CN107271688A - 一种检测转基因蛋白 Cry1Ab/Ac 的胶体金免疫检测盒及其应用 - Google Patents

一种检测转基因蛋白 Cry1Ab/Ac 的胶体金免疫检测盒及其应用 Download PDF

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Abstract

本发明公开了一种检测转基因蛋白Cry1Ab/Ac的胶体金免疫检测盒，包括预处理PCR管和检测试纸；检测试纸由样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸收垫顺次搭接粘贴在底板上构成；标记垫上涂覆有胶体金标记的抗地高辛抗体，硝酸纤维素膜包括包被有抗FITC抗体的检测区和包被有二抗的控制区；预处理PCR管内包括地高辛标记序列、FITC标记序列、Taq酶、dNTP和buffer，地高辛标记序列为GCTCCTACAAATGCCATCATTGC，FITC标记序列为GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC。本发明的检测核酸胶体金免疫检测卡可针对PCR扩增产物进行快速、现场和灵敏的检测，操作简单，可直接肉眼观察PCR扩增结果；仅需8‑10min即可完成检测。

Description

一种检测转基因蛋白Cry1Ab/Ac的胶体金免疫检测盒及其 应用
技术领域
本发明涉及一种检测转基因蛋白Cry1Ab/Ac的胶体金免疫检测盒及其应用。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)杀虫晶体蛋白基因抗虫基因在棉花和玉米等作物上得到了很成功的应用。根据编码基因序列的同源性和编码蛋白的杀虫谱，Bt杀虫晶体蛋白划分为cry族和cryt族，每一类下又分为数量不等的亚类。目前在植物中表达的Bt基因有Bt cry1Aa，cry1Ab，cry1Ac，cry2Aa，cry3Bb，cry9c。Bt Cry1Ab/Ac蛋白具有非常高的相似度，目前市场上商业化的作物中的转BtCry1Ac蛋白基因已包含BtCry1Ab蛋白基因。
免疫检测试剂盒已广泛应用于转基因抗虫棉花、玉米种子质量检测、真伪鉴定，食品中转基因成分分析及生物安全性的研究。但是现有的检测转基因蛋白Cry1Ab/Ac方法较为繁琐，而且灵敏度不高，不能满足市场的需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的检测转基因蛋白Cry1Ab/Ac方法较为繁琐，而且灵敏度不高，不能满足市场的需求的缺陷，提供一种检测转基因蛋白Cry1Ab/Ac的胶体金免疫检测盒及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种检测转基因蛋白Cry1Ab/Ac的胶体金免疫检测盒，包括预处理PCR管和检测试纸；所述检测试纸由样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸收垫顺次搭接粘贴在底板上构成；所述标记垫上涂覆有胶体金标记的抗地高辛抗体，所述硝酸纤维素膜包括包被有抗FITC抗体的检测区和包被有二抗的控制区；所述预处理PCR管内包括地高辛标记序列、FITC标记序列、Taq酶、dNTP和buffer，所述地高辛标记序列为GCTCCTACAAATGCCATCATTGC，所述FITC标记序列为GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC。
进一步的，所述的检测试纸中的样品垫的大小为4mm×15mm，标记垫的大小为3mm×4mm，硝酸纤维素膜的大小为4mm×28mm，吸收垫的大小为4mm×19mm。
进一步的，所述的检测试纸的整体外部包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有加样孔，外壳上对应于检测区(T)和控制区(C)处设置有观察孔。
进一步的，所述抗地高辛抗体的涂覆量为5ng-50ng，硝酸纤维素膜上抗FITC抗体的量为0.4μg-1.2μg。
进一步的，所述抗地高辛抗体的涂覆量为40ng，硝酸纤维素膜上抗FITC抗体的量为0.8μg。
进一步的，所述检测试纸的干燥温度为37℃，时间为30min。
本发明的具体检测步骤及原理如下：
核酸引物对分别修饰地高辛与FITC，对提取的检测样本进行PCR反应；在加样孔中加入反应产物溶液并水平放置；反应产物溶液沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的试纸条，如果样品溶液中含核酸那么PCR扩增产物将与检测卡上的抗地高辛抗体结合，并与NC膜上的抗FITC抗体结合，8-10min后，可于观察孔中观察到检测区(T)的颜色变化，即T出现阳性条带；如果样品溶液中不含对应核酸，那么检测区则观察不到阳性条带。而无论样品溶液中是否含对应核酸，当样品溶液到达硝酸纤维素膜时，检测卡上的抗地高辛抗体均可与控制区包被的二抗结合，从而显色。
因此，本发明专利核酸胶体金免疫检测卡的结果判断规则为：
阴性结果(-)：只出现1条C线；
阳性结果(+)：同时出现T线和C线；
本发明的检测盒可以应用在检测Cry1Ab/Ac中，较现有的凝胶电泳紫外成像检测相比，具有以下特有优势。
(1)操作简单，不需要专门的仪器设备，可直接肉眼观察PCR扩增结果；
(2)检测时间短，仅需8-10min；结果判定标准统一，即阴性结果(-)，只出现1条C线；阳性(+)：同时出现T线和C线。
本发明专利的检测核酸胶体金免疫检测卡可针对PCR扩增产物进行快速、现场和灵敏的检测。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的检测试纸的结构示意图；其中，1为结果观察孔，2为控制区(C)，3为检测区(T)，4为加样孔。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
首先，制作检测试纸
在上层的塑料板卡条上设置两个孔，加样孔和观察孔，加样孔大小为3mm×7mm，观察孔大小为4mm×18mm。在塑料卡条下方并排粘贴样品垫和固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫、醋酸纤维素膜以及吸收垫。在金标垫上固定40ng抗地高辛抗体，在醋酸纤维素膜上的检测区固定0.8μg抗FITC抗体以及在控制区固定二抗。然后置于37℃真空干燥30min，如图1所示。
然后，设计地高辛标记序列、FITC标记序列的
目标核酸 引物名称 序列 修饰
Cry1Ac 引物1 GCTCCTACAAATGCCATCATTGC 地高辛
Cry1Ac 引物2 GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC FITC
接下来对不同的待测样本进行PCR扩增，PCR扩增方法如下：
PCR验证
以ddH2O为阴性对照，阳性样本基因组为阳性对照
最后检测结果的判断如下：
样本名称 样本属性 检测结果 结果判断
样本1 含有Cry1Ac T、C显色 Cry1Ac检出
样本2 不含Cry1Ac C显色，T不显色 Cry1Ac未检出
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测转基因蛋白Cry1Ab/Ac的胶体金免疫检测盒，其特征在于，包括预处理PCR管和检测试纸；所述检测试纸由样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸收垫顺次搭接粘贴在底板上构成；所述标记垫上涂覆有胶体金标记的抗地高辛抗体，所述硝酸纤维素膜包括包被有抗FITC抗体的检测区和包被有二抗的控制区；所述预处理PCR管内包括地高辛标记序列、FITC标记序列、Taq酶、dNTP和buffer，所述地高辛标记序列为GCTCCTACAAATGCCATCATTGC，所述FITC标记序列为GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC。
2.如权利要求1所述的检测盒，其特征在于，所述的检测试纸中的样品垫的大小为4mm×15mm，标记垫的大小为3mm×4mm，硝酸纤维素膜的大小为4mm×28mm，吸收垫的大小为4mm×19mm。
3.如权利要求1所述的检测盒，其特征在于，所述的检测试纸的整体外部包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有加样孔，外壳上对应于检测区(T)和控制区(C)处设置有观察孔。
4.如权利要求1所述的检测盒，其特征在于，所述抗地高辛抗体的涂覆量为5ng-50ng，硝酸纤维素膜上抗FITC抗体的量为0.4μg-1.2μg。
5.如权利要求4所述的检测盒，其特征在于，所述抗地高辛抗体的涂覆量为40ng，硝酸纤维素膜上抗FITC抗体的量为0.8μg。
6.如权利要求1所述的检测盒，其特征在于，所述检测试纸的干燥温度为37℃，时间为30min。
7.权利要求1-6所述的检测盒在检测Cry1Ab/Ac中的应用。
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