 도피 및 비순응 위험을 감소시킨다. 다른 예로서, 신속한 분석은 범죄 현장 조사를 용이하게 한다. 또 다른 분석으로서, 환경학적 오염의 신속한 분석은 오염을 특정의 산업적 또는 자연적 사건과 서로 관련시키는 것을 용이하게 한다.
상기 언급한 것들 중 어떤 것에서, 본 발명의 분리 방법 (필터, 카트리지 또는 다른 기재를 사용하여 수행하는지의 여부는 상관없음)을 30분 미만으로 수행할 수 있다. 다른 실시양태에서, 분리 방법을 25분, 20분, 15분, 14분, 13분, 12분, 11분, 10분, 9분 또는 8분 이하로 수행할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 분리 방법을 7분, 6분, 5분 또는 4분 이하로 수행할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 분리된 표적은 임의로는 다른 신속한 분석 기술을 이용해서 추가로 분석할 수 있다.
상기 언급한 것들 중 어떤 것에서, 본 발명의 분리 방법 (필터, 카트리지 또는 다른 기재를 사용하여 수행하는지의 여부는 상관없음)을 수행하는데 요구되는 시간은 기재에 대한 표적의 결합에 요구되는 시간 (예, 포획 시간)을 포함하며, 기재로부터 표적을 방출시키는데 필요한 시간 (예, 용리 시간)을 포함할 수도 있다. 한 실시양태에서, 포획 시간은 30분, 25분, 20분, 15분, 14분, 13분, 12분, 11분, 10분, 9분 또는 8분 이하일 수 있다. 다른 실시양태에서, 포획 시간은 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분 또는 1분 이하일 수 있다. 다른 실시양태에서, 포획 시간은 5분 내지 10분, 1분 내지 5분, 1분이거나 또는 1분 미만일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 포획된 표적은 임의로는 기재로부터 용리될 수 있다. 용리된 표적은 임의로는 다른 신속한 분석 기술을 이용해서 추가로 분석할 수 있다.
다른 실시양태에서, 용리 시간은 30분, 25분, 20분, 15분, 14분, 13분, 12분, 11분, 10분, 9분 또는 8분 이하일 수 있다. 다른 실시양태에서, 용리 시간은 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분 또는 1분 이하일 수 있다. 다른 실시양태에서, 용리 시간은 5분 내지 10분, 1분 내지 5분, 1분이거나 또는 1분 미만일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 용리된 표적은 다른 신속한 분석 기술을 이용해서 추가로 분석할 수 있다.
상기 언급한 것들 중 어떤 것에서, 본 발명의 분리 방법은 유효량의 기재의 사용을 요구할 수 있다. 어떤 경우에는 더 높은 농도의 기재를 사용하는 것이 유리할 수 있지만, 최소 농도의 기재를 사용하는 것이 본 발명의 방법의 비용을 감소시키는데 도움을 주며, 당해 분야에서 상기 방법의 사용 용이성을 증가시키는데 도움을 준다 (예를 들어, 사용하기 위해 필요한 소모가능한 시약의 양을 감소시킨다). 한 실시양태에서, 기재의 양은 샘플 mL 당 10 mg을 초과한다. 한 실시양태에서, 기재의 양은 샘플 mL 당 10 mg 이하이다. 다른 실시양태에서, 기재의 양은 샘플 mL 당 7, 6 또는 5 mg 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 기재의 양은 샘플 mL 당 4, 3, 2 또는 1 mg 이하이다. 또 다른 예에서, 기재의 양은 샘플 ml 당 5 내지 10 mg, 또는 샘플 ml 당 1 내지 5 mg이다.
달리 언급하지 않는다면, 본 발명의 실시에서는 당업계의 기술 범위내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉(transgenic) 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌들 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. 미국 특허 제4,683,195호; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986)]을 참조한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 자명할 것이다.
도면의 상세한 설명
도 1은 친화도 프로토콜의 모식도를 제공한다.
도 2는 대표적인 규소 함유 표면 개질제 (좌측 도면) 및 상기 규소 함유 표면 개질제로 개질된 기재 (우측 도면)를 나타낸다.
도 3은 대표적인 규소 함유 표면 개질제 (좌측 도면) 및 상기 규소 함유 표면 개질제로 개질된 기재 (우측 도면)를 나타낸다. 도 2에 나타낸 표면 개질제와는 달리, 이 모델은 서로 동일하거나 상이할 수 있는 복수개의 활성 영역을 함유하는 표면 개질제를 제공한다.
도 4는 기재와 표적 사이의 상호작용을 용이하게 평가 및 정량하는데 사용될 수 있는 유동세포측정 검정법을 나타낸다.
도 5는 기재와 표적 사이의 상호작용을 용이하게 평가 및 정량하는데 사용될 수 있는 형광 검정법을 나타낸다.
도 6은 저널 베어링 유동 (journal bearing flow)의 원리를 예시한다. 우측의 모식도는 미립자 슬러리를 혼합하는데 사용된 저널 베어링 유동의 시뮬레이션 결과를 나타낸다.
도 7은 대규모 친화도 프로토콜을 묘사하는 모식도를 나타낸다. 대규모 프로토콜은 표준 친화도 프로토콜에서 기재와 표적 사이의 상호작용을 용이하게 하는 카오스(Chaotic) 혼합 장치의 사용을 포함한다. 이러한 모식도에서, 기재 (자성 비드), 샘플 토양, 및 물을 혼합하여 슬러리를 생성시킨다. 표적 및 기재를 함유하는 슬러리를 카오스 혼합 장치에 넣고, 저속으로 혼합하여 표적과 기재 사이의 상호작용을 용이하게 한다. 혼합 후, 표적-기재 복합체를 제거하는데 사용되는 전자석에 의해 내부 실린더를 대체한다. 기재가 자성 비드이기 때문에, 표적-기재 복합체는 전자석으로 용이하게 유인된다. 슬러리로부터 표적-기재 복합체를 제거한 후, 표적 세포를 비드로부터 분리하고, 이어서 용해시키고, SNAP를 사용하여 프로세싱함으로써 표적 세포에 함유된 DNA를 조사한다.
도 8은 시판되는 자성 비드의 분석 결과를 요약한다. 데이터는 SNAP 단독에 의해 분석된 샘플에 대한 신호로 정규화되었으며, 도면에 제시된 그래프는 비드가 SNAP 단독에 비해 신호를 증가시켰음을 입증한다.
도 9는 시판되는 비-자성 비드의 분석 결과를 요약한다. 이들 비드의 효능은, 비드를 샘플과 함께 인큐베이션한 후에 비드에 부착된 DNA의 백분율을 측정함 으로써 평가하였다.
도 10은 여러 상이한 기재의 표면을 개질시키는데 사용된 표면 개질제 (문자 A 내지 Y로 표시됨)의 구조를 나타낸다.
도 11은 본 발명자들의 아민-관능화 비드가 DNA에 대한 부착을 향상시켰음을 나타낸다.
도 12는 본 발명자들의 아민-관능화 비드 및 시판되는 여러가지 비드 둘 다가 두 가지 상이한 세균 표적에 부착된 것을 나타낸다.
도 13은 본 발명자들의 아민-관능화 비드 및 시판되는 여러가지 비드 둘 다가 두 가지 상이한 세균 표적에 부착된 것을 나타낸다.
도 14는 본 발명자들의 아민-관능화 비드 및 시판되는 여러가지 비드 둘 다가 세균 표적의 무성 형태 및 포자 형태에 부착된 것을 나타낸다.
도 15는 다양한 기재의 표면에 물리적으로 부착된 세균 표적의 SEM 영상을 나타낸다.
도 16은 친화도 프로토콜 및 SNAP의 조합을 사용하면 표적 (이 경우, 세균 DNA)의 확인이 향상됨을 나타낸다.
도 17은 코팅된 기재에 대한 DNA의 부착이 염 농도에 의해 영향받음을 나타낸다.
도 18은 코팅된 기재에 대한 DNA의 부착이 염 농도 및 pH 둘 다에 의해 영향받음을 나타낸다.
도 19는 기재가 물, 배양 배지, 및 비-실험실-등급의 환경수를 비롯한 다양 한 샘플에 존재하는 표적 DNA와 효율적으로 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 20은 온도 조작을 사용하여 기재로부터 표적 DNA를 용리시킬 수 있음을 나타낸다.
도 21은 전기용리를 사용하여 표적을 기재로부터 방출시킬 수 있음을 나타낸다. 도 21A는 진캡슐(GeneCapsule) 기기의 도면 및 이 기기 내의 기재의 위치를 나타낸다. 도 21B는 기재로 로딩한 후의 진캡슐 기기의 도면을 나타낸다. 도 21C는 전기용리 이후에 아민 비드로부터의 송아지 흉선 DNA의 용리를 나타낸다. 기재로부터 멀리 이동하는 다량의 송아지 흉선 DNA가 나타날 수 있다.
도 22는 DNA에 대해 친화도를 갖는 다양한 자성 비드의 포획 및 방출 활성의 비교를 나타낸다. 각 비드 유형에 대해, 기재 1 mg을 표준 탈이온수 중 500 pg/mL DNA 1 mL에 첨가하였다. 각 비드 유형에 대해, 가장 좌측의 막대는 기재에 포획된 DNA의 백분율을 나타낸다. 중간의 막대는 0.01 N NaOH 중 100 ㎍/mL 송아지-흉선 DNA 150 ㎕를 포함하는 용리 완충액 중에 방출된 포획 DNA의 백분율을 나타낸다. 이는 회수된 표적의 백분율로서 지칭되며, 포획된 DNA에 대한 회수된 DNA의 비율이다. 가장 우측의 막대는 효율을 나타내며, 최초 샘플 중 존재하는 총 DNA (500 pg)에 대한 회수된 DNA의 비율이다.
도 23은 시판되는 아민 코팅된 자성 비드가 DNA를 포획하는 효율을 기재 양 및 포획 시간 (예, 기재와 샘플 사이의 접촉 시간)의 함수로 나타낸다.
도 24는 시판되는 아민 코팅된 자성 비드가 DNA를 포획하는 효율을 기재 양 및 포획 시간 (예, 기재와 샘플 사이의 접촉 시간)의 함수로 나타낸다.
도 25는 시판되는 아민 코팅된 자성 비드가 DNA를 방출시키는 효율을 기재 양 및 용리 시간의 함수로 나타낸다.
도 26은 시판되는 아민 코팅된 자성 비드가 DNA를 방출시키는 효율을 기재 양 및 용리 시간의 함수로 나타낸다.
도 27은 용리 효율에 대한 용리 부피의 영향을 나타낸다.
도 28은 용리 효율에 대한 pH의 영향을 나타낸다.
도 29는 건조 친화도 자기(Affinity Magnet) 프로토콜을 사용하여 건조 토양 샘플로부터 세균 DNA를 단리한 후의 PCR 결과를 나타낸다. 점선은 DNA를 단리하기 위해 SNAP 방법만을 사용하여 처리한 토양 샘플을 나타내고, 실선은 SNAP 처리에 앞서 정전기 하전된 비-자성 비드와 접촉시킨 토양 샘플을 나타낸다.
도 30은 자성-비드-함유 카트리지를 사용해서, 물과 혼합되면 슬러리를 형성하는 모래로 이루어진 샘플로부터 세균 포자를 분리한 후의 PCR 결과를 나타낸다. 모래 중의 표적 포자로부터의 DNA를 PCR에 의해 직접 분석하거나 또는 친화도 프로토콜을 사용해서 샘플로부터 분리한 후 PCR에 의해 분석하였다. PCR 전의 표적의 분리는 표적-함유 샘플의 직접적인 PCR 분석에 비해 검출을 10배 증가시켰다.
도 31은 카오스 혼합을 위한 장치 (카오스 혼합 장치)를 나타낸다.
도 32는 SNAP 프로토콜 단독 (상부 패널)을 사용하여 단리한 DNA 또는 SNAP 프로토콜과 함께 대규모 친화도 프로토콜 (하부 패널)을 사용하여 단리한 DNA에 대해 수행된 PCR 반응의 겔 전기영동을 나타낸다. 양쪽 패널에서, 화살표는 증폭된 밴드를 나타내기 위해 사용된다. 이러한 결과는 대규모 친화도 프로토콜이 큰 샘 플에서의 검출 한계를 개선함을 입증한다.
도 33은 SNAP 프로토콜을 단독으로 사용하여 단리한 DNA 또는 SNAP 프로토콜과 함께 대규모 친화도 프로토콜을 사용하여 단리한 DNA에 대해 수행된 PCR 반응의 겔 전기영동을 나타낸다. 화살표는 증폭된 밴드를 나타내기 위해 사용된다. 이러한 결과는 대규모 친화도 프로토콜이 큰 샘플에서의 검출 한계를 개선함을 입증한다.
도 34는 표면 개질된 수집 튜브를 나타낸다.
도 35는 표면 개질된 기재를 함유하는 필터의 두 가지 디자인을 나타낸다. 이 도면에 제공된 특정 예는 필터가 공기 샘플 (기체 샘플)을 수집하는데 사용되는 것을 나타내지만, 유사한 디자인을 용이하게 개조하여 액체 샘플을 수집하는데 사용되는 필터를 구성할 수 있다.
도 36은 하나 이상의 기재를 통해 샘플을 처리하는데 사용될 수 있는 LiNK 장치의 변형예를 나타낸다. 추가로, 상기 장치는 수집 후 샘플을 보존하는 것을 돕는다.
도 37은 개선된 2-챔버 (LiNK) 장치를 나타낸다. 개선된 장치는 샘플 정제 및 농축을 증대시키는 실리카 컬럼을 함유한다.
도 38은 LiNK-형 장치에 대한 2가지 변형된 디자인을 나타낸다. 쌍을 이룬 디자인 또는 이중-챔버형 디자인은 샘플 내의 핵산 분석을 용이하게 하는데 사용되는 카오트로픽(chaotropic) 염의 부재하에서 샘플 내의 세균 및 다른 세포의 배양을 가능하게 한다.
(i) 개관
생물학, 화학 및 환경학에서는 종종 이종 물질 집단으로부터 우선 분리되어야 하거나 검출되어야 하는 표적의 분석이 요구된다. 상기 과정은 표적을 열화시키거나 표적의 차후 분석을 억제할 수 있는 샘플 내의 오염물질의 존재에 의해 더욱 복잡해질 수 있다. 본 발명은 이종 물질 집단으로부터의 표적을 정제하는데 사용되는 방법, 조성물 및 기기를 제공한다. 상기 방법, 조성물 및 기기는 광범위한 표적 (예를 들어, DNA, RNA, 단백질, 세균 및 세균 포자 (그람 양성 및 그람 음성 포함), 바이러스 (DNA-계 및 RNA-계 포함), 소 유기 분자 및 화학적 화합물)에 사용될 수 있으며, 다양한 생물학적, 화학적 및 환경학적 용도를 갖는다.
본원에 상세히 설명된 상기 개선된 방법 및 조성물은 광범위한 기체, 액체 및 고체 샘플로부터의 표적의 분리 능력 또는 검출 능력을 크게 증대시킨다. 또한, 본 발명은 이를 분리하는 동안 및 추가 분석 전에 표적의 무결성을 유지하는데 도움이 되는 종래에 기재된 방법 및 기기와 조합될 수 있다. 표적의 무결성을 유지하는데 도움이 되는 이러한 방법 및 조성물은 동시계류중인 미국 특허 공개 제2003/0129614호 (2003년 7월 10일자 출원, 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 상세히 기재되어 있다. 간략하게, 미국 특허 공개 제2003/0129614호에는 표적을 열화시킬 수 있거나 표적에 결합하여 추가 분석을 억제할 수 있는 샘플 내의 제제를 억제하는 조성물의 존재하에서 샘플을 프로세싱함으로써, 샘플로부터 수득된 핵산의 단리 및 분석을 용이하게 하도록 디자인된 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 예를 들면, 샘플 내의 제제는 DNA와 같은 핵산을 열화시킬 수 있다. 상기 열화는 주어진 샘플 내의 DNA 농도를 감소시키며, 또한 DNA의 질을 저하시키므로, PCR과 같은 검정법에서의 추가 분석을 위한 DNA의 프로세싱이 어려워질 수 있다.
용도
본 발명의 방법, 조성물 및 기기는 수많은 잠재적인 용도를 갖는다. 예를 들어, 법의학에 사용되는 많은 검정법에서는 복합 샘플 중에서부터, DNA, 단백질, 또는 비-펩티드 호르몬과 같은 소 유기 분자의 정제가 필요하다. 이러한 샘플로는 혈액, 타액, 가래, 뇨, 배설물, 피부 세포, 모낭, 정액, 질액, 골 단편, 골수, 뇌 물질, 뇌척수액, 양수 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 인간 또는 동물 체액 또는 조직이 포함된다. 상기 복합 샘플로부터의 표적의 정제 및 추가 분석은 (a) 종종 샘플 내의 표적의 낮은 농도, (b) 환경 오염물질에 의한, 또는 시간 경과에 따라 표적을 열화시키는 샘플 내의 제제에 의한 샘플의 열화, 및 (c) 정제 후 표적을 분석하는데 필요한 기술을 방해하는 상기 복합 체액 내의 제제의 존재에 의해 방해받는다. 따라서, 본 발명은 법의학에 실질적으로 적용되며, 생물학적 샘플의 분석 능력을 증대시킬 것이다. 또한, 본 발명자들은, 본 발명의 방법 및 조성물이 토양 또는 물과 같은 "더러운" 환경에 존재할 수 있는 물질의 혼합물로부터 표적을 분리하는데 효과적으로 사용될 수 있음에 주목하였다. 따라서, 본 발명은 개체로부터 직접 제공된 신선한 체액 또는 비교적 손상되지 않은 환경에서 발견된 샘플에 대해 수행되는 법의학 및 다른 연구를 용이하게 할 뿐만 아니라, 또한 오염물질 및 기타 열화성 제제를 보다 고농도로 함유할 수 있는, 토양, 물 (담수 또는 염수 포함) 또는 다른 공급원으로부터 회수되어야 하는 샘플을 분석하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법, 조성물 및 기기는 실험실, 병원 또는 의원 환경에서 생물학적 물질의 분석에 뿐만 아니라 경찰, 의료 검사관, 응급 의료 기술자, 범죄 조사자, 하즈-마트(Haz-mat) 직원 및 기타 현장-기반 종사자에 의한 현장의 생물학적 물질의 분석에 폭넓게 적용가능하다.
그러나, 생물학에서의 본 발명의 적용은 법의학에 한정되지 않는다. 의학적 및 유전적 검사에서의 진보는 이미 보건의료에 접근하는 방식을 변화시키기 시작하고 있다. 광범위한 진단 검사법이 이용가능하거나, 현재 개발중이다. 이러한 검사법은 인간 또는 동물 체액 또는 조직의 샘플 내에 함유된 특정 표적 (DNA, 단백질, 호르몬)을 분석하는 능력에 의존한다. 따라서, 본 발명을 사용하여 생물학적 샘플을 분석하는 용이성 및 효율성을 추가로 개선시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물로 보다 소량의 표적의 분리가 가능하다면, 진단 설비에 상기 방법 및 조성물을 사용하는 것이 특정 환자로부터 수거되어야 하는 샘플의 양을 감소시키는데 도움이 될 것이다. 또한, 본 발명은 종래에는 달성하기 어려웠던 속도와 최소의 시약을 사용하여 광범위한 샘플로부터의 표적을 분리할 수 있는 방법을 제공한다. 샘플을 신속하고도 감소된 비용으로 분석하는 능력은 보건의료 및 의료 산업에서 뿐만 아니라 본원에 상세하게 설명된 본 발명의 많은 기타 적용분야에서 유리하다.
추가의 예로, 본 발명은 혈액, 혈액 제품, 또는 기타 예비-패키징된 의료 공급물을 스크리닝하여 상기 공급물에 세균 및 바이러스와 같은 특정 오염물질이 확실히 없도록 하는데 사용될 수 있다.
의학적 용도 이외에, 본 발명은 다양한 환경학적 용도를 갖는다. 물, 토양 또는 공기 샘플에 대해 특정 표적의 존재를 분석할 수 있다. 이러한 표적으로는 DNA, RNA, 단백질, 소 유기 분자, 화학적 화합물, 세균 세포 또는 포자 (그람 양성 또는 그람 음성 포함) 및 바이러스 (DNA-계 및 RNA-계 포함)가 포함된다. DNA, RNA 및 단백질은 인간, 비-인간 동물, 식물, 세균, 진균, 원생동물 및 바이러스 유래일 수 있다. 예를 들어, 지역 연못, 호수 및 해변으로부터 수집된 물의 샘플을 분석하여 잠재적으로 유해한 세균 또는 화학적 오염체의 존재 및 농도를 평가할 수 있다. 이러한 분석법을 사용하여 상기 수질원의 상태을 모니터링하고 인간 휴양성에 대한 안전성을 평가할 수 있다. 유사하게, 토양의 샘플을 수집하고 분석하여 자연적 또는 산업적 공급원으로부터의 오염 수준을 평가할 수 있다.
추가의 예로, 본 발명의 조성물을 함유하는 카트리지 및 필터를 사용하여 공기 및 물 공급물을 모니터링할 수 있다. 이러한 카트리지 및 필터를 사용하여 공기 순환에 의존하는 빌딩, 비행기 및 기타 폐쇄된 공간 내의 공기 질을 평가할 수 있다. 또한, 이러한 카트리지를 수조, 수족관 등에 사용하여 수질을 모니터링하고 수질에 임의의 변화의 근원을 정확하게 지적하는데 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 용도의 마지막 비제한적 예는 국가 보안 분야로 폭넓게 분류될 수 있다. 생물학적 및(또는) 화학적 무기를 사용하는 전쟁의 위협이 있다면, 식량, 물, 토양 또는 공기 내의 생물학적 또는 화학적 제제의 존재를 확인하는데 사용될 수 있는 방법 및 조성물은 대단한 가능 용도를 갖는다. 예를 들어, 지역 저수조 또는 기타 유사한 공격 기원 주위의 물 및 토양의 샘플을 수집하여 생물학적 또는 화학적 오염물의 존재에 대해 분석할 수 있다. 또한, 카트리지 및 필터를 사용하여 공기 (빌딩, 열차, 비행기 또는 기타 차량의 외부 또는 내부)를 생물학적 또는 화학적 오염물의 존재에 대해 모니터링할 수 있다. 본 발명은 생물학적 오염물을 특정 생물학적 제제 (예를 들어, 세균 또는 바이러스)로부터의 DNA 또는 RNA의 검출, 또는 세균 또는 바이러스 자체의 검출에 의해 확인할 수 있음을 고려한다. 화학적 오염물은 유기 분자 자체의 검출 뿐만 아니라, 그의 화학적 부산물 또는 대사산물의 검출에 의해 확인될 수 있다. 검출될 수 있는 예시적인 생물학적 및 화학적 제제로는 탄저병, 리신, 브루셀라증, 천연두, 흑사병, Q열, 야생토끼병, 보툴리눔독소증, 포도상구균, 및 에볼라병을 비롯한 바이러스성 출혈열, 머스타드 가스, 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium Perfringens), 낙타두창, 사린, 소만, O-에틸 S-디이소프로필아미노메틸 메틸포스포노티올레이트, 타분 및 시안화수소를 들 수 있다. 임상적 및 환경적으로 연관된 예시적인 바이러스는 그들의 게놈형 및 그들이 외피로 싸여져 있는지 여부에 따라 분류될 수 있으며, 예로 (i) 단일-가닥이고, 포지티브 센스 가닥이고, 외피화된 RNA 바이러스; (ii) 단일-가닥이고, 네가티브 센스 가닥이고, 비-외피화된 RNA 바이러스; (iii) 단일-가닥이고, 네가티브 센스 가닥이고, 외피화된 RNA 바이러스; (iv) 이중-가닥이고, 비-외피화된 RNA 바이러스; 및 (v) 이중-가닥이고, 외피화된 DNA 바이러스를 들 수 있다. 단일-가닥이고, 포지티브 센스 가닥이고, 외피화된 RNA 바이러스로는 동부마뇌염, 서부마뇌염, 베네주엘라 마뇌염, 세인트루이스 뇌염, SARS, C형 간염, HIV, 및 웨스트나일 바이러스가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 단일-가닥이고, 포지티브 센스 가닥이고, 비-외피화된 RNA 바이러스로는 노워크(Norwalk) 바이러스, A형 간염 및 리노바이러스가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 단일-가닥이고, 네가티브 센스 가닥이고, 외피화된 RNA 바이러스로는 에볼라, 마르부르그 및 인플루엔자가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 이중-가닥이고, 비-외피화된 RNA 바이러스로는 로타바이러스가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 이중-가닥이고, 외피화된 DNA 바이러스로는 B형 간염 및 대두창 바이러스가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 약술된 본 발명의 각각의 잠재적인 법의학적, 의학적, 진단, 환경, 산업적 및 안전 적용분야에 대해, 본 발명은 이종 샘플로부터의 표적을 분리 및(또는) 확인하는데 본 발명의 방법, 기기 및 조성물을 사용하는 것을 고려한다. 따라서, 상기 방법, 조성물 및 기기는 특정 표적 및 샘플의 추가 분석에 유용할 뿐만 아니라, 표적 (예를 들어, 원하지 않는 표적)을 샘플로부터 제거하는데도 또한 유용하다. 표적을 제거하는 본 발명의 예시적인 용도는 샘플의 정화에 포함된다. 샘플로부터의 표적의 전부 또는 일부를 분리 (예를 들어, 제거; 물리적 분리)한 후, 샘플은 표적의 제거 전보다 더 안전하게 취급될 수 있다. 분리된 표적은 폐기되거나 (예를 들어, 표적과 회합할 수 있는 임의의 위험물의 성질을 고려하여 적절하게 폐기됨), 또는 표적과 회합할 수 있는 임의의 위험물의 성질을 고려하여 적절한 시약 및 주의법을 사용하여 추가로 연구될 수 있다.
(ii) 정의
편의상, 발명의 상세한 설명, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 특정 용어를 여기에 모아둔다. 달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
부정관사 ("a" 및 "an")는 본원에서 상기 부정관사의 문법적 대상이 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)임을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
용어 "표적"은 해당 특정 분자를 지칭하는데 사용된다. 예시적인 표적으로는 DNA, RNA, 단백질, 그람 양성 세균, 그람 음성 세균, 세균 포자, DNA-계 및 RNA-계 바이러스 (레트로바이러스 포함), 소 유기 분자 (비-펩티드 호르몬 포함) 및 화학적 화합물이 포함된다. DNA, RNA 및 단백질은 인간, 비-인간 동물, 식물, 진균, 원생동물, 세균 및 바이러스 유래일 수 있다. 임의의 상기 표적에 대해, 본 발명은 일반적인 부류의 표적 (예를 들어, 샘플 내의 모든 DNA)의 정제 뿐만 아니라, 표적의 부류 중 특정 종 (예를 들어, 특정 세균 또는 주어진 항원에 대한 항체)의 정제를 고려한다. 본 발명의 명세서에서, 표적은 본 발명의 방법, 조성물 및 기기를 사용하여 이종 샘플로부터 실질적으로 정제된 분자이다.
용어 "샘플"은 생물학적, 화학적 또는 환경학적 물질의 이종 혼합물을 지칭하는데 사용된다. 본 발명의 방법, 조성물 및 기기는 샘플로부터의 특정 표적의 분리, 검출 또는 실질적인 정제를 가능하게 한다. 샘플은 기체, 액체 또는 고체 (예를 들어, 습윤성 고체 샘플 또는 건성 고체 샘플)일 수 있으며, 생물학적, 화학적 또는 환경학적 물질이 포함될 수 있다. 예시적인 생물학적 샘플로는 혈액, 타액, 가래, 뇨, 배설물, 피부 세포, 모낭, 정액, 질액, 골 단편, 골수, 뇌 물질, 뇌척수액 및 양수가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 환경학적 샘플로는 토양, 물, 비-실험실-등급 환경수, 슬러지, 공기, 식물 및 기타 식물성 물질, 오일, 액상 광물 침착물 및 고상 광물 침착물이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 식품 가공 또는 기타 상업 제품의 제조 동안의 오염물질의 정제를 비롯한 많은 상업적 및 산업적 용도에서 상기 방법 및 조성물의 적용성을 고려한다.
용어 "기재(substrate)"는 "표면 개질제"로 개질되거나 코팅되어 코팅된 기재와 하나 이상의 표적 사이의 상호작용을 촉진시키거나 증대시킬 수 있는 임의의 표면을 지칭하는데 사용된다. 기재는 크기 및 형태가 폭넓게 다양할 수 있으며, 특정 기재는 본 발명의 특정 적용분야에 특수한 개질제, 표적, 샘플 및 다른 인자에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예시적인 기재로는 자성 비드, 비-자성 비드, 튜브 (예를 들어, 폴리프로필렌 튜브, 폴리우레탄 튜브 등), 유리 슬라이드 또는 커버슬립, 칩, 카세트, 필터, 카트리지, 및 광섬유 프로브를 비롯한 프로브가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
표면 개질제는 기재에 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링될 수 있으며, 표면 개질제는 임의로 표면 개질제의 활성 영역이 기재로부터 방출될 수 있도록 하는 절단가능한 링커를 함유할 수 있다. 용어 "활성 영역"은 표적과 상호작용하는 영역을 함유하는 개질제의 일부분을 지칭하는데 사용된다. 개질제가 절단가능한 링커를 함유하는 실시양태에서, 링커의 절단은 표적 + 개질제의 활성 영역을 방출시키면서, 기재에 부착된 개질제의 일부분은 남긴다.
용어 "친화도 프로토콜" 또는 "AP"는 기재와 샘플을 접촉시킴으로써 표적이 실질적으로 정제되거나 샘플로부터 분리되는 방법을 지칭하는데 사용된다. 기재의 표면은 기재와 특정 표적 사이의 상호작용을 촉진시키거나 증대시키는 개질제로 코팅될 수 있다.
용어 "친화도 자기 프로토콜" 또는 "AMP"는 기재가 자성을 갖는 AP 방법의 실시양태를 지칭하는데 사용된다. AP 방법에 사용되는 기재와 유사하게, AMP 방법에 사용되는 기재는 기재와 특정 표적 사이의 상호작용을 촉진시키거나 증대시키는 개질제로 코팅될 수 있다.
친화도 프로토콜 및 친화도 자기 프로토콜은 표적과 기재가 상호작용하여 표적-기재 복합체를 형성하는 포획 단계를 포함한다. 표적과 기재가 결합하여 표적-기재 복합체를 형성하는데 필요한 시간은 본원에서 "포획 시간"으로 지칭된다. "표적과 기재가 결합하여 표적-기재 복합체를 형성함"이라는 것은 샘플 내의 표적의 50％ 초과 (예를 들어, 51％ 이상)가 기재에 결합하여 표적-기재 복합체를 형성하도록 하는 표적과 기재 사이의 충분한 상호작용을 의미한다. 특정 실시양태에서, 샘플 내의 표적의 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 또는 95％ 초과가 기재에 결합하여 표적-기재 복합체를 형성한다.
AP 및 AMP의 특정 적용분야에서, 표적-기재 복합체를 붕괴시키고, 결합된 표적을 기재로부터 용리시킨다. 기재로부터 표적을 용리시키는데 필요한 시간은 본원에서 "용리 시간"으로 지칭된다. "기재로부터 표적을 용리시키거나 제거하여 표적-기재 복합체를 붕괴시킴"은 표적-기재 복합체의 50％ 초과 (예를 들어, 51％ 이상)의 붕괴를 의미한다. 특정 실시양태에서, 이미 표적에 결합된 샘플 내의 표적의 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 또는 95％ 초과가 용리된다.
용어 "커플링 영역"은 기재와 상호작용하는 개질제의 일부분을 지칭한다.
용어 "SNAP" 또는 "SNAP 방법" 또는 "SNAP 프로토콜"은 본원 전반에 상호교환적으로 사용되어 동시계류중인 미국 공개 제2003/0129614호 (미국 출원 제10/193,742호)에 상세히 설명된 방법을 지칭하게 될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어의 사용은 동시계류중인 출원에 제시된 특정 장치 및 기기의 사용에 한정되는 것을 의미하는 것은 아니고, 오히려 핵산 샘플의 열화를 억제하고(하거나) 샘플의 추가 프로세싱 및 분석을 방해하는 샘플 내의 제제를 억제하는 조건하에서 핵산 샘플을 단리하는데 사용되는 일반적인 방법을 지칭하는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "지방족기"는 직쇄, 분지쇄 또는 지환족 탄화수소기를 지칭하며, 포화 및 불포화 지방족기, 예를 들어 알킬기, 알케닐기 및 알키닐기가 포함된다.
용어 "알케닐" 및 "알키닐"은 길이 및 가능한 치환에 있어서 상기 기재된 알킬과 유사하지만 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 각각 함유하는 불포화 지방족기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "알콕실" 또는 "알콕시"는 그에 부착된 산소 라디칼을 갖는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 지칭한다. 대표적인 알콕실기로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, tert-부톡시 등이 포함된다. "에테르"는 산소에 의해 공유 연결된 2개의 탄화수소이다.
용어 "알킬"은 직쇄 알킬기, 분지쇄 알킬기, 시클로알킬 (알리시클릭)기, 알킬-치환된 시클로알킬기 및 시클로알킬-치환된 알킬기를 비롯한, 포화 지방족기의 라디칼을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 그 주쇄에 30개 이하의 탄소 원자를 가지며 (예를 들어, 직쇄에 대해 C1-C30, 분지쇄에 대해 C3-C30), 보다 바람직하게는 20개 이하의 탄소 원자를 갖는다. 또한, 바람직한 시클로알킬은 그의 고리 구조에 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지며, 보다 바람직하게는 고리 구조에 5, 6 또는 7개의 탄소를 갖는다.
더욱이, 발명의 상세한 설명, 실시예 및 청구의 범위 전반에 사용된 용어 "알킬" (또는 "저급 알킬")은 "비치환된 알킬" 및 "치환된 알킬" 둘 다를 포함하는 것으로 의도되며, 치환된 알킬은 탄화수소 주쇄의 하나 이상의 탄소에 수소를 대체하는 치환기를 갖는 알킬 잔기를 지칭한다. 이러한 치환기로는 예를 들어 할로겐, 히드록실, 카르보닐 (예를 들어, 카르복실, 알콕시카르보닐, 포르밀 또는 아실), 티오카르보닐 (예를 들어, 티오에스테르, 티오아세테이트 또는 티오포르메이트), 알콕시, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 술프히드릴, 알킬티오, 술페이트, 술포네이트, 술파모일, 술폰아미도, 술포닐, 헤테로시클릴, 아랄킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기가 포함된다. 탄화수소 쇄 상에 치환된 잔기는 경우에 따라 그 자체가 치환될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 치환된 알킬의 치환기는 치환된 및 비치환된 형태의 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴 (포스포네이트 및 포스피네이트 포함), 술포닐 (술페이트, 술폰아미도, 술파모일 및 술포네이트 포함) 및 실릴기 뿐만 아니라, 에테르, 알킬티오, 카르보닐 (케톤, 알데히드, 카르복실레이트 및 에스테르 포함), -CF3, -CN 등을 포함할 수 있다. 예시적인 치환된 알킬은 하기에 기재되어 있다. 시클로알킬은 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아미노알킬, 카르보닐-치환된 알킬, -CF3, -CN 등으로 추가로 치환될 수 있다.
탄소의 수가 달리 특정되지 않는다면, 본원에 사용된 "저급 알킬"은 상기 정의된 바와 같지만 그의 주쇄 구조에 1 내지 10개의 탄소, 보다 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 의미한다. 또한, "저급 알케닐" 및 "저급 알키닐"은 유사한 쇄 길이를 갖는다. 본원 전반에 걸쳐, 바람직한 알킬기는 저급 알킬이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 알킬로 나타내어지는 치환기는 저급 알킬이다.
용어 "알킬티오"는 그에 부착된 황 라디칼을 갖는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 지칭한다. 대표적인 알킬티오기로는 메틸티오, 에틸티오 등이 포함된다.
용어 "아민" 및 "아미노"는 당업계에 인지되어 있으며, 비치환된 및 치환된 아민 둘 다, 예를 들어 하기 화학식으로 표시될 수 있는 잔기를 지칭한다.
Figure 112006010071368-PCT00001
또는
Figure 112006010071368-PCT00002
상기 식에서, R9, R10 및 R'10은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R8을 나타내거나, R9 및 R10은 이들이 부착된 N 원자와 함께 취해져 고리 구조에 4 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성하고; R8은 아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로사이클 또는 폴리사이클을 나타내고; m은 0 또는 1 내지 8의 정수이다. 바람직한 실시양태에서, R9 또는 R10 중 하나만이 카르보닐이며, 예를 들어 R9, R10 및 질소는 함께 이미드를 형성하지는 않는다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, R9 및 R10 (및 임의로 R'10)은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐 또는 -(CH2)m-R8을 나타낸다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "알킬아민"은 그에 부착된 치환되거나 비치환된 알킬을 갖는, 즉 R9 및 R10 중 하나 이상이 알킬기인 상기 정의된 바와 같은 아민기를 의미한다.
용어 "아미도"는 아미노-치환된 카르보닐로 당업계에 인지되어 있으며, 하기 화학식으로 표시될 수 있는 잔기를 들 수 있다.
Figure 112006010071368-PCT00003
상기 식에서, R9 및 R10은 상기 정의된 바와 같다. 아미드의 바람직한 실시양태는 불안정할 수 있는 이미드는 포함하지 않을 것이다.
본원에 사용된 용어 "아랄킬"은 아릴기 (예를 들어, 방향족 또는 헤테로방향족기)로 치환된 알킬기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "아릴"은 0 내지 4개의 헤테로원자를 포함할 수 있는 5-원, 6-원 및 7-원 단일-고리 방향족기를 포함하며, 예를 들어 벤젠, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등이 포함된다. 고리 구조에 헤테로원자를 갖는 아릴기는 또한 "아릴 헤테로사이클" 또는 "헤테로방향족"으로도 지칭될 수 있다. 방향족 고리는 하나 이상의 고리 위치에서 상기 기재된 바와 같은 치환기, 예를 들어 할로겐, 아지드, 알킬, 아랄킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 히드록실, 알콕실, 아미노, 니트로, 술프히드릴, 이미노, 아미도, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 술포닐, 술폰아미도, 케톤, 알데히드, 에스테르, 헤테로시클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 잔기, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다. 용어 "아릴"은 또한 2개 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리 (고리는 "융합된 고리"임)에 공통적이며, 하나 이상의 상기 고리는 방향족인 2개 이상의 시클릭 고리를 갖는 폴리시클릭 고리계를 포함하며, 예를 들어 기타 시클릭 고리는 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴 및(또는) 헤테로시클릴일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "카르보사이클"은 고리의 각 원자가 탄소인 방향족 또는 비-방향족 고리를 지칭한다.
용어 "카르보닐"은 당업계에 알려져 있으며, 여기에는 하기 화학식으로 나타낼 수 있는 잔기가 포함된다.
Figure 112006010071368-PCT00004
또는
Figure 112006010071368-PCT00005
상기 식에서, X는 결합이거나, 또는 산소 또는 황을 나타내고, R11은 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R8 또는 제약상 허용되는 염을 나타내고, R'11은 수소, 알킬, 알케닐 또는 -(CH2)m-R8을 나타내며, 여기서 m 및 R8은 상기 정의한 바와 같다. X가 산소이고 R11 또는 R'11이 수소가 아닌 경우, 상기 화학식은 "에스테르"를 나타낸다. X가 산소이고 R11이 상기 정의한 바와 같은 경우, 상기 잔기는 본원에서 카르복실기라고 지칭하며, 특히 R11이 수소인 경우에 상기 화학식은 "카르복실산"을 나타낸다. X가 산소이고 R'11이 수소인 경우, 상기 화학식은 "포르메이트"를 나타낸다. 일반적으로, 상기 화학식의 산소 원자가 황으로 치환되는 경우, 상기 화학식은 "티오카르보닐"기를 나타낸다. X가 황이고 R11 또는 R'11이 수소가 아닌 경우, 상기 화학식은 "티오에스테르"를 나타낸다. X가 황이고 R11이 수소인 경우, 상기 화학식은 "티오카르복실산"을 나타낸다. X가 황이고 R'11이 수소인 경우, 상기 화학식은 "티오포르메이트"를 나타낸다. 한편, X가 결합이고 R11이 수소가 아닌 경우, 상기 화학식은 "케톤"기를 나타낸다. X가 결합이고 R11이 수소인 경우, 상기 화학식은 "알데히드"기를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소를 제외한 임의 원소의 원자를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 붕소, 질소, 산소, 인, 황 및 셀레늄이다.
용어 "헤테로시클릴" 또는 "헤테로시클릭기"는 고리 구조가 1개 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 3-원 내지 10-원 고리 구조, 보다 바람직하게는 3-원 내지 7-원 고리를 지칭한다. 헤테로사이클은 또한 폴리사이클일 수도 있다. 헤테로시클릴기의 예로는 티오펜, 티안트렌, 푸란, 피란, 이소벤조푸란, 크로멘, 크산텐, 페녹사티인, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 이소티아졸, 이소옥사졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 인다졸, 푸린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카르바졸, 카르볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 피리미딘, 페난트롤린, 페나진, 페나르사진, 페노티아진, 푸라잔, 페녹사진, 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 옥사졸, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 락톤, 락탐, 예컨대 아제티디논 및 피롤리디논, 술탐, 및 술톤 등이 있다. 헤테로시클릭 고리는 하나 이상의 위치에서 상기 기재된 치환기 (예를 들어, 할로겐, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 히드록실, 아미노, 니트로, 술프히드릴, 이미노, 아미도, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 술포닐, 케톤, 알데히드, 에스테르, 헤테로시클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 잔기, -CF3, 또는 -CN 등)로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "니트로"는 -NO2를 의미하고, 용어 "할로겐"은 -F, -Cl, -Br 또는 -I를 나타내고, 용어 "술프히드릴"은 -SH를 의미하고, 용어 "히드록실"은 -OH를 의미하며, 용어 "술포닐"은 -SO2-를 의미한다.
용어 "폴리시클릴" 또는 "폴리시클릭기"는 2개의 결합 고리에 2개 이상의 탄소가 공통적으로 존재하는 2개 이상의 고리 (예를 들어, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴 및(또는) 헤테로시클릴)를 나타내며, 예를 들어 상기 고리는 "융합된 고리"이다. 인접하지 않는 원자를 통해 결합된 고리는 "브릿지(bridged)" 고리라고 명명된다. 폴리사이클의 각 고리는 상기 기재된 치환기 (예를 들어, 할로겐, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 히드록실, 아미노, 니트로, 술프히드릴, 이미노, 아미도, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 술포닐, 케톤, 알데히드, 에스테르, 헤테로시클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 잔기, -CF3, 또는 -CN 등)로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "보호기"는 잠재적으로 반응성인 관능기가 원하지 않는 화학적 변환 반응을 거치지 않도록 보호하는 일시적 치환기를 의미한다. 그러한 보호기의 예로는 카르복실산의 에스테르, 알콜의 실릴 에테르, 및 알데히드 및 케톤 각각의 아세탈 및 케탈이 있다. 보호기 화학 분야에 대해서는 문헌 [Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed.; Wiley: New York, 1991]에서 고찰된 바 있다.
"셀레노알킬"은 치환된 셀레노기가 부착된 알킬기를 지칭한다. 알킬 상에서 치환될 수 있는 예시적인 "셀레노에테르"는 -Se-알킬, -Se-알케닐, -Se-알키닐 및 -Se-(CH2)m-R8 (식 중, m 및 R8은 상기 정의한 바와 같음) 중 하나로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "치환된"은 유기 화합물의 허용가능한 모든 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 넓은 측면에서, 허용가능한 치환기로는 유기 화합물의 비-시클릭 및 시클릭, 분지 및 비-분지, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비-방향족 치환기가 있다. 예시적인 치환기로는, 예를 들어 본원의 상기에 기재된 것들이 있다. 허용가능한 치환기는 적당한 유기 화합물에 대해 하나 이상일 수 있고, 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 목적상, 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환기를 가질 수 있고(있거나) 헤테로원자의 원자가를 충족시키는 본원 기재의 유기 화합물에 대한 임의의 허용가능한 치환기를 가질 수 있다. 어떤 방식으로든 유기 화합물의 허용가능한 치환기에 의해 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
"치환" 또는 "~로 치환된"에 대해서는, 그러한 치환이 치환된 원자 및 치환기의 허용된 원자가에 따르며, 치환의 결과로 안정한 화합물 (예를 들어, 재배열, 고리화, 제거 등과 같은 변환 과정을 자발적으로 거치지 않는 것)이 생성된다는 암시적 단서 조항을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
알케닐기 및 알키닐기에 대해서도 유사한 치환이 이루어져, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미도알케닐, 아미도알키닐, 이미노알케닐, 이미노알키닐, 티오알케닐, 티오알키닐, 카르보닐-치환된 알케닐 또는 알키닐 등이 생성될 수 있다.
본원에 사용된 알킬, m, n과 같은 각 표현의 정의는, 이러한 표현이 어떠한 구조에서 2회 이상 나타나는 경우에 당해 구조의 어디에서든 그 정의가 독립적인 것이다.
용어 트리플릴, 토실, 메실 및 노나플릴은 당업계에 알려져 있으며, 각각 트리플루오로메탄술포닐기, p-톨루엔술포닐기, 메탄술포닐기 및 노나플루오로부탄술포닐기를 지칭한다. 용어 트리플레이트, 토실레이트, 메실레이트 및 노나플레이트는 당업계에 알려져 있으며, 각각 트리플루오로메탄술포네이트 에스테르, p-톨루엔술포네이트 에스테르, 메탄술포네이트 에스테르 및 노나플루오로부탄술포네이트 에스테르 관능기, 및 상기 기를 함유하는 분자를 지칭한다.
약어 Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms는 각각 메틸, 에틸, 페닐, 트리플루오로메탄술포닐, 노나플루오로부탄술포닐, p-톨루엔술포닐 및 메탄술포닐을 나타낸다. 당업계 통상의 기술을 가진 유기 화학자가 사용하는 보다 포괄적인 약어 목록은 문헌 [Journal of Organic Chemistry]의 각 권(volume)의 첫번째 발행물에 나타나 있으며, 이 목록은 전형적으로 표준 약어 목록(Standard List of Abbreviations)이라는 제목의 표에 제시되어 있다. 상기 목록에 함유된 약어 및 당업계 통상의 기술을 가진 유기 화학자가 사용하는 모든 약어는 본원에 포함되어 있는 것으로 간주한다.
본 발명의 특정 화합물은 특정한 기하 또는 입체 이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에서는 그러한 모든 화합물을 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려하고 있으며, 여기에는 시스- 및 트랜스-이성질체, R- 및 S-에난티오머, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 이들의 라세미체 혼합물, 및 이들의 다른 혼합물이 포함된다. 부가적인 비대칭 탄소 원자가 알킬기와 같은 치환기에 존재할 수 있다. 그러한 모든 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명에 포함되는 것으로 한다.
예를 들어, 본 발명의 화합물에 대한 특정 에난티오머가 필요한 경우, 이는 비대칭 합성법 또는 키랄 보조물질을 사용한 유도체화에 의해 제조될 수 있으며, 이 때 생성된 부분입체이성질체 혼합물이 분할되고 보조기가 절단되어 원하는 순수 에난티오머를 얻게 된다. 별법으로, 분자가 아미노와 같은 염기성 관능기 또는 카르복실과 같은 산성 관능기를 함유하는 경우에는, 적당한 광학 활성 산 또는 염기와의 반응으로 부분입체이성질체의 염이 형성될 수 있고, 이후에 이와 같이 형성된 부분입체이성질체를 당업계에 공지된 분별 결정화 또는 크로마토그래피 수단에 의해 분할하고, 후속적으로 순수한 에난티오머를 회수할 수 있다.
본 발명의 목적상, 화학 원소는 문헌 [Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87]의 내부 표지에 있는 CAS 버전의 원소 주기율표에 따라 식별한다. 또한, 본 발명의 목적상, 용어 "탄화수소"는 하나 이상의 수소 및 하나 이상의 탄소 원자를 갖는, 허용가능한 모든 화합물을 포함하는 것으로 고려된다. 넓은 측면에서, 허용가능한 탄화수소에는 비-시클릭 및 시클릭, 분지 및 비-분지, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비-방향족 유기 화합물 (치환되거나 치환되지 않을 수 있음)이 포함된다.
"아미노산"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단량체 단위이다. 자연 발생적인 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질에서는 약 80개의 아미노산이 발견되며, 이들은 모두 L-이성질체이다. 또한, 상기 용어에는 아미노산의 유사체, 및 단백질 아미노산의 D-이성질체 및 이들의 유사체가 포함된다.
용어 "소수성"은 비-극성 원자를 갖는 화학 잔기가 물 또는 다른 극성 원자와 상호작용하기보다는 서로가 상호작용하는 경향을 지칭한다. "소수성"인 물질은 대부분 물에 불용성이다. 소수성 특징을 갖는 천연 산물로는 지질, 지방산, 인지질, 스핑고지질, 아실글리세롤, 왁스, 스테롤, 스테로이드, 테르펜, 프로스타글란딘, 트롬복산, 류코트리엔, 이소프레노이드, 레티노이드, 바이오틴, 및 소수성 아미노산 (예컨대, 트립토판, 페닐알라닌, 이소루이신, 루이신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 프롤린 및 티로신)이 있다. 또한, 화학 잔기는 그의 물리적 특성이 비-극성 원자의 존재에 의해 결정된다면 소수성이거나 소수성 특징을 갖는 것이다.
용어 "친수성"은 물에 대해 높은 친화도를 갖는 화학 잔기를 지칭한다. "친수성"인 물질은 대부분 물에 가용성이다.
본원에 사용된 "단백질"은 약 80개의 아미노산 중 어느 것으로 본질적으로 이루어진 중합체이다. "폴리펩티드"는 상대적으로 큰 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용되는 반면, "펩티드"는 대체로 작은 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용되며, 당업계에서는 이들 용어의 사용이 중복되고 변한다.
용어 "펩티드(들)", "단백질(들)" 및 "폴리펩티드(들)"은 본원에서 상호 교환하여 사용될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"도 또한 본원에서 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 및 적절한 경우 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 용어는 단일-가닥 (센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
용어 "소 분자"는 분자량이 약 2500 amu 미만, 바람직하게는 약 2000 amu 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1500 amu 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1000 amu 미만, 가장 바람직하게는 약 750 amu 미만인 화합물을 지칭한다.
(iii) 예시적 방법
본 발명은 표적을 추가로 분석할 수 있도록 샘플로부터 표적을 분리하는 개선된 방법을 제공한다. 이 방법은 본원에서 "친화도 프로토콜", "AP" 또는 "친화도 방법"으로 지칭될 것이다. 이 방법론의 특정 실시양태에서는 자성 기재를 이용할 것이며, 또한 "친화도 자기 프로토콜" 또는 "AMP"로서 지칭될 수도 있다.
친화도 프로토콜은 샘플로부터 하나 이상의 표적을 확인하도록 돕는 기재를 이용한다. AP는 핵산 (예컨대, DNA 및 RNA), 단백질, 세균 세포 또는 포자 (예컨대, 그람 양성 및 그람 음성), 바이러스 (예를 들어, DNA-계 또는 RNA-계), 소 유기 분자 (예컨대, 독소, 호르몬 등), 및 거대 화학적 화합물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 임의의 다양한 표적에 대해 이용될 수 있다. AP는 기체 샘플 (예컨대, 여과되거나 여과되지 않은 공기), 환경학적 액체 샘플 (예컨대, 담수, 해수, 슬러지, 진흙, 재-수화 토양, 가솔린, 오일), 생물학적 액체 및 반-고체 샘플 (예컨대, 혈액, 뇨, 가래, 타액, 배설물, 뇌척수액, 골수, 정액, 질액, 뇌 물질, 골 단편), 및 환경학적 고체 샘플 (예컨대, 건조 토양 또는 점토)을 비롯한 임의의 광범위한 샘플로부터 표적을 확인하는데 이용될 수 있다. 부가적으로, AP는 전체 공정을 따를 수 없는 고체 표면 상에서 표적의 존재 여부를 분석하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 데스크탑 컴퓨터 키보드, 문 손잡이 등에서 표적의 존재 여부를 분석할 수 있다. 이러한 경우, 표적의 존재는 우선 고체 표면의 표면 와이프(wipe)를 취하고, 이어서 표적의 존재 여부에 대해 표면 와이프를 프로세싱함으로써 평가할 수 있다. 추가로, AP는 식품 가공, 화학 가공, 또는 시료 내에 특정 오염 표적이 존재함으로써 방해받는 임의의 대규모 생산 활동과 같은 임의의 다수 산업 분야에서 표적을 확인하는데 이용될 수도 있다.
본 발명에서는 친화도 프로토콜이 샘플에서 표적을 확인하고 그 표적의 추가 분석을 용이하게 하는데 단독으로 이용될 수 있음을 고려한다. 예를 들어, 친화도 프로토콜은 물로 이루어진 샘플에서 특정 세균 세포의 존재 여부를 확인하는데 이용될 수 있다. 이들 세균 세포는 이후에 세포학적 또는 분자적으로 추가 분석될 수 있다.
친화도 프로토콜은 이종 샘플로부터 표적을 단리하거나 분리하는 다른 방법에 비해 다수의 상당한 이점을 갖는다. 친화도 프로토콜 및 친화도 자기 프로토콜에 사용하기 위한 기재는 코팅되지 않거나 (예를 들어, 유도체화되지 않음), 또는 상대적으로 간단한 화학 잔기로 유도체화된 것이다. 이는, 특정 표적과 면역반응성인 항체로 기재가 코팅되어야 하는 종래의 이용가능한 다수의 분리 기술과 상반되는 점이다. 항체는 제조 비용과 기재에 부착시키는 비용이 더 고가이기 때문에, 항체를 사용하기 위해서는 해당 표적에 대한 방대한 지식이 필요하며, 각각의 항체는 좁은 범위의 면역반응성을 나타낼 가능성이 높다. 부가적으로, 친화도 프로토콜 및 친화도 자기 프로토콜은 이종 샘플로부터 표적의 신속한 분리를 가능하게 하며, 이 방법은 최소한의 시약을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 특징들로 인하여 상기 프로토콜의 비용이 절감되며, 실험실 뿐만 아니라 현장 (예컨대, 실험실 조건이 아닌 조건)에서도 상기 프로토콜을 이용할 수 있다.
그러나, 본 발명에서는 친화도 프로토콜이 종래에 개시된 SNAP 방법, 또는 핵산을 추가로 분석하기 위한 다른 방법론과 함께 이용될 수 있음을 고려한다. 미국 공개 제2003/0129614호에 상세히 설명되고 그 전문이 본원에 참고로 포함되어 있는 SNAP 방법은, 핵산의 분해를 방지하는 방식 및(또는) 핵산의 추가 분석을 방해하는 샘플 내의 제제를 억제하는 방식으로 샘플로부터 핵산을 단리할 수 있게 한다. SNAP와 유사한 방법론의 표본이 되는 예시적 시판 제품은 이소코드 페이퍼(IsoCode paper)이다. 친화도 프로토콜을 SNAP 방법론과 병용함으로써, 본 발명은 복잡한 이종 샘플로부터 표적을 확인하는 매우 개선된 방법을 제공한다. 본원에 제공된 실시예에서 예시되는 바와 같이, 친화도 프로토콜과 SNAP 방법론을 둘 다 이용하면 샘플 내에서 확인된 표적의 질이 개선되며, 따라서 표적의 추가 분석이 용이해진다. 부가적으로, 조합된 방법은 SNAP 방법론 단독보다 더 감도가 높으며, 따라서 샘플 내에서 보다 낮은 농도의 표적을 확인할 수 있다.
친화도 프로토콜은 샘플 내에 존재하는 표적과 상호작용하는 기재를 사용한다. 이러한 기재는 실제로 임의의 크기 및 형태일 수 있으며, 예시적인 기재로는 비드, 튜브, 프로브, 광섬유, 플레이트, 필터, 카트리지, 커버슬립, 칩, 필름, 디쉬, 면봉, 페이퍼 또는 기타 와이프 등이 있다. 추가로, 상기 기재는 유리, 플라스틱 및 실리카를 포함하나, 이에 한정되지는 않는 임의의 다수 물질로 구성될 수 있다. 상기 기재는 자성화될 수 있다 (예를 들어, 자성을 가질 수 있음). 상기 기재는 다공성이거나 비-다공성일 수 있으며, 다공성 기재는 소정 범위의 다공도를 가질 수 있다.
친화도 프로토콜에 사용하기 위한 기재는 샘플 내에서 비-표적 물질에 비해 표적에 대해 증가된 친화도를 가져야 한다. 본원에서 상세히 설명되는 바와 같이, 몇몇 기재는 특정한 다른 표적에 비해 특정 표적에 대해 더 높은 친화도를 가지며, 당업자는 표적, 샘플 등을 비롯한 인자에 따라 특정한 기재를 용이하게 선택할 수 있다. 부가적으로, 본 발명에서는 기재의 표면이 개질되어 기재와 하나 이상의 표적 사이의 상호작용을 촉진시킬 수 있음을 고려한다. 기재의 표면에 부착되어 기재와 표적의 상호작용에 영향을 미치는 잔기는 표면 개질제라고 지칭된다. 본 발명에서는 하나 이상의 표면 개질제가 기재의 표면에 부착되어 기재와 특정 표적의 상호작용을 촉진할 수 있음을 고려한다. 예시적인 표면 개질제가 본원에 제공되며, 본 발명의 한 실시양태에서는 샘플로부터 표적을 확인 및(또는) 분리하기 위해 본원에 개시된 하나 이상의 표면 개질제로 개질된 기재가 친화도 프로토콜에 사용된다.
추가로, 본 발명에서는 기재의 칵테일을 채용하는 친화도 프로토콜을 고려한다. 예를 들어, 상기 방법에서는 상이한 표면 개질제로 개질된 2개 이상의 기재를 사용하여 2개 이상의 표적을 확인할 수 있고(있거나), 상기 방법에서는 크기, 형태 또는 조성은 상이하지만, 동일한 표면 개질제로 개질된 기재를 사용할 수도 있다.
친화도 프로토콜을 추가로 설명하기 위해, 도 1에 모식도가 제공되어 있다. 본 발명자들은 도 1에 제공된 모식화된 방법에서 추가의 분자적 분석용으로 핵산을 단리 및 제조하기 위해 친화도 프로토콜과 SNAP 방법론 둘 다를 이용하여 샘플이 분석됨을 주목하였다. 그러나, 본 발명에서는 또한 친화도 프로토콜을 단독으로 이용하여, DNA, RNA, 단백질, 세균 세포 및 포자, 바이러스, 소 유기 분자, 및 거대 화합물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 임의의 다수 표적을 분리하는 것을 고려한다.
도 1에 약술된 이론적 실시예에서, 본 발명자들은 특정 세균 표적을 함유할 것으로 의심되는 토양 샘플을 사용하였다 (단계 1). 이 토양 샘플을 채취하여 물 및 기재와 배합하였다 (단계 2). 이 실시예에서, 기재는 의심되는 세균 세포에 대해 친화도를 갖는 자성 비드였다. 토양, 물 및 비드의 슬러리를 혼합하여 기재와 표적 사이의 상호작용을 촉진시켰다 (단계 3). 단계 3의 진행 과정 동안, 샘플 내의 표적은 기재와 결합할 수 있었다. 표적과 기재의 상호작용 후에, 표적-기재 복합체를 샘플로부터 분리하였다. 이 실시예에서는 기재가 자성 비드였기 때문에, 복합체는 자석을 이용하여 용이하게 분리할 수 있었다 (단계 4). 단계 1 내지 4는 친화도 프로토콜을 요약한 것이다. 기재-표적 복합체를 분리한 후, 표적의 특정 종류 및 얻기 원하는 정보의 유형에 따라 임의의 다수 방식으로 표적을 분석할 수 있다. 한 실시양태에서, 친화도 프로토콜은 용이하게 SNAP 방법론과 조합될 수 있으며, 이에 따라 표적으로부터 핵산을 단리하고, 핵산의 분해를 억제하고(하거나) 핵산의 추가 분석을 방해하는 제제를 억제하는 조건 하에서 상기 핵산을 프로세싱할 수 있다. 단계 5 내지 7은 SNAP 방법론이 친화도 프로토콜과 조합되는 방식을 설명한다.
기재를 이용하여 샘플로부터 표적을 확인 및(또는) 분리하는 것은 무수한 용도를 지닌다. 당업자는 용어 "분리"가 본 발명에 있어서 2가지 의미를 가질 수 있음을 알 것이다. 용어 "분리"는 표적이 기재와의 결합에 의해 샘플의 나머지 성분들로부터 분리되도록 표적이 기재와 결합한 것 (예를 들어, 표적-기재 복합체의 형성)을 지칭할 수 있다. 부가적으로, 용어 "분리"는 샘플의 나머지 성분들로부터 표적 및(또는) 표적-기재 복합체를 물리적으로 제거하는 것을 지칭할 수 있다. 본 발명에서는 상기 2가지 중 어느 하나가 바람직한 실시양태를 고려한다.
본 출원은 이종 액체, 고체 또는 기체 샘플로부터 표적을 확인 및(또는) 분리하는 개선된 방법 (친화도 프로토콜)을 제공한다. 본원에 제공된 실시예로부터 이해되는 바와 같이, 친화도 프로토콜은 실험실, 병원 또는 식품 가공 플렌트와 같이 제어된 환경에서 이용될 수 있으며, 또한 덜 제어된 현장 환경에서도 이용될 수 있는 개선된 방법을 제공한다. 친화도 프로토콜은 신속한 확인 및(또는) 분리를 가능하게 하고, 이 프로토콜에서는 적용분야, 샘플 및 표적의 특정 요건에 기초하여 선택될 수 있는 임의의 다수 기재를 사용할 수 있다.
(iv) 예시적 조성물
상기 상세히 설명한 바와 같이, 친화도 프로토콜의 한 실시양태에서는 기재의 표면이 표면 개질제로 개질될 수 있다. 예시적인 표면 개질제는 코팅된 기재와 표적의 상호작용을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 표면 개질제는 다른 코팅 기재 또는 비-코팅 기재에 비해 코팅된 기재와 표적 사이의 친화도를 증가시킨다.
본 발명에서는 기재가 임의의 다수 표면 개질제로 코팅될 수 있으며, 추가로 기재가 단일 표면 개질제 또는 2개 이상의 표면 개질제로 코팅될 수 있음을 고려한다. 몇몇 표면 개질제는 특정 부류의 표적 (예를 들어, 모든 DNA 또는 모든 RNA 또는 모든 세균 세포)에 대해 친화도를 갖는 한편, 다른 표면 개질제는 특정 표적 (예를 들어, 특정 세균 또는 세균 부류의 세포 형태에 대해 특정 세균 종 또는 포자)에 대해 친화도를 가질 것으로 생각된다. 당업자는 다양한 표면 개질제를 용이하게 시험하여, 원하는 표적에 대해 원하는 친화도를 갖는 물질을 용이하게 선택할 수 있다.
원하는 표면 개질제 또는 물질의 확인 후에, 기재의 표면이 표면 개질제로 코팅되도록 임의의 다수 기재가 코팅되거나 다르게 유도체화될 수 있다. 본 발명에서는 특정 표면 개질제가 보다 용이하게 특정 기재로 코팅되거나 보다 용이하게 특정 기재와 공유결합적으로 상호작용할 수 있으며, 따라서 모든 표면 개질제가 가능한 모든 기재에 대해 적합하지 않을 수도 있음을 고려한다. 그러나, 표면 개질제로 코팅하기에 적합한 기재는, 특정 적용분야, 표적, 샘플 등에 따라 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 규소 함유 표면 개질제를 이용하여 기재의 표면을 개질시켜, 도 2에 나타내어진 표면 개질된 기재를 제공하는 것이다. 기재는 전형적으로 표면 피복량 (몰/g)으로 표현되는 표면 개질도를 갖는 임의의 개수의 표면 개질제로 개질될 수 있다. 기재는 또한 하나 이상의 표면 개질제를 순차적으로 또는 동시에 부착시킴으로써 하나 이상의 표면 개질제로 개질될 수 있다. 본 발명은 동일한 표적에 대해 친화도를 갖는 2개 이상의 표면 개질제를 사용하는 것 뿐만 아니라, 상이한 표적에 대해 친화도를 갖는 2개 이상의 표면 개질제를 사용하는 것을 고려한다.
도 2의 좌측 도면은 표면 개질제의 대표를 제공하고, 우측 도면은 개질된 기재의 대표를 제공한다. 도 2에 도시된 바와 같이 개질된 기재는 임의의 광범위한 생물학적, 환경학적 또는 화학적 샘플로부터 표적을 확인 및(또는) 분리하는데 (친화도 프로토콜) 사용될 수 있다. 편리하게는, 도 2에 나타내어진 대표는 여러 가변기를 사용하며, 본 발명은 이들 가변기가 하기한 것 중 임의의 것인 표면 개질제를 사용하는 것을 고려한다. 주어진 구조체에서, 가변기는 허용되는 원자가 및 안정성에 따라 선택된다는 것을 주의한다.
R1 = F, Cl, Br, I, OH, OM, OR, R, NR2, SiR3, NCO, CN, O(CO)R
R2 = F, Cl, Br, I, OH, OM, OR, R, NR2, SiR3, NCO, CN, O(CO)R
R3 = F, Cl, Br, I, OH, OM, OR, R, NR2, SiR3, NCO, CN, O(CO)R
M = 금속
X = NR, O
R = 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 아릴 또는 헤테로아릴, 수소
Y = 링커/스페이서 = 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 아릴 또는 헤테로아릴, 실라닐, 실록사닐, 헤테로알킬
Z = F, Cl, Br, I, OH, OM, OR, R, NR2, SiR3, NCO, CN, O(CO)R, N(CO)R, PR2, PR(OR), P(OR)2, SR, SSR, S02R, S03R
도 2의 예시는 규소 함유 표면 개질제와 기재 사이의 부착이 한 지점에서만 일어나는 것을 도시한다. R1, R2 또는 R3의 임의의 조합을 비롯하여 R1, R2 또는 R3의 치환을 통해 규소 함유 표면 개질제와 기재 사이에 2개 또는 3개의 부착점에서 부착이 일어날 수 있음이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 기재에 이미 부착된 제1 규소 함유 표면 개질제 및 제2 규소 함유 표면 개질제의 R1, R2 또는 R3의 치환을 통해 부착이 일어날 수 있다는 것 또한 당업자에게 널리 공지되어 있다. 규소 함유 표면 개질제와 기재 사이의 임의 형태의 부착 (예를 들어, 공유 또는 비공유)이 본 발명의 실시에서 허용된다.
표면 개질제는 전형적으로 하나 이상의 가수분해가능한 잔기에 결합된 규소 원자를 함유하는 커플링 영역, 임의로 Y로 도시된 스페이서/링커 영역, 및 Z로 도시된 활성 영역을 함유한다. 규소 원자는 전형적으로 Y로 도시된 스페이서 영역으로 치환되나, 상기 Y기는 임의적이며, Z가 규소에 직접 부착될 수 있다. 전형적으로, 규소는 또한 하나의 기가 가수분해가능하다면 동일하거나 상이할 수 있는 R1, R2 및 R3으로 지정된 세 개의 기로 치환된다. 가수분해가능한 기는 H, F, Cl, Br, I, OH, OM, OR, NR2, SiR3, NCO 및 OCOR일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
스페이서 영역은 전형적으로 알킬 (치환되거나 비치환됨), 알케닐, 방향족 실란, 또는 실록산 기재의 유기 잔기를 함유하며, 상기 유기 잔기는 다른 유기 잔기, 예컨대 아실 할로겐화물, 알콜, 알데히드, 알칸, 알켄, 알킨, 아미드, 아민, 아렌, 헤테로아렌, 아지드, 카르복실산, 디술피드, 에폭시드, 에스테르, 에테르, 할로겐화물, 케톤, 니트릴, 니트로, 페놀, 술피드, 술폰, 술폰산, 술폭시드, 실란, 실록산 또는 티올로 치환될 수 있다. 상기 알킬, 알케닐 또는 방향족 기재의 유기 잔기는 50개 이하의 탄소 원자를 함유할 수 있고, 더욱 바람직하게는 20개 이하의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 10개 이하의 탄소 원자를 함유한다. 상기 실란 또는 실록산 기재의 규소 잔기는 50개 이하의 규소 또는 탄소 원자를 함유할 수 있고, 더욱 바람직하게는 20개 이하의 규소 또는 탄소 원자, 가장 바람직하게는 10개 이하의 규소 또는 탄소 원자를 함유한다. Z로 도시된 활성 영역은 Y 스페이서 영역에 부착되거나, 임의로 규소에 직접 부착된다. 활성 영역은 해당 유기체 또는 생물학적 분자 (표적)를 유인하여 결합하는데 사용된다. 표적과 활성 영역의 결합은 임의의 수많은 상호작용을 통해 일어날 수 있다. 이론에 구애되는 것은 아니지만, 활성 영역과 표적 사이의 결합은 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 공유 결합 및(또는) 이온 결합을 통해 일어날 수 있다.
추가로, 활성 영역 또한 알킬, 알케닐 또는 방향족 기재의 유기 잔기를 함유할 수 있고, 상기 유기 잔기는 다른 유기 잔기, 예컨대 아실 할로겐화물, 알콜, 알데히드, 알칸, 알켄, 알킨, 아미드, 아민, 아렌, 헤테로아렌, 아지드, 카르복실산, 디술피드, 에폭시드, 에스테르, 에테르, 할로겐화물, 케톤, 니트릴, 니트로, 페놀, 술피드, 술폰, 술폰산, 술폭시드, 실란, 실록산 또는 티올로 치환될 수 있음을 주의한다. 상기 알킬, 비닐 또는 방향족 기재의 유기 잔기는 50개 이하의 탄소 원자를 함유할 수 있고, 더욱 바람직하게는 20개 이하의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 10개 이하의 탄소 원자를 함유한다.
본 발명의 제2 측면은 규소 함유 표면 개질제를 사용하여 기재의 표면을 개질시켜, 도 3에 도시된 물질을 제공하는 것이다. 이러한 본 발명의 측면에서, 표면 개질제 중 활성 영역의 개수는 1개 이상이며, 이들 각각은 스페이서 영역에 의해 분리된다. 표면 개질제 상에 1개 이상의 활성 영역을 사용할 때, 상기 활성 영역은 스페이서/링커 영역으로부터 선형 방식으로 또는 분지형 방식으로 부착될 수 있다는 것을 인식한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 활성 영역이 스페이서 영역에 부착될 수 있고, 상기 스페이서 영역 자체는 분지화될 수 있다는 것을 고려한다. 표면 개질제 상의 활성 영역의 개수는 2 내지 1000개, 바람직하게는 2 내지 100개, 더욱 바람직하게는 2 내지 20개, 가장 바람직하게는 2 내지 5개 범위의 임의의 개수일 수 있다.
표면 개질제 상의 활성 영역은 동일하거나 상이할 수 있으며, 표면 개질제 상의 스페이서 영역은 동일하거나 상이할 수 있다. 기재는 전형적으로 표면 피복량 (몰/g)으로 표현되는 표면 개질도를 갖는 임의의 개수의 표면 개질제로 개질될 수 있다. 기재는 또한 하나 이상의 표면 개질제를 순차적으로 또는 동시에 부착시킴으로써 하나 이상의 표면 개질제로 개질될 수 있다.
도 3의 좌측 도면은 표면 개질제의 대표를 제공하고, 우측 도면은 개질된 기재의 대표를 제공한다. 도 3에 도시된 바와 같이 개질된 기재는 임의의 광범위한 생물학적, 환경학적 또는 화학적 샘플로부터 표적을 확인 및(또는) 분리하는데 (친화도 프로토콜) 사용될 수 있다. 편리하게는, 도 3에 나타내어진 대표는 여러 가변기를 사용하며, 본 발명은 이들 가변기가 하기한 것 중 임의의 것인 표면 개질제를 사용하는 것을 고려한다. 주어진 구조체에서, 가변기는 허용되는 원자가 및 안정성에 따라 선택된다는 것을 주의한다.
R1 = F, Cl, Br, I, OH, OM, OR, R, NR2, SiR3, NCO, CN, O(CO)R
R2 = F, Cl, Br, I, OH, OM, OR, R, NR2, SiR3, NCO, CN, O(CO)R
R3 = F, Cl, Br, I, OH, OM, OR, R, NR2, SiR3, NCO, CN, O(CO)R
M = 금속
X = NR, O
R = 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 아릴 또는 헤테로아릴, 수소
Y = 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 아릴 또는 헤테로아릴, 실라닐, 실록사닐, 헤테로알킬
Z = F, Cl, Br, I, OH, OM, OR, R, NR2, SiR3, NCO, CN, O(CO)R, N(CO)R, PR2, PR(OR), P(OR)2, SR, SSR, SO2R, S03R
도 2에 나타내어진 개질제, 도 3에 나타내어진 개질제 또는 다른 개질제로 개질된 기재에 대하여, 본 발명은 임의의 기재가 개질될 수 있다는 것을 고려한다. 추가로, 기재의 크기 및 형태는 기술의 특별한 적용에 기초하여 변경 및 선택될 수 있다. 예시적인 형태로는 구형, 불규칙형 및 로드형이 있으며, 크기 및 형태에 대해서는 평균적인 기재의 크기 및 형태를 참조한다. 기재는 고체, 벽공 또는 다공성일 수 있으며, 당업자라면 이러한 형태가 기재의 표면적에 영향을 주어, 가능한 피복량에 영향을 미칠 수 있다는 것을 잘 알 것이다. 기재 크기는 평균 근처에서 다양할 수 있으며, 본 발명의 일부 측면에서는 여러 크기의 기재의 혼합물이 유리할 수 있다는 것을 이해하도록 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 다양한 크기의 코팅된 비드의 사용이 유리할 수 있다. 일반적으로, 기재 크기는 0.01 내지 100 mm일 수 있다. 몇몇 적용에서, 기재 직경은 0.5 내지 10 mm, 1 내지 5 mm, 또는 1 내지 2 mm일 것이다. 다른 적용에서는, 기재 직경이 0.01 내지 500 ㎛, 0.1 내지 120 ㎛, 또는 1 내지 50 ㎛인 것이 바람직할 것이다. 그러나, 본 발명은 추가로 플레이트 및 디쉬와 같이 보다 큰 표면을 개질하는 것 뿐만 아니라, 보다 대규모의 산업적 적용을 위해 본 발명의 방법 및 조성물을 개조하는 것을 고려한다.
기재는 임의의 물질로 제조될 수 있다. 바람직한 기재는 금속 산화물, 수산화물 또는 할로겐화물로 전체적으로 또는 부분적으로 이루어진 표면을 갖는다. 당업자라면 임의의 금속 산화물 표면이 본래 또는 금속 산화물의 부분 가수분해 처리를 통해 수산화물 관능기를 함유할 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 임의의 금속 할로겐화물 또한 본래 또는 금속 할로겐화물의 부분 가수분해 처리를 통해 수산화물 관능기를 함유할 수 있다. 또한, 유기 표면에 수산화물 잔기가 존재하거나 잠재적인 형태로 있다면, 이러한 유기 표면을 본 발명에 사용할 수 있다. 바람직한 물질은 규소 산화물 또는 규소 수산화물을, 다른 금속 또는 금속 산화물 또는 금속 할로겐화물의 존재 또는 부재하에 함유하는 물질이다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 추가의 기재로는 유리 및 플라스틱이 있다.
본 발명의 몇몇 측면에서, 기재가 자기장으로 유인된다는 점에서, 기재는 기재를 상자성 (본원에서 프로세싱 자성 특성으로 지칭됨)으로 만들기에 충분한 양으로 물질을 함유할 것이다. 본 발명의 바람직한 형태에서 기재는 철, 니켈 또는 코발트를 함유할 것이며, 더욱 바람직한 형태에서 기재는 철 또는 철 산화물을 함유할 것이다. 이러한 측면에서, 자기장이 자성 기재를 다른 비-자성 물질로부터 분리하는데 이용될 수 있다는 점에서, 상자성 기재를 사용하는 것이 유리하다.
본 발명의 몇몇 다른 측면에서, 기재는 줄이 기재를 통해 통과할 수 있도록 천공을 함유할 것이다. 이러한 줄, 테더(tether) 또는 다른 연결 수단은 기재들을 함께 연결할 수 있고, 기재 또는 기재-표적 복합체의 차후의 회수를 용이하게 하는데 사용될 수 있다.
표면 개질제의 활성 영역을 기재로부터 분리하는 것이 유리할 것이라는 본 발명의 측면이 있다. 따라서, 본 발명은 절단가능한 링커를 함유하는 개질제를 고려한다. 절단가능한 링커의 존재는 개질제 + 표적의 활성 영역을 기재의 나머지 부분으로부터 방출시키는 것을 가능하게 한다. 이러한 방식으로 표적을 방출시키는 능력은 표적에 대한 추가의 분석을 매우 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 표적을 방출시키는 이러한 능력은 기재와 표적 사이의 회합이 매우 강한 경우에 특히 중요할 수 있다.
분리 방법으로는 표적 및 활성 영역을 유인하는 결합력을 파괴하거나 반대로 만드는 임의의 가공법 또는 화학물질로 표면 개질된 기재를 처리하는 것이 포함될 수 있다. 상기 방법에는 pH 또는 염 농도를 변경시키고, 복합체를 열에 노출시키고, 복합체를 빛에 노출시키는 것이 포함된다. 이러한 방법의 사용이 개질제 자체를 붕괴시키거나 절단하지는 않으며, 오히려 개질제에는 아무런 손상을 주지 않고 활성 영역으로부터 표적을 방출시킨다는 것을 주의한다.
다른 측면에서, 본 발명은 표적의 방출이 개질제 중 소정 부위 내에서의 절단 (예를 들어, 링커의 절단 및 활성 영역 + 표적의 방출)과 관련 있다는 것을 고려한다. 이는 스페이서 영역에서 공유 결합을 절단하여 표면 개질제의 활성 영역을 기재로부터 분리함으로써 달성될 수 있다. 이는 또한 커플링 영역에서의 공유 결합을 절단하여 표면 개질제의 활성 영역을 기재로부터 분리함으로써 달성될 수 있다. 개질제 내에서의 절단을 유도하는데 사용될 수 있는 방법의 특별한 특정 예는 실시예에서 확인할 수 있다.
(v) 예시적인 스크리닝 검정법
본 발명은 샘플로부터 표적을 확인하고(하거나) 분리하기 위한 친화도 프로토콜을 제공한다. 기재는 특정한 표적과 기재의 상호작용을 더욱 촉진시키는 임의의 다양한 방식으로 개질될 수 있다. 예를 들어, 기재의 표면은 하나 이상의 표면 개질제, 예컨대 본원에 제공된 아민-함유 개질제로 개질될 수 있다.
표적과 개질된 기재의 상호작용을 촉진시키는 수많은 표면 개질제의 확인의 전재하에, 본 발명은 개질제로서 사용될 수 있는 추가의 개질제를 확인하는 스크리닝을 고려한다. 기재 코팅의 비교적 효율적인 평가를 가능하게 하는 적절한 검정법 또는 검정법들과 관련하여, 당업자들은 임의의 수많은 코팅을 용이하게 스크리닝하고, 기재와 특정한 표적의 상호작용을 촉진시키는데 유용할 수 있는 코팅을 확인할 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 DNA, RNA, 세균 세포 및 포자, 또는 특정한 세균 세포 또는 포자와 기재의 상호작용을 촉진시키는 코팅을 특이적으로 스크리닝할 수 있다.
본 발명자들은 친화도 프로토콜에 사용하기 위한 표면 개질제를 효율적으로 확인하는데 사용될 수 있는 여러 스크리닝 검정법을 제공한다. 후보 표면 개질제로 개질된 기재는 이러한 임의의 검정법을 이용하여 스크리닝할 수 있으며, 하나 이상의 후보 표면 개질제로 코팅된 기재가 표적과 상호작용하는 능력을 평가할 수 있다. 비-코팅된 기재에 비해 보다 높은 친화도로 특정한 표적과 상호작용하는 후보 개질제로 코팅된 기재는 그들의 표적 특이성, 제작 용이성 등을 측정하기 위해 추가로 분석될 수 있다.
검정 1 - 유동 세포측정 스크리닝 검정법. 도 4에 개략적으로 나타내어진 하기 프로토콜은 수많은 후보 기재 코팅의 유용성을 용이하게 평가하는데 사용될 수 있는 대표적인 검정법이다. 세균을 적절한 조건하에 후기 대수 증식기 또는 정지기까지 배양하고, 형광 염색하였다. 세균의 샘플 (105 내지 107개의 세포/ml는 15％ 미만의 표준 편차를 제공함)을 유동 세포측정기를 이용하여 카운팅하여 초기 농도를 수득하였다. 세균을 다양한 pH (2, 7, 10)의 소정 부피의 인산염-완충된 염수 (PBS) 중에서 또는 탈이온수 (pH 5) 중에서 코팅된 기재와 혼합하였다. 기재 코팅에 따라, 일부 세균은 비드에 부착할 것이다. 기재와 표적을 혼합한 후, 샘플을 5 ㎛ PVDF 시린지 필터 (밀리포어(Millipore))를 통해 천천히 여과하여, 세포와 결합된 기재를 제거하고, 유리 세포가 필터를 통과하여 튜브로 들어가게 하였다. 필터 크기는 효율적인 분리를 위해 표적 크기 및 비드 크기를 기준으로 조정될 수 있다. 필터를 통과한 비결합 세균을 유동 세포측정에 의해 분석하고, 비드에 의해 제거된 세균의 백분율을 계산하였다 (도 4). 세균의 샘플은 또한 대조군으로서 기재가 첨가되지 않은 동일한 유형의 필터에 통과시켰다.
이러한 유형의 검정법을 이용하여, 매우 수많은 기재 코팅을 신속하게 평가하고 비교할 수 있다. 추가의 분석에 이용될 수 있는 후보 코팅은 비-코팅된 기재에 비해 세균 세포가 보다 용이하게 결합하는 (예를 들어, 표적과 기재 사이의 상호작용을 촉진시키는) 것이다.
유동 세포측정에 의한 세균의 카운팅은 샘플들 사이에서 재현가능하게 확인되었고, 유동 세포측정에 의해 계산된 세포 밀도는 광현미경에 의해 측정하여 예측된 세포 밀도와 2 표준 편차 내에서 일치하였다.
검정 2 - 형광 스크리닝 검정법. 도 5에 개략적으로 나타내어진 하기 프로토콜은 수많은 후보 기재 코팅의 유용성을 용이하게 평가하는데 사용될 수 있는 대표적인 두번째 검정법이다. 핵산에 대한 기재의 친화도를 정량화하기 위해, 특정한 코팅된 기재에 의해 포획된 dsDNA의 백분율을 정량화하는데 사용될 수 있는 형광 기술이 개발되었다. 이 검정법의 중요한 용도는 표면 개질제로서 사용하는데 있어서 현재 유용하고 신규한 코팅을 평가하는 것이다.
원심분리 튜브에 적합한 부피의 적절한 혼합 완충액을 넣었다. 완충액은 특정한 샘플 및 표적을 기준으로 선택될 수 있다. 임의의 기재를 첨가하기 전에 dsDNA의 양을 측정하였다. 시험관내 스크리닝 검정을 위해서는, 50 pg/ml 내지 1 ㎍/ml의 dsDNA 출발 농도가 적절하다. 피코-그린(Pico-green) dsDNA 삽입 염료를 상기 dsDNA에 첨가하였다. 피코-그린은 488 nm의 파장에서 여기 및 522 nm의 파장에서 방출을 갖는다. 다른 형광 삽입 염료 또한 사용할 수 있으며, 당업자는 실험실 분석의 용이성을 위해 적절한 여기 및 방출 특성을 갖는 염료를 선택할 수 있다. 일반적으로 사용되는 다른 형광 삽입 염료로는 아크리딘 오렌지, 프로피듐 요오드, DAPI, SYBR 그린 1, 및 에티듐 브로마이드가 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 염료를 첨가한 후, 염료와 DNA를 혼합하고, 형광을 측정하였다. 이는 분석을 위한 기준을 제공한다.
코팅된 기재를 표지된 DNA 샘플에 첨가하고, 기재와 샘플을 혼합하였다. 대략 30초 동안 진탕하고 와동시켜 부착이 일어나게 하였다. 원심분리 또는 정치에 의해 기재를 유리 DNA로부터 분리시키고, 용액 중에 남아있는 DNA의 형광을 측정하였다.
코팅된 기재의 첨가 전후의 DNA 혼합물의 형광을 비교함으로써, 각각의 코팅된 기재의 포획 효율을 정량화할 수 있다. 이는 임의의 수많은 기재 코팅의 평가를 가능하게 한다.
검정 3 - PCR 스크리닝 검정법. PCR 또한 코팅된 기재의 첨가 전후의 샘플의 주기수를 측정함으로써 부착량을 측정하는데 이용될 수 있다. 상기 방법의 단계는 삽입 염료로 DNA를 염색할 필요가 없다는 것을 제외하고는 형광 검정에 대해 상기 설명한 것과 유사하다. DNA 초기 원액의 샘플, 및 기재 첨가 및 혼합 후에 제거된 상등액의 샘플을 PCR에 의해 비교하였다. 기재의 첨가 후에 샘플로부터 DNA를 증폭시키는데 필요한 주기수의 증가는 DNA가 기재에 부착하였다는 것을 나타낸다.
(vi) 예시적인 기기
본 발명은 두가지 부류의 기기를 제공한다. 제1 부류의 장치는 개질된 기재와 다량의 샘플의 효율적인 상호작용을 용이하게 하도록 디자인된다. 이러한 장치는 특정한 표적을 함유하는 샘플과 기재가 용이하게 접촉하는 것이 어려울 수 있는 대규모의 산업적 환경에 친화도 프로토콜을 적용하는데 유용하며, 표적이 전체 샘플을 통해 균일하게 분포되지 않을 수 있을 때 특히 중요하다.
본원에 상세하게 기재된 친화도 프로토콜 및 친화도 자기 프로토콜은 액체, 슬러리 및 공기와 같은 물질로부터 표적을 포획하기 위해 비드와 같은 기재를 이용한다. 기재-표적 상호작용 및 비드 표면 상의 포획 효율을 최대화하기 위해 다량의 샘플 물질을 효과적으로 혼합할 필요가 있다. 제I 부류의 본 발명의 장치는 점성 슬러리를 혼합하기 위한 공지된 기술의 변형법에 기초하여 디자인되었다. 이들 기술은 카오스 혼합의 원리를 이용하며, 저널 베어링 유동(journal bearing flow)으로도 공지되어 있다 (이는 저널 베어링 (축에 대하여 회전하는 고체 샤프트를 둘러싸는 중공 실린더)에서 유체의 유동을 나타낸다). 저널 베어링 유동은 전형적으로 오일 및 시멘트와 같은 점성 유체를 다량으로 (수 갤론) 혼합하는데 이용된다. 원리는 제1 실린더 내부에 제2 실린더를 넣음으로써 형성된 원환부(annulus)를 구비한 실린더 용기에 물질을 넣는 것이다. 두개의 실린더는 서로에 대해 편심적으로 배열되고, 느린 속도 (전형적으로 20회 회전/분)로 수직 축에 대해 병류로 또는 역류로 회전한다. 느린 회전은 원환부 내의 물질이 연장되고 중첩되어, 물질 중의 임의의 두개의 입자들 사이의 상호작용 거리가 감소되게 한다. 수차례의 회전 과정에 걸쳐, 효율적인 혼합이 달성될 수 있다. 도 6은 실린더의 구조를 나타내고, 혼합 후의 매우 균일한 입자 분포를 입증하는 시뮬레이션의 결과를 도시한다.
도 7은 토양 샘플 내의 표적을 분석할 때 상기 원리를 특정한 시나리오에 적용하는 것을 개략적으로 나타낸다. 샘플 및 기재를 물과 혼합하여 슬러리를 형성한다. 기재를 카오스 혼합 방법을 이용하여 샘플을 통해 혼합하였다. 그 후, 기재를 샘플로부터 추출하여, 물 또는 다른 완충액으로 방출시킨다.
기재와 샘플의 혼합을 용이하게 하기 위해 디자인된 특정한 기기는 본원의 실시예 부분에서 상세히 기재된다. 또한, 본원의 실시예는 대표적인 시나리오에서 이 장치의 성능을 입증하는 데이터를 제공한다. 본 발명은 "제I 부류의 기기", "제I 부류의 장치", "카오스 혼합 기기" 또는 "카오스 혼합 장치"로서 지칭되는 상기 부류의 장치에 대한 다양한 변형예를 고려한다. 장치는 실제로 임의의 크기를 가질 수 있고, 장치의 크기는 동반되어야 할 샘플의 총 부피에 따라 규모가 커지거나 작아질 수 있다. 장치의 중요한 측면은 그의 전체적인 크기가 아니라, 오히려 (a) 편심적으로 위치하는 두개의 실린더의 존재, (b) 내부 실린더보다 더 큰 외부 실린더, 및 (c) 비교적 느린 속도의 실린더의 회전이다. 실린더는 크기 및 형태가 다양할 수 있고, 두개의 실린더가 동일한 형태를 가질 필요는 없다. 추가로, 실린더 중 하나 또는 둘다는 내부 실린더의 외부 표면 및(또는) 외부 실린더의 내부 표면에 예를 들어 핀, 날개 또는 립을 첨가하여 그의 표면적을 증가시킬 수 있다. 이러한 핀 또는 날개는 표면적을 증가시킬 뿐만 아니라, 혼합하는 동안 샘플의 수직 순환을 증가시켜서, 기재-표적 상호작용을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 실린더가 충실형(solid) 또는 중공형일 수 있고, 실린더가 충실형이어야 하는지 중공형이어야 하는지의 여부는 실린더의 크기 및 실린더를 제작하는데 사용되는 물질을 기초로 결정할 수 있다는 것을 고려한다. 이들 인자는 실린더의 중량 및 강도 뿐만 아니라, 그들의 제작 비용에도 영향을 미칠 것이다. 실린더는 임의의 수많은 물질로부터 제작될 수 있고, 두개의 실린더가 동일한 물질로 제작될 필요는 없다. 상기 물질은 실린더의 크기 및 형태 뿐만 아니라, 특정한 유형의 샘플, 기재 및 표적을 기준으로 선택될 수 있다. 예시적인 물질로는 테플론, 스테인리스 스틸, 철 또는 다른 금속, 및 플라스틱이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 추가로, 본 발명은 실린더가 금, 백금, 철, 테플론 등과 같은 물질로 도금되어, 실린더의 특정한 특성을 향상시킬 수 있다는 것을 고려한다.
실린더의 회전은 동일한 방향이거나 반대 방향일 수 있다 (예를 들어, 두 실린더가 모두 시계 방향으로 회전할 수 있거나, 두 실린더가 모두 시계 반대 방향으로 회전할 수 있거나, 한 실린더는 시계 방향으로 회전하는 반면 다른 실린더는 시계 반대 방향으로 회전할 수 있음). 실린더의 회전은 5 내지 50 rpm, 바람직하게는 10 내지 20 rpm 범위의 비교적 느린 속도로 수행해야 한다. 예시적인 장치에서 실린더의 회전은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 rpm으로 수행되어야 하나, 본 발명은 특정 샘플, 혼합될 총 부피 및 특정 표적을 기준으로 최적의 회전을 선택할 수 있음을 고려한다.
추가로, 본 발명은 변화하는 외부 자기장, 예를 들어 외부 실린더에 대해 외부의 회전 자기장을 이용함으로써, 혼합물을 통해 순환될 때의 비드의 동력학에 영향을 줄 수 있음을 고려한다. 이는 기재가 자성 (예를 들어, 코팅 또는 비-코팅 자성 비드)을 가질 때 특히 유용할 수 있다. 상기 장치에 자기장을 사용하는 추가 적용에서, 내부 실린더는 철-기재의 코어 주위에 감긴 와이어의 코일을 가진 전자석으로서 구축됨으로써 이중의 목적을 제공할 수 있다. 전자석이 활성화되는 경우, 내부 실린더는 자성이 있는 기재를 사용하는 실시양태에서 기재에 대한 수집 로드로서 작용할 수 있다. 이러한 방법으로, 내부 실린더는 기재와 표적의 혼합을 촉진하는 기구로서, 그리고 혼합 후 기재-표적 복합체를 수집하기 위한 수단으로서 2가지 기능을 제공할 수 있다.
본 발명은 추가로 제2 부류의 장치를 고려한다. 상기 장치는 하나 이상의 기재를 함유하는 필터 또는 카트리지를 포함한다. 표적과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 기재를 함유하는 필터 및 카트리지의 디자인은 다양한 공기 및 액체 샘플의 모니터링 및 분석을 용이하게 할 것이다. 예를 들어, 이러한 필터 및 카트리지로 인해 저수조 및 스트림내 물의 분석 뿐만 아니라 빌딩, 비행기 및 대중 교통 차량 내에서 순환하는 공기의 보다 상세한 분석이 가능해질 것이다.
본 발명은 친화도 프로토콜-개조된 필터 및 카트리지를 단독으로, DNA의 분석을 용이하게 하는 종래에 개시된 필터 및 카트리지와 조합하여 (US 공개 제2003/0129614호 참조, 그 전문이 본원에 참고로 포함됨), 그리고 공기 및 물을 분석하는 데에 사용되는 다른 시판되는 필터 (예를 들어, HVAC 공기 필터, HEPA 필터, 숯-기재의 물 필터 등)와 조합하여 사용할 수 있음을 고려한다.
도 27 내지 30은 몇몇 예시적인 필터 및 카트리지 디자인의 도면을 제공한다. 그러나, 본 발명은 소정 범위의 필터 및 카트리지 디자인을 고려한다. 몇몇 실시양태에서, 카트리지 또는 필터는 다수층의 기재를 함유한다. 각 층은 동일한 기재 또는 상이한 기재를 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 카트리지 또는 필터는 오직 단일층만을 함유하나, 상기 단일층이 임의로 다수의 기재 또는 다수의 표면 개질제로 개질된 단일 기재를 함유할 수 있다.
특히, 본 발명의 모든 기재 및 개질된 기재와 함께, 친화도 프로토콜 개조된 필터 및 카트리지를 소정 범위의 조건하에서 사용할 수 있고, 분석을 위해 용이하게 변화 또는 프로세싱할 수 있으며, 작업대에서 (예를 들어, 의원, 병원, 실험실, 프로세싱 플렌트에서) 또는 현장에서 (예를 들어, 오염이 의심되는 곳, 공항의 활주로, 범죄 현장에서) 사용할 수 있다.
이제 본 발명을 일반적으로 기술하며, 이는 하기 실시예를 참고로 보다 쉽게 이해될 것이고, 하기 실시예는 본 발명의 특정 측면 및 실시양태를 단지 예시하기 위하여 포함될 뿐 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1: 친화도 프로토콜의 적용
상기 상세히 설명한 바와 같이, 친화도 프로토콜은 샘플 중의 표적을 확인하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 상기 프로토콜은 단독으로 또는 SNAP 방법과 조합하여 사용할 수 있고, 다양한 샘플 어레이로부터 다양한 표적을 확인하는데 사용할 수 있고, 다양한 기재와 함께 사용할 수 있다. 특정 표적을 확인하기 위해 유용할 수 있는 한 기재는 시판되는 자성 비드이다. 이러한 비드는 다수의 제조사로부터 입수가능하고, 소정 범위의 크기 및 형태가 존재하며, 다수의 물질로 이루어진다. 상기 인자 각각은 특정 표적, 샘플 및 다른 인자를 기초로 최적화될 수 있다.
하기 방법론은 친화도 프로토콜에서 시판되는 자성 비드를 기재로서 사용하기 위해 이용되는 방법론을 간략히 요약한다. 시판되는 자성 비드는 완충액 중에서 운송된다. 사용 전에, 비드를 하기와 같이 세척하였다: 1 mL 자성 비드를 마이크로원심분리 튜브에 넣고, 최대 (14,000 rpm) 마이크로원심분리 속도로 비드를 펠렛화하고, 상기 비드 펠렛으로부터 모든 액체를 제거하고, 증류수 중에 재현탁시키고, 필요하다면 이를 반복하여 비드를 세척하였다.
도 1에 개략적으로 약술한 바와 같이, 액체 샘플에 대해 친화도 프로토콜을 수행하기 위해서는, 해당 특정 표적을 함유하는 액체 샘플을 수득해야만 한다. 샘플을 잠깐 와동시켜 혼합하고, 샘플의 일부를 마이크로원심분리 튜브에 넣었다. 토양 샘플과 같은 고체 샘플일 경우에는, 샘플을 수득하여 마이크로원심분리 튜브에 넣었다. 여과된 증류수를 샘플에 첨가하고 혼합하여 슬러리를 형성하였다.
샘플의 초기 제조 후, 준비된 자성 비드를 샘플을 함유하는 튜브에 첨가하고, 튜브를 닫았다. 샘플 및 비드를 보유한 튜브를 10 내지 20분 동안 회전 혼합기에 두었다. 모든 비드가 확실히 이동하기에 충분한 시간을 소요하여, 수집용 자석을 이용하여 비드를 튜브의 가장자리로 잡아끌었다. 수집 시간은 10 내지 20초이어야 한다. 필터 팁이 있는 피펫을 이용하여, 튜브의 가장자리에서 수집된 자성 비드의 펠렛을 휘젓지 않도록 주의하면서, 적은 부피의 액체를 제외한 모든 액체를 튜브에서 제거하였다. 이전의 단계에서 남겨둔 적은 부피의 액체를 이용하여 (표적에 결합되어야만 하는) 기재를 부드럽게 재현탁시켰다. 표적-기재 복합체를 재현탁시킨 후, (표적-기재 복합체를 함유하는) 모든 액체를 제거하고, 이소코드 페이퍼와 같은 시판되는 매체에 도포하였다 (이로써 샘플에서 SNAP 방법을 수행할 수 있음).
상기 상세히 설명한 친화도 프로토콜 단계 후에, 샘플로부터의 핵산을 이소코드 페이퍼 또는 다른 SNAP 방법론을 이용하여 프로세싱할 수 있고, 그 후 PCR 또는 핵산 분석을 위해 통상적으로 사용되는 다른 기술을 통해 핵산을 분석할 수 있었다. 간략하게, 하기 4가지 방법 중 하나를 이용하여 이소코드 페이퍼 3벌을 디 쉬에서 건조시켰다: 3벌의 디쉬 (덮지 않음)를 진공 오븐에서 60±5 ℃에서 15분 동안 두거나, 3벌의 디쉬 (덮지 않음)를 인큐베이터에서 60±5 ℃에서 15분 동안 두거나 (습윤 트레이에 물이 없음을 확인함), 3벌의 디쉬 (덮지 않음)를 완전히 건조될 때까지 실온에서 생체안전 후드에 두거나, 또는 3벌의 디쉬 각각을 완전히 건조될 때까지 실온에서 건조제 다발이 있는 실링된 파우치에 두었다. 샘플이 건조된 후, 이소코드로부터의 표적의 용리를 위해 SNAP 프로토콜로 계속 프로세싱하고, PCR 또는 다른 통상적으로 사용되는 분자 생물학적 접근법으로 핵산을 분석하였다.
실시예 2: 표면 개질제의 예비 분석 - 시판되는 기재의 분석
다양한 코팅 및 크기의 19개의 시판되는 자성 비드 (표 1)의 초기 스크리닝을 수행하여 친화도 프로토콜에서의 그의 유용성을 확인하였다. 목표는 어떤 시판 비드가 SNAP 프로토콜 단독 사용에 의해 달성되는 것에 비해, 신호를 증가시킴에 있어서 (PCR을 이용하여 주기수를 감소시킴) 최상의 전체 효율을 제공하는지를 결정하는 것이다. 다양한 샘플로부터 핵산을 분리 및 확인시, 효율 증가를 제공하는 시판되는 기재 및 코팅의 특성 확인은 추가의 기재 및 코팅의 디자인을 위한 근본적 전략을 개발하기 위해 사용될 수 있다. 시판되는 비드를 이용하는 본 실험에서, 각 비드의 효능을 SNAP만을 이용하는 표적의 분석과 비교하여 평가하였다. 각 비드의 결합 효율은 하기 기재하는 형광 검정법 및 유동세포측정 검정법을 이용하여 평가하였다.
시판되는 자성 비드
비드 번호 회사 설명 크기(㎛)
1 코텍스 바이오켐 (Cortex Biochem) PS-DVB-아민-아미드 3.2
2 코텍스 바이오켐 PS-DVB-COOH-아릴 산 3.2
3 코텍스 바이오켐 숯상 폴리아크릴아미드 1-25
4 코텍스 바이오켐 셀룰로스 1-10
5 코텍스 바이오켐 아크롤레인 1-10
7 AB 진(Gene) 폴리스티렌-COOH 3.5
8 MPG 실리카 0.5-5.0
9 바이오소스(BioSource) 스트렙타비딘 1
10 벅스 엔 비즈 (Bugs n' Beads) 폴리비닐알콜 ~1
11 디나비즈(Dynabeads) PS-아민 2.8
12 폴리사이언시즈 (Polysciences) COOH ~1
13 폴리사이언시즈 COOH ~1
14 스페로테크(Sperotech) PS-COOH(매끄러움/캡핑/엑스링크 없음) 3.0-3.2
15 스페로테크 PS-COOH(캡핑/엑스링크 없음) 3.0-3.2
16 스페로테크 PS-COOH(캡핑/엑스링크 없음) 1.5-1.9
17 스페로테크 PS-COOH(캡핑/엑스링크 없음) 1.1-1.4
18 스페로테크 PS-COOH(캡핑/엑스링크 없음) 4.0-4.5
19 스페로테크 PS(캡핑/엑스링크 없음) 4.0-4.5
코텍스 바이오켐 카르복시메틸 셀룰로스 (양이온 교환) 1-10
코텍스 바이오켐 디에틸아미노에틸 셀룰로스 (음이온 교환) 1-10
코텍스 바이오켐 스트렙타비딘의 아민 전구물 ~1
간략하게, 도 8은 시판되는 자성 비드의 분석 결과를 요약한 것이다. 데이터를 SNAP 단독에 의해 분석된 샘플에 대한 신호로 정규화하였고, 도면에 제시된 그래프는 어떤 비드가 SNAP 단독에 비해 신호를 증가시켰는지를 입증한다. 토양 샘플을 토양 g 당 104개 세포의 무성 비. 안트라시스(B. anthracis)로 접종하였다. 토양 샘플을 다양한 친화도를 갖는 세균 세포와 결합된 비드와 접촉시켰다.
도 8은 친화도 프로토콜과 SNAP 기술의 조합이 SNAP 단독에 비해 샘플의 분석을 향상시킴을 증명한다. 또한, 도면은 특정 표면 개질제가 기재와 표적 사이의 상호작용을 추가로 향상시킬 수 있음을 입증한다.
또한, 본 발명자들은 다수의 시판되는 비-자성 비드를 시험하였다. 다수의 비드를 초기에 스크리닝하였지만, 오직 50 ㎛ 크기의 비드만을 직접 비교하고 데이터를 기록하였음을 주의한다.
시판되는 비-자성 비드
비드 번호 회사 설명 크기 (㎛)
1 알드리치(Aldrich) 아미노프로필 실리카 (NH2) 50
2 알드리치 클로로프로필 실리카 (Cl) 50
알드리치 셀라이트 n/a
3 YMC 디올(OH2) 50
4 YMC 실리카 (YMC) (SiO) 50
알드리치 암버리스트 36 강한 음이온 교환 ＞1㎛
알드리치 암버라이트 ICR 양이온 교환 ＞1㎛
알드리치 암버라이트 IRC 음이온 교환 ≥1㎛
알드리치 중성 알루미나 25-50
알드리치 약간 산성 알루미나 25-50
알드리치 산성 알루미나 25-50
알드리치 염기성 알루미나 25-50
5 YMC 아민 (NH2) 50
YMC 아민 (NH2) 10
6 CPG 아미노프로필 (NH2) 40-70
7 CPG 장쇄 아민 (15A) (NH2) 40-70
8 CPG 글리세릴 (OH2) 40-70
9 CPG 카르복실 (COOH) 40-70
10 CPG 카르복실메틸 (COOMe) 70-120
11 CPG 실리카 (SiO) 40-70
상기 비드를 샘플과 함께 인큐베이션한 후 비드에 부착된 DNA의 백분율을 측정함으로써 비드의 효능을 평가하였고, 그 결과를 도 9에 요약하였다. 아민-관능화된 비드가 기재와 DNA의 상호작용을 증가시킴을 주목한다. 따라서, 본원에 상술한 바와 같이, 본 발명은 다양한 다른 아민-관능화된 표면 개질제를 디자인하였고, 다른 아민-관능화된 표면 개질제가 기재와 표적 - 특히 기재와 핵산 사이의 상호작용을 촉진하도록 디자인될 수 있음을 고려한다.
본 실험에서는 기재와 DNA 사이의 상호작용을 직접 시험하였지만, 기재와 다른 핵산, 예를 들어 RNA의 상호작용도 또한 평가할 수 있음을 주목한다. RNA의 화학적 구조를 기초로, DNA와 상호작용하는 기재는 RNA와 상호작용할 가능성이 있고, 샘플로부터 표적 RNA를 분리하는데 사용할 수 있다. RNA가 표적인 방법론은 일반적으로 DNA보다 덜 안정한 RNA의 분해를 방지하기 위해 추가로 변형될 수 있다.
실시예 3: 아민-함유 표면 개질제의 제조
다양한 시판 코팅을 함유하는 시판 비드 (예를 들어, 기재)를 분석한 후, 다양한 신규의 코팅된 기재를 제조하여 친화도 프로토콜에서 상기 코팅된 기재의 유용성을 평가하였다. 구체적으로, 아민 함유 표면 개질제에 촛점을 맞추었으나, 다른 부류의 표면 개질제를 이용하여 유사한 실험을 용이하게 수행할 수 있었다. 본원에 상술한 바와 같이, 다수의 표면 개질제를 제조하고, 상기 개질제를 사용하여 다양한 크기, 형태 및 물질의 기재를 개질시켰다.
A. 50 ㎛ 표면 개질된 실리카 겔의 제조
워터스 코포레이션으로부터 구입한 50 ㎛ 입자 크기의 실리카 겔 (YMC-겔 실리카) 2.0 g 및 이소프로필 알콜 20 ml로부터 슬러리를 제조하였다. 슬러리에 표면 개질제 10 mmole을 첨가하였다. 슬러리를 16시간 동안 부드럽게 교반한 후, 여과하였다. 실리카 겔을 이소프로필 알콜 20 ml에 재현탁시키고, 2회 더 여과하여 미반응 표면 개질제를 제거하였다. 표면 개질된 실리카 겔을 밤새 50℃에서 진공 오븐 중에서 건조시켰다. 표면 개질 정도를 열중량 분석으로 결정하였다. 표 3에는 사용된 표면 개질제 및 개질된 50 ㎛ 입자 크기의 실리카 겔에 대해 측정된 표면 피복을 나열하였다. W 명칭는 생성된 기재가 개질된 워터스 코포레이션 실리카 겔임을 나타내고, 영어 철자는 사용된 표면 개질제를 나타내기 위해 사용하였다.
샘플 표면 개질제 표면 피복 (mmole/gm)
W-A 3-아미노프로필트리메톡시실란 1.00
W-B (3-트리메톡시실릴프로필)디에틸렌트리아민 0.63
W-C N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란 0.76
W-D N-트리메톡시실릴프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 0.61
W-E 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란 0.45
W-F (N,N-디메틸아미노프로필)트리메톡시실란 0.79
W-G N-(3-트리에톡시실란프로필)-4,5-디히드로이미다졸 0.50
W-H 2-(트리메톡시실릴에틸)피리딘 0.46
W-I (아미노에틸아미노메틸)펜에틸트리메톡시실란 0.75
W-J 2-(디페닐포스피노)에틸트리에톡시실란 0.29
W-K 테트라데실디메틸(3-트리메톡시실릴프로필)암모늄 클로라이드 0.30
W-L 디에틸포르파토에틸트리에톡시실란 0.33
W-M 3-머캅토프로필트리메톡시실란 0.47
W-N N-페닐아미노프로필트리메톡시실란 0.09
W-O N-(6-아미노헥실아미노프로필트리메톡시실란트리메톡시실란 0.66
W-R N-(트리메톡시실릴프로필)에틸렌디아민, 트리아세트산, 삼나트륨 염 0.15
W-S N-(2-아미노에틸)-11-아미노운데실트리메톡시실란 0.67
W-T N-(3-트리에톡시실란프로필)글루콘아미드 0.66
W-U N-(트리에톡시실란프로필)-O-폴리에틸렌 옥시드 우레탄 0.15
W-V 3-(트리히드록시실릴)-1-프로판술폰산 0.09
W-W 카르복시에틸실란트리올 0.24
W-X N,N-디데실-N-메틸-N-(3-트리메톡시실릴프로필)암모늄 클로라이드 0.37
W-Y 2-[메톡시(폴리에틸렌옥시)프로필]트리메톡시실란 0.15
B. 1 mm 표면 개질된 소다 석회 유리 비드의 제조
PGC 사이언티픽(Scientific) 제품인 1 mm 소다 석회 유리 비드 2.0 g 및 10% 수성 질산 2 ml로부터 현탁액을 제조하고, 30분 동안 부드럽게 교반하면서 환류하였다. 질산 용액을 따라내고, 비드를 여과하고, 탈이온수로 세척하였다. 이어서, 비드를 10 N 수산화나트륨 2 ml에 첨가하고, 120분 동안 부드럽게 교반하면서 환류하였다. 수산화나트륨 용액을 따라내고, 비드를 여과하고, 탈이온수로 철저하게 세척하였다. 비드를 진공하에 100℃에서 4시간 동안 건조시켰다.
건조된 비드, 표면 개질제 1 ml 및 무수 톨루엔 19 ml로부터 현탁액을 제조하였다. 현탁액을 45분 동안 부드럽게 교반하고 여과하였다. 비드를 톨루엔으로 세척하고 에탄올로 세척하고, 실온에서 3시간 동안 및 100℃에서 30분 동안 진공 건조시켰다. 카이저(Kaiser) 시험을 수행하고 575 nm에서의 흡광도 변화에 따라 표면 개질 정도를 결정하였다. 표 4에는 사용된 표면 개질제 및 개질된 1 mm 소다 석회 유리 비드에 대해 측정된 생성된 표면 피복을 나열하였다. PS 명칭은 생성된 기재가 개질된 PGC 소다 석회 유리 비드임을 나타내고, 영어 철자는 사용된 표면 개질제를 나타내기 위해 사용하였다.
샘플 표면 개질제 표면 피복 (μmole/gm)
PS-B (3-트리메톡시실릴프로필)디에틸렌트리아민 0.52
C. 1 mm 표면 개질된 붕규산염 유리 비드의 제조
PGC 사이언티픽 제품인 1 mm 붕규산염 유리 비드 2.0 g 및 10% 수성 질산 2 ml로부터 현탁액을 제조하고, 30분 동안 부드럽게 교반하면서 환류하였다. 질산 용액을 따라내고, 비드를 여과하고, 탈이온수로 세척하였다. 이어서, 비드를 10 N 수산화나트륨 2 ml에 첨가하고, 120분 동안 부드럽게 교반하면서 환류하였다. 수산화나트륨 용액을 따라내고, 비드를 여과하고, 탈이온수로 철저하게 세척하였다. 비드를 진공하에 100℃에서 4시간 동안 건조시켰다.
건조된 비드, 표면 개질제 1 ml 및 무수 톨루엔 19 ml로부터 현탁액을 제조하였다. 현탁액을 5시간 동안 부드럽게 교반하고 여과하였다. 비드를 톨루엔으로 세척하고 에탄올로 세척하고, 실온에서 3시간 동안 및 100℃에서 30분 동안 진공 건조시켰다. 카이저 시험을 수행하고 575 nm에서의 흡광도 변화에 따라 표면 개질 정도를 결정하였다. 표 5에는 사용된 표면 개질제 및 개질된 1 mm 붕규산염 유리 비드에 대해 측정된 생성된 표면 피복을 나열하였다. P 명칭은 생성된 기재가 개질된 PGC 붕규산염 유리 비드임을 나타내고, 영어 철자는 사용된 표면 개질제를 나타내기 위해 사용하였다.
샘플 표면 개질제 표면 피복 (μmole/gm)
P-A 3-아미노프로필트리메톡시실란 4.05
P-B (3-트리메톡시실릴프로필)디에틸렌트리아민 2.50
P-D N-트리메톡시실릴프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 ND
D. 6.0 ㎛ 표면 개질된 자성 입자의 제조
물 1.9 ml 중에 현탁된 마이크로모드 파티켈테크놀로지(Micromod Partikeltechnologie) 제품인 6.0 ㎛ 자성 입자 (시카스타(Sicastar)-M-CT) 0.1 g, 표면 개질제 0.5 mmole 및 이소프로필 알콜 1.25 ml로부터 현탁액을 제조하였다. 슬러리를 16시간 동안 부드럽게 교반하였다. 입자를 자석 위에 위치시키고, 액체를 따라내었다. 다음 단계를 2회 수행하였다. 추가의 4 ml의 이소프로필 알콜을 입자에 첨가하고, 새로운 현탁액을 1분 동안 격렬하게 교반하고, 입자를 자석 위에 위치시키고, 액체를 따라내었다. 표면 개질된 실리카 겔을 진공 오븐에서 50℃에서 밤새 건조시켰다. 표면 개질 정도를 열중량 분석으로 결정하였다. 표 6에는 사용된 표면 개질제 및 개질된 6.0 ㎛ 자기 입자에 대해 측정된 생성된 표면 피복을 나열하였다. S6 명칭은 생성된 기재가 시카스타로부터의 개질된 6.0 ㎛ 자기 비드임을 나타내고, 영어 철자는 사용된 표면 개질제를 나타내기 위해 사용하였다.
샘플 표면 개질제 표면 피복 (mmole/gm)
S6-A 3-아미노프로필트리메톡시실란 0.11
S6-B (3-트리메톡시실릴프로필)디에틸렌트리아민 0.06
S6-D N-트리메톡시실릴프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 0.09
E. 5.0 내지 10.0 ㎛ 표면 개질된 자성 입자의 제조
물 3.2 ml 중에 현탁된 씨피지, 인크(CPG, Inc) 제품인 5.0 내지 10.0 ㎛ 자성 입자 (MPG 언코티드) 0.1 g, 표면 개질제 0.5 mmole 및 이소프로필 알콜 1.25 ml로부터 현탁액을 제조하였다. 슬러리를 16시간 동안 부드럽게 교반하였다. 입자를 자석 위에 위치시키고, 액체를 따라내었다. 다음 단계를 2회 수행하였다. 추가의 4 ml의 이소프로필 알콜을 입자에 첨가하고, 새로운 현탁액을 1분 동안 격렬하게 교반하고, 입자를 자석 위에 위치시키고, 액체를 따라내었다. 표면 개질된 실리카 겔을 진공 오븐에서 50℃에서 밤새 건조시켰다. 표면 개질 정도를 열중량 분석으로 결정하였다. 표 7에는 사용된 표면 개질제 및 개질된 5.0 내지 10.0 ㎛ 자기 입자에 대해 측정된 생성된 표면 피복을 나열하였다. M 명칭은 생성된 기재가 개질된 MPG 비드임을 나타내고, 영어 철자는 사용된 표면 개질제를 나타내기 위해 사용하였다.
샘플 표면 개질제 표면 피복 (mmole/gm)
M-A 3-아미노프로필트리메톡시실란 0.11
M-B (3-트리메톡시실릴프로필)디에틸렌트리아민 0.07
M-D N-트리메톡시실릴프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 0.07
M-K 테트라데실디메틸(3-트리메톡시실릴프로필)암모늄 클로라이드 0.11
M-P 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴프로필)암모늄 클로라이드 0.11
M-X N,N-디데실-N-메틸-N-(3-트리메톡시실릴프로필)암모늄 클로라이드 0.08
표 8은 본원에서 분석된 표면 개질제의 화학 명칭을 보다 상세하게 제공한다. 본 발명은 상기 표면 개질제 중 하나 이상으로의 임의의 기재의 코팅, 친화도 프로토콜 (단독으로 또는 SNAP 방법과 조합)에서의 코팅된 기재의 용도, 및 상기 표면 개질제 하나 이상으로 개질된 기재를 함유하는 층을 보유한 필터 및 카트리지와 같은 장치의 디자인을 고려한다.
표면 개질제
A 3-아미노프로필트리메톡시실란
B (3-트리메톡시실릴프로필)디에틸렌트리아민
C N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란
D N-트리메톡시실릴프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드
E 비스(2-히드록시에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란
F (N,N-디메틸아미노프로필)트리메톡시실란
G N-(3-트리에톡시실란프로필)-4,5-디히드로이미다졸
H 2-(트리메톡시실릴에틸)피리딘
I (아미노에틸아미노메틸)펜에틸트리메톡시실란
J 2-(디페닐포스피노)에틸트리에톡시실란
K 테트라데실디메틸(3-트리메톡시실릴프로필)암모늄 클로라이드
L 디에틸포스파토에틸트리에톡시실란
M 3-머캅토프로필트리메톡시실란
N N-페닐아미노프로필트리메톡시실란
O N-(6-아미노헥실)아미노프로필트리메톡시실란
P 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴프로필)암모늄 클로라이드
Q N-(트리메톡시실릴프로필)이소티오우로늄 클로라이드
R N-(트리메톡시실릴프로필)에틸렌디아민, 트리아세트산, 삼나트륨 염
S N-(2-아미노에틸)-11-아미노운데실트리메톡시실란
T N-(3-트리에톡시실란프로필)글루콘아미드
U N-(트리에톡시실란프로필)-O-폴리에틸렌 옥시드 우레탄
V 3-(트리히드록시실릴)-1-프로판술폰산
W 카르복시에틸실란트리올
X N,N-디데실-N-메틸-N-(3-트리메톡시실릴프로필)암모늄 클로라이드
Y 2-[메톡시(폴리에틸렌옥시)프로필]트리메톡시실란
또한, 표면 개질제 A 내지 Y 각각에 대한 화학적 구조를 도 10에 제공한다. 추가로 하기에 커플링제 A 내지 Y 각각의 화학식량에 대한 정보 뿐만 아니라 각각을 언급하기 위해 사용되는 통상적인 약어를 기재한다.
Figure 112006010071368-PCT00006
F. 펩티드-기재 표면 개질제
상기 아민-기재 화학적 관능기 이외에도, 본 발명은 전체 또는 부분이 펩티드로 구성된 표면 개질제를 포함한다. 상기 펩티드는 절단가능한 링커, 또는 자신이 직접 기재의 표면에 부착되는 화학적 관능기를 통해 기재의 표면에 직접 부착될 수 있다.
표면 개질제로 사용되는 펩티드의 예는 표적과 상호작용하여 코팅된 기재의 상기 표적에 대한 친화도를 증가시키는 임의의 펩티드를 포함한다. 표면 개질제로서 적합한 펩티드의 구체적인 예로는 항-미생물 펩티드 군, 압타머(aptamer) 및 PNA가 있다. 다른 유형의 기재 및 기재 코팅에서와 같이, 펩티드-기재 표면 개질제를 사용하여 DNA, RNA, 단백질, 세균 세포 또는 포자 (그람 양성 또는 그람 음성), 바이러스 (DNA-계 또는 RNA-계), 소 유기 분자 및 화학적 화합물을 비롯한 광범위한 표적 중 어느 하나에 결합시킬 수 있다. 바람직한 펩티드-기재 표면 개질제는 펩티드-기재 코팅된 기재와 표적의 상호작용을 촉진하는 데 필요한 특정 조건하에서 비교적 안정할 것이다.
실시예 4: 기재로부터의 활성 영역-표적 복합체의 방출에 사용되는 절단가능한 링커
하기 방법은 표면 개질제 + 기재의 잔류물로부터 활성 영역-표적 복합체를 방출시키는데 사용될 수 있는 방법의 비-제한적 예이다.
A. 커플링 반응에서의 플루오라이드 불안정성 알킬실릴 링커
알킬실릴 잔기는 표면 개질제를 기재에 부착시키기 위해 커플링 영역에 사용될 수 있다. 표적을 표면 개질제의 활성 영역에 결합시킨 후에, 플루오르화수소산을 사용하여 규소-산소 결합을 절단하고 표면 개질제 + 기재의 잔류물로부터 활성 영역을 분리할 수 있다.
B. 스페이서 영역에서의 플루오라이드 불안정성 알킬실릴 링커
알킬실릴 잔기는 활성 영역을 기재에 부착시키는데 사용되는 스페이서 영역의 주쇄에 사용될 수 있다. 표적을 표면 개질제의 활성 영역에 결합시킨 후에, 플루오르화수소산을 사용하여 규소-산소 결합을 절단하고 표면 개질제 + 기재의 잔류물로부터 활성 영역을 분리할 수 있다.
C. 스페이서 영역에서의 산 불안정성 카르보닐 링커
산 불안정성 카르보닐 잔기는 활성 영역을 기재에 부착시키는데 사용되는 스페이서 영역의 주쇄에 사용될 수 있다. 산 불안정성 카르보닐 잔기의 예로는 아미드, 에스테르, 카르보네이트, 우라탄 및 우레아가 있다. 표적을 표면 개질제의 활성 영역에 결합시킨 후에, 트리플루오르아세트산, 염산, 브롬화수소산, 질산, 인산 및 황산과 같은 산을 사용하여 산 불안정성 카르보닐 잔기를 절단할 수 있다.
D. 스페이서 영역에서의 염기 불안정성 카르보닐 링커
염기 불안정성 카르보닐 잔기는 활성 영역을 기재에 부착시키는데 사용되는 스페이서 영역의 주쇄에 사용될 수 있다. 염기 불안정성 카르보닐 잔기의 예로는 아미드, 에스테르, 카르보네이트, 우라탄 및 우레아가 있다. 표적을 표면 개질제의 활성 영역에 결합시킨 후에, 수산화암모늄, 수산화나트륨 및 수산화칼륨과 같은 염기를 사용하여 염기 불안정성 카르보닐 잔기를 절단할 수 있다.
E. 스페이서 영역에서의 친핵체 불안정성 링커
친핵체 불안정성 잔기는 활성 영역을 입자에 부착시키는데 사용되는 스페이서 영역의 주쇄에 사용될 수 있다. 친핵체 불안정성 잔기의 예로는 옥심 또는 술폰아미드가 있다. 표적을 표면 개질제의 활성 영역에 결합시킨 후에, 임의의 유기 기재 아민을 친핵체로서 사용하여 절단할 수 있다.
F. 스페이서 영역에서의 광 불안정성 링커
광 불안정성 잔기는 활성 영역을 입자에 부착시키는데 사용되는 스페이서 영역의 주쇄에 사용될 수 있다. 광 불안정성 잔기의 예로는 에스테르, 니트로 치환된 아릴히드록시메틸 에스테르 및 아릴치환된 디아조 유도체가 있다. 표적을 표면 개질제의 활성 영역에 결합시킨 후에, 빛을 사용하여 광 불안정성 잔기의 절단을 유도할 수 있다. 사용되는 빛의 파장은 중요하지 않지만, 빛의 파장은 바람직하게는 800 내지 100 nm, 보다 바람직하게는 465 내지 190nm, 가장 바람직하게는 365 내지 240 nm일 것이다.
실시예 5: 신규 표면 개질된 비드의 시험
상기 상세히 기재한 바와 같이, 본 발명자들은 다양한 아민-관능화된 표면 개질제로 개질된 다수의 비드형 기재를 합성하였다. 코팅된 비드를 이들의 이중-가닥 DNA와의 상호작용 뿐만 아니라 세균 세포 및 포자와의 상호작용에 대해 평가하였다. 비드는 달리 언급되는 경우를 제외하고는 문자 A 내지 P를 사용하여 지칭하며, A 내지 P는 상기 표 8에 나타낸 바와 동일한 개질을 나타낸다 (비드 P는 비드 W 내지 U에 상응함). 특히, 비드는 표 3에 기재되어 있으며 W로 나타낸 50 μm 실리카 겔 비드이다.
도 11은 다수의 아민-관능화된 기재가 DNA에 대해 개선된 접착성을 갖는다는 것을 나타내는 결과를 요약한 것이다 (도 11). DNA에 접착된 비드 스크리닝시, 50 μm 비드 5 mg을 pH 5의 탈이온수 1.5 mL 중에 송아지 흉선 dsDNA (표적) 200 ng을 함유하는 샘플에 첨가하였다. 통상적으로 혼합 시간이 길어질수록 접착 효율이 개선되지만, 접착을 위한 혼합 시간은 적당한 프로세싱 시간을 가능하게 하는 5분으로 셋팅하였다. 본원에 기재된 형광 검출 방법을 이용하여 이중-가닥 DNA와 비드의 접착을 측정하였다.
세포 및 포자의 비드에 대한 접착 효율을 조사하는데 사용되는 조건은 DNA와의 상호작용을 측정하는데 사용되는 것과 거의 동일하다. 간략하게, 비드 5 mg을 물 1.5 mL 중 약 109개 세포/mL의 샘플 (pH 5)과 5분 동안 혼합하였다. 샘플과 비드를 서서히 회전시키면서 혼합하고, 비드를 첨가하기 전후에 용액을 형광 또는 유동 세포측정법을 이용하여 시험하였다. 샘플 중 표적의 양이 적을수록 보다 양호한 접착성을 나타내며, 따라서 보다 효율적인 포획을 나타낸다. 세포 접착을 측정하기 위해, 흡광도 측정도 수행하여 결과를 확인하였다.
도 12는 2가지 상이한 세균 세포 (2가지 상이한 표적)와 비드 A 내지 P 및 비드 1 내지 11의 상호작용을 분석한 결과를 요약한 것이다. 비드 1 내지 11은 표 2에 기재된 시판되는 비드에 상응한다. 요컨대, 다양한 개질된 비드를 이들이 비. 안트라시스 (Ba) 또는 비. 투링기엔시스 (Btk)로부터의 세균 세포와 상호작용하는 능력에 대해 분석하였다.
도 13은 2가지 부가적인 세균 세포 (2가지 상이한 표적)와 비드 A 내지 P 및 비드 1 내지 11의 상호작용을 분석한 결과를 요약한 것이다. 비드 1 내지 11은 표 2에 기재된 시판되는 비드에 상응한다. 요컨대, 다양한 개질된 비드를 이들이 대장균 또는 와이. 페스티스 (Yp)로부터의 세균 세포와 상호작용하는 능력에 대해 분석하였다.
도 14는 비드 A 내지 P 및 비드 1 내지 11과 비. 안트라시스 (Ba) 세포 (무성) 또는 비. 안트라시스 포자 (Ba 포자)의 상호작용을 분석한 결과를 요약한 것이다. 비드 1 내지 11은 표 2에 기재된 시판되는 비드에 상응하고, 다양한 개질된 비드를 이들이 비. 안트라시스 (Ba)의 무성 세포 또는 포자 형태와 상호작용하는 능력에 대해 분석하였다.
도 15는 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 영상을 제공한다. 이 영상을 통하여 세포 (표적)가 비드에 물리적으로 접착되어 있음이 입증되었다. 요컨대, 비드를 비. 안트라시스 무성 세포 또는 포자를 함유하는 샘플과 함께 인큐베이션하고, SEM 영상을 통해 세포 및 포자가 비드와 물리적으로 회합되어 있는지 여부를 확인하였다. SEM 영상의 조사로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포 및 포자는 비드의 표면에 접착한다. 그러나, 본 발명자들은 비드의 표면이 약 109개 세포 또는 포자의 고농도에서도 표적으로 포화되지 않는다는 것에 주목하였다. 무성 Ba의 경우, 세균의 쇄가 여러 개의 비드를 연결하여 이들이 함께 집단을 형성하도록 하는 것이 관찰될 수 있다.
도 16은 친화도 프로토콜 및 SNAP 방법을 이용하는 샘플의 분석이 SNAP 기술을 단독으로 이용하는 것에 비해 세균 표적 DNA의 검출을 개선시킨다는 것을 입증한다.
실시예 6: 접착에 영향을 미치는 인자
본 발명의 방법의 중요한 목적은 친화도 프로토콜 기술이 (a) 특정 장소 (예를 들어, 범죄 현장, 환경 현장, 사고 현장, 등)에서 용이하게 사용될 수 있으며, (b) 광범위한 샘플, 기재 및 표적에 따라 개조할 수 있는 조건하에 사용되도록 허용하는 파라미터의 확인에 있다. 따라서, 본 발명자들은 일련의 실험을 계획하여 DNA의 기재로의 접착에 영향을 미치는 인자를 확인하였다.
본 발명자들은 소정 범위의 pH 및 염 농도가 코팅 B (트리아민 코팅)로 코팅된 비드의 상호작용에 미치는 영향을 조사하였다. 간략하게, 실험은 샘플 용액의 pH와 이온 강도를 조정하고, 비드로부터 포획되고 추후에 방출되는 표적에 대해 상응하는 효과를 측정하는 것을 포함한다. pH 및 이온 강도는 DNA의 비드로의 접착 효율％에 많은 영향을 미친다.
도 17 및 18은 이중-가닥 송아지 흉선 DNA와 코팅 B로 코팅된 비드의 상호작용을 조사한 실험의 결과를 요약한 것이다. DNA와 비드의 상호작용은 염 농도 및 pH에 의해 영향을 받으며, 상기 상호작용은 0 내지 500 mM의 염 농도에서 현저하게 감소한다.
다음 실험 셋트에서, 본 발명자들은 코팅 D로 코팅된 비드와, 물, 세균 배양물 상등액, 또는 비-실험실-등급 환경수의 샘플에 접종한 DNA의 상호작용을 분석하였다. 도 19는 상기 실험의 결과를 요약한 것이며, 이는 코팅된 비드가 광범위한 샘플에 함유된 표적에 효율적으로 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7: 표적 방출에 영향을 미치는 인자
특정 코팅 또는 비-코팅 기재의 유용성을 평가하는 제1 단계는 기재가 표적과 상호작용하는 능력을 측정하는 것이지만, 추가의 표적 분석에서는 기재로부터 표적을 회수하는 능력의 측정도 필요하다. 표적 분석에 사용되는 현대 기술의 감도 수준이 높은 수준에 있으므로, 모든 표적을 기재로부터 용이하게 방출시킬 필요는 없다. 그러나, 추가의 분석에 충분한 표적을 양을 회수하는 능력은 중요하다.
본 발명자들이 이전에 DNA의 기재로의 접착에 영향을 미치는 인자를 분석한 결과가 나타내는 바와 같이, 기재와 표적 DNA 사이의 접착 (예를 들어, 표적의 접착 및 방출 둘 다)은 pH 및 염 농도에 의해 크게 영향을 받는다. 따라서, 기재로부터 표적을 방출시키는데 사용될 수 있는 방법은 pH 및 염 농도의 조작을 포함한다. 부가적으로, 본 발명자들은 온도가 표적 DNA의 기재로의 부착에 영향을 끼친다는 것을 발견하였다 (도 20).
본 발명은 기재로부터 표적 (DNA, RNA, 단백질, 세균 세포, 등)을 방출시키는데 사용될 수 있는 다수의 가변 요인 중 어느 하나를 조작하는 것을 포함한다. 당업자라면 상기 가변 요인 중에서 용이하게 선택할 수 있으며, 최적의 용리 (예를 들어, 방출) 조건은 사용되는 특정 기재, 특정 표적, 표적의 농도 및 초기 접착 조건에 따라 달라질 것이다. 조작될 수 있는 가변 요인의 예로는 염 농도 (예를 들어, NaCl, CaCl2, NaOH, KOH, LiBr, HCl), pH, 스페르미딘의 존재, SDS의 존재, 완충액의 유형 (예를 들어, 카르보네이트 완충액, 트리스 완충액, MOPS 완충액, 인산 완충액), 혈청의 존재, 세제의 존재, 알콜의 존재, 접착 시간, 온도, 및 기계적 교반의 적용 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 기계적 조작의 예로는 초음파처리, 프렌치(French) 프레스의 사용, 전기 충격, 마이크로파, 탈수, 와동, 또는 레이저의 적용이 있다.
본 발명은 표적의 방출이 기재에 표면 개질제를 연결시키는 잔기를 절단함으로써 달성될 수 있는 것을 추가로 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 전기용리를 이용하여 기재로부터 표적 핵산을 회수하는 것도 포함한다.
아민 표면-관능화된 비드는 개발되어 있으며, DNA에 대해 높은 친화도를 나타내는 것으로 밝혀져 있다. DETAP 개질된 비드는 다수의 액체 환경에서 핵산을 매우 잘 포획한다. 그러나, DNA에 대한 상기 기재의 높은 친화도가 바람직할 수 있지만 기재로부터 표적을 효율적으로 방출시켜 표적이 추가로 분석될 수 있도록 하는 것도 바람직할 수 있다.
기재로부터의 표적의 방출을 촉진하는 다른 방법 이외에, 본 발명자들은 전기장을 이용하여 DETAP 비드-결합된 DNA의 회수 효율을 개선시켰다. 최근에 시험된 프로토콜은 기재로부터 미량의 DNA를 회수하는데 효율적이지 않았지만, 이 방법은 보다 높은 초기 농도로 기재에 접착되는 경우에 DNA를 방출시키는 데에는 성공적인 것으로 입증되었다.
아가로스 및 송아지 흉선 DNA는 인비트로젠 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터 입수하였다. 아가로스를 0.5X TBE 전기영동 완충액 (45 mM 트리스-보레이트, 1 mM EDTA) 중에서 용융시켰다. DETAP 비드를 합성하고, 배치 라벨 PB-7을 사용하여 아민-관능화된 비드를 표시할 것이다. GeneCapsule(상표명) 장치를 제노 테크놀로지 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였다. 다른 표준 시약은 분자 생물학 등급 순도를 나타내었다.
20개의 PB-7 비드를 송아지 흉선 DNA 50 ㎍/mL를 함유하는 물 1 mL에 밤새 로딩하였다. 비드를 가시화하기 위해 에티듐 브로마이드 0.2 ㎍/mL를 포함하는 정상-모드 0.5％ 아가로스-TBE 겔에 로딩하고, 1N NaOH를 함유하는 탑 아가로스로 덮었다. 또한, 비드를 다양한 농도의 NaOH를 함유하는 0.5％ 아가로스-TBE를 이용하는 GeneCapsule(상표명) 장치에 로딩하였다. 아가로스 베드 100 ㎕를 GelPICK(상표명)에 세팅하였다. 로딩된 비드를 상기 기재 베드 상에 적층하고, 아가로스의 복층을 셋팅하였다. GelTRAP(상표명)를 15분 동안 TBE 중에서 평형화시킨 후에 신선한 TBE 150 ㎕를 첨가하고, GelPICK(상표명)를 도 21에 도시된 트랩 TBE의 수준까지 삽입하였다. 2가지 실험 셋트에서의 전기영동은 200 V에서 15분 동안 수행하고, 추가로 반대 극성 방향으로 5초씩 3회 펄싱하여 GeneTRAP(상표명) 막으로부터 DNA를 유리시켰다. GeneCapsule(상표명)로부터의 수집 용기에 구멍을 내고 피펫에 의해 액체를 제거함으로써 용리액을 제거하였다.
모든 낮은 DNA 로딩 수준 실험을 0.1N NaOH 또는 0.1N NaOH + 송아지 흉선 DNA 100 ㎍/mL를 함유하는 0.5％ 아가로스-TBE를 사용하는 GeneCapsule(상표명) 장치로 수행하였다. 20개의 PB-7 비드 셋트를 5, 50 또는 500 pg/mL의 pCR2.1Topo-BtkCryIA 바실러스 투링기엔시스(bacillus thuringiensis) 하위종 커스타키(kurstaki) 유전자 카피 표준 플라스미드를 함유하는 물 1 mL에 30분 동안 로딩하였다. 상기와 같이, 로딩된 비드를 GelPICK(상표명)의 기재 겔 100 ㎕ 상에 적층하고, 대략 450 ㎕의 아가로스 복층을 세팅하여 남은 부피를 충전하였다. 미리-평형화된 GeneTRAP(상표명)를 신선한 TBE 150 ㎕로 충전하고, 로딩된 GelPICK(상표명)를 삽입하였다. 로딩된 GeneCapsule(상표명)의 전기영동을 200V에서 15분 또는 45분 동안 수행하였다. 용리액을 피펫을 통해 구멍을 낸 수집 용기를 통과시켜 제거하였다. 대조군 샘플을 실온에서 15분 동안 0.01N NaOH + 100 ㎍/mL 송아지 흉선 DNA 150 ㎕ 중에서 인큐베이션함으로써 용리하였다. 샘플을 TaqMan(등록상표) 실시간 PCR에 의해 분석하였다.
도 21에 도시한 겔에 의해 나타낸 바와 같이, 높은 DNA 로딩 수준이 전기용리를 이용하여 효율적으로 회수될 수 있다. 도 21C는 송아지 흉선 DNA가 50 ㎍ 로딩되어 전기장에 노출되었을 때 비드로부터 용이하게 멀리 이동한다는 것을 나타낸다.
초기에 본 발명자들은 이들의 실험이 DNA를 비교적 낮은 전압 (15분 내에 약 10 V/cm)을 이용하여 아민 비드로부터 분리할 수 있음을 나타낸다는 것에 주목하였다. 하기 표는 기재로부터 DNA를 방출시키기 위해 여러가지 저전압 전기용리를 이용하여 수득한 결과를 요약한 것이다. 본 발명자들은 변화하는 염 농도의 조건하에서 DNA의 수율이 양호하지만, NaOH 농도가 높을수록 (예를 들어, 보다 알칼리성인 환경일수록) 최고의 회수율이 관찰된다는 것을 주목하였다.
비드 아가로스 NaOH 포획량 회수량 회수율(％)
비드 없음 0.5％ 0.00N 50㎍ 50㎍ 100％
PB-7 0.5％ 0.00N 24㎍ 2㎍ 8％
PB-7 0.5％ 0.01N 28㎍ 1㎍ 4％
PB-7 0.5％ 0.10N 20㎍ 9㎍ 45％
상기 실험은 전기용리가 기재로부터 표적을 방출시키는 데 사용될 수 있는 또다른 메카니즘임을 나타낸다. 본 실험의 조건은 매우 낮은 농도의 DNA에 대해 최적의 조건은 아니지만, 결과는 전기용리가 빠르고, 안전하며 비용면에서 효율적인 기재로부터의 표적 방출 메카니즘을 대표한다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 기재로부터 표적을 방출시키기 위한 절단가능한 링커의 사용
상기 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 중요한 측면은 표적을 추가로 분석할 수 있도록 기재로부터 표적을 방출시키는 능력이다. 기재로부터의 표적의 방출을 용이하게 할 수 있는 한 메카니즘은 특이적으로 절단되어 기재로부터 표적을 방출시킬 수 있는 절단가능한 링커를 함유하는 표면 개질제를 사용하는 것이다. 본 발명은 다수의 절단가능한 링커 중 어느 하나의 사용을 포함한다.
절단가능한 링커의 사용과 관련한 한 가지 가능한 문제는 링커의 절단을 유도하는 데 필요한 개질제가 표적을 분해하거나 또는 표적의 추가 분석을 억제할 수 있다는 것이다. 이와 같은 가능한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 DETAP 또는 절단 생성물 DETA의 존재하에 표적 DNA를 분석하여 PCR에 의한 DNA의 추가 분자 분석에서 이들 잔기에 대한 가능한 억제 역할을 평가하였다. 본 발명자들의 분석에 기초하여, 본 발명자들은 DETAP 및 절단 생성물 DETA의 존재가 실시간 PCR에 의한 DNA의 추가 분석을 저해하지 않는 것으로 결론을 내렸다.
간략하게, 디에틸렌트리아민 및 (3-트리메톡시실릴-프로필)-디에틸렌트리아민을 시그마-알드리치로부터 입수하였다 (DETA 103.2 g/mol, 0.95 g/mL; DETAP 265.4 g/mol, 1.031 g/mL). 각각의 연속 희석액을 암비온의 오토클레이브된 디에틸피로카르보네이트-처리된 물 중에서 제조하였다.
표적 DNA는 바실러스 투링기엔시스 하위종 커스타키로부터의 조 플라스미드 DNA 또는 유전자 카피 표준 pCR2.1 Topo-BtkCryIA이다. TaqMan(등록상표) 실시간 PCR 화학법을 이용하여 ABI 7700 서열 검출 시스템 상에서 샘플을 분석하였다.
TaqMan(등록상표) 실시간 PCR 분석을 표준 50 ㎕ 부피에서 수행하였다. 음성 대조군을 제외하고는, 분석 시약을 표적 DNA 50 ㎍/mL로 고정하였다. 샘플을 다양한 농도의 DETAP 또는 DETA로 고정하고, 양성 대조군에 물을 첨가하였다.
아민 첨가제를 함유하지 않는 양성 대조군의 감지 시작 주기에 대한 감지 시작 주기의 변화로서 PCR의 억제를 측정하였다. 억제 백분율은 양성 대조군의 감지 시작 주기에 대한 감지 시작 주기 변화의 비로 구하였다. 본 발명자들의 결과는 DETAP가 보다 높은 농도에서 PCR을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 비드-기재 DNA 포획 및 방출의 적용과 관련된 농도 (약 25 nmol 아민 관능기)에서, 억제 수준은 유의하게 감소하였다. 20 nmol의 DETAP를 PCR 반응물 50 ㎕에 첨가한 결과 감지 시작 주기가 대략 2 (약 9％의 신호 억제)로 이동하였다.
반면, 본 발명자들의 결과는 DETA만으로는 PCR이 유의하게 억제되지 않음을 나타낸다. 비드-기재 분석과 관련된 양 및 등급 크기가 몇몇 더 높은 양에서는, 양성 대조군에 대한 DETA 첨가에 의해 감지 시작 주기의 명백한 이동이 나타나지 않았다.
이러한 결과는 절단가능한 링커를 함유하는 표면 개질제의 사용이 기재를 통한 표적의 포획, 이러한 표적의 방출, 및 이러한 표적의 추가의 분자 분석을 용이하게 하는 실행가능한 접근법임을 나타낸다.
표면 개질제를 기재에 가역적으로 부착하는 데 사용될 수 있는 제2 군의 절단가능한 링커는 암모니아 불안정성 링커이다. 따라서, 제2 실험 셋트에서, 본 발명자들은 암모니아가 PCR에 의한 추가의 표적 분석을 억제하는지 여부를 분석하였다.
두 가지 실험을 수행하였다. 표적은 BHI (배양 배지)에서 밤새 증식시키고, 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화시킨 무성 Ba로부터의 상등액이다. 상등액 희석액을 BHI에서 제조하였다.
다양한 농도의 암모니아를 Ba 상등액의 다양한 희석액과 혼합하고, 실온에서 인큐베이션하였다. 생성된 혼합물을 ABI7700의 표준 TaqMan(등록상표) 반응에서 용리액으로 사용하였다. 각각의 용리액 5 ㎕ (총 50 ㎕ 이외의 양)를 Ba 프라이머-프로브 셋트와 함께 PCR 반응 웰에 첨가하였다. 모든 샘플을 2개씩 준비하였다. 상등액 희석액으로 이루어진 대조군 (암모니아 무함유)을 직접 PCR 웰에 넣었다.
두 가지 독립적인 셋트의 실험 결과는 암모니아의 첨가가 PCR 효율을 전혀 감소시키지 않고 PCR 반응에서 0.005M 농도의 수준까지 지속될 수 있음을 입증하였다. 0.05M의 암모니아 농도에서조차 대략 1 내지 2 등급 크기만의 PCR 효율의 감소가 관찰되었다. 부가적으로, 본 발명자들의 관찰 결과는 암모니아의 낮은 수준이 PCR 반응의 효율을 실제로 개선시킬 수 있다는 것을 나타내며, 이는 아마도 PCR 반응 혼합물의 pH가 유리하게 변화하기 때문일 것이다.
실시예 9: 표적 포획 및 방출의 최적화
친화도 프로토콜은 이종 액체 및 고체 샘플로부터 임의의 다수의 표적을 확인하고(거나) 분리하는데 폭넓게 이용될 수 있다. 친화도 프로토콜은, 비교적 비최적화 형태에서도, 이종 샘플에서 저농도의 표적을 검출하는 증가된 감도를 제공하므로, 비최적화 형태의 프로토콜이라도 다양한 환경에서 실질적인 이점을 갖는다. 그러나, 보다 최적화된 친화도 프로토콜은 (i) 보다 낮은 농도의 표적을 검출하는 능력, (ii) 보다 짧은 시간에 표적을 확인하고(거나) 분리하는 능력, (iii) 기재상 포획물 (샘플 중에서 보다 높은 백분율의 이용가능한 표적)을 검출하는 능력, (iv) (예를 들어, 추가의 분석 또는 분리를 위해) 결합된 보다 높은 백분율의 표적을 기재로부터 분리/용리하는 능력, 및 (v) 보다 소수의 출발 물질 (예를 들어, 보다 소수의 소모성 물질, 보다 소량의 기재)을 사용하여 친화도 프로토콜을 수행하는 능력을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 다양한 부가적 이점을 갖는다.
하기 실시예는 친화도 프로토콜을 최적화시켜 상기 약술된 이점의 일부를 달성하기 위해 수행된 실험을 상술한다.
(a) 코팅된 기재의 포획 및 용리 효율
본 발명자들은 다수의 시판되는 코팅된 기재 및 실험실-합성 코팅된 기재를 시험하여 각 코팅된 기재가 표적을 포획하고 방출하는 효율을 평가하였다. 상기 특정 예에서, 표적은 DNA이고, 기재는 표면 개질제로 개질된 다양한 자성 비드였다.
시판되는 하기 비드를 사용하였다: 코텍스-바이오켐 (Cortex-Biochem) 폴리스티렌-아민 비드, 다이날 (Dynal) M-270 폴리스티렌-아민 비드, 폴리사이언시스 (Polysciences) 폴리스티렌 비드, 바이오소스 (Biosource) 실란화된 FeO-아민 비드 및 스트렙타비딘 관능화된 비드. 또한, 하기 실험실-합성 비드를 사용하였다: M-B-1, M-B-2 및 M-B-3. 실험실-합성 비드는 하기와 같이 제조하였다: 5 내지 10 ㎛의 비-코팅 자성 입자 (입자 크기 5 내지 10 ㎛의 비드 또는 직경 5 내지 10 ㎛의 비드로도 공지됨; 씨피지, 인크.로부터 입수됨)를 물, 표면 개질제 및 이소프로필 알콜의 조합물에 현탁시켰다. 이 슬러리를 16시간 동안 부드럽게 교반하였다. 입자를 자석 위에 위치시키고, 액체를 따라내었다. 다음 단계를 2회 반복하였다. 추가의 이소프로필 알콜을 입자에 첨가하고, 현탁액을 1분 동안 격렬하게 교반하고, 입자를 자석 위에 위치시키고, 액체를 따라내었다. 표면-개질된 실리카 비드를 진공 하에 50 ℃에서 밤새 건조시키고, 건조 후에 표면 개질 정도를 열중량 분석에 의해 결정하였다.
도 22에는 비드 M-B-1, M-B-2, M-B-3 뿐만 아니라, 시판되는 비드를 사용하여 수행된 일련의 실험이 요약되어 있다. 이 실험에서는 DNA 표적을 사용하여 각 코팅된 자성 비드의 포획 및 방출 활성을 조사하였다. 간략하게, 코팅된 비드 1 mg을 500 pg/mL DNA 1 mL에 첨가하였다. 비드가 DNA를 포획하는 효율을 측정하여 도 22에 가장 좌측의 막대로 나타내었다. DNA가 비드로부터 방출 (예를 들어, 용리)되는 효율을 측정하였다. 용리 효율은 상호교환적으로 회수율을 나타내며, 도 22에 중간 막대로 나타냈다. DNA는 0.01 N NaOH 중 100 ㎍/mL 송아지 흉선 DNA 150 ㎕를 포함하는 용리 완충액으로 방출되었다. 회수된 DNA 대 포획된 DNA의 비율이 용리 효율이다. 최종적으로, 각 비드의 효율 백분율을 분석하여 도 22에서 가장 우측의 막대로 나타내었다. 효율 백분율은 회수된 DNA 대 출발 샘플 중 표적 DNA의 총량 (이 실시예에서는 500 pg)의 비율이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 초과 또는 99％ 초과의 포획 효율이 예상된다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 100％의 포획 효율이 예상된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 초과 또는 99％ 초과의 용리 효율이 예상된다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 100％의 용리 효율이 예상된다.
상기 언급한 것들 중 어떤 것에서, 본 발명은 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 초과 또는 99％ 초과의 전체 효율이 예상된다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 100％의 전체 효율이 예상된다.
(b) 기재의 양 및 포획 시간
친화도 프로토콜은 다수의 용도에 적합하다. 이러한 용도의 상당수는 방법을 수행하기 위해 필요한 비용, 시간 및 소모성 공급물의 양에 민감하다. 따라서, 본 발명자들은 기재의 양과 포획 시간 (예를 들어, 기재-샘플 사이의 상호작용에 할당된 시간의 양)의 함수로서 포획 효율을 조사하기 위한 많은 실험을 수행하였다. 상기 실험의 결과는 도 23 및 24에서 그래프로 요약되어 있다. 간략하게, 시판되는 아민 코팅된 자성 비드 (다이날)를 사용하여 물로 희석된 세균 배양 상등액 1 mL로부터 DNA 표적을 포획하였다. 기재의 농도는 1 내지 5 mg으로 다양하였고, 포획 시간은 1 내지 10분으로 다양하였다.
본 발명자들은 1분 동안 1 mg 정도의 기재 (예를 들어, 비드)로도 상기 샘플 중의 표적을 90％를 초과하여 포획하기에 충분함을 주목하였다. 기재 농도, 포획 시간, 또는 둘 다를 증가시킴에 따라 포획 효율이 99.99％보다 크게 증가된다. 친화도 프로토콜의 특정 적용을 위한 요건에 따라 파라미터를 조작하여 적절한 조합의 효율 및 비용을 달성할 수 있었다.
(c) 기재의 양 및 용리 시간
상기 상세히 설명된 바와 같이, 친화도 프로토콜의 가능한 적용의 대부분의 경우에 방법을 수행하기 위해 필요한 시간의 총량은 중요한 인자이다. 따라서, 본 발명자들은 기재의 양과 용리 시간의 함수로서 용리 효율을 조사하였다. 상기 실험의 결과는 도 25 및 26에 그래프로 요약되어 있다. 간략하게, 시판되는 아민 코팅된 자성 비드 (다이날)를 사용하여 물로 희석된 세균 배양 상등액 1 mL로부터 DNA 표적을 포획하였다. 0.01 N NaOH 중 100 ㎍/mL 송아지 흉선 DNA 150 ㎕를 포함하는 용리 완충액으로 용리를 수행하였다. 기재의 농도는 1 내지 5 mg으로 다양하였고, 용리 시간은 1 내지 10분으로 다양하였다. 본 발명자들은 상기 기재 농도 및 용리 시간 전반에 걸쳐서 용리 효율에는 유의한 변화가 없었음을 주목하였다.
(d) 용리 부피
상기 상세히 설명된 바와 같이, 친화도 프로토콜의 가능한 적용의 대부분의 경우에 방법을 수행하기 위해 필요한 시약의 양은 중요한 인자이다. 시약이 요구되는 것은 방법의 비용을 증가시킬 뿐만 아니라, 통상적인 실험실 환경에서 수행되지 않는 본 발명의 적용을 위해 현장에 수송되고 유지되어야 하는 물질의 양을 증가시킨다. 친화도 프로토콜에 필요한 가능한 시약 중 하나는 포획된 표적을 기재로부터 회수하는데 필요한 용리 완충액이다. 따라서, 본 발명자들은 용리 완충액의 부피가 용리 효율에 미치는 영향을 조사하였다.
상기 실험의 결과는 도 27에 요약되어 있다. 간략하게, 포획 후 표적을 샘플 5 mL로부터 0.01 N NaOH 중 100 ㎍/mL 송아지 흉선 DNA 150 ㎕를 포함하는 용리 완충액으로 용리시켰다. 용리 완충액의 부피는 1 mL 내지 150 ㎕로 다양하였다. 용리 완충액 부피의 상기 범위 전반에 걸쳐서 용리 효율에는 유의한 변화가 없음을 관찰하였다. 따라서, 용리 완충액의 부피는 친화도 프로토콜의 적용을 위한 특정 요건에 따라 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 기재로부터 표적을 용리하는 방법을 표적이 포획된 초기 샘플 부피의 1/5 미만의 부피를 갖는 용리 완충액으로 수행하였다. 다른 특정 실시양태에서, 기재로부터 표적을 용리하는 방법을 표적이 포획된 초기 샘플 부피의 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/lO, 1/15, 1/20 또는 1/25 미만의 부피를 갖는 용리 완충액으로 수행하였다. 다른 특정 실시양태에서, 기재로부터 표적을 용리하는 방법을 표적이 포획된 초기 샘플 부피의 1/30, 1/40 또는 1/50 미만의 부피를 갖는 용리 완충액으로 수행하였다.
(e) 용리 pH
상기 실험에서 사용된 표준 용리 완충액 (0.01 N NaOH 중 100 ㎍/mL 송아지 흉선 DNA)의 pH는 11.8이었다. 본 발명자들은 용리 완충액의 pH의 작은 변화가 용리 효율에 미치는 영향을 조사하였다. 상기 실험의 결과는 도 28에 요약되어 있다. 간략하게, 본 발명자들은 용리 완충액의 pH가 약 pH 11.5 내지 12.3 사이에서 변화하는 것은 용리 효율에 통계상 유의한 영향을 주지 않음을 알게 되었다.
(f) 용리 완충액 최적화
상기 상세히 설명된 바와 같이, 송아지 흉선 DNA는 용리 완충액에 포함되었다. 따라서, 본 발명자들은 용리 효율이 완충액에 포함된 송아지 흉선 DNA의 농도에 대해 감수성인지 여부를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 간략하게, 본 발명자들은 용리 완충액 중의 송아지 흉선 DNA의 농도를 50 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL 사이에서 변화시켰다. 본 발명자들은 100 ㎍/mL 초과의 송아지 흉선 DNA 농도에서는 용리 효율이 유의하게 증가하지 않음을 관찰하였다. 따라서, 추가량의 시약 사용 (예를 들어, 수반되는 비용과 함께)은 용리 효율과 관련하여 유의한 이점을 주지 못하기 때문에, 본 발명자들은 용리 완충액으로 사용하기 위해 100 ㎍/mL의 표준 농도의 송아지 흉선을 선택하였다.
(g) 세척
수많은 단리 또는 분리 프로토콜에서 하나 이상의 세척 단계가 통상적으로 수행된다. 따라서, 친화도 프로토콜의 한 실시양태는 표적 포획 이후이지만 표적을 방출시키기 이전에 세척 단계를 포함할 수 있었다. 이러한 세척 단계는 기재로부터 저친화도의 물질을 제거하는데 사용되고, 그에 따라 증가된 친화도로 기재에 결합되는 표적의 특이적 포획 및 용리 수준을 증가시킬 수 있었다. 그러나, 하나 이상의 세척 단계에 대한 요구는 친화도 프로토콜을 수행하기 위해 필요한 시간, 비용 및 시약의 양을 증가시킨다. 따라서, 본 발명자들은 표적 포획 이후이지만 표적을 방출시키기 이전에 하나 이상의 세척 단계에 대한 필요성을 평가하기 위한 일련의 실험을 수행하였다.
간략하게, 본 발명자들은 2 단계의 1 mL 세척 단계를 포함시키거나 또는 포함시키지 않고 친화도 프로토콜을 수행하였다. 상기 실험의 결과에서는 세척 단계가 필요하지 않은 것으로 나타났다. 즉, DNA 회수 효율을 유의하게 변경시키지 않는 것으로 나타났다. 또다른 이종 샘플, 예를 들어 성장 배지 또는 비-실험실 등급수에 현탁된 DNA를 사용하여 수행된 추가의 실험에서는 세척 단계가 필요하지 않은 것으로 나타났다. 본 발명자들은 두 세척 단계를 포함하는 것이 DNA 회수 효율을 유의하게 감소시키지는 않기 때문에 세척 단계가 특정 적용에서 필요한 경우 또는 원하는 경우에 수행될 수 있음을 주목하였다. 예를 들어, 샘플이 매우 이종이거나, 유해하거나, 또는 단리된 표적의 추가 분석에 영향을 줄 수 있는 억제성 물질을 고농도로 함유하는 경우, 회수 효율에 대한 유의한 부정적 영향이 없이 세척 단계가 수행될 수 있다. 한편, 속도 또는 비용이 중요한 이슈인 경우에는 포획후 세척 단계를 생략할 수 있다.
실시예 10: 급속 친화도 프로토콜
친화도 프로토콜은 기재를 사용하여 이종 샘플로부터 표적을 분리하고(거나) 확인하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 기재는 실질적으로 임의의 크기 또는 형태일 수 있고, 자성 또는 비-자성일 수 있으며, 샘플 중 다른 물질에 대한 개질제의 친화도에 비해 특정 표적에 대한 개질된 기재의 친화도를 우선적으로 증가시키는 하나 이상의 표면 개질제로 개질될 수 있다.
친화도 프로토콜은 다수의 실험실 또는 현장 적용 중 어느 것에도 적합하다. 또한, 실시예 9에 상세히 설명된 바와 같이, 친화도 프로토콜의 양상은 (i) 방법을 수행하기 위해 필요한 시간을 단축하고, (ii) 방법을 수행하기 위해 필요한 물질의 비용을 감소시키고, (iii) 방법을 수행하기 위해 필요한 물질의 수를 감소시키기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 친화도 프로토콜은 예를 들어, 1 내지 5 mL 범위의 샘플 부피로 수행될 수 있다. 친화도 프로토콜은 예를 들어, 1 내지 5 mg/mL 범위의 기재 (예를 들어, 비드) 농도로 수행될 수 있다. 친화도 프로토콜은 5분 또는 5분 미만의 포획 시간, 및 1분, 1분 미만 또는 30초의 용리 시간으로 수행될 수 있다. 물론, 당업자는 본 발명이 임의의 수많은 파라미터의 사용을 고려하고, 상기한 것들은 단지 이 방법을 수행하는 시간 및 비용을 감소시키는 데 유리하게 사용될 수 있는 파라미터를 나타낸 것임을 잘 알 것이다.
본 발명자들은 본원에서 이종 샘플로부터 표적을 분리하는 데 사용된 급속 친화도 프로토콜의 적용을 상세히 제공한다. 이 실시예에서, 표적의 분리에 필요한 총 시간은 5분 미만이다. 이 실시예에서, 기재는 2.7 ㎛의 아민-유도체화된 자성 비드 (다이날)이고, 표적은 DNA이며, 샘플은 실험실용 탈이온수로 희석된 세균 상등액이었다. 본 발명자들은 하기에 예시적인 급속 프로토콜을 제공하였다. 각 단계 외에도, 프로토콜의 각 단계를 수행하기 위해 필요한 시간 및 총 경과 시간 둘 다를 제공하였다.
프로토콜
단계 단계 시간 분:초 총 시간 분:초
1 기재 33 ㎕를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 피펫팅하였다. 0:30 0:30
2 액체 샘플 1 mL를 첨가하였다. 튜브를 닫았다. 0:30 1:00
3 튜브를 2초 이상 와동시켜 샘플 전체에 비드를 분포시켰다. 튜브를 비-자성 랙에 놓고 30초 동안 방치하였다 (포획 시간은 미량의 검출을 위해 연장될 수 있음). 0:45 1:45
4 튜브를 열고 가능한 경우 자성 분리 랙에 놓거나, 독립형 자석을 사용하여 비드를 튜브의 가장자리로 잡아끌었다. 0:15 2:00
5 비드를 튜브의 가장자리로 이동 (약 10초)시킨 후에, 폐기물 용기 위에서 튜브를 뒤집고, 잔류물을 피펫팅함으로써 또는 유체 전부를 피펫팅함으로써 유체를 튜브로부터 제거하였다. 비드의 제거를 방지하기 위해 이 과정 동안 튜브와 자석의 접촉을 유지하였다. 0:15 2:15
6 필요한 경우 저장기로부터 튜브를 제거하여 비-자성 랙에 놓았다. 0:15 2:30
7 용리 완충액 (0.01 N NaOH 중 100 ㎍/mL 송아지 흉선 DNA, pH=11.8) 150 ㎕를 첨가하였다. 0:30 3:00
8 튜브를 닫고, 2초 이상 와동시켜 비드 전부를 용리 완충액에 노출시켰다. 튜브를 비-자성 랙에 놓고 30초 동안 방치하였다. 0:45 3:45
9 튜브를 열고 가능한 경우 자성 분리 랙에 놓거나, 독립형 자석을 사용하여 비드를 튜브의 가장자리로 잡아끌었다. 0:15 4:00
10 필요량의 유체를 PCR 반응 튜브 또는 플레이트에 직접 피펫팅하거나, 또는 달리 추가의 분석을 위해 프로세싱하였다 (필요한 경우). 0:15 4:15
실시예 11: 표적의 저장
본 발명의 방법, 구성 및 장치의 한 적용으로는 샘플로부터 분리된 표적의 장기 저장이 있다. 이러한 장기 저장은 다양한 측면에서 유용하다. 예를 들어, 효율적이고 신뢰성 있는 장기 저장은 법의학적 측면에서 생물학적 증거의 분류에 유용하다. 또한, 장기 저장은 의학적 측면에서 교육용 샘플의 보존 뿐만 아니라, 표적 수집시 즉시 수행할 수 없는 분석을 위한 샘플의 보존에 유용하다. 또한, 장기 저장은, 표적 수집은 현장에서 수행될 수 있으나 표적 분석은 현장으로부터 지리상 격리된 곳일 수 있는 실험실에서 수행되는 경우에 환경학적 측면에서 유용하다.
장기 저장의 한 예로는 표적을 위한 비히클로서 기재 자체를 사용하는 것이 포함된다. 예를 들어, 기재 상에서 표적 포획 후, 표적-기재 복합체를 샘플로부터 분리하고, 진공 건조시키고 저장할 수 있다. 이는 매우 신속하게 수행될 수 있다. 상기 요약된 급속 프로토콜에서, 상기 건조 및 저장 단계는 단계 5 이후에 (예를 들어, 약 2분의 처리 시간 이후에) 임의로 삽입될 수 있다. 구체적인 예로, 표적-비드 복합체를 함유하는 튜브를 80 ℃에서 약 30분 동안 또는 비드 펠렛이 건조될 때까지 진공 오븐에 놓아둘 수 있다. 건조된 펠렛은 예를 들어 건조제를 함유한 암실 용기에 저장될 수 있다.
실시예 12: 복합 샘플로부터의 표적 회수
상기 상세히 설명된 바와 같이, 친화도 프로토콜은 샘플로부터 표적을 분리하는데 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명자들은 실시예 9에 상술된 특정 비드, 포획 및 용리 조건을 추가로 시험하여 보다 고도의 복합 샘플로부터의 표적 회수 효율을 평가하였다. 보다 고도의 복합 샘플은 이 기술이 적용되는 의학적 및 환경학적 샘플의 유형을 보다 정확하게 모방할 수 있다. 예시적인 복합 샘플로는 토양, 진흙, 점토 및 모래 또는 다른 고부식토와 같은 고체 샘플이 포함된다. 추가의 예시적인 복합 샘플로는 혈액, 뇨, 배설물, 정액, 질액, 골수 및 뇌척수액과 같은 생물학적 샘플이 포함된다. 또다른 추가의 예시적인 복합 샘플로는 해수, 샘수, 오일, 액상 또는 고상 광물 침착물, 및 건조 및 습윤 식품 성분이 포함된다.
간략하게, 본 발명자들은 친화도 프로토콜을 이용하여 다양한 복합 샘플로부터 표적 DNA를 분리하였다. 분리된 표적 DNA를 PCR로 증폭시켰다. 그 결과, 표적 DNA는 친화도 프로토콜을 이용하여 복합 샘플로부터 분리될 수 있으며, 분리 공정은 PCR을 억제할 수 있는 제제를 제거하는데 충분한 것으로 나타났다. 비. 안트라시스 (Ba) 및 비. 투링기엔시스 (Btk) 배양 상등액 둘 다로부터의 표적 DNA를 실험실 등급수에서 발견되지 않는 임의의 다양한 복합 오염물질을 함유하는 비-실험실 등급의 환경수로부터 효율적으로 분리하였다. DNA가 효율적으로 포획 및 용리되었을 뿐만 아니라, PCR 반응에서 DNA 증폭의 수행에 충분한 정도로 억제성 오염물질로부터 분리되었다.
제2 실험 셋트에서, 비. 안트라시스 (Ba) 및 비. 투링기엔시스 (Btk) 배양 상등액 둘 다로부터의 표적 DNA를 실험실 등급수 또는 비-실험실 등급수에서 발견되지 않는 임의의 다양한 복합 첨가제를 함유하는 농축 성장 배지 (BHI)로부터 효율적으로 분리하였다. DNA가 효율적으로 포획 및 용리되었을 뿐만 아니라, PCR 반응에서 DNA 증폭의 수행에 충분한 정도로 억제성 오염물질로부터 분리되었다.
제3 실험 셋트에서, 본 발명자들은 친화도 프로토콜을 이용하여 복합 샘플로부터 표적 세균 세포를 분리하였다. 간략하게, 본 발명자들은 친화도 프로토콜을 이용하여 다양한 복합 샘플로부터 표적 DNA를 분리하였다. 분리된 표적 세포로부터의 DNA를 PCR로 증폭시켰다. 그 결과, 세균 세포가 복합 샘플로부터 효율적으로 분리될 수 있었으며, 또한 상기 세균 세포로부터의 DNA가 PCR로 증폭될 수 있는 것으로 나타났다. Ba, Btk 및 Yp 무성 세포를 표적 세균 세포로서 사용하였고, 실험실 등급수에서 발견되지 않는 임의의 다양한 복합 오염물질을 함유하는 비-실험실 등급의 환경수로부터 상기 표적들을 분리하였다.
실시예 13: 건성 샘플에 대한 친화도 프로토콜의 적용
본원에서 상술된 바와 같이, 친화도 프로토콜은 다양한 샘플, 예를 들어 기체, 액체 및 고체 샘플로부터 광범위한 표적을 분리하는 데 사용될 수 있다. 이제 본 발명자들은 각종 샘플로부터의 표적 분리에 있어서 샘플이 우선 물로 재수화되거나 또는 달리 슬러리를 형성하도록 처리될 필요가 없음을 입증한다. 특정 유형의 샘플의 재수화가 유용할 수 있으나, 점토와 같은 특정 물질은 재수화시키기 어렵거나 또는 재수화 이후의 추가 처리가 어려워질 수 있다.
건성 생물학적 입자는 전형적으로 전하를 갖고, 이 전하는 토양 샘플 또는 공기와 같은 건성 샘플로부터 표적을 분리하는 것을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 설명하면, 자성 기재 또는 표면 개질제로 코팅된 자성 기재를 샘플에 첨가할 수 있고, 이어서 기재가 샘플과 접촉하도록 샘플 및 기재를 혼합할 수 있다. 혼합 후, 표적-기재 복합체가 형성되고, 이것은 친화도 프로토콜로 분리된 표적을 조사하기 위해 본원에 상술된 많은 방법 중 하나를 이용하여 프로세싱될 수 있다.
도 29는 표적이 건성 샘플로부터 효율적으로 확인될 수 있음을 예시하기 위해 수행된 실험의 결과를 요약한 것이다. 본 발명자들은 건성 토양 샘플에 세균 표적을 접종하였다. SNAP를 단독으로 이용하여 세균 표적으로부터 단리된 DNA에 대해 PCR 분석을 수행하고, 이를 건조 친화도 프로토콜 및 SNAP의 조합을 이용하여 세균 표적으로부터 단리된 DNA와 비교하였다. 이 실험에서, 친화도 프로토콜은 토양 샘플을 정전기적으로 하전된 비-자성 비드와 접촉시키고 표적을 농축한 후에 SNAP를 이용하여 DNA를 단리하는 것과 PCR 분석을 포함한다. 도 29는 건조 친화도 프로토콜을 수행한 후에 DNA 단리 및 PCR을 수행하는 것이 친화도 프로토콜을 사용하지 않는 토양 샘플 분석에 비해 관련 신호를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 이러한 신호 증가는 (a) 건성 샘플로부터 표적을 분리하는데 건조 친화도 프로토콜이 이용될 수 있고, (b) 친화도 프로토콜의 이용이 건성 샘플을 비롯한 다양한 샘플로부터 표적의 개선된 검출을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 14: 건성 샘플에 대한 친화도 프로토콜의 적용
비-액체 샘플에 대한 친화도 프로토콜의 적용은 각종 중요한 환경학적, 의학적, 산업적 및 안전 용도를 갖는다. 상기 약술된 바와 같이, 건성 샘플로부터 표적을 분리하는 것은 우선 건성 샘플을 재수화시켜 슬러리를 형성한 후에 이를 기재와 접촉시켜, 분리되고 임의로는 추가로 분석될 수 있는 표적-기재 복합체를 형성함으로써 달성될 수 있다. 별법으로, 건성 샘플로부터 표적을 분리하는 것은 건성 샘플을 우선적으로 재수화시킬 필요 없이 달성될 수 있다.
본 발명자들은 건성 샘플로부터 표적을 분리하고 임의로는 분석하기 위한 추가의 실험을 수행하였다. 상기 실험에서, 표면-개질 자성 기재를 포함하는 카트리지를 사용하여 건성 샘플에 대해 친화도 프로토콜을 수행하였다. 간략하게, Ba 포자 (표적)를 다양한 희석액 (0-106개 포자/모래 mL)으로 모래 샘플에 접종하였다. 각 카트리지에 증류수 5 mL로 습윤화된 모래 1 g을 로딩하였다. 카트리지에 자성 비드 (기재) 15 mg (3 mg/mL)을 사용하여 표적을 포획하였다. 상기 적용에서 친화도 프로토콜의 포획 시간은 5분이고, 용리 시간은 1분이었다.
표적 포자의 용리 후, 표적으로부터의 DNA를 PCR로 분석하여, 친화도 프로토콜을 이용한 후에 PCR 분석을 수행하는 모래 중 표적 검출의 한계를 단독 PCR에 의한 검출의 한계와 비교하여 평가하였다. 도 30에는 상기 실험의 결과가 요약되어 있다. 본 발명자들은 친화도 프로토콜을 이용한 표적 분리를 이용함으로써 표적 검출 수준을 단독 PCR을 통한 검출에 비해 10배 개선하였음을 주목하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 모래 중의 세균 포자로부터의 DNA를 100개 포자/mL 정도의 저농도로 검출하였다.
본 발명자들은 자성 비드 (기재)를 함유하는 상기 카트리지가 표적을 함유하는 다른 샘플에 대한 친화도 프로토콜 수행과 유사하게 효과적으로 사용되었음을 주목하였다. 예를 들어, 상기 카트리지는 비-실험실 등급의 환경수로부터 세균 세포 또는 세균 포자를 분리하는데 사용하였다. 본 발명자들은 샘플 mL 당 기재 3 mg의 기재 농도, 5분의 표적 포획 시간 및 1분의 표적 용리 시간을 이용한 경우, 단독 PCR에 비해 10배 이상으로 검출 수준을 개선하였다는 것을 관찰하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 세균 세포 및 세균 포자를 샘플 mL 당 10개 정도의 세포의 저농도로 검출하였다.
실시예 15: 카오스 혼합(chaotic mixing) 장치의 디자인 및 사용
상기 상세히 약술한 바와 같이, 친화도 프로토콜 및 친화도 자기 프로토콜의 대규모 적용은 큰 샘플 내의 기재 및 표적의 효율적 혼합을 촉진하는 장치의 개발에 의해 조장될 수 있다. 본 발명자들은 도 6에 약술된 원리에 기초한 유동을 갖는 저널(journal)을 달성하기 위해 기기를 제작하였다. 상기 기기는 카오스 혼합 장치 또는 제I 부류 장치로서 본원에 공지되고, 이러한 기기의 한 예는 도 31에 나타낸다. 도 31에 나타낸 장치는 2개의 테플론 실린더로 이루어지고, 이들 각각은 모터에 의해 그의 중심축 주위를 자유롭게 회전한다. 보다 작은 실린더는 고체이고, 보다 큰 실린더의 내부에 편심적으로 위치한다. 샘플을 2개의 실린더 사이의 원환부에 위치시키고, 1분 당 16회전으로 실린더 둘 다를 동시에 회전시킴으로써 혼합한다. 저속 회전 속도는 샘플 슬러리의 연장 및 중첩에 의해 형성된 유선들 사이에서 확산성 혼합을 최대화한다. 이 장치를 사용하는 특정 실시양태에서, 보다 작은 실린더를 기재 및 표적의 혼합 후에 제거하고, 이어서 전자기로 대체하였다. 그 후에 전자기를 사용하여 샘플로부터 기재-표적 복합체를 수집하였다. 이 특정 예에서, 기재는 자성 비드이고, 전자기를 사용하여 자성 비드를 효율적으로 수집하였다.
본 발명자들은 친화도 프로토콜과 함께 카오스 혼합 장치를 사용하여 세균 표적을 각종 유형의 토양으로부터 샘플 당 2 g의 양으로 추출하였다. 친화도 프로토콜의 대규모 적용은 이들 방법 및 장치가 작은 샘플 크기에 적합하고, 산업적 적용을 위해 규모를 증대시킬 수 있다는 것을 입증한다. 친화도 프로토콜의 규모 증대력이 이 기술의 산업적 적용만을 함축하는 것은 아니다. 본원에 제공된 결과는 또한 특정 표적-기재 상호작용이 보다 큰 부피로 보다 용이하게 검출될 수 있다는 것을 입증한다.
도 32 및 33은 SNAP와 함께 대규모 친화도 프로토콜 (카오스 혼합 장치에서 수행된 친화도 프로토콜)을 사용하여 추출한 DNA의 겔 전기영동의 결과를, 보다 작은 부피로 SNAP만을 사용한 것과 비교하여 나타낸다. 간략하게는, 특정 토양 샘플을 SNAP 프로토콜 또는 SNAP와 함께 대규모 친화도 프로토콜을 사용하여 분석하고, 단리된 표적 DNA를 PCR로 증폭시켰다. 이 특정 예에서, 기재는 코팅되지 않은 자성 비드였다. 도 32 및 33에 제공되는 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 대규모 친화도 프로토콜의 사용은 특정 토양 유형 중의 검출 한계를 개선하였다. 구체적으로, 슬러지 샘플에서, 본 발명자들은 검출 한계를 10배 개선할 수 있었고, 캐리(Cary) 토양 유형 (고수준의 부식산을 함유함, 공지된 PCR 억제제)에서 본 발명자들은 SNAP 프로세싱만으로는 가능하지 않는 검출을 얻을 수 있었다.
실시예 16: 변형 장치
본원에 상세히 약술한 바와 같이, 본 발명은 광범위한 기재를 친화도 프로토콜에 사용할 수 있다는 것을 고려한다. 이러한 기재를 하나 이상의 표면 개질제로 추가로 코팅할 수 있다. 하나 이상의 표면 개질제로 코팅될 수 있는 다른 기재의 한 예를 도 34에 제공하였다. 도 34는 광범위한 적용에 유용할 관능화된 기재를 나타낸다. 그 예로는, 원심분리 또는 PCR 튜브의 내벽이 있다 (여기서, X = 하나 이상의 표면 개질제임).
관능화된 튜브 및 배양 용기의 사용은 샘플 전달의 제거를 돕는데, 이는 가능한 에러 및 오염 둘 다를 감소시키고, 추가 공급에 대한 필요성을 감소시킬 것이다. 또한, 이러한 기재의 사용은 표적 부착, 및 단일 용기에서 수행되는 추가 분석을 가능하게 하고, 따라서 공급 및 시간이 제한될 수 있는 현장 적용 또는 다른 세팅에 따라 용이하게 조작될 수 있다.
본원에 기재된 친화도 프로토콜을 기초로 하여 디자인할 수 있는 다른 특정 장치는 가스 또는 액체 샘플 수집 및 분석을 용이하게 하는 장치이다. 이들 장치는 대체로 제2 부류 장치라고 지칭할 것이다. 본 발명은 습윤 및 건조 필터의 제작을 고려한다. 필터는 하나 이상의 층을 갖는 기재 (예를 들면, 비드, 페이퍼, 등)를 함유할 수 있다. 필터 상으로 및(또는) 필터를 통해 통과하는 건성 또는 습윤 샘플이 기재를 통해 통과할 것이고, 샘플 중의 표적이 기재에 부착될 것이다. 도 35는 공기 또는 물 샘플 중의 표적을 검출하기 위해 사용될 수 있는 대표적인 필터에 대한 설명을 제공하다.
건조 포맷 필터의 추가 예로서, 하나 이상의 층을 갖는 기재, 예컨대 비드를 팩킹할 수 있다. 본 발명은 동일한 기재 또는 상이한 기재의 다수의 층을 함유한 필터 뿐만 아니라, 단일 층을 함유한 필터를 고려한다. 필터가 단일 층을 함유하고, 상기 층이 단일 기재를 함유할 수 있는 실시양태에서, 단일 기재를 다수의 표면 개질제, 또는 다수의 기재로 유도체화시켰다. 공기가 필터를 통해 흐르고, 공기 샘플 중의 표적은 비드 상에 흡착된다.
본 발명은 이들 필터를 단독으로, 또는 빌딩 및 차량에 통상적으로 사용되는 다른 공기 필터와 조합하여 사용하는 것을 고려한다. 예를 들어, 친화도 프로토콜-기재 필터를 빌딩 HVAC 시스템에 추가하여 빌딩에서 순환하는 공기의 질을 추가로 분석하기 위한 수단을 제공한다.
유사하게, 습윤-필터를 사용하여 물 샘플 중의 표적의 존재를 평가할 수 있다. 이러한 필터를 사용하여 저수조를 모니터링하고, 그에 따라 식수질을 평가하며, 호수 또는 연못을 모니터링하고, 그에 따라 이들 환경의 위생을 평가할 수 있다. 이들 필터를 수족관에 사용하기 위해 개조할 수 있고, 그에 따라 수질을 평가하고, 임의의 물-관련 문제점을 진단하는 데 모두 도움을 준다. 또한, 이들 필터를 시판되는 물 정화 장치와 조합하여 가정에서 사용할 수 있다. 본 발명은 이들 필터를 단독으로, 또는 가정, 환경 또는 산업적 적용에 통상적으로 사용되는 기타 물 필터와 조합하여 사용하는 것을 고려한다.
본 발명은 추가로 또다른 제2 부류 장치 (친화도 프로토콜 카트리지)의 제작을 고려한다. 이들 특정 카트리지는 미국 공개 제2003/0129614호 (미국 특허 출원 제10/193,742호, 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 따라 이미 디자인되었고 개시되어 있는 카트리지를 기초로 하여 디자인되었지만, 본 발명은 샘플 상에서 친화도 프로토콜을 수행하기 위한 수단만을 함유하는 카트리지 뿐만 아니라, 친화도 프로토콜의 수행 수단 및 SNAP 프로토콜의 수행 수단 둘 다를 함유하는 카트리지를 고려한다.
DNA를 함유하는 환경학적 샘플, 임상적 샘플, 생체 작용제, 또는 법의학적 샘플의 수집 및 정제를 위해 사용되는 하기 장치는 미국 공개 제2003/0129614호 기재되어 있다. 이 장치는 샘플 상에 친화도 프로토콜을 수행하기 위한 수단을 포함하도록 추가로 개조될 수 있다.
도 36은 장치의 간략한 요약서를 제공한다. 상기 장치는 외부 용기 및 내부 하우징의 2부로 이루어져 있다. 내부 하우징은 DNA 정제 기능 및 추출한 DNA를 증폭시키기 위해 사용되는 PCR (중합효소 연쇄 반응)에 대한 억제제의 보유 기능을 제공하는 다공성 기재를 함유한다 (예컨대, 이 다공성 기재는 샘플 상에 SNAP 방법을 수행하기 위한 수단을 제공함). 외부 용기는 도 36에 나타내는 바와 같이, 제조되는 방식에 따라 이중 목적을 제공할 수 있다. 저장 및 수송을 위해 사용하는 경우에, 외부 용기는 샘플을 외부 용기에 가한 후에 다공성 기재의 건조를 증대시키기 위한 건조제를 포함한다. 건조제는 원환부에 의해 다공성 기재로부터 분리됨으로써 다공성 기재는 건조제와 접촉하지 않는다. 다공성 기재 상에 수집되는 샘플의 프로세싱을 위해 사용하는 경우에, 외부 용기를 열-접착성 막으로 실링하고, DNA를 용리하기 위해 사용되는 액체를 함유한다. 샘플은 열-접착성 막을 제거하고, 내부 하우징을 외부 실린더 내로 밀어넣는 프로세싱을 하여, 액체가 다공성 기재를 통해 흐르고, DNA가 생성된 용리액 내로 운반되도록 한다.
외부 용기를 외부 용기 하부 상의 스크루 또는 스냅 패스너(snap fastener) 및 테더의 의해 내부 하우징에 부착시킬 수 있다. 외부 용기는 실린더가 표면 상에 있는 경우에 안정성을 제공하고, 티핑(tipping)을 방지하기 위해 하부 표면 내로 통합된 플랜지를 가질 수도 있다.
이 장치의 하나의 변형에서, 추가 층을 도입하여 샘플을, SNAP 필터와 접촉하기 전에 친화도 프로토콜 (예컨대, 표적에 결합하는 기재)을 수행하기 위한 수단과 접촉시킨다.
장치의 또다른 가능한 변형은 상기 기재한 정제 및 억제제 결합 단계 후에 프로세싱 단계의 추가를 포함한다. 적절한 염 및 pH 조건 하에서, 핵산이 실리카 및 유리에 강하게 결합할 것이지만, 다른 부류의 화합물은 강하게 결합하지 않을 것이라는 것은 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Tian et al. 2000 Analytical Biochemistry. 283:175-191] 참조). pH 및(또는) 염 조건을 변경시킴으로써, 핵산을 실리카/유리 물질로부터 용리시킬 수 있으므로, 그에 따라 선택적 결합 및 혼합된 샘플로부터의 핵산의 후속 방출을 허용할 수 있다. 붐(Boom)의 미국 특허 제5,234,809호에 기재된 이 효과는 회사, 예컨대 퀴아젠(Qiagen) 및 프로메가(Promega)에 의해 개발된 몇몇의 종래의 상업적 핵산 정제 기술에 기초한다. 본 발명자들은 본 발명자들의 장치와 기계적 및 화학적으로 상용가능한 이러한 "붐" 효과의 신규한 구현을 제공하고, 샘플 내의 표적의 검출 및 분석을 더욱 용이하게 할 수 있다.
상기 장치를 사용하는 샘플의 프로세싱을 샘플이 고형 매트릭스 상에서 카오트로픽 염과 접촉하고, 상기 매트릭스로부터 용리되는 시점까지 상기 기재한 바와 같이 진행한다. 프로세스 중의 이 시점에서, 샘플은 고농도의 카오트로픽 염을 함유하며, 이는 실리카 또는 유리에 대한 핵산의 결합을 촉진한다. 이어서 샘플을 실리카 또는 용융 유리 기재와 접촉시킨다. 바람직한 실시양태에서, 플런저로 양압을 가함으로써 실리카 컬럼을 통해 샘플을 용리시킨다 (도 37 참조). 샘플이 실리카 컬럼 상을 통과할 때, 핵산이 컬럼에 결합된다. 유체는 실리카 컬럼을 경유하여, 샘플 유체를 포획하고 보유하는 흡수재로 계속해서 통과한다. 실리카 컬럼은 사용자가 슬라이더를 잡아당김으로써 실리카 컬럼을 제2 챔버 내로 용이하게 옮길 수 있게 하는 "슬라이더" 포맷으로 제작될 수 있다. 한 실시양태에서, 슬라이더를 잡아당기는 것은 제2 챔버 중의 완충액 저장소를 개방하는 기능을 한다. 도 37에서, 제2 저염 완충액 저장소를 개방하고, 사용자가 제2 플런저를 사용하여 압력을 가함으로써 실리카 컬럼을 통해 액체를 유도하여, 핵산을 청결한 구획 내로 용리하였다. 이 샘플에 대한 접근은 격막, 나사 플러그, 또는 통합된 시린지를 비롯한 다수의 방식 중 임의의 하나의 방식을 통해 수행될 수 있다. 제1 챔버에 대한 제2 챔버의 배향은 180°회전한 것일 수 있다. 즉, 실리카 또는 유리 컬럼을 함유하는 슬라이더가 하나의 챔버에서 다른 챔버로 이동될 수 있다면, 2개의 플런저가 나란히 위치하거나 또는 장치의 대향하는 단부에 위치할 수 있다.
이 방법 및 장치는 본 특허 출원 및 종래 특허 출원에 이미 기재된 종래의 샘플 포획 및 세포 용해 기술의 여러가지 변형된 기술과 병용될 수 있다. 이 방법은 또한 이 프로세싱을 개시하기 직전에 샘플의 조성이 고농도의 염을 포함하고, 실용적 pH 범위 (예를 들어, pH 3 내지 12)에 있다면, 다른 샘플 포획 및 세포 용해 기술과도 병용될 수 있다.
상기 기재한 바와 같이, 상기 장치의 바람직한 실시양태는, 다른 기능 중에서도 샘플에서 제제를 불활성화시키거나 소멸시키는 고농도의 카오트로픽 염을 함유하는 다공성 지지체에 샘플을 가하는 것을 포함한다. 이 효과는 후속 조작 및 운반에 대해 카트리지를 안전하게 한다. 그러나, 일부 적용에서, 사용자는 샘플에 존재하는 임의의 유기체를 배양하면서 카오트로픽 염으로 샘플을 프로세싱하는 것의 다른 이점을 여전히 얻기를 원할 수 있다. 이들 상충하는 목적을 처리하는 샘플 카트리지의 2개의 대안의 구성을 제공한다 (도 38 참조). 한 디자인에서, 다공성 지지체 상에 카오트로픽 염을 갖지 않는 장치가 카오트로픽 염을 갖는 장치에 물리적으로 연결된다. 이 연결에 의해 염을 갖는 장치가 카오트로픽 염-무함유 장치와 독립적으로 프로세싱되고, 2개의 병렬 검정을 함께 유지함으로써 샘플의 추적을 용이하게 한다. 카오트로픽 염-무함유 장치는 배양이 가능할 때까지 유기체의 생존성을 지속시키는 다른 화학물질을 함유할 수 있다.
제2 디자인에서, 장치의 내부 챔버는 유체 소통이 없는 2개의 서브-챔버로 나누어진다. 다공성 지지체는 또한 2개의 구획으로 나누어지며, 여기서 하나의 구획은 카오트로픽 염을 함유하는 반면에 다른 구획은 카오트로픽 염을 함유하지 않지만 대신에 배양을 증대시키는 화학물질을 함유할 수 있다. 이 디자인은 그 절반 둘 다가 동시에 프로세싱되어야 하기 때문에 기록용으로 보다 적합하다. 내부 실린더의 카오트로픽 염-무함유 부분으로부터 수취된 용리액으로부터 배양이 가능한 것으로 추측되지만, 용리 전에 다공성 지지체로부터의 배양은 더 높은 농도의 유기체를 수득할 것이다.
실시예 17: RNA의 단리 및 정제
상기 상세히 설명한 바와 같이, DNA 및 RNA의 유사한 특징 및 구조는 DNA와 상호작용하는 기재가 RNA와도 상호작용할 것이라는 것을 암시한다. 본 발명은 샘플로부터의 DNA의 분리 및(또는) 확인을 위한 조성물 및 방법이 RNA의 확인 및(또는) 분리에 사용될 수도 있다는 것을 고려한다. 그러나, RNA가 DNA보다 전형적으로 덜 안정하고, 보다 더 분해되기 쉽기 때문에, 본 발명은 RNA의 분리 및(또는) 확인이 본 방법에 대한 추가 변형을 요구할 수 있다는 것을 추가로 고려한다.
해당 샘플로부터 RNA를 신속하게 단리하고 정제하는 능력은 RNA를 보존하는 조건하에 RNA를 단리할 것을 요구한다. RNA는 모든 유기체에 존재하고, 따라서 본원에 기재된 방법은 진핵생물, 원핵생물, 고세균(archaea), 또는 바이러스로부터의 RNA 단리에 적용할 수 있다. 특히, 본 발명자들은 바이러스로부터의 RNA의 단리를 조사하였다.
RNA 단리는 RNA가 환경 중의 뉴클레아제에 의해 신속하게 분해되기 쉽기 때문에 복잡해진다. 바이러스 RNA는 이들 리보뉴클레아제 (RNase)를 불활성화시키는 방식으로 비리온 입자로부터 단리되어야 한다. RNase를 억제 또는 불활성화시키는 제제가 RNA를 단리하기 위해 사용되는 다수의 현재 사용가능한 실험실 절차 및 시판용 키트에 혼입되지만, 다수의 이들 방법은 늦고, 노동 집약적이고, 고가이다.
본 발명자들은 DNA 분해를 억제하는 조건하에서 DNA를 효율적으로 단리하는 것을 조력하기 위한 SNAP 방법의 사용 및 시약, 예컨대, 이소코드 페이퍼의 사용을 이전에 보고하였다. 또한, 본 발명자들은 더 용이한 조작, 휴대, 및 현장-관련 사용을 위해 SNAP 방법을 카트리지 포맷에 통합하는 LiNK라고 지칭하는 장치의 개발을 이전에 보고하였다. 본 발명은 SNAP 및 LiNK 기술이 샘플로부터의 표적 RNA의 분리 및 분석 능력을 추가로 증대시키도록 적합하게 조작될 수 있다는 것을 고려한다. SNAP 및 LiNK의 이러한 RNA-중심 변형은 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 친화도 프로토콜의 효능을 추가로 증대시킬 수 있다.
SNAP 및 LiNK 기술의 RNA-특정 변형은 하기 원리에 기초할 것이다. RNA의 보존은 RNase에 의한 RNA 분해의 방지 및 RNA 중의 포스포디에스테르 결합의 비효소적 가수분해의 방지 둘 다를 포함하여야 한다. 이 가수분해는 고온 또는 극단의 pH 및 이가 양이온에 의해 매개된다. 따라서, RNA 정제는 적절하게 완충된 용액에서 수행되어야 한다.
역전사 PCR (RT-PCR)에 의한 RNA 바이러스의 확인은 4 단계로 나눠질 수 있다: RNA의 추출 및 단리, RNase에 의한 RNA의 분해 및 가수분해 방지, RT-PCR을 통한 RNA의 cDNA로의 전환, 및 PCR을 통한 DNA의 증폭. 이들 단계는 하기에 더 상세하게 논의된다.
a) RNA의 추출 및 단리
바이러스로부터의 RNA 단리는 RNA 분해 없이 외부 바이러스 코팅의 해리를 요구한다. 통상적으로 사용되는 RNA-추출 방법은 SDS, 페놀, 또는 높은 몰 농도의 카오트로픽 염을 포함한다. SNAP 프로토콜에 사용되는 이소코드 (등록상표) 페이퍼 또한 페이퍼에 가한 샘플로부터의 RNA 방출 능력을 갖는다.
b) RNase에 의한 RNA 분해의 방지
다수의 RNase 억제제가 존재한다. 다수의 이들 억제제는 단독으로, 또는 신속하고 간단한 RNA 단리 프로토콜과 조합하여 사용될 수 있다. 유용한 억제제는 넓은 특이성 (일부 RNase 억제제는 한 부류의 RNase에 대해서만 작용함)을 가져야 하거나, 그 자신이 다운스트림 RT-PCR 반응을 억제하지 않아야 하거나 (일부 RNase 억제제는 일반적인 효소 억제제임), 또는 그들은 추출된 RNA로부터 용이하고 완전하게 제거될 필요가 있다.
본 발명은 RNA 표적의 분리 및(또는) 확인에 사용하기 위해 하기 억제제를 고려한다: 점토 (벤토나이트, 마칼로이드(macaloid)); 아우린트리카르복실산 (ATA); 카오트로픽 염 (예, 구아니디늄 티오시아네이트 (GT) 및 구아니디늄 히드로클로라이드 (GH)); 디에틸피로카르보네이트 (DEPC); SDS; 우레아; 및 바나딜-리보뉴클레오시드 복합체 (VRC).
본 발명은 극단의 pH 및 온도에 의한 가수분해의 억제가 pH-완충된 용액, 예컨대 트리스-EDTA로 RNA를 용리함으로써 매개될 수 있다는 것을 추가로 고려한다.
하기 RNase 억제제는 그들을 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 제제로 만드는 특징을 가진다: 마칼로이드, 벤토나이트, ATA, SDS, 우레아, DEPC, 및 카오트로픽 염. 이들 제제는 실온에서 안정하고, 다운스트림 RT 및 PCR 반응을 억제하지 않거나 또는 유기 추출 없이 용이하게 제거되거나 또는 희석된다. 하기 문단은 이들 억제제 각각에 대한 간략한 설명을 제공한다.
RNase 억제제의 개요
RNase 억제제 중 마칼로이드 및 벤토나이트는 점토의 유형들이다. 그의 억제 특성은 RNase 및 다른 염기성 단백질에 결합하는 것을 허용하는 그의 전체적인 음하전에 의해 야기되는 것으로 생각된다. 마칼로이드는 정제된 헥토라이트 (나트륨 마그네슘 리토플루오로실리케이트로 이루어진 점토)이다. 벤토나이트는 몬모릴로나이트 점토(Al203·5SiO2·7H2O)이다. 점토 각각으로부터 제조한 분획은 실온에서 안정하고, 카트리지 포맷 내로의 혼입과 상용가능한 것으로 나타난다. 이들은 RNase 억제에 최적인 pH가 상이하고, 따라서 개별적으로 또는 함께 사용될 수 있다.
아우린트리카르복실산 (ATA)은 시험관내 검정에서 뉴클레아제 (DNase 및 RNase 포함)의 일반적인 억제제이고, 세균 RNA 단리에 사용되었다. ATA는 시판용 RNase 억제제인 RNase 블록(이노제넥스, 인크(Innogenex, Inc.))의 주요 구성성분이다. 이는 겔 여과 (세파덱스(Sephadex) G-100을 통함)에 의해 정제된 핵산으로부터 제거할 수 있는 고도의 수용성 흑적색 용액이다. ATA로 단리된 RNA는 RT-PCR에 사용될 수 있다. ATA는 DNA 단리를 억제하는 것으로 나타나지 않지만, 미량은 역전사효소의 작용을 억제할 수 있다. 역전사효소의 이러한 억제가 관찰되는 경우에, 역전사 전에 ATA를 제거하는 추출 단계를 용이하게 사용할 수 있다.
카오트로픽 염, 예컨대 구아니디늄 화합물 (GT 및 GH)은 RNase의 작용을 억제하고, 다수의 RNA 추출 절차의 기초인 강력한 단백질 변성제이다. 이들 화합물은 SNAP 프로토콜에 사용되는 이소코드 (등록상표) 페이퍼의 기재이다.
바나딜-리보뉴클레오시드 복합체(VRC)는 RNase의 경쟁적 억제제이다. 이들은 DEPC, 폴리비닐 술페이트, 헤파린, 벤토나이트, 마칼로이드, SDS, 및 프로테이나제 K보다 우수하다. 불행히도, 이들은 미량으로 RT 및 PCR 중합효소 활성을 억제하기 때문에 유기 추출에 의한 제거가 요구되는 유의한 결점을 가진다. 또한, VRC는 모든 RNase를 억제하지는 않으며, 구체적으로는 RNase H의 활성을 억제하지 않는다. 추가로, VRC가 -20 ℃ 미만에서의 저장이 요구되는 한계가 있지만, 이를 극복할 수 없는 것은 아니다. 그러나, 본 발명자들은 특정 표면 (예를 들어, 샘플이 통과되는 카트리지 또는 첨가되고 샘플로부터 제거될 수 있는 비드)에 대한 VRC의 물리적 부착이 변형된 표면의 존재하에 샘플을 혼합함으로써 RNase를 결합시키고, 후속 분자 분석 전에 샘플로부터 VRC를 물리적으로 후속 분리시킬 수 있을 것이라는 것에 주목하였다.
SDS는 RNase를 비롯한 단백질을 변성시키는 세제이다.
상기의 경우에, 모든 현재 사용되는 RNA-단리 절차에서, 관련 용액을 DEPC로 예비처리할 것이다. DEPC는 환경학적 샘플을 위한 독립형 RNase 억제제로서 유용하지 않은데, 그 이유는 DEPC가 아민과 반응하여 불활성화되기 때문이다.
c) 역전사 및 PCR
추출된 RNA는 다운스트림 분석과 상용가능하여야 한다. 즉, 역전사효소 및 PCR 억제제를 함유하지 않아야 한다. 윌손(Wilson, 1997)에 의해 개관된 바와 같이, 억제제를 제거하기 위한 물질에는, 그 중에서도 특히, 5% DMSO, BSA, 및 T4 진(Gene) 32가 포함된다. 또한, RT-PCR 반응 조건은 다수의 해당 바이러스의 검출을 위해 사용가능하다 [De Paula, 2002; Drosten, 2002; Leroy, 2000; Pfeffer, 2002; Warrilow, 2002].
표적 RNA를 분리하고 추가로 분석하기 위한 상기 약술된 방법의 한 적용은 표적 RNA의 분해를 방지하고(거나) RNA 표적의 후속 분자 분석을 저해하는 화합물의 작용을 방지하는 것을 조력하는 제제를 혼입하는 장치의 제작이다. 이러한 장치 및 방법은 단독으로 또는 본원에 기재된 친화도 프로토콜 기재의 방법 및 장치와 함께 사용될 수 있다.
하기는 예시적인 층상 장치의 상세한 설명을 제공한다. 그러나, 본 발명은 동일한 또는 유사한 시약을 사용하지만 층상 구조로 구성되지는 않는 장치의 제작을 고려한다. 샘플이 위치하는 장치의 제작 또는 카트리지 어프로치의 개발은 하기와 같이 층상 어프로치에서 수행될 수 있다:
a) 해당 유기체의 용해
먼저 샘플과 접촉하는 장치의 부분이 바이러스, 세균, 진핵, 또는 고세균 유기체를 용해시키기 위한 시약을 함유할 수 있다. 이 용해는 유기체를 쪼개어 열고 DNA 또는 RNA가 추출되도록 할 것이다. 이렇게 하는 시약은 카오트로픽 염, SDS, 또는 우레아로 이루어질 수 있다. 또한, 가열 또는 냉각을 샘플을 용해하기 위해 사용할 수 있다. 온도 변화는 카트리지를 위한 지지 구조에 내장된 배터리-전원 저항기-기재 가열 회로 또는 화학 반응에 의해 제공될 수 있다.
용해 메카니즘의 가능한 구현은 상기 언급한 시약을 함유하는 용액을 첨가하는 것; 시약을 함유하는 건조 필터 또는 매트릭스에 상기 샘플을 첨가하는 것을 포함할 수 있으며, 물(건성 샘플일 경우) 또는 샘플 그 자체(액체 샘플일 경우)의 첨가시, 상기 시약은 바람직한 농도로 재용해될 것이다.
b) RNase의 억제
샘플을 용해시키는 시약과 혼합될 때, RNase의 활성을 저해하며, RNase를 물리적으로 트랩핑하거나, 또는 RNase를 결합시키는 시약이 존재해야 한다. 이러한 시약은 GT, GH, 우레아, SDS, 벤토나이트, 마칼로이드, ATA, VRC, 및 이소코드 (등록상표) 유사 셀룰로스-기재 페이퍼를 포함한다. GT, GH, 우레아, 및 SDS가 용액 중에 존재할 수 있고, 탈염 단계를 추가하거나 하류 검출 단계의 기능을 저해하지 않는 농도로 희석함으로써 제거될 수 있다. 벤토나이트 및 마칼로이드 점토는 이소코드 (등록상표) 또는 다른 셀룰로스-기재 페이퍼의 상부에 적층될 수 있다. ATA 또는 VRC의 혼입은 이들이 RNA를 함유하는 용리액 중에 존재하지 않도록 하기 위하여, ATA 또는 VRC를 고형 지지체에 화학적으로 연결하거나, 또는 여과 단계를 추가함으로써 수행될 수 있다.
c) ATA를 제거하기 위한 여과
장치에 RNase 억제제로서 ATA가 혼입될 경우에는, 용리액으로부터 ATA를 제거할 필요가 있다. 이는 크기 배제 컬럼 (예를 들어, 세파덱스 G-100 컬럼)을 통해 여과함으로써 수행될 수 있다. 상기 컬럼은 카트리지-기재 장치 내에 층으로서 포함될 수 있다.
d) 핵산의 결합 및 RNase의 제거
크기-분별된 실리카, 화학-처리된 비드, 또는 화학 처리된 막 또는 표면의 층을 사용하여 핵산 (DNA 또는 RNA)을 결합시킴으로써, 용해된 샘플을 세정하여 이전 층에 특이적으로 결합되어 있지 않는 금속, 염, 또는 다른 물질을 제거하는 후속 정제가 가능할 수 있다. 이어서 핵산을 적합한 조건으로 실리카, 비드, 또는 표면으로부터 용리시키고 분자 생물학의 표준 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
실시예 18: 다수 표적의 동시 검출
본 발명의 여러 적용분야에서, 다수의 표적의 존재를 동시에 평가하는 능력이 유리하다. 예를 들어, 2개의 상이한 세균 세포 유형을 분리하는 능력은 단일 시험에서 다수의 잠재적 감염제의 존재를 평가하는 의학적 진단을 가능하게 할 것이다. 유사하게, DNA 및 RNA 둘 다를 동일한 샘플로부터 분리하는 능력은 세균 및 바이러스 유기체, 또는 DNA 및 RNA-기재 바이러스의 동시 평가를 가능하게 할 것이다.
본 발명자들은 시판되는 유리 섬유 필터, 및 상기 필터를 사용하기 위한 표준 프로토콜을 사용하여 DNA 및 RNA를 단리하는 능력을 평가하였다. 그 결과는 DNA 및 RNA가 표준 프로토콜을 사용하여 동일한 샘플로부터 동시에 단리될 수 있고, 친화도 프로토콜을 사용하는 다수의 표적의 동시 단리 또한 가능하다는 것을 나타내었다. 친화도 프로토콜의 사용은 보다 시간 집약적, 노동 집약적 및 시약 집약적인, 현재 이용가능한 기술과 비교하였을 때 다수의 제제의 분리를 매우 단순하게 할 것이다.
간략하게, 세균 (바실러스 투링기엔시스 (Btk)), MS2 박테리오파지 (대장균을 감염시키고, 단일 가닥 RNA 바이러스의 모델로서 작용하는 박테리오파지), 또는 Btk 및 MS2 둘 다를 함유한 샘플을 분석하였다. 샘플을 L6 완충액 (구아니딘 이소티오시아네이트; 0.1 M 트리스-HCl (pH 6.5); 0.2 M EDTA (pH 8.0); 트리톤-X 100을 함유하는 완충액) 중에 희석시키고, 1 mL 부피의 시판되는 유리 섬유 필터를 통해 통과시켰다. 60 mL 시린지를 사용하여 필터를 통해 공기 60 mL를 통과시켰다. L2 완충액 (구아니딘 이소티오시아네이트; 0.1 M 트리스-HCl (pH 6.5); 0.2 M EDTA (pH 8.0); 트리톤-X 100을 함유하는 완충액) 2 mL를 상기 필터에 적용하였다. L2 완충액, 이어서 강제 공기 60 mL, 70% EtOH 3 mL, 및 그 후에 다시 강제 공기 60 mL (반복 2X)를 적용하였다. 이어서 필터를 건조시키고, 표적을 TE (트리스, 1.0 mM EDTA-최종 pH = 7.0)로 용리하였다.
용리액의 분취물에 대해 RT-PCR 및 PCR을 수행하여 각각 바이러스 RNA 및 세균 DNA를 검출하였다. RT-PCR을 25 ㎕의 반응물 부피로 수행하였다. MS2 특이적 프라이머 및 프로브 셋트를 사용하여 1-단계 RT-PCR 반응물 (TaMan 1-단계, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 제조하고, ABI7700 실시간 PCR 기계 (어플라이드 바이오시스템즈)에서 수행하였다. 반응물 25 ㎕ 각각은 샘플 용리액 2.5 ㎕를 함유하였다. 하기 RT-PCR 조건을 사용하였다: 48 ℃에서 30분, 95 ℃에서 10분, 95 ℃에서 각각 15초의 주기 50회, 및 60 ℃에서 1분. 유사하게 PCR을 수행하였으나, Btk 특이적 프라이머를 사용하였다.
MS2 단독 또는 MS2와 Btk의 조합을 함유하는 샘플에서 RT-PCR에 의해 MS2의 존재를 검출하였다. MS2만을 함유하는 샘플에서 RT-PCR에 의한 MS2의 검출은 20.65 (표준 편차 = 0.33)의 감지 시작 주기(cycle threshold)에서 일어났다. MS2 및 Btk 둘 다를 함유하는 샘플에서 RT-PCR에 의한 MS의 검출은 21.75 (표준 편차 = 2.04)의 감지 시작 주기에서 일어났다.
Btk 단독 또는 Btk와 MS2의 조합을 함유하는 샘플에서 PCR에 의해 Btk의 존재를 검출하였다. Btk만을 함유하는 샘플에서 PCR에 의한 Btk의 검출은 23.65 (표준 편차 = 0.23)의 감지 시작 주기에서 일어났다. Btk 및 MS2 둘 다를 함유하는 샘플에서 PCR에 의한 Btk의 검출은 23.81 (표준 편차 = 0.39)의 감지 시작 주기에서 일어났다.
실시예 19: RNA 표적의 분리 및 확인
시판되는 유리-섬유 필터, 및 수반되는 방법론을 사용하여 DNA 및 RNA 표적을 분리할 수 있다. 이러한 방법은 시간 집약적 및 시약 집약적이고, 그에 따라서 (i) 소정의 분야에서의 이의 사용; (ii) 시간-감수성 적용에서의 이의 사용; (iii) 비용-감수성 적용에서의 이의 사용으로 한정된다. 본 명세서에서 상세하게 기술된 바와 같이, 친화도 프로토콜은 당업자에게 공지된 다른 분석 방법의 수많은 한계를 극복하고, 최소의 시약 및 시간으로 다양한 표적을 분리하고, 임의로는 추가로 분석할 수 있게 한다.
본 발명자들은 친화도 프로토콜이 세균 세포 및 세균 포자를 비롯한 다양한 표적을 분리하는데 효과적으로 사용될 수 있고, 또한 친화도 프로토콜에 의해 분리된 세균 세포 및 포자로부터의 DNA가 PCR과 같은 방법에 의해 추가로 분석될 수 있다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 본 발명에 이르러 친화도 프로토콜이 바이러스 표적을 분리하는데 효과적으로 사용될 수 있고, 또한 친화도 프로토콜에 의해 분리된 바이러스 표적으로부터의 RNA가 RT-PCR과 같은 방법에 의해 추가로 분석될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
시판되는 유리 섬유 필터 및 제조업자의 지시사항 (실시예 18에 요약됨)을 사용하거나, 또는 친화도 자기 프로토콜 (아민 유도체화된 자성 비드를 사용하여 표적을 포획하고 0.01 N NaOH 중 송아지 흉선 DNA 100 μg/ml을 함유하는 완충액에서 용리함)을 사용하여 물 샘플로부터 MS2를 분리하였다. 둘 중 한 방법을 사용하여 MS2를 분리한 후에, 용리액을 RT-PCR에 의해 처리하여 MS2 RNA를 확인하였다. 요약하면, 본 발명자들은 둘 중 한 방법론을 사용하여 MS2를 성공적으로 분리하였고 RT-PCR에 의해 추가로 분석하였다. 유리 섬유 필터를 사용하여 MS2를 분리한 후에 RT-PCR에 의한 MS2의 검출은 29.83 (표준 편차 = 0.19)의 감지 시작 주기에서 일어났다. 친화도 프로토콜을 사용하여 MS2를 분리한 후에 RT-PCR에 의한 MS의 검출은 33.02 (표준 편차 = 0.72)의 감지 시작 주기에서 일어났다. 검출의 감수성이 유리 섬유 필터를 사용하는 분리 후에 약간 높은 것으로 나타났지만, 친화도 프로토콜을 사용하여 시간, 비용 및 실시의 용이함 측면에서 상당한 진보를 달성하였다.
추가 실험은 유리 섬유 필터 방법 대 친화도 프로토콜을 사용한 후에 RNA 검출의 감수성 차이가 RT-PCR 분석에 미치는 억제 효능에 기인한 것이며, 친화도 프로토콜을 사용였을 때의 표적의 비효율적인 포획 또는 용리에 기인한 것이 아니라는 것을 나타내었다. 요약하면, RT-PCR 분석 전에, MS2 함유 용리액을 물 또는 AP-용리 완충액 중에 희석하였고, MS2의 RT-PCR 분석 전에, 0분, 30분, 또는 60분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 수중에서 0분, 30분, 또는 60분 동안 인큐베이션 한 후에 RT-PCR에 의한 MS2의 검출은 각각 20.57, 20.65, 및 21.02의 감지 시작 주기에서 일어났다 (표준 편차 = NA). 샘플을 0분, 30분, 또는 60분 동안 용리 완충액 중에 인큐베이션 한 후에 RT-PCR에 의한 MS2의 검출은 각각 24.15, 24.05, 및 24.14의 감지 시작 주기에서 일어났다 (각각 표준 편차 = 0.03, 0.93, 및 0.04).
기타 참고문헌
Figure 112006010071368-PCT00007
Figure 112006010071368-PCT00008
각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 명세서는 구체적으로 및 개별적으로 그 전문이 상기 거명을 통해 포함되는 것으로 명시되는 것처럼, 모든 공보, 특허 및 특허 명세서는 상기 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함된다.
등가물
당업자는 다만 일상의 실험을 통해 본원에 기재된 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 인지하거나, 또는 확인할 것이다.

Claims (66)

  1. (a) 기재(substrate)가 표적에 결합하여, 기재가 비-표적 물질보다 상기 표적에 대해 더 높은 친화도로 결합하는 기재-표적 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 이종(heterogeneous) 샘플을 상기 기재와 접촉시키는 단계, 및
    (b) 상기 샘플로부터 상기 기재-표적 복합체를 제거하여, 상기 이종 샘플로부터 상기 표적을 분리하는 단계
    를 포함하는, 이종 샘플로부터 표적을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기재-표적 복합체를 형성하기에 충분한 시간이 15분 미만인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기재-표적 복합체를 형성하기에 충분한 시간이 5분 미만인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 기재를 하나 이상의 표면 개질제로 개질시켜 표면 개질된 기재를 형성하고, 상기 표면 개질된 기재가 비-표적 물질보다 상기 표적에 대해 더 높은 친화도로 결합하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 표면 개질제가 도 2, 도 3, 및 도 10 중 어느 하나에 나타내어진 개질제로부터 선택되고, 표면 개질된 기재가 비-표적 물질보다 상기 표적에 대해 더 높은 친화도로 결합하는 방법.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 기재가 자성 또는 상자성 기재인 방법.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서, 하나 이상의 표면 개질제가 절단가능한 링커를 통해 기재에 부착되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 표적이 진핵 세포, 고세균(archaea), 세균 세포 또는 포자, 또는 바이러스 입자인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 표적이 DNA, RNA, 단백질, 소 유기 분자, 또는 화학적 화합물인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 이종 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 이종 샘플이 건성 샘플인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 건성 샘플을 상기 기재와 접촉시키기 전에 액체를 상기 건성 샘플에 첨가하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, (c) 상기 표적을 상기 기재로부터 용리시키기에 충분한 시간 동안 상기 기재-표적 복합체를 용리 완충액과 접촉시켜, 상기 기재로부터 상기 표적을 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 기재로부터 상기 표적을 용리시키기에 충분한 시간이 15분 미만인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 기재로부터 상기 표적을 용리시키기에 충분한 시간이 5분 미만인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 기재로부터 상기 표적을 용리시키기에 충분한 시간이 1분 미만인 방법.
  17. 제14항에 있어서, (d) 상기 분리된 표적을 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  18. (a) 기재가 표적에 결합하여, 기재가 비-표적 물질보다 상기 표적에 대해 더 높은 친화도로 결합하는 기재-표적 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 이종 샘플을 상기 기재와 접촉시키는 단계,
    (b) 상기 샘플로부터 상기 기재-표적 복합체를 제거하여, 상기 이종 샘플로부터 상기 표적을 분리하는 단계, 및
    (c) 상기 표적을 상기 기재로부터 용리시키기에 충분한 시간 동안 상기 기재-표적 복합체를 용리 완충액과 접촉시켜, 상기 기재로부터 상기 표적을 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 표적으로는 DNA, RNA, 단백질, 진핵 세포, 고세균, 세균 세포 또는 포자, 바이러스, 소 유기 분자, 또는 화학적 화합물이 포함되고, 상기 분리 방법이 이종 샘플로부터 DNA, RNA, 단백질, 진핵 세포, 고세균, 세균 세포 또는 포자, 바이러스, 소 유기 분자, 또는 화학적 화합물을 분리하는 것을 포함하는, 이종 샘플로부터 표적을 분리하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, (d) 상기 분리된 표적을 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 분리된 표적의 분석이 상기 분리된 표적으로부터 DNA 또는 RNA를 분석하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 기재-표적 복합체를 형성하기에 충분한 시간이 15분 미만인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 기재-표적 복합체를 형성하기에 충분한 시간이 5분 미만인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 기재를 하나 이상의 표면 개질제로 개질시켜 표면 개질된 기재를 형성하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 하나 이상의 표면 개질제가 도 2, 도 3, 및 도 10 중 어느 하나에 나타내어진 개질제로부터 선택되고, 표면 개질된 기재가 비-표적 물질보다 하나 이상의 표적에 대해 더 높은 친화도로 결합하는 방법.
  25. 제18항 또는 제23항에 있어서, 기재가 자성 또는 상자성 기재인 방법.
  26. 제23항 또는 제25항에 있어서, 하나 이상의 표면 개질제가 절단가능한 링커를 통해 기재에 부착되는 방법.
  27. 제18항에 있어서, 상기 기재로부터 상기 표적을 용리시키기에 충분한 시간이 15분 미만인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 기재로부터 상기 표적을 용리시키기에 충분한 시간이 5분 미만인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 기재로부터 상기 표적을 용리시키기에 충분한 시간이 1분 미만인 방법.
  30. 하나 이상의 표면 개질제가 도 2, 도 3, 및 도 10 중 어느 하나에 나타내어진 개질제로부터 선택되고, 표면 개질된 기재가 비-표적 물질보다 하나 이상의 표적에 대해 더 높은 친화도로 결합하는, 하나 이상의 표면 개질제로 개질되어 표면 개질된 기재를 형성하는 기재.
  31. 제30항에 있어서, 자성 또는 상자성 기재인 표면 개질된 기재.
  32. 제30항에 있어서, 하나 이상의 표면 개질제가 절단가능한 링커를 통해 기재에 부착되는 표면 개질된 기재.
  33. 제30항에 있어서, DNA, RNA, 단백질, 소 유기 분자, 또는 화학적 화합물에 결합하는 표면 개질된 기재.
  34. 제30항에 있어서, 하나 이상의 종 (species)으로부터의 진핵 세포, 고세균, 세균 세포 또는 포자, 또는 바이러스 입자에 결합하는 표면 개질된 기재.
  35. 제34항에 있어서, 하나의 종으로부터의 진핵 세포, 고세균, 세균 세포 또는 포자, 또는 바이러스 입자에, 또다른 종으로부터의 진핵 세포, 고세균, 세균 세포 또는 포자, 또는 바이러스 입자에 대한 친화도보다 더 높은 친화도로 결합하는 표면 개질된 기재.
  36. 제34항에 있어서, 하나 이상의 종으로부터의 세균 세포에, 하나 이상의 종으로부터의 세균 포자에 대한 친화도보다 더 높은 친화도로 결합하는 표면 개질된 기재.
  37. 제34항에 있어서, 하나 이상의 종으로부터의 세균 포자에, 하나 이상의 종으로부터의 세균 세포에 대한 친화도보다 더 높은 친화도로 결합하는 표면 개질된 기재.
  38. 제30항에 있어서, 0.1 내지 120 ㎛의 입자 크기를 갖는 비드인 기재.
  39. 제30항에 있어서, 직경이 0.5 내지 10 mm인 기재.
  40. 제30항에 있어서, 튜브 또는 배양 용기인 기재.
  41. 하나 이상의 층 중에서 적어도 한 층이 하나 이상의 기재를 포함하고, 상기 하나 이상의 기재를 하나 이상의 표면 개질제로 개질시켜 제30항의 표면 개질된 기재를 형성하는, 하나 이상의 층을 포함하는 필터.
  42. 제41항에 있어서, 하나 이상의 기재를 포함하는 하나의 층을 포함하고, 상기 기재를 다수의 표면 개질제로 개질시킨 필터.
  43. 제41항에 있어서, 다수 층을 포함하는 필터.
  44. 제30항에 있어서, 2종 이상의 표면 개질제로 개질시킨 표면 개질된 기재.
  45. 제30항의 표면 개질된 기재를 포함하는 카트리지.
  46. 표적-기재 복합체를 소정의 시간 (용리 시간) 동안 용리 완충액과 접촉시켜, 상기 표적-기재 복합체를 붕괴시키고 상기 기재로부터 표적을 방출시키는 것을 포함하는, 기재에 결합되어 표적-기재 복합체를 형성하는 표적의 방출 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 용리 완충액이 송아지 흉선 DNA를 함유하는 것인 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 용리 완충액의 pH가 대략 11 내지 13인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 용리 완충액의 pH가 대략 11.5 내지 12.3인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 용리 시간이 1 내지 10분인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 용리 시간이 1 내지 5분인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 용리 시간이 1분 미만인 방법.
  53. 표적을 함유하는 샘플을, 표적을 포획하고 표적-기재 복합체를 형성하기에 충분한 소정의 시간 (포획 시간) 동안 소정량의 기재와 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 포획 시간이 1 내지 10분인, 표적의 포획 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 포획 시간이 1 내지 5분인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 포획 시간이 1분 미만인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 소정량의 기재가 대략 1 내지 5 mg/샘플 mL인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 소정량의 기재가 대략 1 mg/샘플 mL인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 소정량의 기재가 1 mg/샘플 mL 미만인 방법.
  59. (a) 표면 개질된 기재가 표적에 결합하기에 충분한 시간 동안 이종 샘플을 표면 개질된 기재를 형성하도록 하나 이상의 표면 개질제로 개질된 기재와 접촉시켜 기재-표적 복합체를 형성하며, 상기 표면 개질된 기재가 비-표적 물질보다 상기 표적에 대해 더 높은 친화도로 결합하고, 상기 하나 이상의 표면 개질제가 절단가능한 링커를 통해 상기 기재에 부착되는 단계;
    (b) 상기 샘플로부터 상기 기재-표적 복합체를 제거하여, 상기 이종 샘플로부터 상기 표적을 분리하는 단계, 및
    (c) 상기 절단가능한 링커의 절단을 유도하여, 상기 기재로부터 표적을 분리하는 단계
    를 포함하는, 이종 샘플로부터 표적을 분리하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, (d) 상기 분리된 표적을 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 분리된 표적의 분석이 상기 분리된 표적으로부터 DNA 또는 RNA를 분석하는 것을 포함하는 방법.
  62. 제59항에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 플루오라이드 불안정성 알킬실릴 링커인 방법.
  63. 제59항에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 산 불안정성 카르보닐 링커인 방법.
  64. 제59항에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 염기 불안정성 카르보닐 링커인 방법.
  65. 제59항에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 친핵체 불안정성 링커인 방법.
  66. 제59항에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 광 불안정성 링커인 방법.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
US20050277204A1 (en) * 2003-08-12 2005-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Sample preparation methods and devices
US20060134806A1 (en) * 2004-12-20 2006-06-22 General Electric Company Method of separating unattached Raman-active tag from bioassay or other reaction mixture
WO2006088601A2 (en) * 2005-01-21 2006-08-24 New York Blood Center, Inc., The Method for extraction and identification of nucleic acids
AU2006350038B2 (en) 2005-11-30 2011-09-15 Massachusetts Institute Of Technology Pathogen detection biosensor
US20080170230A1 (en) * 2007-01-11 2008-07-17 Lamdagen Corporation Silanization of noble metal films
US7935906B2 (en) * 2007-04-17 2011-05-03 Dynamic Connections, Llc Separation and manipulation of a chiral object
US8698031B2 (en) * 2007-04-17 2014-04-15 Dynamic Connections, Llc Separation and manipulation of a chiral object
US8614083B2 (en) * 2007-06-13 2013-12-24 Trustees Of Tufts College Method and device for the concentration of multiple microorganisms and toxins from large liquid toxins
US20090239281A1 (en) * 2008-03-21 2009-09-24 Dynamic Connections, Llc Moving A Small Object in A Direction
EP2379226B1 (en) 2008-12-31 2016-04-20 3M Innovative Properties Company Live bioload detection using microparticles
CN102770208B (zh) * 2009-12-30 2016-02-03 3M创新有限公司 使用微粒进行的活生物负载检测
WO2012037978A1 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 Alphahelix Molecular Diagnostics Ab New device and method for conducting direct quantitive real time pcr
US20120085712A1 (en) * 2010-10-06 2012-04-12 Joseph Anthony Moss Filter apparatus and method
WO2014033326A1 (en) * 2012-09-03 2014-03-06 Qiagen Gmbh Method for isolating rna including small rna with high yield
JP2016509206A (ja) 2012-12-21 2016-03-24 マイクロニクス， インコーポレイテッド 携帯型蛍光検出システムおよびマイクロアッセイカートリッジ
EP3549674B1 (en) 2012-12-21 2020-08-12 PerkinElmer Health Sciences, Inc. Low elasticity films for microfluidic use
AU2014262710B2 (en) 2013-05-07 2019-09-12 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions
JP6484222B2 (ja) 2013-05-07 2019-03-13 マイクロニクス， インコーポレイテッド 核酸の調製および分析のためのデバイス
US10386377B2 (en) 2013-05-07 2019-08-20 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
US20230211294A1 (en) * 2016-08-16 2023-07-06 Smith-Root, Inc. Self-preserving biodegradable environmental dna filter
CN116510994A (zh) * 2023-07-03 2023-08-01 中国农业大学 一种用于一体化提取基因组的pcr管

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3652761A (en) * 1969-09-04 1972-03-28 Corning Glass Works Immunochemical composites and antigen or antibody purification therewith
US3919044A (en) * 1973-03-28 1975-11-11 Armour Pharma Processes for concentrating and purifying viruses and viral antigens
US4152410A (en) * 1975-09-03 1979-05-01 Eisai Co., Ltd. Diagnosis reagent for neoplasm and method for diagnosis of neoplasm
US4230685A (en) * 1979-02-28 1980-10-28 Northwestern University Method of magnetic separation of cells and the like, and microspheres for use therein
US4672040A (en) * 1983-05-12 1987-06-09 Advanced Magnetics, Inc. Magnetic particles for use in separations
US4554088A (en) * 1983-05-12 1985-11-19 Advanced Magnetics Inc. Magnetic particles for use in separations
US4895809A (en) * 1984-01-09 1990-01-23 Varian Associates, Inc. Immobilized antigen-antibody displacement process
JP3040469B2 (ja) * 1990-10-18 2000-05-15 セルプロ インコーポレイテッド 可撓性容器を用いて粒子を分離する装置及び方法
US5665582A (en) * 1990-10-29 1997-09-09 Dekalb Genetics Corp. Isolation of biological materials
US5248589A (en) * 1991-02-21 1993-09-28 Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations Separation of cells and biological macromolecules by ferritin conjugates
US5496926A (en) * 1992-01-19 1996-03-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Process of preparing a soluble LDL receptor
US5714320A (en) * 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
US5986076A (en) * 1994-05-11 1999-11-16 Trustees Of Boston University Photocleavable agents and conjugates for the detection and isolation of biomolecules
US5705628A (en) * 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles
US6500343B2 (en) * 1995-02-21 2002-12-31 Iqbal W. Siddiqi Method for mixing and separation employing magnetic particles
JP2965131B2 (ja) * 1995-07-07 1999-10-18 東洋紡績株式会社 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
US6190870B1 (en) * 1995-08-28 2001-02-20 Amcell Corporation Efficient enrichment and detection of disseminated tumor cells
US5858534A (en) * 1995-09-05 1999-01-12 Solid Phase Sciences Corp. Method of making and using derivatized paramagnetic polymer beads
US5965375A (en) * 1997-04-04 1999-10-12 Biosite Diagnostics Diagnostic tests and kits for Clostridium difficile
US5922288A (en) * 1997-05-29 1999-07-13 Herst; C. V. Taylor Device for isolating a component of a physiological sample
US6207370B1 (en) * 1997-09-02 2001-03-27 Sequenom, Inc. Diagnostics based on mass spectrometric detection of translated target polypeptides
ATE340870T1 (de) * 1998-04-03 2006-10-15 Compound Therapeutics Inc Adressierbare protein arrays
US6294392B1 (en) * 1999-07-21 2001-09-25 The Regents Of The University Of California Spatially-encoded analyte detection
US7169618B2 (en) * 2000-06-28 2007-01-30 Skold Technology Magnetic particles and methods of producing coated magnetic particles
CN100487116C (zh) * 2001-07-09 2009-05-13 旭化成株式会社 应用非织造织物纯化和检测核酸的方法
US7217513B2 (en) * 2001-07-10 2007-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Apparatus and method for isolating a nucleic acid from a sample
US6989175B2 (en) * 2002-03-08 2006-01-24 Beckman Coulter, Inc. Acyl fluoride activation of carboxysilyl-coated glass substrates

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