CN108828230B - 核酸层析快速检测转基因产品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸层析快速检测转基因产品的方法。本发明包括转基因产品处理、核酸裂解、核酸PCR扩增和采用待测PCR扩增样品核酸层析试纸条检测的四个步骤。本发明所述的方法具有灵敏度高、检测时间短、安全性高等优点，可广泛应用于转基因产品精确快速检测，提高食品的监管力度和质量水平，监管转基因食品非法销售提供有效的方法。

Description

核酸层析快速检测转基因产品的方法
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体地涉及一种核酸层析快速检测转基因产品的方法。
背景技术
一般转基因检测分为核酸水平检测和蛋白水平检测。
蛋白水平检测(现有胶体金蛋白试纸技术)检测便捷，但是由于有些转基因样品蛋白未能表达，且蛋白容易降解，因此有可能待测样品内蛋白表未达或者待测样品储存条件造成降解，所以造成假阴性结果(阳性未检出)。蛋白试纸条方法具有快速、简便、经济的优点，无需任何特殊仪器设备，但由于其检测灵敏度较低、适用范围窄，主要适用于转基因植物的大田和原材料的快速初筛。
PCR方法是基于基因水平的检测，可检出存在于样品基因组内的待测基因而不受基因表达情况的影响。但是PCR方法对实验设施和条件要求较高，且比较费时。目前普通PCR检测方法是我国转基因植物检测的核心技术，但该方法对实验条件要求较高，对实验区要求具有前PCR区、样品制备区、核酸提取纯化区、PCR体系配置区、PCR反应区、电泳分析区等功能区，需要生物安全柜、高压灭菌锅、组织粉碎机、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、核酸定量检测仪器、生物安全柜、PCR扩增仪、涡旋混合仪、电泳系统、凝胶成像系统等。
发明内容
鉴于上述问题，本发明旨在提出一种核酸层析快速检测转基因产品的方法，其仅需使用较少设备就能快速地以PCR方法进行转基因产品检测。
本发明的核酸层析快速检测转基因产品的方法，其包括以下步骤：
步骤1)样本处理：取30mg待测粉状物样本，加500μl ddH2O，使用移液枪多次吹吸混匀，静置5min得到待测样本备用；
步骤2)DNA一管法提取步骤：取5μl核酸释放剂，加入PCR反应管中；取所述待测样本5μl加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀10次；每个PCR反应管中加30μl无菌石蜡油；将PCR反应管放置在PCR仪中进行裂解，得到裂解样品；
步骤3)试样PCR反应：在PCR反应管中依次加入反应试剂、混匀，加入到所述裂解样品中；将PCR反应管放到离心机上，500g-1000g离心10s，然后取出PCR反应管，放入PCR仪中进行扩增得到反应产物；
步骤4)PCR产物胶体金检测：将PCR反应管从PCR仪中取出，取预定量的反应产物到入胶体金核酸层析试纸条上，等待5-10min后观察显色状况；如果胶体金检测T线和C线出现肉眼可见显色，则表明样品含有转基因成分。
优选地，所述步骤2)中的裂解程序为将样品置于95℃反应10min后，再置于4℃冷却5min。
优选地，所述步骤3)中的PCR反应体系总体积为35μl，其中：ddH2O为27.4μl，10×PCR Buffer为5μl，du dNTP混合液为1μl；10μmol/L上游引物为0.3μl，10μmol/L下游引物为0.3μl，Taq DNA聚合酶为1μl；
其中10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、3～5％体积的BSA、1％～2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
优选地，所述上游引物序列为地高辛标记；所述下游引物序列为生物素标记。
优选地，所述步骤3)中的PCR扩增程序如下：50℃反应2分钟后升温到95℃反应5分钟，然后进入32次循环，每次循环中在95℃反应15sec，然后在60℃反应45sec。
优选地，所述核酸释放剂含有120～200mM/L的KCl、1％～5％体积的Triton X-100、5～10mg/ml的蛋白酶K、5-10μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH。
优选地，在样品垫上滴少量超纯水，以加快层析。
优选地，所述胶体金核酸层析试纸条顺次包括样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜检测区和吸水垫；金标结合垫上涂有胶体金标记的地高辛抗体；硝酸纤维素膜检测区设置有检测线和质控线；所述检测线通过在硝酸纤维素膜检测区上包被链亲和素形成；所述质控线通过在硝酸纤维素膜检测区上包被羊抗鼠IgG形成；所述反应产物被滴到样品垫上后通过毛细管作用，向着吸水垫的方向层析。
通过常规PCR扩增技术与PCR胶体金层析技术相结合，可以快速简便对转基因样品进行检测，结果可以通过直接肉眼观察胶体金卡条显色状况进行判别，结果易于判别分析。
附图说明
图1为本发明的PCR扩增产物核酸层析快速检测阳性结果示意图；
图2为本发明的PCR扩增产物核酸层析快速检测阴性结果示意图；
图3为胶体金核酸层析试纸条层析示意图；
图4为Npt引物胶体金检测结果；释放剂为120mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、3％体积的BSA、1％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/LpH＝8.0Tris-HCl。
图5为Pmi引物胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、1％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/LpH＝8.0Tris-HCl。
图6为T-CaMV35S引物胶体金检测结果；释放剂为200mM/L的KCl、3％体积的TritonX-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、5％体积的BSA、1％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图7为NOS引物胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、1％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/LpH＝8.0Tris-HCl。
图8为Mir604核酸Pmi胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、5％体积的TritonX-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图9为Bt11核酸Bt F3/R3胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图10为Bt11核酸Bt-Cry F/R胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、10mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图11为Mir604核酸Bt F3/R3胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图12为Mir604核酸Bt-Cry F/R胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、10μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图13为Bar引物胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/LpH＝8.0Tris-HCl。
图14、15为Bt11核酸Pat胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图16为cp4-epsps引物胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图17为ZSSⅡB引物胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的TritonX-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图18为Zein引物胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/LpH＝8.0Tris-HCl。
图19为水稻SPS基因检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCR Buffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
图20为大豆GMLE基因Buffer-100-15-3胶体金检测结果；释放剂为160mM/L的KCl、3％体积的Triton X-100、7.5mg/ml的蛋白酶K、7.5μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；10×PCRBuffer含有0.1％体积的DMSO、4％体积的BSA、2％体积的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
具体实施方式
下面，结合附图对本发明的核酸层析快速检测转基因产品的方法进行详细说明。
本发明的核酸层析快速检测转基因产品的方法包括：
步骤1)样本处理：取30mg转基因种子粉状物样本，加500μl ddH2O，使用移液枪多次吹吸混匀，静置5min备用。
步骤2)DNA一管法提取步骤：取5μl核酸释放剂，加入PCR反应管中；取待测样本5μl加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀10次；每管加30μl无菌石蜡油；将PCR反应管放置在PCR仪中进行裂解。裂解程序95℃10分钟；4℃5分钟。
微量核酸释放剂含有120～200mM/L的KCl、1％～5％体积的TritonX-100、5～10mg/ml的蛋白酶K、5-10μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH。。
在一管法检测中，甘氨酸可以保证核酸稳定，有利于核酸释放。其中5-10μM/ml甘氨酸的添加是发明人在实验过程中意外的发现，之前没有文献报道有向相关用途试剂中添加这一组分。
步骤3)试样PCR反应：在PCR反应管中依次加入反应试剂、混匀，加入到步骤2)裂解样品中。将PCR管放到离心机上，500g-1000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中进行扩增，PCR反应程序为：50度2分钟；95度5分钟；[95度15秒，60度45秒-32循环]。
所述步骤3)中的PCR反应体系总体积为35μl，反应体系如下：
表1反应体系
试剂 体积(μl)
ddH2O 27.4
10×PCR Buffer 5
du dNTP混合液 1
10μmol/L上游引物 0.3
10μmol/L下游引物 0.3
Taq DNA聚合酶 1
总体积 35
10X PCR buffer含有0.1％DMSO、3～5％BSA、1％～2％PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0Tris-HCl。
PEG-6000是作为PCR反应的增效剂。由于一管式检测属于DNA裂解粗提，因此本身特异性会很低。发明人创造性地使用添加甘氨酸的核酸释放剂，从而保证核酸的稳定。但是如果由此直接进行PCR会造成核酸稳定性较高扩增效率低非特异较多。因此发明人配套地在PCR试剂中添加PEG-6000用以降低非特异性，机制是在DNA的水溶液中通过脱水作用，导致DNA结构不稳定，从而功能性的降低DNA的熔点及解链温度，提高扩增效率。
步骤4)PCR产物胶体金检测：将PCR反应管从PCR仪中取出，取反应产物35μl加入胶体金检测卡，等5-10min观察显色状况(期间根据胶体金卡层析情况，可以加入少量超纯水加快层析)，根据显色卡读取各样品显色级别。
阳性结果：胶体金检测T线和C线出现肉眼可见显色。表明样品含有转基因成分，结果表述为“样品检检出转基因成分，检测结果为阳性”(图1可见)。
阳性结果：胶体金检测T线未出现肉眼可见显色；C线出现肉眼可见显色。表明样品不含有转基因成分，结果表述为“样品检未检出转基因成分，检测结果为阴性”(图2可见)
图3为胶体金核酸层析试纸条层析示意图。图中样品垫为11，金标结合垫为12，硝酸纤维素膜为13，胶体金检测线为14，质控线为15；吸水垫为16。
试剂与材料
1)释放剂(120～200mM/L的KCl、1％～5％体积的Triton X-100、5～10mg/ml的蛋白酶K、5-10μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH。)。
2)石蜡油
3)du dNTP混合液：将浓度为10mmol/L的dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。
4)10×PCR buffer
5)Taq DNA聚合酶
6)引物
7)ddH2O
8)DNA提取试剂盒
9)胶体金检测试纸条
10)转基因实验样本
仪器和设备
1)分析天平
2)PCR扩增仪
3)恒温金属浴
4)小型离心机
5)旋窝振荡仪
6)其他相关仪器和设备
操作步骤
1)样本处理：取30mg转基因种子粉状物样本，加500μl ddH2O，使用移液枪多次吹吸混匀，静置5min备用。
2)DNA一管法提取步骤
2.1)取5μl核酸释放剂，加入PCR反应管中；
2.2)取待测样本5μl加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀10次；
2.3)每管加30μl无菌石蜡油；
2.4)将PCR反应管放置在PCR仪中进行反应，反应温度及时间设定如下：
表2反应温度及时间
温度 时间
95℃ 10分钟
4℃ 5分钟
PCR方法
1)试样PCR反应
在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂、混匀，加入到裂解样品中。将PCR管放到离心机上，500g-1000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。
反应体系如表1。
2)PCR反应程序
50度2分钟；95度5分钟；[95度15秒，60度45秒-32循环]。
3)PCR产物胶体金检测
将PCR反应管从PCR仪中取出，取反应产物35μl加入胶体金检测卡，等5-10min观察显色状况(期间根据胶体金卡层析情况，可以加入少量超纯水加快层析)，根据显色卡读取各样品显色级别。
结果分析与表述
1)样品检测结果分析和表述
2)标记基因×××胶体金检测出现肉眼可见显色。表明样品检测出标记基因×××，结果表述为“样品检测出标记基因×××，检测结果为阳性”。
3)标记基因×××胶体金检测结果未出现肉眼可见显色。表明样品未检测出标记基因×××，结果表述为“样品未检测出标记基因×××，检测结果为阴性”。
各标记基因检测结果：
由图4可知，Npt引物检测阳性样本核酸检测良好，出现两条红色条带，其他样本无显色，检测结果良好；
由图5可知，Pmi引物检测阳性样本核酸检测良好，出现两条红色条带，其他样本无显色，检测结果良好；
由图6可知，T-CaMV35S引物阳性样本核酸检测良好，出现两条红色条带，其他样本无检出，检测结果良好；
由图7-8可知，NOS基因检测阳性玉米粉样本，出现两条红色条带，空白和阴性样本无检出，检测结果良好；
由图9-12可知，Cry1Ab/1Ac基因检测阳性玉米粉样本，出现两条红色条带，空白和阴性样本无检出，检测结果良好；
由图13可知，Bar基因检测阳性玉米粉样本结果良好，出现两条红色条带；其他样本无显色，检测结果良好；
由图14、15可知，Pat基因检测，阳性核酸及玉米粉样本有检出，出现两条红色条带，其他样本无检出，检测结果良好；
由图16可知，CP4-EPSPS基因检测阳性玉米粉样本，出现两条红色条带,其他样本无检出，检测结果良好；
由图17、18可知，ZSSⅡB基因检测玉米粉样本结果良好，出现两条红色条带，空白样本无显色；Zein基因检测玉米粉样本结果良好，出现两条红色条带，空白样本无显色；
由图19可知，水稻SPS基因检测水稻样本，出现两条红色条带，空白样本无显色，检测结果良好；
由图20可知，大豆内源基因检测大豆样本，出现两条红色条带，空白样本无显色，检测结果良好。
本发明主要具有以下几个方便的优势：
操作简便，本发明采用一步法获取样本核酸，结合常规PCR与核酸层析技术，可以对样本进行快速检测。
灵敏度高，PCR能在模板DNA纯度很低的情况下进行扩增，很少受培养介质和生物学物质的影响，纯化步骤可以忽略，核酸层析可以检测微量PCR扩增产物。
检测时间短，仅需8-10min；结果肉眼可见且判定标准统一，阳性结果，T线和C线均显色；阴性结果，只有C线显色。
安全性该技术不需要用到特殊试剂，避开凝胶电泳中EB等污染物，对操作者和试验环境都是安全无害的。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范围。

Claims (4)

1.一种核酸层析快速检测转基因产品的方法，其包括以下步骤：
步骤1)样本处理：取30mg待测粉状物样本，加500μl ddH2O，使用移液枪多次吹吸混匀，静置5min得到待测样本备用；
步骤2)DNA一管法提取步骤：取5μl核酸释放剂，加入PCR反应管中；取所述待测样本5μl加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀10次；每个PCR反应管中加30μl无菌石蜡油；将PCR反应管放置在PCR仪中进行裂解，得到裂解样品；
步骤3)试样PCR反应：在PCR反应管中依次加入反应试剂、混匀，加入到所述裂解样品中；将PCR反应管放到离心机上，500g-1000g离心10s，然后取出PCR反应管，放入PCR仪中进行扩增得到反应产物；
步骤4)PCR产物胶体金检测：将PCR反应管从PCR仪中取出，取预定量的反应产物滴到胶体金核酸层析试纸条的样品垫上，等待5-10min后观察所述胶体金核酸层析试纸条的检测线和质控线的显色状况；如果所述胶体金核酸层析试纸条的检测线和质控线出现肉眼可见显色，则表明样品含有转基因成分；
所述步骤2)中的核酸释放剂含有120～200mM/L的KCl、1％～5％体积的Triton X-100、5～10mg/ml的蛋白酶K、5-10μM/ml甘氨酸、10mM/ml的NaOH；
所述步骤3)中的PCR反应体系总体积为35μl，其中：ddH2O为27.4μl，10×PCR Buffer为5μl，du dNTP混合液为1μl；10μmol/L上游引物为0.3μl，10μmol/L下游引物为0.3μl，TaqDNA聚合酶为1μl；所述10×PCR Buffer含有0.1％的DMSO、3～5％的BSA、1％～2％的PEG-6000、100mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、50mmol/L pH＝8.0 Tris-HCl；所述上游引物带有地高辛标记，所述下游引物带有生物素标记；
所述胶体金核酸层析试纸条顺次包括样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜检测区和吸水垫；金标结合垫上涂有胶体金标记的地高辛抗体；硝酸纤维素膜检测区设置有检测线和质控线；所述检测线通过在硝酸纤维素膜检测区上包被链亲和素形成；所述质控线通过在硝酸纤维素膜检测区上包被羊抗鼠IgG形成；所述反应产物被滴到样品垫上后通过毛细管作用，向着吸水垫的方向层析。
2.如权利要求1所述的核酸层析快速检测转基因产品的方法，其特征在于：
所述步骤2)中的裂解程序为将样品置于95℃反应10min后，再置于4℃冷却5min。
3.如权利要求1所述的核酸层析快速检测转基因产品的方法，其特征在于：
所述步骤3)中的PCR扩增程序如下：50℃反应2分钟后升温到95℃反应5分钟，然后进入32次循环，每次循环中在95℃反应15秒，然后在60℃反应45秒。
4.如权利要求1所述的核酸层析快速检测转基因产品的方法，其特征在于：
在样品垫上滴少量超纯水，以加快层析。
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