CN110346561A - 一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用 - Google Patents
一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110346561A CN110346561A CN201910557872.0A CN201910557872A CN110346561A CN 110346561 A CN110346561 A CN 110346561A CN 201910557872 A CN201910557872 A CN 201910557872A CN 110346561 A CN110346561 A CN 110346561A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- magnetic microsphere
- silicone dioxide
- anaphylactoid
- room temperature
- dioxide magnetic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 88
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 87
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims abstract description 11
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 32
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 20
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical class [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 14
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 14
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 claims description 8
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 claims description 8
- UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N methane;palladium Chemical compound C.[Pd] UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 8
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 6
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 6
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 claims description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 5
- WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl formate Chemical compound CCOC=O WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 claims description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 claims 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims 1
- 238000002242 deionisation method Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 abstract description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000009920 chelation Effects 0.000 abstract description 2
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 19
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 208000002366 Nut Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940056319 ferrosoferric oxide Drugs 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 238000005381 potential energy Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N bromoacetic acid Chemical class OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 241000790917 Dioxys <bee> Species 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000001376 Familial Combined Hyperlipidemia Diseases 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Natural products C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 229910003978 SiClx Inorganic materials 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040744 Sinus headache Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- -1 at low cost Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000006757 chemical reactions by type Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
Abstract
本发明提供了一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用。该方法首先在二氧化硅磁性微球的表面进行化学反应修饰镍离子螯合基团，再与含组氨酸标签的重组过敏原蛋白通过His/Ni‑NTA相互作用牢固结合。然后，依次孵育含有sIgE的病人血清和辣根过氧化物酶标记的第二抗体anti‑IgE；最后，利用化学发光技术读取信号，从而实现对病人血清中sIgE的特异性检测。与现有技术相比，本体系制备过程简单、成本低、效率高，且检测过程可在30 min内完成。从结果可以看出，本发明应用灵敏高、分离简便，能够实现对过敏反应的快速、灵敏且高通量、低成本、特异性好的检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用。
背景技术
过敏性皮炎、过敏性鼻炎、过敏性哮喘及食物过敏等较为常见，且发病人数不断增长。过敏患者常伴有打喷嚏、咳嗽、瘙痒、鼻窦疼痛和呼吸短促等症状，严重时甚至会引起死亡。因此，过敏疾病给患者带来极大的痛苦，已成为现代社会的一个主要健康问题。
过敏性疾病又称“变态反应性疾病”，是人体对过敏原产生异常免疫应答而引起的一类疾病。临床上，根据过敏反应的速度和发病原理，可以将过敏反应分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型这四种类型。其中，Ⅰ型过敏反应是由过敏原特异性免疫球蛋白E（specificimmunoglobulin E, sIgE）介导的过敏反应，是临床上最常见的过敏反应类型，其特征是发病速度很快。I型过敏反应的发生与sIgE 存在的水平紧密相关，因此，快速且准确的检测血清中的sIgE对过敏反应的诊断有着重要意义。目前，国内外许多研究组利用组分解析的诊断方法来测定血清中的sIgE，主要包括四种方法：酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白芯片法、免疫印迹法和ImmunoCAP。其中，（1）ELISA的操作步骤复杂，难以实现对目标分子的高通量、快速检测；（2）蛋白芯片法虽然可以实现对目标检测物的高通量筛选，但是也存在耗时长，需要样品量大等问题；（3）免疫印迹法操作过程繁琐，且只能定性诊断而无法定量检测sIgE；（4）ImmunoCAP是目前临床诊断过敏性疾病常用的方法，其具有安全性高且检测结果准确等优点，但其检测条件受限于固相过敏原的固定，且检测成本较高，一般病人很难负荷多种过敏原组分的筛选。因此，开发一种新型的能够快速、灵敏、低成本且操作简便的定量检测血清中sIgE的方法对诊断过敏反应来说是非常重要的，具有重要的临床应用价值。
随着纳米技术的快速发展，纳米材料特别是磁性纳米颗粒在生物医学领域引起了人们极大的研究兴趣，为生命科学和生物技术提供了多种可能。磁性纳米颗粒作为一种处于纳米级的磁性材料，其性能比较稳定，因此制备比较容易，且易于表面功能化。同时磁性纳米粒子具有良好的磁导向性、生物相容性和生物降解性等，可以被生物分子修饰从而与多种目标检测物结合，在医学检测、诊断等方面有良好的应用前景。而一般的磁性纳米粒子由于偶极相互作用，容易发生团聚和沉降，这限制了磁性纳米粒子的应用。因此需要在四氧化三铁纳米粒子表面修饰无机惰性材料，从而屏蔽偶极相互作用，提高纳米粒子的分散性。其中，二氧化硅是较为常用的一种对磁性纳米粒子表面改性的材料，适用于细胞、核酸的分离、以及免疫分析等生物领域。
申请号201710366724.1公开了一种四氧化三铁免疫纳米磁珠及其制备方法和应用。该方法包括以下步骤：(1)制备纳米磁珠；(2)纳米磁珠的表面修饰；(3)免疫磁珠的制备。本发明还公布了该四氧化三铁免疫纳米磁珠的应用。本发明所述的一种四氧化三铁免疫纳米磁珠及其制备方法和应用，该制备方法可以不受氮气的限制，并改善了Fe3O4的磁学性质；通过对Fe3O4纳米磁珠表面进行改性，制成磁性高分子微球，与坚果过敏性血清抗体结合制成免疫磁珠，增加了免疫纳米磁珠的种类和制备方法；使免疫磁珠与酶联免疫法结合，无需生物传感器法、质谱仪等昂贵设备，成本低，可以有效检测坚果过敏蛋白，提高预测与评估交叉过敏反应的准确性。但是，专利是利用磁珠上修饰的醛基与过敏性血清抗体的氨基结合，从而使抗体偶联到磁珠表面，这种结合不具有特异性且结合效果较差。
申请号2016100234323公开了一种纳米磁珠的表面修饰方法。其制备方法包括纳米微球的制备和表面修饰的过程。本发明通过水相反应得到一定大小的生物磁性微球，在其表面引入能吸附核酸的基团，利用二氧化硅带电性吸核酸的性质，能高效纯化多种复杂样品，从而实现核酸纯化的自动化，大大减少工作人员的工作量。并且本发明磁性微球具有分散性好，成本低，颗粒均一性好，磁珠大小可控性强的特点，能有效用于诊断试剂前期纯化以及临床核酸检测，在测序领域、生物磁性微球靶向治疗、生物医药开发领域有着广泛的应用前景和社会经济效益。但是，该专利通过在硅基磁珠表面固定亲水性阴离子交换剂，从而特异性吸附带负电的核酸分子，这种结合方式的特异性比较差，且结合不够牢固。
发明内容
针对临床上现有的过敏检测技术的耗时久、成本高、效率低的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用，本发明利用二氧化硅磁性微球与His标记的蛋白的特异性结合，达到对过敏反应快速、灵敏且高效率、低成本的特异性检测。
一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，取3-12 mg二氧化硅磁性微球，超声分散在1.5-6 mL的pH为6的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，以13500 rpm的转速离心10-30 min，弃上清液，并清洗沉淀，重复离心洗涤操作2-4次后，将沉淀超声分散在1.5-6 mL的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液A，备用；
步骤2，将3-12 mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-16 mg的N-羟基琥珀酰亚胺依次加入1.5-6 mL的混合液A中，37℃下在摇床上活化0.5-2 h后以13500 rpm的转速离心10-30 min，弃上清液，依次用2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液洗，循环冲洗操作2-4次，每次1.5-6 mL，以13500 rpm的转速离心10-30 min，弃上清，得活化后的二氧化硅磁性微球；
步骤3，将2-8 mg的次氮基三乙酸溶解于1.5-6 mL的磷酸盐缓冲液中，将其加入活化后的二氧化硅磁性微球中，37℃下在摇床上摇6-24 h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作2-4次，每次1.5-6 mL，以13500 rpm的转速离心10-30 min，弃上清，再将NTA功能化的磁性微球分散在去离子水中4℃保存；
步骤4,向制备得到的NTA功能化的磁性微球中加入5-20 mL的0.05-0.2 M的氯化镍中，室温下在摇床上摇1-3 h，用去离子水洗3次，每次1.5-6 mL，13500 rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。
作为改进的是，步骤3中NTA的制备方法，包括以下步骤：
第一步，0℃下，将0.5-1g N-碳苄氧基赖氨酸溶于4-8mL的2M氢氧化钠后，转入烧瓶中，将1.05-2.1 g的溴乙酸溶于10-20 mL的2 M氢氧化钠中，并以0.5 mL/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，室温下搅拌1.5-3 h，加热至50℃，反应15-20 h后，置于0℃下，再加入浓盐酸反应形成沉淀，减压过滤得白色粉末b；第二步，将0.5-1 g白色粉末b溶解于25-50 mL甲醇中，再加入50-100 mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16 h，再在减压条件下过滤除去钯碳得NTA。
上述NTA的反应式如下所示：
进一步改进的是，第一步中N-碳苄氧基赖氨酸与溴乙酸的摩尔比为1:2.1-8.2。
上述制备方法所得的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球在制备临床检测过敏反应产品中的应用。
上述应用包括以下步骤：
步骤a，将制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加至96孔板中，再滴加含组氨酸标签的重组过敏原蛋白，室温孵育，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，去除未结合物，得混合物B；
步骤b，向混合物B中加入待测血清样本，室温孵育，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗未结合物;
步骤c，再加入HRP-羊抗人sIgE，再室温下孵育后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本的sIgE的检测。
作为改进的是，步骤a和步骤b中磷酸盐缓冲液的浓度是0.01 mol/L，清洗2-4次，每次10-40 μL。
作为改进的是，步骤a中制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球与重组过敏原蛋白的体积比为1:5-20，室温下孵育5-30 min。
作为改进的是，步骤b中混合物B与待测血清样本的体积比为1:0.5-10，室温下孵育5-30 min。
作为改进的是，步骤c中待测血清样本与HRP-羊抗人sIgE的体积比为1:0.5-10，室温下孵育5-30 min。
有益效果
本发明首先在二氧化硅磁性微球的表面进行化学反应修饰镍离子螯合基团（Ni-NTA），再与含组氨酸标签（His-tag）的重组过敏原蛋白通过 His/Ni-NTA 相互作用牢固结合。然后，依次孵育含有sIgE 的病人血清和辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的第二抗体anti-IgE；最后，利用化学发光技术读取信号，从而实现对病人血清中 sIgE的特异性检测。我们利用磁性纳米粒子比表面积大、表面可修饰、易分离等优点，并利用Ni-NTA修饰磁性纳米粒子，使其与含有His标签的狗毛过敏蛋白特异性结合，His标签体积小，不会遮盖抗原表位的结合位点，保持蛋白的活性，对靶生物目标进行快速分离，从而实现对生物样本的免疫分析检测。
与现有技术相比，本体系制备过程简单、成本低、效率高，且检测过程可在30 min内完成。临床检测结果表明，本方法灵敏高、分离简便，能够实现对过敏反应的快速、灵敏且高通量、低成本、特异性好的检测，有利于人类的健康发展。
附图说明
图1 为本发明中二氧化硅磁性微球检测过敏反应的流程图；
图2为结合Ni-NTA前后二氧化硅磁性微球的电势变化图，其中，1- 商业的带有羧基二氧化硅磁性微球，2-二氧化硅磁性微球结合NTA， 3-二氧化硅磁性微球结合Ni-NTA；
图3为二氧化硅磁性微球结合Ni-NTA前后的红外测试图谱，a-商业的带有羧基的二氧化硅磁性微球，b为结合NTA的二氧化硅磁性微球，c为结合Ni2+的二氧化硅磁性微球；
图4为 Ni-NTA的合成路线；
图5为真实血清样本的商业化ELISA试剂盒的检测与磁珠检测的结果对比图，（a）为二氧化硅磁性微球检测血清样本得到的化学发光图，（b）为利用Image J进行对化学发光强度进行量化从而得到阴性与阳性血清发光强度的柱状图,（c）为商业化ELISA试剂盒检测得到的光密度值。
图6为二氧化硅磁性微球对10个未知血清样本的检测结果情况，（a）为二氧化硅磁性微球应用检测后利用凝胶成像仪拍摄得到的化学发光图，（b）是利用Image J对图6（a）的化学发光强度进行量化得到的柱状图，（c）是临床ELISA检测血清样本得到的光密度值。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取12 mg二氧化硅磁性微球（SLC核壳式二氧化硅磁性微球,基质:SiO2,表面基团:-COOH,粒径:4-5μm,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司），超声分散在3 mL的pH为6的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，13500 rpm离心10 min，弃上清液，并洗涤沉淀，重复离心洗涤步骤4次，再将沉淀超声分散在3 mL 的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液A，备用；
步骤2：将12 mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和16 mg的N-羟基琥珀酰亚胺依次加入6 mL的混合液A中，37℃下在摇床上活化2 h后，以13500 rpm的转速离心10min，弃上清液，依次用2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液洗，重复冲洗操作4次，每次3 mL，13500 rpm离心10 min，弃上清，得活化后的磁性微球；
步骤3：将2 mg的NTA溶解于3 mL的磷酸缓冲液中，将其加入活化后的磁性微球中，37℃下在摇床上摇24 h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作4次，每次3 mL，13500rpm离心10 min，弃上清，再将NTA功能化的磁性微球分散在去离子水中4℃保存；
步骤4：向制备得到的NTA功能化的磁性微球加入10 mL的0.1 M的氯化镍中，室温下在摇床上摇2 h，用去离子水洗三次，每次3 mL，13500 rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。
上述的一种对二氧化硅磁性微球表面修饰前后的表征，主要表征手段如下：
（1）如图2的电势图中的变化可以看出，在结合了带有负电荷的NTA 之后，电势向负方向移动；而在螯合了带正电荷的Ni2+后，磁性微球的电势正向移动，这可以证明Ni-NTA与二氧化硅磁性微球结合了。
（2）如图3的红外测试图谱可以看出，从红外图中可以看出，由于二氧化硅磁性微球带有羧基，因此在3300 cm-1和1700 cm-1左右有吸收峰，而在结合NTA后，由于NTA上带有更多的羧基，因此3300 cm-1左右的O-H峰和1643 cm-1左右的C=O峰强度都有一定的增加。在螯合Ni2+后，在500 cm-1左右Ni2+的吸收峰的强度增强，这证明了Ni-NTA与二氧化硅磁性微球结合了。
在上述制备过程中，所用的 NTA的制备方法如下：
（1）0℃下，将1 g的N-碳苄氧基赖氨酸溶解于4 mL的2 M氢氧化钠中，再加入到烧瓶中，再将1.6 g溴乙酸溶于20 mL的2 M的氢氧化钠中，并将其以0.5 mL/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌1.5 h，然后加热到50℃反应15 h。0℃下，将浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末b。
（2）将上述0.5 g的白色粉末b溶解于25 mL甲醇中，加入50 mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16 h，再在减压条件下过滤除去钯碳得NTA，反应式如下：
上述制备方法所得的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球在制备临床检测过敏反应产品中的应用，包括以下步骤：
（1）将制备得到的20 μL制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加到96孔板中，再向其中滴加含组氨酸标签（His）的重组过敏原蛋白，室温孵育5 min，再用20 μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；
（2）加入6 μL待测血清样本与二氧化硅磁性微球室温孵育5 min，并用10 μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；
（3）加入3 μL二抗室温孵育10 min后，用10 μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，磁性分离洗去未结合物，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本中sIgE的特异性检测。
实施例2
一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取6 mg表面含羧基的二氧化硅磁性微球，超声分散在1.5 mL的pH为6的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，13500 rpm下离心30 min弃上清液，重复离心洗涤步骤2次，再将磁性微球超声分散在6 mL 的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液A，备用；
步骤2：将3 mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4 mg的N-羟基琥珀酰亚胺依次加入1.5 mL的混合液A中，37℃下在摇床上活化1 h，以13500 rpm的转速离心30min后弃上清液。依次用2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作2次，每次6 mL，13500 rpm的转速离心30 min，弃上清，得活化后的二氧化硅磁性微球；
步骤3：将6 mg的NTA溶解于6 mL的磷酸盐缓冲液中，将其加入活化后的二氧化硅磁性微球中，37℃下在摇床上6 h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作2次，每次1.5mL，13500 rpm离心30 min，弃上清，再将磁性微球分散在去离子水中4℃保存；
步骤4：向制备得到的功能化的磁性微球加入20 mL的0.2 M的氯化镍，室温下在摇床上摇3 h，用去离子水洗三次，每次6 mL，13500 rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。
上述的一种对二氧化硅磁性微球表面修饰前后的表征，主要表征手段如下：
（1）如图2的电势图中的变化可以看出，在结合了带有负电荷的NTA 之后，电势向负方向移动；而在螯合了带正电荷的Ni2+后，磁性微球的电势正向移动，这可以证明Ni-NTA与二氧化硅磁性微球结合了。
（2）如图3的红外测试图谱可以看出，从红外图中可以看出，由于二氧化硅磁性微球带有羧基，因此在3300 cm-1和1700 cm-1左右有吸收峰，而在结合NTA后，由于NTA上带有更多的羧基，因此3300 cm-1左右的O-H峰和1643 cm-1左右的C=O峰强度都有一定的增加。在螯合Ni2+后，在500 cm-1左右Ni2+的吸收峰的强度增强，这证明了Ni-NTA与二氧化硅磁性微球结合了。
上述制备过程中，所用NTA的制备方法如下：
（1）0℃下，将1 g的N-碳苄氧基赖氨酸溶解于8 mL的2 M氢氧化钠，再加入到烧瓶中，将2.1 g的溴乙酸溶于15 mL的2 M氢氧化钠中，并以0.5 mL/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌3h，然后加热到50℃反应18 h。0℃下，将浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末b。
（2）将上述1 g白色粉末b溶解于50 mL甲醇中，加入80 mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16 h，再在减压条件下过滤除去钯碳得NTA，反应式如下：
上述的一种二氧化硅磁性微球检测过敏反应的方法，主要步骤如下：
（1）将制备得到的40 μL制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加到96孔板中，再向其中滴加1.5 μL含组氨酸（His）标签的重组过敏原蛋白，室温孵育30 min，再用20 μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；
（2）加入1.5 μL的待测血清样本与二氧化硅磁性微球室温孵育15 min，并用20 μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；
（3）加入1.5 μL的二抗孵育后，用20 μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，磁性分离洗去未结合物，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本中sIgE的特异性检测。
将本实施例制备的二氧化硅磁性微球用于检测4个血清样本，从图5可以看出，图5（c）中样品的发光强度可以看出，ELISA检测中样本1、2的发光强度大约是样本3、4的2倍。而图5（b）二氧化硅磁性微球检测中样本1、2的发光强度大约是样本3、4的5倍，因此可以判断样本1、2为阳性血清，样本3、4为阴性血清。磁珠检测得到的结果与ELISA结果完全一致，而其中磁珠检测得到的结果区分度更大，检测更具有灵敏性。
实施例3
一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取3 mg表面含羧基的二氧化硅磁性微球，超声分散在6 mL的pH为6的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，13500 rpm下离心弃上清液，重复离心洗涤步骤3次，再将磁性微球超声分散在1.5 mL 的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液A，备用；
步骤2：将6 mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8 mg的N-羟基琥珀酰亚胺依次加入3 mL的得混合液A中，37℃下在摇床上活化0.5 h后，以13500 rpm的转速离心15 min，弃上清液,依次用2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液洗3次，每次1.5 mL，13500 rpm离心15 min，弃上清，得活化后的二氧化硅磁性微球；
步骤3：将8 mg的NTA溶解于1.5 mL的磷酸盐缓冲液中，将其加入活化后的二氧化硅磁性微球中，37℃下在摇床上12 h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液，循环冲洗操作3次，每次6mL，13500 rpm离心15 min，弃上清，再将NTA功能化的磁性微球分散在去离子水中4℃保存；
步骤4：向制备得到的NTA功能化的磁性微球中加入5 mL的0.1 M的氯化镍，室温下在摇床上摇1 h，用去离子水洗三次，每次1.5 mL，13500 rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。
上述的一种对二氧化硅磁性微球表面修饰前后的表征，主要表征手段如下：
（1）如图2的电势图中的变化可以看出，在结合了带有负电荷的NTA 之后，电势向负方向移动；而在螯合了带正电荷的Ni2+后，磁性微球的电势正向移动，这可以证明Ni-NTA与二氧化硅磁性微球结合了。
（2）如图3的红外测试图谱可以看出，从红外图中可以看出，由于二氧化硅磁性微球带有羧基，因此在3300 cm-1和1700 cm-1左右有吸收峰，而在结合NTA后，由于NTA上带有更多的羧基，因此3300 cm-1左右的O-H峰和1643 cm-1左右的C=O峰强度都有一定的增加。在螯合Ni2+后，在500 cm-1左右Ni2+的吸收峰的强度增强，这证明了Ni-NTA与二氧化硅磁性微球结合了。
上述二氧化硅磁性微球检测过敏反应的方法，主要步骤如下：
（1）将制备得到的30 μL制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加到96孔板中，再向其中滴加6 μL含组氨酸（His）标签的重组过敏原蛋白，室温孵育15 min，再用40 μL 的pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；
（2）加入6 μL的待测血清样本与二氧化硅磁性微球室温孵育30 min，并用40 μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；
（3）加入6 μL的二抗孵育后，用40 μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，磁性分离洗去未结合物，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本中sIgE的特异性检测。
检测过敏反应的结果如图6所示，从图中可以看出，除3、5、8号样本为阳性血清，其余均为阴性样本。将磁性微球的检测结果与临床检测结果对比发现，二氧化硅磁性微球对血清样本的检测结果与临床检测结果完全吻合。
上述制备方法中，所用的NTA的制备方法如下：
（1）0℃下，将0.5 g的N-碳苄氧基赖氨酸溶解于4 mL的2 M氢氧化钠，再加入到烧瓶中，将1.05 g溴乙酸溶解于10 mL的2 M氢氧化钠中，并以0.5 mL/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌3 h，然后加热到50℃反应20 h。0℃下，将浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末。
（2）将上述0.8 g白色粉末溶解于35 mL甲醇中，加入100 mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16 h，再在减压条件下过滤除去钯碳得NTA，反应式如下：
申请号201710366724.1的专利是利用已知的对坚果过敏的血清，来检测导致过敏的坚果蛋白，对食物中过敏原检测具有一定意义，虽然同样利用磁性微球检测过敏反应，但与本专利有一定区别。主要表现在：1、本发明利用磁珠修饰Ni-NTA，再结合导致过敏的重组过敏原蛋白，从而检测血清中否含有sIgE，判断病人是否会对此种蛋白过敏，在临床过敏检测方面有广阔的应用前景；2、申请号201710366724.1的专利结合抗原后需要加入牛血清蛋白，封闭其余反应位点；而本专利中由于Ni-NTA特异性结合His标记的蛋白，无需BSA封闭的步骤，节省操作时间和成本；3、申请号201710366724.1的专利检测时间需要2天左右；而本发明仅需要30分钟左右，极大缩短了检测时间，且需要的样本量也极少，能够实现低成本、高通量的快速检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，取3-12 mg二氧化硅磁性微球，超声分散在1.5-6 mL的pH为6的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，以13500 rpm的转速离心10-30 min，弃上清液，并清洗沉淀，重复离心洗涤操作2-4次后，将沉淀超声分散在1.5-6 mL的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液A，备用；步骤2，将3-12 mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-16 mg的N-羟基琥珀酰亚胺依次加入1.5-6 mL的混合液A中，37℃下在摇床上活化0.5-2 h后以13500 rpm的转速离心10-30min，弃上清液，依次用2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液洗，循环冲洗操作2-4次，每次1.5-6 mL，以13500 rpm的转速离心10-30 min，弃上清，得活化后的二氧化硅磁性微球；步骤3，将2-8 mg的次氮基三乙酸溶解于1.5-6 mL的磷酸盐缓冲液中，将其加入活化后的二氧化硅磁性微球中，37℃下在摇床上摇6-24 h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作2-4次，每次1.5-6 mL，以13500rpm的转速离心10-30min，弃上清，再将NTA功能化的磁性微球分散在去离子水中4℃保存；步骤4,向制备得到的NTA功能化的磁性微球中加入5-20 mL的0.05-0.2 M的氯化镍中，室温下在摇床上摇1-3 h，用去离子水洗3次，每次1.5-6 mL，13500 rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤3中NTA的制备方法，包括以下步骤：第一步，0℃下，将0.5-1g N-碳苄氧基赖氨酸溶于4-8 mL的2 M氢氧化钠后，转入烧瓶中，将1.05-2.1 g的溴乙酸溶于10-20 mL的2M氢氧化钠中，并以0.5 mL/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，室温下搅拌1.5-3 h，加热至50℃，反应15-20 h后，置于0℃下，再加入浓盐酸反应形成沉淀，减压过滤得白色粉末b；第二步，将0.5-1 g白色粉末b溶解于25-50 mL甲醇中，再加入50-100 mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16 h，再在减压条件下过滤除去钯碳得NTA。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，其特征在于，第一步中N-碳苄氧基赖氨酸与溴乙酸的摩尔比为1:2.1-8.2。
4.基于权利要求1制备方法所得的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球在制备临床检测过敏反应产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤a，将制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加至96孔板中，再滴加含组氨酸标签的重组过敏原蛋白，室温孵育，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，去除未结合物，得混合物B；步骤b，向混合物B中加入待测血清样本，室温孵育，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗未结合物；步骤c，再加入HRP-羊抗人sIgE，再室温下孵育后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本的sIgE的检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤a和步骤b中磷酸盐缓冲液的浓度是0.01 mol/L，清洗2-4次，每次10-40μL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤a中制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球与重组过敏原蛋白的体积比为1:5-20，室温下孵育5-30min。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤b中混合物B与待测血清样本的体积比为1:0.5-10，室温下孵育5-30 min。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤c中待测血清样本与HRP-羊抗人sIgE的体积比为1:0.5-10，室温下孵育5-30min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910557872.0A CN110346561A (zh) | 2019-06-26 | 2019-06-26 | 一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910557872.0A CN110346561A (zh) | 2019-06-26 | 2019-06-26 | 一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110346561A true CN110346561A (zh) | 2019-10-18 |
Family
ID=68183005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910557872.0A Pending CN110346561A (zh) | 2019-06-26 | 2019-06-26 | 一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110346561A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110850101A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-02-28 | 南京工业大学 | 一种快速定量检测特异性免疫球蛋白的纸基传感器及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1922310A (zh) * | 2002-10-18 | 2007-02-28 | 普罗梅加公司 | 分离分子的方法 |
| WO2015170844A1 (ko) * | 2014-05-09 | 2015-11-12 | 한국생명공학연구원 | 마그네틱(magnetic)을 이용한 형광다중면역검사 |
| CN106492770A (zh) * | 2015-09-08 | 2017-03-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种组氨酸标签蛋白亲和纯化材料及其应用 |
| CN107643404A (zh) * | 2017-09-04 | 2018-01-30 | 江南大学 | 一种检测中华绒螯蟹特异性免疫球蛋白e方法 |
| CN108957010A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-12-07 | 南京工业大学 | 一种可检测过敏反应的纸基传感器及其制备和应用 |
| CN109851663A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-07 | 天津威特生物医药有限责任公司 | 镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原的方法 |
-
2019
- 2019-06-26 CN CN201910557872.0A patent/CN110346561A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1922310A (zh) * | 2002-10-18 | 2007-02-28 | 普罗梅加公司 | 分离分子的方法 |
| WO2015170844A1 (ko) * | 2014-05-09 | 2015-11-12 | 한국생명공학연구원 | 마그네틱(magnetic)을 이용한 형광다중면역검사 |
| CN106492770A (zh) * | 2015-09-08 | 2017-03-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种组氨酸标签蛋白亲和纯化材料及其应用 |
| CN107643404A (zh) * | 2017-09-04 | 2018-01-30 | 江南大学 | 一种检测中华绒螯蟹特异性免疫球蛋白e方法 |
| CN108957010A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-12-07 | 南京工业大学 | 一种可检测过敏反应的纸基传感器及其制备和应用 |
| CN109851663A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-07 | 天津威特生物医药有限责任公司 | 镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FEI XU，ET AL: "Polymer Brush-Modified Magnetic Nanoparticles for His-Tagged Protein Purification", 《LANGMUIR》 * |
| HUILING GUO，ET AL: "Selective binding and magnetic separation of His-tagged proteins using Fe3O4/PAM/NTA-Ni2+ Magnetic Nanoparticles", 《MATERIALS SCIENCE AND ENGINEERING》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110850101A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-02-28 | 南京工业大学 | 一种快速定量检测特异性免疫球蛋白的纸基传感器及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104634980B (zh) | 心肌肌钙蛋白i超敏检测试剂盒及超敏检测方法 | |
| CN108982834A (zh) | 纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法 | |
| CN102495215B (zh) | 一种定量检测肿瘤坏死因子α的试剂盒 | |
| US20230333115A1 (en) | KIT FOR DETECTING ANTI-PROTEASOME SUBUNIT ALPHA TYPE 1-IMMUNOGLOBULIN G (IgG) ANTIBODY | |
| CN108333346A (zh) | dsDNA免疫磁性微球体系、其制备方法和应用以及保存液 | |
| CN109929009A (zh) | Ccp肽段、包含其的抗原、试剂、试剂盒及应用 | |
| CN102331492A (zh) | 一种检测血清中螨虫过敏原特异性抗体的方法 | |
| CN104820090A (zh) | 食物过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备和检测方法 | |
| CN110346561A (zh) | 一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用 | |
| Shi et al. | Visual typing detection of brucellosis with a lateral flow immunoassay based on coloured latex microspheres | |
| CN109342718A (zh) | 一种磁微粒化学发光检测方法 | |
| CN114354525B (zh) | 一种α-银环蛇毒素检测探针、一种非诊断目的检测α-银环蛇毒素的方法 | |
| US20100267009A1 (en) | Method for the in vitro diagnosis and/or in vitro therapy monitoring of infections | |
| CN109738644A (zh) | 一种抗穆勒氏管激素免疫比浊定量检测试剂 | |
| JP2007525643A5 (zh) | ||
| CA2355294C (en) | A method of detecting and/or quantifying a specific ige antibody in a liquid sample | |
| CN115236341A (zh) | 一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法及用途 | |
| CN114924081A (zh) | 神经母细胞分化相关蛋白-IgG在制备血管内皮损伤试剂盒中的应用 | |
| CN106381286A (zh) | 一种叶酸免疫磁珠及其制备方法 | |
| US8889836B2 (en) | Method for non-covalent immobilization of infectious prion protein | |
| CN107643404B (zh) | 一种检测中华绒螯蟹特异性免疫球蛋白e方法 | |
| RU2187121C2 (ru) | Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах | |
| RU2140085C1 (ru) | Способ диагностики пищевой аллергии | |
| JP2684425B2 (ja) | ラテックス試薬 | |
| CN113447648B (zh) | 检测抗富含丝氨酸/精氨酸剪接因子9-IgG抗体的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191018 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |