CN108957010A - 一种可检测过敏反应的纸基传感器及其制备和应用 - Google Patents

一种可检测过敏反应的纸基传感器及其制备和应用 Download PDF

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魏继福
韩希思
曹梦妲
余昌敏
黄维
许晨晨
张承武
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刘金华
吴琼
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Abstract

本发明涉及一种可检测过敏反应的纸基传感器及其制备和应用，属于纸基传感器领域。过敏反应是指当机体受到某些抗原刺激时，产生特异性免疫球蛋白(IgE)抗体，IgE可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE特异性受体结合，从而引起的异常的、过高的免疫应答。因此，血清中的IgE是检测过敏反应的重要标志。Ni‑NTA可以与有His标签的蛋白特异性结合，实现对蛋白质的亲和纯化。而纸基材料具有便宜、便携、高选择性、以及生物相容性等优势，因此通过制备含Ni‑NTA的纸基传感器，可以与含His标签的过敏原牢固结合，从而实现对免疫球蛋白的定性检测，这对快速、灵敏地检测过敏反应具有十分重要的意义。

Description

一种可检测过敏反应的纸基传感器及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种可检测过敏反应的纸基传感器及其制备和应用，属于纸基传感器领域。
背景技术
纸基传感器是以滤纸为基底替代硅、玻璃、高聚物等材料，通过在滤纸上建造疏水的隔离带，以使亲水部分形成通道及检测区，对样品进行分析检测的一种微型分析器件。它具有制备简单、易于携带、成本低廉、分析速度快等优点，因此近年来在生物医药领域引起了广泛关注。
纸基传感器的发展史可以追溯到17世纪，然而直至2007年，纸基材料才有了迅猛的发展。2007年，Whitesides课题组首次用光刻法制备纸基传感器，并将纸基材料与手机等移动设备结合，实现了远程实时诊断，这极大促进了纸基材料的发展。而由于纸基材料易于对表面进行物理或化学改性，且具有良好的生物相容性等优点，因此很多研究者报道了有关纸基检测生物标志物的文献，其在生物检测领域有广阔的应用前景。例如，在2012年，Wang等利用高碘酸盐将纸基上的羟基转化为醛基，从而使抗体共价固定在纸基表面，实现对人血清中癌胚抗原(CEA)的快速、简单、低成本的即时检测。2016年，Zhao等用等离子体处理纸基使其产生醛基，从而使抗体直接固定到纸基表面，高效、灵敏的检测CEA，从而观测肿瘤的复发，这些相关的研究对推进纸基传感器的发展有重要意义。然而，目前纸基传感器人存在加工效率较低、检测结果误差大等缺点，因此，针对这些问题，2018年，蒋兴宇课题组开发了一种用于即时检验的条码化纸基传感器，较好的解决了这些问题，使纸基传感器真正意义上实现了一次性便携式分析，是未来及时诊断的趋势之一。
氨三乙酸(Nitrilotriacetic acid,NTA)为白色棱形结晶或粉末，是一种分子较小的化合物，它能为过渡金属离子如Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+等提供四个配位键，因此具有极强的络合能力，是一种重要的氨羧络合剂。NTA通过四个位点牢固的螯合Ni2+，从而减少Ni2+的泄露，得到具有良好的物理、化学稳定性的化合物镍-氨三乙酸(Ni-NTA)。而由于金属离子能够与蛋白质表面的一些特殊的氨基酸发生相互作用，因此Ni-NTA能够与含组氨酸(6×His)标签的蛋白特异性结合，从而实现对蛋白质的亲和纯化。
过敏反应是指机体与抗原性物质在一定条件下相互作用，产生特异性抗体，当与再次进入的抗原结合时，会导致机体生理功能紊乱和组织损害的免疫病理反应，又称变态反应。当变应原初次进入过敏体质的机体时，会刺激B细胞，从而产生特异性免疫球蛋白(IgE)类抗体，而IgE能通过Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE特异性受体结合，引起异常的、过高的免疫应答，即I型超敏反应。而正常人血清中仅有极少量的IgE，因此检测血清中IgE对检测过敏反应和确定过敏原有重要意义。
目前检测过敏反应的方法较为复杂、昂贵，因此需要一种方法简便、成本低廉且快速的检测方法判断过敏反应。相较于传统酶联免疫吸附测定(ELISA)，本发明具有所需样本量少、时间短、灵敏度高、便捷、分析快速等优势，能定性且高通量的检测人血清中的免疫球蛋白IgE，使过敏反应的检测更加方便，对人类的健康发展有巨大的帮助。
发明内容
为了解决以上的问题，本发明提供了一种可检测过敏反应的纸基传感器，其对蛋白有良好的结合能力，因此能够实现对过敏反应快速简便、高效率、低成本的特异性检测。
为了解决以上的问题，本发明的技术方案是：一种可检测过敏反应的纸基传感器，所述的纸基传感器是用来检测过敏反应的，主要步骤是先在层析纸上制备得到检测区域，并对其进行修饰产生醛基，然后与高亲和络合物镍-氨三乙酸Ni-NTA结合，使其螯合带有组氨酸His标签的过敏原，从而检测血清中的免疫球蛋白IgE，实现对过敏反应的检测。
为了解决以上的问题，本发明的另一技术方案是：所述的可检测过敏反应的纸基传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：利用等离子清洗机对层析纸进行等离子体处理，使纸表面产生醛基；利用蜡打印机在纸上打印出微流控检测区域，并将打印好的层析纸置于烘箱中烘烤，使蜡熔化并穿透纸张厚度，形成亲水-疏水壁垒；
步骤2：在层析纸的检测区域滴加Ni-NTA，室温下放置直至干透；
步骤3：在检测区域滴加带有组氨酸His标签的过敏原，并用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，即得可检测过敏反应的纸基传感器，然后对血清中的免疫球蛋白IgE进行检测。
优选的，步骤1中等离子清洗机工作参数为工作电源13.56MHZ，射频功率为80-100W，处理时间为3-5min。
优选的，步骤2中烘烤温度为100℃，时间90s，检测区为直径3-6mm的圆孔，边缘为亲疏水通道。
优选的，步骤3中Ni-NTA的制备，其制备方法如下：
(3)NTA：0℃下，将N-碳苄氧基赖氨酸0.5-2g和溴乙酸1.05-2.1g按摩尔比为1:3.5-5溶解于氢氧化钠中，再加入到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌1.5-3h，然后加热到50℃反应15-20h；0℃下，将浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末；将所述白色粉末溶解于甲醇中，加入10％的钯碳，向烧瓶中充满氢气，反应混合物在室温下搅拌10-16h，将溶液在减压条件下过滤去除钯碳得到NTA，反应式如下：
(4)Ni-NTA：取所述氨三乙酸0.5-2g与氯化镍1.25-5mL溶解于去离子水中，按摩尔比1:1-2反应，室温下在摇床上摇晃0.5-2h，得到Ni-NTA，其结构式如下：
优选的，所述的Ni-NTA的制备方法步骤(1)中，N-碳苄氧基赖氨酸一定要缓慢滴加到烧瓶中，否则会导致反应不完全。
优选的，步骤2中Ni-NTA 2.5-10μL与过敏原(1.5-6μL)的体积比为1:0.4-2。
优选的，步骤3中过敏原1.5-6μL与免疫球蛋白1.5-6μL的体积比为1:0.5-2，室温下孵育10-30min，pH为7.4的磷酸盐缓冲液的浓度是0.01mol/L，清洗2-4次，每次5-20μL。
为了解决以上的问题，本发明的另一技术方案是：所述的可检测过敏反应的纸基传感器的应用，可检测过敏反应的纸基传感器在检测血清中免疫球蛋白方面的应用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明的纸基传感器具有以下有益效果：
(1)本发明首次将纸基材料的潜在临床应用推广到对过敏性疾病的诊断方面，在对变态反应性疾病的检测中有着广阔的应用前景。
(2)本发明公开的制备方法是利用Ni-NTA对纸基表面进行修饰，更牢固的特异性结合含6×His标签的过敏原，从而实现对免疫球蛋白IgE的特异性检测，也使检测的灵敏度有一定提高。
(3)本发明公开的纸基传感器具有制备简单、操作方便、良好的生物相容性等优点，能即时、快速速的检测过敏反应，且成本低廉。
(4)本发明公开的纸基传感器上含有多个检测区域，因此可以实现对免疫球蛋白的高通量、高精度检测。
附图说明
1.图1为本发明检测过敏反应的纸基传感器；
2.图2为等离子处理后纸基的SEM，比例尺为10μm；
3.图3为红外测试图谱；
4.图4为纸基器件的制备和检测流程；
5.图5为Ni-NTA的合成路线；
6.图6为Ni-NTA的结构式；
7.图7为医院病人的血清样本的检测结果，
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍。
实施例1
一种可检测过敏反应的纸基传感器，其制备方法如下：
1.1Ni-NTA的合成：
(1)NTA：0℃下，在圆底烧瓶中加入1.05g溴乙酸，用8mL氢氧化钠将其溶解。将1gN-碳苄氧基赖氨酸溶解于10mL的氢氧化钠中，再加入到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌2h，然后加热到50℃反应19h。0℃下，将5mL浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末。将得到的2g白色粉末溶解于25mL甲醇中，加入100mg钯碳，向烧瓶中充满氢气，反应混合物在室温下搅拌12h，将溶液在减压条件下过滤去除钯碳得到NTA，反应式如下：
(2)Ni-NTA：取1mg的NTA与5mL的NiCl2反应，室温下在摇床上摇晃1h，得到Ni-NTA，其结构式如下：
1.2纸基传感器的制备：
步骤1：利用工作电源为13.56MHZ、射频功率为96W的等离子清洗机对层析纸进行等离子体处理4min，使纸表面产生醛基；
步骤2：利用蜡打印机在纸上打印出直径3mm的微流控检测区域，并将打印好的层析纸置于100℃烘箱中烘烤90s，使蜡熔化并穿透纸张厚度，形成亲水-疏水壁垒；
步骤3：在层析纸的检测区域滴加5μL的Ni-NTA，室温下放置直至干透；
步骤4：在微流控检测区域滴加6μL带有组氨酸His标签的过敏原，并用5μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，即得可检测过敏反应的纸基传感器。
图2为等离子处理后纸基的SEM，比例尺为10μm。SEM图中可看出，处理前，纸基表面的显微镜结构是光滑的。而经过等离子处理，纸表面会发生变化，纤维素的结构会被破坏，表面出现裂纹，这有利于Ni-NTA的固定。
图3为红外测试图谱。红外图中可以看出，和未处理的纸比，经过等离子体处理后，1643cm-1处的C＝O的峰值吸收是变大了的，因此，可以证明醛基的增加；而加了Ni-NTA之后因为有羧基，所以3300cm-1左右的O-H峰和1643cm-1处的C＝O峰的强度都增强了，这证明了Ni-NTA固定在纸基表面
1.3样品的检测：
(1)从江苏省人民医院检验科获取若干狗毛过敏原的血清样本，分为阳性样本(1，2)和阴性样本(3，4)，以1：15的比例稀释后分别滴6μL在检测区，室温下孵育15min，然后在每个检测区用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5μL；
(2)向纸基检测区域滴加6μL辣根过氧化酶标记的二抗羊抗人IgE(HRP anti-IgE)，室温下孵育10min后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5μL；
(3)按BeyoECL Plus A液和BeyoECL Plus B液1：1配置BeyoECL Plus曝光液，并在微流控检测区域内滴加12μL的曝光液，并立即放入化学检测器检测化学发光。
(4)将图片通过Image J方式转化数值，制定标准曲线，得到的发光强度的柱状图。ELISA实验结果为样本1和2为阳性血清，样本3和4为阴性血清。而由图7中样品的发光强度可以看出，样本1和2的发光强度大约是样本3和4的4倍，因此样本1和2为阳性血清，纸基器件测得的结果与ELISA结果完全一致。
实施例2
一种可检测过敏反应的纸基传感器，其制备方法如下：
1.1 Ni-NTA的合成：
(1)NTA：0℃下，在圆底烧瓶中加入2.1g溴乙酸，用4mL氢氧化钠将其溶解。将0.5gN-碳苄氧基赖氨酸溶解于10mL的氢氧化钠中，再加入到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌2h，然后加热到50℃反应19h。0℃下，将10mL浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末。将得到的0.5g白色粉末溶解于50mL甲醇中，加入50mg钯碳，向烧瓶中充满氢气，反应混合物在室温下搅拌12h，将溶液在减压条件下过滤去除钯碳得到NTA，反应式如下：
(2)Ni-NTA：取2mg的NTA与2.5mL的NiCl2反应，室温下在摇床上摇晃1h，得到Ni-NTA，其结构式如下：
1.2纸基传感器的制备：
步骤1：利用工作电源为13.56MHZ、射频功率为96W的等离子清洗机对层析纸进行等离子体处理4min，使纸表面产生醛基；
步骤2：利用蜡打印机在纸上打印出直径为6mm的微流控检测区域，并将打印好的层析纸置于100℃烘箱中烘烤90s，使蜡熔化并穿透纸张厚度，形成亲水-疏水壁垒；
步骤3：在层析纸的检测区域滴加2.5μL的Ni-NTA，室温下放置直至干透；
步骤4：在微流控检测区域滴加1.5μL带有组氨酸His标签的过敏原，并用10μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，即得可检测过敏反应的纸基传感器。
1.3样品的检测：
(1)从江苏省人民医院检验科获取若干狗毛过敏原的血清样本，分为阳性样本(1，2)和阴性样本(3，4)，以1：15的比例稀释后分别滴1.5μL在检测区，室温下孵育15min，然后在每个检测区用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，每次10μL；
(2)向纸基检测区域滴加1.5μL辣根过氧化酶标记的二抗羊抗人IgE(HRP anti-IgE)，室温下孵育10min后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，每次10μL；
(3)按BeyoECL Plus A液和BeyoECL Plus B液1：1配置BeyoECL Plus曝光液，并在微流控检测区域内滴加3μL的曝光液，并立即放入化学检测器检测化学发光。
(4)将图片通过Image J方式转化数值，制定标准曲线，得到的发光强度的柱状图。ELISA实验结果为样本1和2为阳性血清，样本3和4为阴性血清。而由图7中样品的发光强度可以看出，样本1和2的发光强度大约是样本3和4的4倍，因此样本1和2为阳性血清，纸基器件测得的结果与ELISA结果完全一致。
实施例3
一种可检测过敏反应的纸基传感器，其制备方法如下：
1.1 Ni-NTA的合成：
(1)NTA：0℃下，在圆底烧瓶中加入1.6g溴乙酸，用16mL氢氧化钠将其溶解。将2gN-碳苄氧基赖氨酸溶解于20mL的氢氧化钠中，再加入到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌2h，然后加热到50℃反应19h。0℃下，将2.5mL浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末。将得到的2g白色粉末溶解于100mL甲醇中，加入200mg钯碳，向烧瓶中充满氢气，反应混合物在室温下搅拌12h，将溶液在减压条件下过滤去除钯碳得到NTA，反应式如下：
(2)Ni-NTA：取0.5mg的NTA与1.25mL的NiCl2反应，室温下在摇床上摇晃1h，得到Ni-NTA，其结构式如下：
1.2纸基传感器的制备：
步骤1：利用工作电源为13.56MHZ、射频功率为96W的等离子清洗机对层析纸进行等离子体处理4min，使纸表面产生醛基；
步骤2：利用蜡打印机在纸上打印出直径为3mm的微流控检测区域，并将打印好的层析纸置于100℃烘箱中烘烤90s，使蜡熔化并穿透纸张厚度，形成亲水-疏水壁垒；
步骤3：在层析纸的检测区域滴加10μL的Ni-NTA，室温下放置直至干透；
步骤4：在微流控检测区域滴加3μL带有组氨酸His标签的过敏原，并用5μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，即得可检测过敏反应的纸基传感器。
1.3样品的检测：
(1)从江苏省人民医院检验科获取若干狗毛过敏原的血清样本，分为阳性样本(1，2)和阴性样本(3，4)，以1：15的比例稀释后分别滴3μL在检测区，室温下孵育15min，然后在每个检测区用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，每次10μL；
(2)向纸基检测区域滴加3μL辣根过氧化酶标记的二抗羊抗人IgE(HRP anti-IgE)，室温下孵育10min后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5μL；
(3)按BeyoECL Plus A液和BeyoECL Plus B液1：1配置BeyoECL Plus曝光液，并在微流控检测区域内滴加6μL的曝光液，并立即放入化学检测器检测化学发光；
(4)将图片通过Image J方式转化数值，制定标准曲线，得到的发光强度的柱状图。ELISA实验结果为样本1和2为阳性血清，样本3和4为阴性血清。而由图7中样品的发光强度可以看出，样本1和2的发光强度大约是样本3和4的4倍，因此样本1和2为阳性血清，纸基器件测得的结果与ELISA结果完全一致。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种可检测过敏反应的纸基传感器，其特征在于，所述的纸基传感器是用来检测过敏反应的，先在层析纸上制备得到检测区域，并对其进行修饰产生醛基，然后与高亲和络合物镍-氨三乙酸Ni-NTA结合，使其螯合带有组氨酸His标签的过敏原，从而检测血清中的免疫球蛋白IgE，实现对过敏反应的检测。
2.一种如权利要求1所述的可检测过敏反应的纸基传感器的制备方法，其特征包括如下步骤：
步骤1：利用等离子清洗机对层析纸进行等离子体处理，使纸表面产生醛基；利用蜡打印机在纸上打印出微流控检测区域，并将打印好的层析纸置于烘箱中烘烤，使蜡熔化并穿透纸张厚度，形成亲水-疏水壁垒；
步骤2：在层析纸的检测区域滴加Ni-NTA，室温下放置直至干透；
步骤3：在检测区域滴加带有组氨酸His标签的过敏原，并用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，即得可检测过敏反应的纸基传感器，然后对血清中的免疫球蛋白IgE进行检测。
3.根据权利要求2所述的可检测过敏反应的纸基传感器的制备方法，其特征在于，步骤1中等离子清洗机工作参数为工作电源13.56MHZ，射频功率为80-100W，处理时间为3-5min。
4.根据权利要求2所述的可检测过敏反应的纸基传感器的制备方法，其特征在于，步骤1中烘烤温度为100℃，时间90s，检测区为直径3-6mm的圆孔，边缘为亲疏水通道。
5.根据权利要求2所述的可检测过敏反应的纸基传感器的制备方法，其特征在于，步骤2中Ni-NTA的制备，其制备方法如下：
(1)NTA：0℃下，将N-碳苄氧基赖氨酸0.5-2g和溴乙酸1.05-2.1g按摩尔比为1:3.5-5溶解于氢氧化钠中，再加入到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌1.5-3h，然后加热到50℃反应15-20h；0℃下，将浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末；将所述白色粉末溶解于甲醇中，加入10％的钯碳，向烧瓶中充满氢气，反应混合物在室温下搅拌10-16h，将溶液在减压条件下过滤去除钯碳得到NTA，反应式如下：
(2)Ni-NTA：取所述氨三乙酸0.5-2g与氯化镍1.25-5mL溶解于去离子水中，按摩尔比1:1-2反应，室温下在摇床上摇晃0.5-2h，得到Ni-NTA，
其结构式如下：
6.根据权利要求5所述的可检测过敏反应的纸基传感器的制备方法，其特征在于，所述的Ni-NTA的制备方法步骤(1)中，N-碳苄氧基赖氨酸一定要缓慢滴加到烧瓶中，否则会导致反应不完全。
7.根据权利要求2所述的可检测过敏反应的纸基传感器的制备方法，其特征在于，Ni-NTA 2.5-10μL与过敏原1.5-6μL的体积比为1:0.4-2。
8.根据权利要求2所述的可检测过敏反应的纸基传感器的制备方法，其特征在于，步骤3中过敏原1.5-6μL与免疫球蛋白1.5-6μL的体积比为1:0.5-2，室温下孵育10-30min，pH为7.4的磷酸盐缓冲液的浓度是0.01mol/L，清洗2-4次，每次5-20μL。
9.根据权利要求1所述的可检测过敏反应的纸基传感器的应用，其特征在于，其所述的纸基传感器可应用于检测人血清中免疫球蛋白IgE试剂盒的制备，从而实现对过敏反应的精确、快速检测。
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