CN105223367A - 基于微流控芯片和蛋白质芯片检测血清过敏原特异性的IgE的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及基于微流控芯片和蛋白质芯片检测血清过敏原特异性的IgE的方法。本发明利用微流控的微量与快速分析能力、蛋白质芯片的高通量分析能力及结合抗原抗体的特异性免疫反应原理，通过微流控芯片与蛋白质芯片相结合技术，对过敏病人的临床血清样本进行过敏原特异性的IgE检测，结果显示，该方法能有效降低病人血清检测的使用量，适用于婴儿或者儿童等外周血取血量少的患者，同时降低了检测试剂的使用量及检测时间，与现有技术比较，具有快速、高通量、节省检测血清、高效、便携、成本低等特点。尤其适合于大规模的流行病分析等。

Description

基于微流控芯片和蛋白质芯片检测血清过敏原特异性的IgE的方法

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及血清免疫学检测方法，具体涉及一种基于微流控芯片和蛋白质芯片检测血清过敏原特异性的IgE的方法。

背景技术

现有技术公开了过敏即外来抗原解读为有害的物体(例如细菌、花粉、尘螨、蟑螂、灰尘等)而产生的变态反应。变态反应使免疫细胞中的巨噬细胞开始活化，释放出组织胺和前列腺素，组织胺和前列腺素会使微血管扩张、血管通透性增加、发痒、平滑肌收缩和反射作用等一连串的作用；临床表现的症状主要为过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性肠胃炎以及湿疹、荨麻疹、斑疹、丘症、划痕症、异位性皮炎、风团皮症、皮肤瘙痒等过敏性皮肤病。过敏性哮喘是一种比较顽固的疾病，比较难以治愈。报道显示全球大约有三亿人有哮喘，其中过敏性哮喘在成人中占50％，儿童中占了80％，该疾患在全世界大范围普及，每年哮喘治疗的开支及其昂贵。研究显示血清IgE升高是过敏性疾病最有力的指标；过敏原进入机体诱导产生特异性IgE，IgE结合到肥大细胞和嗜酸性粒细胞，使机体进入对该过敏原特异致敏状态，当过敏原再次接触时，与细胞膜上的IgE受体结合引起一系列生化反应，继而释放出诸如组织胺等各种与过敏反应和炎症有关的生物活性介质，因此血清中过敏原特异性IgE的检测是过敏重要的检测手段。皮肤点刺是目前临床运用的体内过敏原检测方法，但是该方法存在缺点，如，有可能引起体内的免疫反应，检测时间长等等；瑞典法玛西亚公司研制的UniCAP全自动体外诊断系统是目前国际上最先进的检查过敏原实验室系统，已获得国际临床实验室标准委员会的确认，该方法以其安全性高、检测结果准确可靠，获得了世界卫生组织的确认，被国际上誉为“过敏原检测的金标准”，但是，实践显示，该方法的缺点是检测需要的血清相对比较多，检测一个样本需要40μl血清，尤其对于婴幼儿，通常采用最方便的抽取指尖血或者耳垂血做检测，由于取血量十分有限，不能达到UniCAP的方法检测所需要的血量。

微流控芯片技术(Microfluidics)是将生物、化学、医学分析过程的样品反应、检测等基本操作单元集成到微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。微流控芯片的特点及发展优势显示在：微流控芯片具有液体流动可控、消耗样本和试剂极少(微流控芯片可以传输10^-6L至10^-15L的流体)、分析产生的废液少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的高通量分析,而且成本低，芯片可以一次性使用。新一代的微流控芯片，主要由硅酮polydimethylsiloxane(PDMS)制成，PDMS材料的物理弹性，多种功能性模块，比如阀门，流体泵以及流体混合器等都可以集中在微流控芯片中；同时功能模块可以和计算机连接，用计算机程序来控制模块的运行。这种集成化、数控式的微流体芯片，可以完成很多复杂的操作。

蛋白质芯片(proteinarray)是一种高通量的蛋白特征分析技术，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，将已知的蛋白产物固定在固相载体上面，根据这些蛋白分子的特征，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、尿液、细胞溶解液、分解液等)，然后洗涤、一系列生化检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的检测过敏病人血清过敏原特异性的IgE的检测方法，具体涉及基于微流控芯片和蛋白质芯片检测血清过敏原特异性的IgE的方法。该方法与现有技术的检测方法相比较，具有快速、高通量、节省检测血清、高效、便携、成本低等特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

提供了可以用于检测临床血清样本中过敏原特异性IgE抗体的整合了蛋白质芯片的微流控芯片,所述的微流控芯片固定了过敏原的固相载体为基材，主要由固相层，阀门层，样品通道层构成；其中，样品通道层覆盖了固体载体的点样区域，共同组成了样品富集和免疫分析模块，每个分析室连接多个进样口和出样口，分析室里固定在固相载体上面的过敏原可以与进入反应腔室的血清中的过敏原特异性的IgE抗体结合，通过免疫反应结合抗IgE抗体，荧光二抗显色，经过多次洗涤，用蛋白质芯片专用扫描仪采集荧光信号进行分析；将采集的样品的荧光信号值输入计算机，根据荧光定量标准曲线计算样品中过敏原特异性的IgE抗体的浓度；用同样的病人的血清做ELISA检测计算病人血清中过敏原特异性的IgE抗体的浓度，检测结果显示，ELISA的结果和微流控芯片检测的结果具有一致性。

更具体的，本发明的基于微流控芯片检测血清过敏原特异性的IgE的方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)用蛋白质点样机将过敏原蛋白点在固相载体上；

(2)将蛋白质芯片和微流控芯片键合；

(3)将含有3％BSA的PBS缓冲液泵入微流控芯片反应腔室；

(4)稀释的血清泵入微流控反应腔室，血清中的特异性IgE与固定在蛋白质芯片上的过敏原蛋白结合；

(5)将抗人的IgE抗体泵入反应腔室后，再泵入带荧光的抗体与抗人的IgE抗体反应；

(6)用芯片扫描仪采集荧光数据，采用软件分析血清中IgE含量。

本发明中，固相载体不限其制做材料，可为硅片类材料，或为玻璃材料，或为膜材料。

本发明中，固相载体上点样的过敏原蛋白为天然过敏原蛋白，或为重组过敏原蛋白；所述的过敏原蛋白点可为一种过敏原蛋白，或为多种过敏原蛋白组合；固相载体上所点蛋白点为单个，或为多个。

本发明的实施例中，过敏原蛋白为人工制备的纯化重组蛋白，分别为rDerf2,rBt5,rPlaa1,rHumj,rCla.这些过敏原有文献报道是引起哮喘的重要过敏原。

本发明中，一抗是抗人过敏原特异性的IgE的抗体，不受物种来源限制。

本发明中，二抗是能和一抗发生免疫反应的抗体，不受物种来源的限制，一定是可以被蛋白质芯片扫描仪采集数据的荧光二抗。

本发明中，由蛋白质芯片和微流控芯片键合的芯片，其中：微流控芯片由多连反应腔室组成，微流控芯片和蛋白质芯片键合时，反应腔室覆盖在蛋白质芯片的点样区域上面，因此，进入反应腔室的血清和抗体可与蛋白质芯片上固定的过敏原反应；每个腔室设有多个进样口和出样口；

本发明中，所述的荧光信号采集模块由芯片扫描仪来完成。

本发明中，整个检测系统包括硬件部分和软件系统部分，其中的硬件部分主要是控制部分以及数据分析(计算机)，操作系统(集成化微流控芯片)和数据采集(芯片扫描仪)；软件系统主要包括LABVIEW(微流控芯片控制)和GenepixPro6.0(蛋白质芯片扫描以及数据提取)或者类似的控制软件和图像分析软件。

本发明中，所述的微流控芯片通过下述方法制备：

(1)基片准备：将硅片放入Piranha溶液(98％浓硫酸:30％双氧水＝7：3)煮沸清洗15min；用去离子水冲洗后用氮气吹干，并在200℃烘焙30min；将AZ-50XT胶水(Microchem公司)倒在硅片中央；用匀胶机以3000转/min旋涂1min,使胶分布比较均匀，静置10min，随后在恒温加热板上软烘。65℃、95℃、65℃分别放置3min、6min、3min；

(2)曝光：将设计好的流体层、阀门控制层的硅片模板分别放置在烘焙好的基片上，用紫外曝光机曝光，然后放在加热板上烘焙；

(3)显影：将硅片放到显影液中显影，显影在通风中进行，显影液的主要成分为丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA),硅片显影之后用去离子水冲洗干净；

(4)硬烘：将硅片放在加热板上面加热固定。先用120℃处理30min，再缓慢降至室温；

(5)浇注：PDMS单体与固化剂按照5：1的质量比均匀混合，除去气泡，倒在经三甲基氯硅烷处理过的AZ-50XT模具上，在调整好的80℃水平加热板上面固定1小时，形成具有阀门控制层的芯片；

(6)具有管道流体层的PDMS层的制作。在硅片上甩上光刻胶，经过紫外曝光、显影制成流体层模板，120℃放置30min固定。制作好的模板在三甲基氯硅烷气象蒸汽中处理10min,防止注塑过程中PDMS粘到模具上。PDMS单体与固化剂的比例为20：1，甩胶机上面以2000转/min速度甩涂1min,形成下层具有管道流体层的基片；

(7)键合及接口制作：将上下层基片打孔，用于控制流体通道。上下两片仔细对合，与蛋白质芯片的玻璃固相载体键合，微流控芯片上面的反应池覆盖

蛋白质芯片的点阵区域，键合过夜，整个芯片结构如图1所示。

本发明中，所述的微流控芯片采用硅酮制成，或采用其他高分子聚合材料制成，

本发明中，所述的微流控芯片上反应腔室根据实际需求确定，样本数量较多的情况下可设计更多的反应腔室来满足需求。

本发明中，微流控芯片的分析室独立或者连接使用。

本发明中利用微流控的微量与快速分析能力、蛋白质芯片的高通量分析能力及结合抗原抗体的特异性免疫反应原理，对过敏病人的临床血清样本进行基于免疫反应原理的血清过敏原特异性的IgE检测，结果显示，能有效降低病人血清检测的使用量，适用于婴儿或者儿童等外周血(指尖血或者耳垂血)取血量少的患者，同时降低了检测试剂的使用量及检测时间，实现了血清样本的高通量快速检测，较适合大规模的流行病分析等方面。

附图说明

图1本发明微流控芯片设计图。

图2本发明蛋白质芯片经过芯片扫描仪扫描之后的结果。

图3本发明微流控芯片对过敏病人血清检测结果。

图4本发明酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质芯片检测过敏病人血清结果比对。

具体实施方案

实施例1制备蛋白质芯片

(1)重组抗原(rDerf₂、rBt5、rRcla、rPlaa1、rHumj，一组阴性BSA)稀释成为4个梯度，分别为1.5mg/ml、1mg/ml、0.4mg/ml、0.04mg/ml.每份样品中加入了25％的甘油，稀释后的样品各取40ul到384孔板中，4000转1min离心；

(2)用点样机点样，点在固相(玻璃)蛋白质载体上，每个样品重复点3次；

(3)点样完成后，4℃冰箱过夜，第二天置于-80℃保存备用。

实施例2制备微流控芯片

(1)基片准备：将硅片放入Piranha溶液(98％浓硫酸:30％双氧水＝7：3)煮沸清洗15min；用去离子水冲洗后用氮气吹干，并在200℃烘焙30min；将AZ-50XT胶水(Microchem公司)倒在硅片中央；用匀胶机以3000转/min旋涂1min,使胶分布比较均匀，静置10min，随后在恒温加热板上软烘。65℃、95℃、65℃分别放置3min、6min、3min；

(2)曝光：将设计好的流体层、阀门控制层的硅片模板分别放置在烘焙好的基片上，用紫外曝光机曝光，然后放在加热板上烘焙；

(3)显影：将硅片放到显影液中显影，显影在通风中进行，显影液的主要成分为丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA),硅片显影之后用去离子水冲洗干净；

(4)硬烘：将硅片放在加热板上面加热固定。先用120℃处理30min，再缓慢降至室温；

(5)浇注：PDMS单体与固化剂按照5：1的质量比均匀混合，除去气泡，倒在经三甲基氯硅烷处理过的AZ-50XT模具上，在调整好的80℃水平加热板上面固定1小时，形成具有阀门控制层的芯片；

(6)具有管道流体层的PDMS层的制作：在硅片上甩上光刻胶，经过紫外曝光、显影制成流体层模板，120℃放置30min固定，制作的模板在三甲基氯硅烷气象蒸汽中处理10min,防止注塑过程中PDMS粘到模具上，PDMS单体与固化剂的比例为20：1，甩胶机上面以2000转/min速度甩涂1min,形成下层具有管道流体层的基片；

(7)键合及接口制作：将上下层基片打孔，用于控制流体通道，上下两片仔细对合，与蛋白质芯片的玻璃固相载体键合，微流控芯片上面的反应池覆盖蛋白质芯片的点阵区域，键合过夜；整个芯片结构如图1所示。

实施例3基于微流控芯片对过敏患者进行血清学检测

键合的微流控芯片和蛋白质芯片用含有3％BSA的PBS封闭1小时，过敏病人的血清1μl(1：35稀释)，泵入微流控芯片反应腔室，固定在固相玻璃载体上的过敏原会与血清中特异性的IgE抗体结合，经过PBS洗涤后，加入羊抗人IgE抗体1μl(1：300稀释)孵育1小时，再用PBS洗涤，加入cy3标记的驴抗羊抗体孵育(1：1000稀释)1小时，PBS洗涤后将微流控芯片和蛋白质芯片分离，单独将蛋白质芯片放到芯片扫描仪上采集荧光信号，做数据分析；一个微流控芯片可以同时检测八份血清，整个检测系统的硬件部分主要是控制部分以及数据分析(计算机)，操作系统(集成化微流控芯片)和数据采集(芯片扫描仪)；软件系统主要包括LABVIEW(微流控芯片控制)和GenepixPro6.0(蛋白质芯片扫描以及数据提取)；

蛋白质芯片扫描结果如图2所示，图3显示了过敏病人的过敏原特异性抗体IgE计算结果。

实施例4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测过敏病人血清

(1)包板：96孔酶标板上，每孔加入含有100ng重组过敏原的包被缓冲液，4℃过夜；

(2)封闭：用含有0.05％Tween的PBS洗板，之后每孔加入含有3％BSA的PBS缓冲液37℃封闭一小时；

(3)血清孵育：每孔加入100μl健康人或者过敏病人血清(1：35稀释)，健康人的血清用来做阴性对照，加好血清之后37℃孵育1.5小时；

(4)抗体孵育：PBS洗板后，加入辣根过氧化物酶羊抗人IgE抗体(1：1000稀释)100μl，湿盒中37℃孵育1.5小时；

(5)显色反应：PBS洗板后加入显色液200μl/孔，室温下避光反应30min,最后每孔加入2MH2SO450μl终止显色反应，酶标仪490nm测吸光值；结果显示(如图4所示)，蛋白质芯片的结果和酶联免疫反应(ELISA)结果一致，两种方法比较病人血清对于rDerf2,rBt5的相关性分别为0.9和0.83.证是本申请的蛋白质芯片的实验方法可靠。

Claims (9)

1.一种基于微流控芯片和蛋白质芯片的血清中过敏原特异性的IgE检测方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)用蛋白质点样机将过敏原蛋白点在固相载体上；

(2)将蛋白质芯片和微流控芯片键合；

(3)将含有3％BSA的PBS缓冲液泵入微流控芯片反应腔室；

(4)稀释的血清泵入微流控反应腔室，血清中的特异性IgE与固定在蛋白质芯片上的过敏原蛋白结合；

(5)将抗人的IgE抗体泵入反应腔室后，再泵入带荧光的抗体与抗人的IgE抗体反应；

(6)用芯片扫描仪采集荧光数据，采用软件分析血清中IgE含量。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中，固相载体的制材选自硅片类材料，玻璃材料，或膜材料。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，固相载体上点样的过敏原蛋白选自天然过敏原蛋白或重组过敏原蛋白。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，固相载体所点过敏原蛋白点为一种过敏原蛋白，或为多种过敏原蛋白组合。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，固相载体上所点蛋白点为单个，也或为多个。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，由蛋白质芯片和微流控芯片键合的芯片，其中：

微流控芯片由多连反应腔室组成，微流控芯片和蛋白质芯片键合时，反应腔室覆盖在蛋白质芯片的点样区域上面，使进入反应腔室的血清和抗体与蛋白质芯片上面固定的过敏原反应。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的反应腔室，每个腔室设有多个进样口和出样口。

8.根据权利6所述的方法，其特征在于，所述的微流控芯片中的分析室独立或者连接使用。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通过包括硬件部分和软件系统的检测系统进行；硬件部分包括控制部分以及数据分析(计算机)，操作系统(集成化微流控芯片)和数据采集(芯片扫描仪)；软件系统包括LABVIEW(微流控芯片控制)和蛋白质芯片扫描以及数据提取(GenepixPro6.0)或者类似的控制软件和图像分析软件。