ES2347176T3 - Dosificacion de un analito mediante inmunocromatografia de migracion lateral. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo de determinación de un analito en una muestra líquida, que comprende: - un medio de difusión capilar (1), mediante migración lateral que determina una dirección de referencia (2) de difusión capilar, que comprende una zona de depósito (3) de la muestra líquida, y una zona de detección (5) del analito, dispuesta corriente abajo de dicha zona de depósito (3), - un primer agente reactivo (4) de unión específica del analito, conjugado con un marcador visible y/o medible, libre de migrar en el estado húmedo, por difusión capilar, en el medio de difusión capilar (1), según la dirección de referencia, estando la zona de disposición del primer agente reactivo de unión confundida con la zona de depósito (3) de la muestra, o estando dispuesta corriente abajo de esta última, pero corriente arriba de la zona de detección (5), - un segundo agente reactivo (6) de unión específica del analito, inmovilizado en la zona de detección (5), caracterizado porque la zona de detección (5) comprende un tercer agente reactivo constituido por el analito (7), o un análogo del analito, inmovilizado, y dispuesto a distancia del segundo agente reactivo (6) de unión específica, corriente abajo de éste.
Description
Dosificación de un analito mediante
inmunocromatografía de migración lateral.
La presente invención se refiere a un
dispositivo inmunocromatográfico de migración lateral que permite
simultáneamente la determinación de un analito en una muestra
líquida mediante un ensayo sándwich y mediante un ensayo de
competición.
Unos dispositivos inmunocromatográficos de
migración lateral se describen por ejemplo en la patente EP 0 284
232. Estos dispositivos utilizan un medio de difusión capilar en
forma de un soporte sólido poroso en el seno del cual la muestra y
los agentes reactivos migran mediante difusión capilar. Estos
dispositivos integran o comprenden así un soporte sólido poroso (o
inmunocromatográfico) que comprende una primera zona que soporta en
forma liofilizada, seca, o deshidratada, un agente reactivo de unión
específica del analito conjugado con un marcador visible y/o
medible, y una zona de detección en la que se inmoviliza un agente
reactivo de captura específica del analito. El agente reactivo de
unión específica del analito es inmóvil en forma seca, pero se
vuelve móvil en el soporte sólido en el estado húmedo. Así, cuando
el soporte sólido se pone en contacto con una muestra líquida, esta
última migra por difusión capilar en este soporte arrastrando el
agente de unión específica del analito conjugado con el marcador
visible y/o medible. La muestra y el agente reactivo de unión
específica del analito migran por difusión capilar en el soporte
sólido hasta la zona de detección que soporta el agente reactivo de
captura específico del analito inmovilizado.
Se conocen a partir del documento WO 2004/088320
unos procedimientos inmunocromatográficos en fase sólida en los que
el agente reactivo de unión, conjugado con un marcador visible y/o
medible se añade extemporáneamente en forma líquida.
Estos dispositivos permiten clásicamente la
detección del analito, o bien mediante un ensayo sándwich, o bien
mediante un ensayo de competición.
En un ensayo sándwich, el agente reactivo de
unión marcado se une al analito, y este último se inmoviliza sobre
el soporte sólido mediante el agente reactivo de captura. La
presencia o la ausencia del analito en la muestra se mide mediante
la presencia o no de una señal visible o medible, a nivel del agente
reactivo de captura.
En un ensayo de competición, el analito y el
agente reactivo de unión están en competición para unirse al agente
reactivo de captura. La presencia o la ausencia del analito en la
muestra se miden mediante la ausencia o no de una señal visible o
medible, a nivel del agente reactivo de captura.
Las patentes EP 0 291 194, EP 0 560 411 y EP 0
560 410 describen unos dispositivos en los que el soporte sólido
inmunocromatográfico en una sola parte es incorporado en una caja
provista de una abertura para el depósito de la muestra líquida, y
de una ventana de observación para la lectura del resultado.
La patente EP 1 091 808 describe unos
dispositivos mejorados que comprenden asimismo un soporte sólido
poroso en varias partes, con un órgano de captación de la muestra
líquida, móvil, que permite una mejor recogida de la muestra.
Estos dispositivos se pueden adaptar a un uso
único y doméstico. En efecto, son de un uso fácil y rápido,
necesitan sólo poca manipulación puesto que todos los agentes
reactivos están integrados o comprendidos en el dispositivo.
Sin embargo, estos ensayos inmunocromatográficos
en fase sólida no permiten una determinación cuantitativa del
analito en la muestra.
Además, en ensayo sándwich, se observa para
algunos analitos un efecto "gancho" o efecto "hook". El
efecto gancho es un efecto indeseable bien conocido en los ensayos
inmunológicos. Se produce cuando el analito está presente en la
muestra a una concentración muy elevada. El efecto gancho puede
entonces provocar unos falsos negativos, que concluyen de manera
aberrante en la ausencia del analito en la muestra.
Los analitos que presentan un efecto gancho
durante dosificaciones inmunológicas de tipo sándwich presentan
unas curvas señal/concentración de tipo curva de Gauss (véase la
figura 1). La figura 1 muestra que a una señal dada (S)
corresponden dos concentraciones posibles del analito (C1 y C2), una débil (C1) y la otra elevada (C2) durante la lectura del resultado a un tiempo definido.
corresponden dos concentraciones posibles del analito (C1 y C2), una débil (C1) y la otra elevada (C2) durante la lectura del resultado a un tiempo definido.
Las curvas señal/concentración para las
dosificaciones mediante competición están representadas en la figura
2. Para un ensayo mediante competición, existe efectivamente la
obtención de dos señales diferentes (S1 y S2) para dos
concentraciones respectivamente diferentes (C1 y C2) del analito a
determinar. Sin embargo, los ensayos mediante competición muestran
asimismo muy rápidamente sus límites, debido a que existe una
extinción de la señal a unas concentraciones relativamente poco
elevadas de analito.
Una solución comúnmente adoptada para evitar
estos inconvenientes de los ensayos sándwich y de los ensayos de
competición consiste en determinar el analito a partir de una gama
de dilución de la muestra líquida. El uso de una gama de dilución
no conviene sin embargo para un uso doméstico. Además, el uso de una
gama de dilución de la muestra necesita unas manipulaciones
suplementarias y un consumo aumentado de dispositivos de ensayo a
uso único, puesto que cada muestra se ensaya varias veces a
diferentes diluciones.
De acuerdo con el documento DE 10054093, se
propone un dispositivo de inmunofiltración constituido por dos
partes distintas o independientes, asignadas respectivamente a un
ensayo de tipo sándwich y a un ensayo de tipo competición. Con este
dispositivo, un agente reactivo de unión específica conjugado con un
marcador fluorescente se mezcla extemporáneamente con el analito.
La mezcla obtenida se divide después en dos porciones. Una primera
porción se filtra en la parte sándwich, y reacciona con un segundo
agente reactivo de unión, inmovilizado, y una segunda porción se
filtra en la parte de competición del dispositivo, y reacciona con
un agente reactivo de captura, inmovilizado, idéntico al analito, o
un análogo del analito. Las señales fluorescentes respectivamente
obtenidas permiten la determinación del analito.
Este dispositivo no es susceptible de mejorar la
sensibilidad o la precisión de la determinación del analito, puesto
que cada ensayo elemental trabaja con la concentración de partida
del agente reactivo de unión específica.
De acuerdo con el documento US 2005/0112729
(véase en particular el párrafo 0063 y la reivindicación 1), se ha
descrito un dispositivo para la determinación de un complejo entre
un analito y un primer agente reactivo de unión específica,
marcado, comprendiendo este dispositivo:
- -
- un medio de difusión capilar,
- -
- en una zona denominada de competición del medio de difusión capilar, un segundo agente reactivo de unión específica del analito, inmovilizado, y complejado con un ligando, asimismo marcado,
- -
- en una zona denominada de detección del medio de difusión capilar; un agente reactivo de captura, inmovilizado, susceptible de unirse tanto al complejo citado anteriormente como al ligando marcado, siendo este último susceptible de ser desplazado o descomplejado en la zona de competición mediante el flujo de dicho complejo sobre el medio de difusión capilar.
La determinación del analito se obtiene a partir
de las señales obtenidas en las zonas de competición y de
detección.
El formato de este ensayo es complejo de
utilizar, y se justifica sólo para unas determinaciones del analito
de gran precisión.
El documento
US-A-5.962.339 describe un ensayo
que comprende una zona 5 denominada "threshold" y una zona 6
denominada "detección". El dispositivo descrito no propone
simultáneamente en la misma membrana una dosificación del analito
mediante sándwich y una dosificación del analito mediante
competición.
La presente invención tiene por objetivo evitar
los inconvenientes de los dispositivos mencionados anteriormente.
En particular, la presente invención tiene por objeto, por un lado,
un dispositivo de ensayo y, por otro lado, un modo de uso de este
último, que permite una determinación del analito, con un grado de
fiabilidad y/o de precisión suficiente, en cualquier circunstancia,
es decir, sea cual sea la concentración de partida de este último,
en particular cuando esta concentración es relativamente fuerte o
relativamente baja.
Según la invención, haciendo referencia a la
figura 3, se propone un dispositivo de determinación de un analito
en una muestra líquida, que comprende:
- -
- un medio de difusión capilar 1, mediante migración lateral que determina una dirección de referencia 2 de difusión capilar, que comprende una zona de depósito 3 de la muestra líquida, y una zona de detección 5 del analito, dispuesta corriente abajo de dicha zona de depósito,
- -
- un primer agente reactivo 4 de unión específica del analito, conjugado con un marcador visible y/o medible, libre de migrar en el estado húmedo, por difusión capilar, en el medio de difusión capilar 1, según la dirección de referencia, siendo la zona de disposición del primer agente reactivo confundida con la zona de depósito (3) de la muestra, o estando dispuesta corriente abajo de esta última, pero corriente arriba de la zona de detección (5),
- -
- un segundo agente reactivo 6 de unión específica del analito, inmovilizado, en la zona de detección 5.
caracterizado porque la zona de detección 5
comprende un tercer agente reactivo constituido por el analito, o
un análogo del analito, inmovilizado, y dispuesto a distancia del
segundo agente reactivo 6 de unión específica corriente abajo de
éste.
Este dispositivo presenta, de manera preferida,
una o varias de las características secundarias siguientes,
consideradas solas o en combinación, todavía explicadas haciendo
referencia a la figura 3:
- -
- este dispositivo puede comprender un órgano de captación de la muestra líquida, independiente del medio de difusión capilar, susceptible de ser llevado en contacto con la zona de depósito, para un flujo de dicha muestra en dicha zona de depósito
- -
- el medio de difusión capilar 1 puede comprender una zona de disposición del primer agente reactivo (4) de unión, en el estado seco y libre, en o sobre dicho medio de difusión capilar;
- -
- el segundo agente reactivo 6 de unión específica, y/o el analito 7, o el análogo de analito, están dispuestos, por ejemplo, sobre el medio de difusión capilar según una línea transversal a la dirección de referencia
- -
- el medio de difusión capilar puede comprender una zona de control (C), corriente abajo de la zona de detección 5.
Según la presente invención, se entiende
mediante la expresión "medio de difusión capilar" cualquier
medio que constituye o que actúa como unidad de difusión capilar
continua, mediante migración lateral (es decir, perpendicularmente
al espesor del o de los materiales capilares utilizados para la
difusión capilar). Dicho medio de difusión capilar es, por ejemplo,
un soporte alargado según la dirección y/o el sentido de la difusión
capilar (migración lateral), constituido por un solo y mismo
material capilar o poroso, o mediante varios elementos o materiales
capilares diferentes, dispuestos unos con relación a los otros, por
ejemplo, mediante superposición, para obtener una continuidad de
flujo capilar de un elemento o de un material a otro, según la
dirección de difusión capilar.
Dicho medio de difusión capilar determina una
dirección y/o un sentido de difusión capilar de cualquier líquido
que se recibe o que se deposita en un extremo hacia el otro extremo
de dicho medio.
La difusión capilar considerada según la
presente invención, o inmunocromatografía por migración lateral, se
distingue de la utilizada en las técnicas de inmunofiltración, según
las cuales los líquidos permean en el espesor del o de los
materiales de filtración, porosos.
Según la presente invención, el analito, o el
análogo del analito considerado, constituye un tercer agente
reactivo, encima de los primer y segundo agentes reactivos de unión.
Este tercer agente reactivo está fijado o inmovilizado en la zona
de detección mediante cualquier medio apropiado. Este tercer agente
reactivo sobre el medio de difusión capilar está disponible para
reaccionar específicamente con el primer agente reactivo de unión
específica, con la exclusión de cualquier otra entidad. En
particular, una vez depositado sobre el medio de difusión capilar,
no se compleja con cualquier otra entidad, o agente reactivo, por
ejemplo conjugado con un marcador visible y/o
medible.
medible.
Dicho dispositivo se puede utilizar según el
procedimiento o modo de uso definido a continuación, haciendo
referencia a la figura 3:
- -
- se deposita en la zona de depósito del medio de difusión capilar, la muestra líquida,
- -
- se espera un tiempo suficiente para la migración por difusión capilar de la muestra líquida hasta la zona de detección 5,
- -
- se observa en la zona de detección la medición en la que, por un lado, el agente reactivo 4 de unión específica complejado con el analito se fija al segundo agente reactivo 6 de unión específica, obteniendo una primera señal y, por otro lado, el primer agente reactivo de unión no complejado se fija al tercer agente reactivo constituido por el analito 7, o análogo de analito, obteniendo una segunda señal,
- -
- se determina el analito a partir de las primera y segunda señales.
Preferentemente, según la invención, la cantidad
del primer agente reactivo 4 de unión es excedentario con relación
a la cantidad del analito presente en la muestra líquida, o del
número de sitios de complejación con el primer agente reactivo de
unión, presentes en dicha muestra líquida.
En un modo cualitativo, una concentración baja
en analito se detecta mediante la ausencia de la primera señal y la
presencia de la segunda señal; y una concentración importante en
analito se detecta mediante la ausencia de las dos señales. Una
concentración normal del analito se detecta mediante la presencia de
las primera y segunda
señales.
señales.
Ventajosamente, los dispositivos y/o los
procedimientos según la presente invención permiten dosificar unos
analitos débilmente o muy altamente concentrados en una muestra sin
obtener ningún resultado de falsos positivos o de falsos negativos.
Además, de manera sorprendente, los dispositivos y/o los
procedimientos según la presente invención permiten la dosificación
cuantitativa del analito.
Los dispositivos y/o los procedimientos según la
invención están particularmente adaptados a la dosificación de
analitos que presentan un efecto gancho importante tal como la
hormona de embarazo (hCG), la proteína C-reactiva,
la albúmina, etc.
\newpage
La presente invención se refiere por lo tanto a
un dispositivo de determinación de un analito en una muestra
líquida, que comprende un medio de difusión capilar (1) que
comprende en la dirección de difusión capilar (2):
- a)
- una zona de depósito o de recepción de la muestra (3);
- b)
- un agente reactivo de unión específica del analito conjugado con un marcador visible y/o medible, libre de migrar por difusión capilar en el estado húmedo en el medio de difusión capilar (1);
- c)
- una zona de detección del analito (5);
en el que la zona de detección del analito (5)
comprende, sucesivamente, en la dirección de difusión capilar (2),
por un lado, un segundo agente reactivo de unión específica del
analito (6) inmovilizado y, por otro lado, el analito, o un análogo
del analito, inmovilizado (7); de tal manera que el primer agente
reactivo de unión específica del analito (4) y el segundo agente
reactivo de unión específica del analito (6) permiten la
determinación del analito en la muestra líquida mediante un ensayo
sándwich, mientras que el primer agente reactivo de unión
específica del analito (4) y el analito, o el análogo del analito,
inmovilizado (7) permiten la determinación del analito en la
muestra líquida mediante un ensayo de competición.
En un modo de realización, el primer agente
reactivo de unión específica del analito (4), conjugado con un
marcador visible y/o medible, se deposita en el estado seco sobre el
soporte, y la invención se refiere por lo tanto a un dispositivo de
determinación de un analito en una muestra líquida que comprende un
medio de difusión capilar (1) que comprende, en la dirección de
difusión capilar (2):
- a)
- una zona de depósito de la muestra (3);
- b)
- un primer agente reactivo de unión específica del analito (4), conjugado con un marcador visible y/o medible, depositado en el estado seco y libre de migrar por difusión capilar en el estado húmedo en el medio de difusión capilar (1);
- c)
- una zona de detección del analito (5);
en el que la zona de detección del analito (5)
comprende, sucesivamente, en la dirección de difusión capilar (2),
un segundo agente reactivo de unión específica del analito (6)
inmovilizado, y el analito, o un análogo del analito, inmovilizado
(7); de tal manera que el primer agente reactivo de unión específica
del analito (4) y el segundo agente reactivo de unión específica
del analito (6) permiten la determinación del analito en la muestra
líquida mediante un ensayo sándwich, mientras que el primer agente
reactivo de unión específica del analito (4) y el analito, o el
análogo del analito, inmovilizado (7) permiten la determinación del
analito en la muestra líquida mediante un ensayo de
competición.
En otro modo de realización, el primer agente
reactivo de unión específica del analito (4), conjugado con un
marcador visible y/o medible, se añade extemporáneamente en forma de
agente reactivo en forma líquida.
Mediante la expresión "agente reactivo en
forma líquida" se entiende cualquier agente reactivo en el que el
agente reactivo de unión está en disolución o en suspensión. La
preparación del agente reactivo de unión conjugado con el marcador
visible y/o medible en forma líquida se lleva a cabo según unas
técnicas descritas en la bibliografía. Habitualmente, el agente
reactivo de unión conjugado está en disolución o en suspensión en
una disolución salina tamponada. Esta disolución puede comprender
asimismo unos agentes estabilizantes y otros compuestos tales como
unos antibacterianos o unos antifúngicos. Entre los agentes
estabilizantes se citarán, por ejemplo, el suero de albúmina bovina
(BSA) y la caseína.
En algunos procedimientos según la presente
invención, se utiliza además un diluyente cuando la muestra líquida
es plasma, suero o sangre total, por ejemplo. Este diluyente migra
en el soporte sólido arrastrando la muestra, y el agente reactivo
de unión marcado. Típicamente, este diluyente está compuesto por una
disolución salina tamponada, y puede comprender asimismo un
detergente o cualquier otro componente necesario para la
reacción.
Preferentemente, el primer agente reactivo de
unión específica del analito (4) está conjugado con un marcador
particular.
Preferentemente, el medio de difusión capilar
(1) es una cinta cromatográfica fijada sobre un soporte rígido.
En un modo de realización preferido, el medio de
difusión capilar (1) está integrado en un soporte de asido (8)
provisto de por lo menos una ventana de observación (9) que permite
observar la zona de detección (5).
Mediante la expresión "agente reactivo de
unión" se entiende cualquier entidad química, bioquímica o
biológica susceptible de unirse específicamente con el analito, o
con el agente reactivo de captura en competición con el
analito.
Por el término "unirse" o "unión" se
entiende cualquier unión fuerte, por ejemplo covalente, o cualquier
unión débil, por ejemplo de tipo antígeno/anticuerpo o
avidina/estreptavidina.
El agente reactivo de unión es, por ejemplo, un
anticuerpo, un antígeno o un ácido nucleico.
En un ensayo por competición, el agente reactivo
de unión está en fase sólida y está fijado al analito en sí, o un
análogo apropiado del analito. Mediante la expresión "análogo
apropiado del analito" se entiende cualquier entidad que se une
de manera específica al primer agente reactivo de unión específica
del analito, en competición con el analito.
En un ensayo de tipo sándwich, el primer agente
reactivo de unión marcado es un anti-analito
conjugado con un marcador visible y/o medible, por ejemplo un
anticuerpo específico del analito, conjugado con dicho marcador.
En un ensayo de tipo sándwich, el segundo agente
reactivo de unión se une de manera específica al analito. El
segundo agente reactivo de unión marcado es por lo tanto asimismo un
anti-analito, por ejemplo un anticuerpo específico
del analito conjugado con un marcador visible y/o medible.
Mediante la expresión "marcador visible y/o
medible" se entiende cualquier procedimiento de marcado que
permite una detección directa o indirecta a simple vista o con la
ayuda de un aparato, debido a la emisión de una señal, siendo dicha
señal por ejemplo una fluorescencia, una coloración, una presencia
de isótopo, o una señal magnética. Se citarán, por ejemplo, los
marcadores particulares coloreados como el oro coloidal, o
fluorescentes, las partículas de látex coloreadas, las partículas
de látex fluorescentes y las partículas conjugadas con la avidina y
con la estreptavidina.
La presente invención se refiere por lo tanto a
un dispositivo de determinación de un analito en una muestra
líquida, que comprende un medio de difusión capilar (1), que
comprende en la dirección de difusión capilar (2):
- a)
- una zona de depósito o de recepción de la muestra (3);
- b)
- un primer anticuerpo específico del analito (4), conjugado con un marcador visible y/o medible, libre de migrar por difusión capilar en el estado húmedo en el medio de difusión capilar (1);
- c)
- una zona de detección del analito (5);
dispositivo en el que la zona de detección del
analito (5) comprende, sucesivamente, en la dirección de difusión
capilar (2), por un lado, un segundo anticuerpo específico del
analito (6) inmovilizado y, por otro lado, el analito, o un análogo
del analito, inmovilizado (7); de tal manera que el primer
anticuerpo específico del analito (4) y el segundo anticuerpo
específico del analito (6) permiten la determinación del analito en
la muestra líquida mediante un ensayo sándwich, mientras que, por
una lado, el primer anticuerpo específico del analito (4) y, por
otro lado, el analito, o el análogo del analito, inmovilizado (7),
permiten la determinación del analito en la muestra líquida
mediante un ensayo de competición.
En un modo de realización, el primer anticuerpo
específico del analito (4), conjugado con un marcador visible y/o
medible, se deposita en el estado seco sobre el soporte, y la
invención se refiere entonces a un dispositivo de determinación de
un analito en una muestra líquida, que comprende un medio de
difusión capilar (1), y que comprende en la dirección de difusión
capilar (2):
- a)
- una zona de depósito o de recepción de la muestra (3);
- b)
- un primer anticuerpo específico del analito (4), conjugado con un marcador visible y/o medible, depositado en el estado seco y libre de migrar por difusión capilar en el estado húmedo en el medio de difusión capilar (1);
- c)
- una zona de detección del analito (5);
dispositivo en el que la zona de detección del
analito (5) comprende, sucesivamente, en la dirección de difusión
capilar (2), por un lado, un segundo anticuerpo específico del
analito (6) inmovilizado y, por otro lado, el analito, o un análogo
del analito, inmovilizado (7); de tal manera que el primer
anticuerpo específico del analito (4) y el segundo anticuerpo
específico del analito (6) permiten la determinación del analito en
la muestra líquida mediante un ensayo sándwich, mientras que, por un
lado, el primer anticuerpo específico del analito (4) y, por otro
lado, el analito, o el análogo del analito, inmovilizado (7),
permiten la determinación del analito en la muestra líquida
mediante un ensayo de competición.
En otro modo de realización, el primer
anticuerpo específico del analito (4), conjugado con un marcador
visible y/o medible, se añade extemporáneamente en forma de agente
reactivo en forma líquida.
Preferentemente, el primer anticuerpo específico
del analito (4) se conjuga con un marcador visible y/o medible.
Preferentemente, el medio de difusión capilar
(1) es una cinta cromatográfica fijada sobre un soporte rígido.
En un modo de realización preferido, el medio de
difusión capilar (1) está integrado en un soporte de asido (8)
provisto de por lo menos una ventana de observación (9) que permite
observar la zona de detección (5).
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de determinación de un analito en una muestra líquida,
que utiliza un dispositivo tal como se ha definido anteriormente,
que comprende las etapas siguientes:
- a)
- disponer de por lo menos un medio de difusión capilar provisto de por lo menos una zona de depósito o de recepción, y de una zona de detección, estando por lo menos un agente reactivo de captura inmovilizado en la zona de detección,
- b)
- depositar, separadamente en la zona de depósito del medio de difusión capilar, por lo menos una vez la muestra líquida,
- c)
- esperar un tiempo suficiente para la migración por difusión capilar de la muestra líquida hasta la zona que comprende el primer agente reactivo de unión específica, conjugado con un marcador visible y/o medible,
- d)
- esperar un tiempo suficiente para la migración por difusión capilar del primer agente reactivo de unión específica conjugado con un marcado visible y/o medible y de la muestra líquida hasta la zona de detección,
- e)
- observar la medición en la que el agente reactivo de unión específica conjugado con un marcador visible y/o medible se fija en la zona de detección, para la determinación del analito simultáneamente mediante un ensayo sándwich y mediante un ensayo de competición.
Según un modo de realización, el primer agente
reactivo de unión específica conjugado con un marcador visible y/o
medible se deposita, en el estado seco y libre, en o sobre el
soporte sólido poroso.
Según un modo de realización, el primer agente
reactivo de unión específica conjugado con un marcador visible y/o
medible, se añade extemporáneamente, en forma de agente reactivo en
forma líquida, simultánea, posterior o previamente al depósito del
analito.
Según un modo de realización, se añade o de
deposita asimismo un diluyente en forma líquida sobre el soporte
sólido poroso.
Según un modo de realización del procedimiento,
en la etapa a), la zona de detección comprende por lo menos dos
agentes reactivos de captura, siendo uno de los dos el analito o un
análogo del analito inmovilizado, y siendo el otro un agente
reactivo de unión específica del analito inmovilizado.
Mediante la expresión "agente reactivo de
captura" se entiende cualquier entidad química, bioquímica o
biológica susceptible de unirse específicamente con el analito, o
un análogo del analito.
En el caso de un ensayo mediante competición, el
agente reactivo de captura se une asimismo al primer agente
reactivo de unión. El analito y el agente reactivo de captura forman
típicamente un par ligando/anti-ligando,
antígeno/anticuerpo, ADN/ARN o ADN/ADN. Así, si el analito es un
antígeno o un hapteno, el agente reactivo de captura es, por
ejemplo, un anticuerpo específico del analito. Si el analito es un
anticuerpo, el agente reactivo de captura es el antígeno reconocido
por el anticuerpo o un anticuerpo que reconoce específicamente el
analito. Si el analito es un ácido nucleico, el agente reactivo de
captura es, por ejemplo, una sonda ADN complementaria.
El agente reactivo de captura inmovilizado es,
por ejemplo, un anticuerpo policlonal o monoclonal que tiene una
fuerte afinidad para el analito, y más particularmente puede
tratarse de un anticuerpo monoclonal.
Para aumentar la sensibilidad, se puede
recurrir, por ejemplo, a un anticuerpo marcado según unas técnicas
conocidas por el experto en la materia para una detección indirecta,
tal como, por ejemplo, un anticuerpo biotinilado, que permite
indirectamente una detección por la formación de las entidades
avidina-biotina y
estreptavidina-biotina.
Este anticuerpo marcado y biotinilado puede
asimismo, o bien ser directamente ya depositado sobre una
línea-ensayo, en la zona de detección, para
aumentar la sensibilidad, o bien ser depositado con el primer
anticuerpo específico y ser eluido y fijado de manera que el
analito y el anticuerpo aumentan el tiempo de contacto y también la
sensibilidad en particular, por ejemplo, debido al número de sitios
de fijación.
El agente reactivo de captura específico del
analito está inmovilizado sobre el soporte sólido según unas
técnicas conocidas por el experto en la materia. Este agente
reactivo de captura se inmoviliza de tal manera que no sea móvil en
el estado húmedo. Esta inmovilización puede efectuarse por ejemplo
mediante absorción o mediante un acoplamiento covalente.
Por el término
"anti-analito" se entiende cualquier entidad
química, bioquímica o biológica, susceptible de unirse
específicamente con el analito, o con el agente reactivo de captura,
en competición con el analito, por ejemplo un anticuerpo, un
antígeno o un ácido nucleico.
Según un modo de realización, la invención se
refiere asimismo a un procedimiento de determinación de un analito
en una muestra líquida, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- se dispone de un dispositivo tal como se ha definido anteriormente,
- b)
- se deposita una muestra líquida en la zona de depósito o de recepción (3) del medio de difusión capilar (1) del dispositivo de la etapa (a);
- c)
- se espera un tiempo suficiente para la migración por difusión capilar de la muestra líquida desde la zona de depósito o de recepción (3) hasta la zona de detección (5), arrastrando el primer anticuerpo específico del analito, conjugado con un marcador visible y/o medible (4);
- d)
- se observa la medición en la que el primer anticuerpo específico del analito conjugado con un marcador visible y/o medible (4) se fija en la zona de detección (5), para la determinación del analito, simultáneamente mediante un ensayo sándwich y mediante un ensato de competición. En un modo de realización ventajoso, en la etapa b) se deposita una muestra líquida y un diluyente en la zona de depósito o de recepción (3) del medio de difusión capilar (1) del dispositivo de la etapa (a).
Por el término "analito" se entiende
cualquier entidad química, bioquímica o biológica que se desea
detectar en una muestra. Entre los analitos detectados por los
dispositivos y los procedimientos según la presente invención, se
citarán en particular las proteínas, los péptidos, los anticuerpos,
las hormonas, los esteroides, los antígenos derivados de agentes
infecciosos o de células tumorales, los agentes infecciosos tales
como las bacterias, los virus o los parásitos, los ácidos nucleicos
(ADN o ARN), los compuestos terapéuticos, las drogas o también los
anti-
bióticos.
bióticos.
Por el término "detectar" o
"determinar" se entiende la determinación de la presencia o de
la ausencia de un analito en una muestra, pero también la medición
y la cuantificación de un analito en una muestra. En efecto, los
rendimientos de los dispositivos y de los procedimientos según la
invención permiten la realización de mediciones cuantitativas o
semi-cuantitativas.
En un modo de realización particular de la
invención, el analito es la hCG (hormona coriogonadotropina), la
proteína C-reactiva o la albúmina.
Mediante la expresión "muestra líquida" se
entiende cualquier muestra en la que el analito buscado está en
disolución o en suspensión. Esta muestra líquida puede en particular
ser cualquier fluido biológico o corporal. La muestra líquida puede
asimismo haber sido obtenida directa o indirectamente a partir de un
fluido biológico o corporal. La muestra puede asimismo ser un
extracto líquido de una muestra sólida.
Típicamente, la muestra líquida es orina, sangre
total, plasma o suero.
En algunos procedimientos según la presente
invención, se utiliza un diluyente cuando la muestra líquida es
plasma, suero o sangre total por ejemplo. El diluyente se deposita
sobre el soporte sólido poroso con la muestra. Alternativamente, el
diluyente se deposita sobre el soporte sólido poroso antes o después
de la muestra. Este diluyente migra en el soporte sólido,
arrastrando, o facilitando la migración de la muestra en el soporte
poroso, con el agente reactivo de unión marcado. Típicamente, este
diluyente está compuesto por una disolución salina tamponada, y
puede comprender asimismo un detergente o cualquier otro componente
necesario para la reacción.
Mediante la expresión "medio de difusión
capilar" se entiende un soporte poroso que permite la migración
de un líquido mediante simple difusión capilar. La porosidad de
este soporte permite la difusión capilar (o migración lateral) de
la muestra y/o de los agentes reactivos en el estado líquido o
húmedo. Dichos medios de difusión capilar se utilizan muy
ampliamente en todas las técnicas de inmunocromatografía de
migración lateral en particular.
Así, los medios de difusión capilar utilizados
en los dispositivos inmunocromatográficos según la invención son
bien conocidos por el experto en la materia (véase el documento EP 0
284 232). A título de ejemplo, estos medios de difusión capilar
pueden estar constituidos por diversos soportes
inmunocromatográficos, por ejemplo de celulosa, de nylon, de
nitrocelulosa, de polietileno o de fibra de vidrio.
El medio de difusión capilar puede estar
constituido por una o más partes distintas. Las diferentes partes
del soporte pueden estar constituidas por materiales diferentes.
Cuando el medio de difusión capilar esta constituido por diferentes
partes o por diferentes materiales, estos elementos están dispuestos
de tal manera que permiten la continuidad del flujo capilar en el
medio de difusión capilar.
Típicamente, el medio de difusión capilar está
constituido por un soporte sólido poroso alargado según la
dirección de difusión capilar. Preferentemente, el medio de difusión
capilar de los dispositivos según la invención comprende un soporte
sólido poroso en forma de cinta inmunocromatográfica. El medio de
difusión capilar se presenta por ejemplo en forma de una cinta
inmunocromatográfica constituida por varias cintas superpuestas o
que se solapan.
\newpage
El dispositivo según la invención puede por
ejemplo estar constituido por una cinta cromatográfica fijada sobre
un soporte sólido. El soporte sólido puede estar constituido por
materiales diversos tales como cartón, cartón plastificado o más
preferentemente por materiales plásticos. Preferentemente, el
soporte rígido está constituido por poliestireno.
El medio de difusión capilar comprende una zona
de depósito o de recepción de la muestra, y una zona de detección
de la muestra. La zona de depósito y la zona de detección son unas
zonas distintas y separadas del medio de difusión capilar. Estas
zonas están dispuestas de manera que permiten la continuidad del
flujo capilar desde la zona de depósito o de recepción, hasta la
zona de detección según una dirección de difusión capilar.
Típicamente, la zona de depósito y la zona de detección
corresponden respectivamente a uno y a otro de los extremos opuestos
del medio de difusión capilar. El medio de difusión capilar está
así, por ejemplo, constituido por un soporte sólido poroso alargado
según la dirección de difusión capilar, que presenta un extremo
proximal y un extremo distal que constituyen respectivamente la
zona de depósito y la zona de detección.
Estas zonas pueden, por ejemplo, estar presentes
en una misma cinta constituida por un material único.
Ventajosamente, un material poroso específico corresponde a cada
zona del medio de difusión capilar. Un material absorbente poroso
puede, por ejemplo, ser utilizado para la zona de depósito de la
muestra. En efecto, la zona de depósito del medio de difusión
capilar esta destinada a ser puesta en contacto con un flujo de
orina o a recibir una muestra líquida. Se seleccionará por lo tanto
un material absorbente adaptado. Estos materiales son bien conocidos
por el experto en la materia. Y se puede utilizar otro material
absorbente para la zona que recibe el primer agente reactivo de
unión específica, y/o la zona de detección.
La zona de depósito de la muestra del medio de
difusión capilar puede cooperar con un órgano de captación en
material absorbente. Este órgano de captación puede ser puesto
directamente en contacto con un flujo de orina por ejemplo. Tal
como se ha descrito en el documento WO 00/00288, el órgano de
captación puede ser móvil entre dos posiciones, una de recogida de
la muestra líquida, al margen del medio de difusión capilar, y la
otra en continuidad o en contacto capilar con la zona de depósito
del medio de difusión capilar.
El medio de difusión capilar soporta, por
ejemplo, un primer anticuerpo específico del analito conjugado con
un marcador visible y/o medible. Este anticuerpo se deposita en el
estado seco en el medio de difusión capilar, y es libre de migrar
por difusión capilar en el estado húmedo. Este primer anticuerpo
específico del analito puede estar localizado en la zona de
depósito o de recepción de la muestra. Pero, este primer anticuerpo
puede ser depositado asimismo en el estado seco, corriente abajo de
la zona de depósito o de recepción de la muestra, para cualquier
pérdida de agente reactivo mediante un efecto de lavado durante el
depósito de la muestra. Así, la muestra líquida se deposita en la
zona de depósito del medio de difusión capilar, y después esta
muestra migra por difusión capilar a través del medio de difusión
capilar, arrastrando entonces el primer anticuerpo específico del
analito conjugado con un
marcador.
marcador.
Ventajosamente, el medio de difusión capilar
puede ser incorporado en un soporte de asido. Este soporte de asido
facilita la manipulación del medio de difusión capilar, y puede
protegerlo asimismo en particular de la humedad.
El soporte de asido puede envolver parcial o
totalmente el medio de difusión capilar.
El soporte de asido puede estar constituido por
materiales diversos tales como cartón, cartón plastificado o más
preferentemente materiales plásticos. De manera ventajosa, el
soporte de asido está constituido por un material rígido e
impermeable. Estos soporte de asido o cajas se han descrito en
particular en las patentes EP 0 291 194, EP 0 560 411,
EP 0 560 410 y EP 1 091 808.
EP 0 560 410 y EP 1 091 808.
Habitualmente, el soporte de asido está en forma
de caja.
En un modo de realización de la invención, el
medio de difusión capilar puede comprender una zona de depósito o
de recogida de la muestra, en resalte con relación al soporte de
asido, para la recepción de la muestra líquida.
En otro modo de realización de la invención, el
soporte de asido o la caja comprende por lo menos una abertura para
el depósito de la muestra líquida.
Típicamente, el soporte de asido está provisto
asimismo de por lo menos una ventana de observación para observar
la zona de detección del medio de difusión capilar.
Los agentes reactivos utilizados en los
procedimientos según la presente invención, que permiten la
determinación del analito en la muestra líquida, son bien conocidos
por el experto en la materia.
El primer anticuerpo específico del analito,
conjugado con un marcador visible y/o medible, se deposita en el
estado seco en o sobre el medio de difusión capilar, pero es libre
de migrar por difusión capilar en el estado húmedo.
El segundo anticuerpo específico del analito se
inmoviliza de manera permanente en la zona de detección del medio
de difusión capilar.
\newpage
Mediante la expresión "anticuerpo específico
del analito" se entiende un anticuerpo capaz de unirse
específicamente con el analito en una unión de tipo
antígeno/anticuerpo. Se trata típicamente de un anticuerpo
policlonal o monoclonal que tiene una fuerte afinidad para el
analito. Preferentemente, se trata de un anticuerpo monoclonal.
El segundo anticuerpo específico del analito se
inmoviliza en la zona de detección del medio de difusión capilar
según unas técnicas conocidas por el experto en la materia. Este
segundo anticuerpo se inmoviliza de tal manera que no sea móvil en
el estado húmedo. Esta inmovilización se puede llevar a cabo por
ejemplo mediante absorción o mediante un acoplamiento
covalente.
El primer y el segundo anticuerpo se unen
respectiva y específicamente con el analito, por ejemplo sobre dos
sitios epitópicos, idénticos o diferentes del analito.
El primer y el segundo anticuerpo de los
dispositivos de la presente invención permiten la determinación del
analito en la muestra líquida mediante un ensayo sándwich.
Además, los dispositivos según la presente
invención comprenden el analito en sí, o un análogo del analito,
inmovilizado en la zona de detección del medio de difusión
capilar.
El analito, o el análogo del analito, se
inmoviliza en la zona de detección del medio de difusión capilar
según unas técnicas conocidas por el experto en la materia. El
analito, o el análogo del analito, se inmoviliza de tal manera que
no sea móvil en el estado húmedo. Esta inmovilización se puede
llevar a cabo por ejemplo mediante absorción o mediante
acoplamiento covalente.
Este segundo agente reactivo de la zona de
detección es idéntico al analito en sí o un análogo apropiado del
analito. Mediante la expresión "análogo apropiado del analito"
se entiende cualquier entidad que se une de manera específica al
primer agente reactivo de unión o anticuerpo específico del analito,
en competición con el analito.
En un modo de realización, por un lado, el
primer anticuerpo específico del analito, conjugado con un marcador
visible y/o medible y, por otro lado, el analito, o el análogo del
analito, inmovilizado en la zona de detección del medio de difusión
capilar, permiten la detección del analito de la muestra líquida
mediante un ensayo de competición. El depósito del segundo
anticuerpo específico del analito se lleva a cabo corriente arriba
del analito, o del análogo del analito, con relación a la dirección
de difusión capilar.
El primer anticuerpo específico del analito,
libre de migrar en el estado húmedo, se conjuga a un marcador
visible y/o medible, que permite una medición o una observación
directa del resultado del ensayo sándwich y del ensayo de
competición. Cualquier marcador visible se puede observar
directamente a simple vista cuando se concentra en la zona de
detección del medio de difusión capilar. La medición del marcador se
puede llevar a cabo directamente a simple vista o con la ayuda de
un aparato de medición. Esta medición se lleva a cabo mediante una
observación directa que no necesita ninguna manipulación
suplementaria.
Ventajosamente, los dispositivos según la
presente invención comprenden un primer anticuerpo específico del
analito conjugado con un marcador visible y/o medible.
Los marcadores considerados según la presente
invención permiten una detección directa a simple vista, o indirecta
con la ayuda de un aparato, debido a la emisión de una señal,
siendo dicha señal por ejemplo una fluorescencia, una coloración,
una presencia de isótopo, una señal magnética.
Se citarán, por ejemplo, los marcadores
particulares, coloreados o fluorescentes, constituidos por
partículas de pequeño tamaño insolubles en agua y que forman por lo
tanto unas suspensiones, dispersiones o soles, en fase líquida.
Los marcadores particulares son bien conocidos
por el experto en la materia. Se conocen en particular los
marcadores particulares coloreados o fluorescentes. A título de
ejemplo, se citará el oro coloidal, las partículas de látex
coloreadas, las partículas de látex fluorescentes y las partículas
conjugadas con la avidina o con la estreptavidina.
Entre los marcadores que permiten una
observación directa a simple vista, se citarán asimismo los
marcadores de tipo dextrano (Hansen T.M., IVD Technology 4,
35-40, 2003). El agente reactivo de unión está
entonces conjugado con una cadena de dextrano (derivado de
polisacárido) que soporta unos fluoróforos.
Los agentes reactivos de unión están conjugados
con el marcador visible y/o medible según unas técnicas bien
conocidas por el experto en la materia.
En un modo de realización preferido de la
invención, la zona de detección del medio de difusión capilar
comprende un tercer agente reactivo dispuesto corriente abajo del
segundo anticuerpo específico del analito, y corriente abajo del
analito, o del análogo del analito, con relación a la dirección de
difusión capilar. Este tercer agente reactivo permite disponer de
un control positivo con el fin de asegurar la difusión efectiva
capilar de la muestra líquida desde la zona de depósito hasta la
zona de detección del medio de difusión capilar.
\newpage
Este tercer agente reactivo se inmoviliza de
manera permanente en la zona de detección del medio de difusión
capilar.
Puede tratarse, por ejemplo, de un anticuerpo
que se une al primer anticuerpo específico del analito conjugado
con el marcador. En este caso, este tercer agente reactivo permite
verificar la migración del primer anticuerpo específico del analito
conjugado con el marcador, hasta la zona de detección del medio de
difusión capilar. Alternativamente, este tercer agente reactivo es
independiente del analito y permite simplemente verificar la
difusión de la muestra líquida hasta la zona de detección.
La invención se describe con mayor detalle
haciendo referencia a las figuras siguientes:
Figura 1: Curva señal/concentración del analito
para una dosificación inmunológica mediante un ensayo sándwich.
Figura 2: Curva señal/concentración del analito
para una dosificación inmunológica mediante un ensayo de
competición.
Figura 3: Dispositivo de dosificación simultánea
de un analito mediante un ensayo según la presente invención.
Figura 4: Dispositivo de ensayo rápido según la
presente invención, que comprende una cinta inmunocromatográfica en
una caja.
Figura 5: Cinta inmunocromatográfica para la
detección del hCG.
Figura 6: Resultado del ensayo según la figura 5
en caso de concentración baja en analito.
Figura 7: Resultado del ensayo según la figura 5
en caso de concentración alta en analito.
La figura 1 representa la curva
señal/concentración obtenida para una dosificación inmunológica
mediante ensayo sándwich. La curva obtenida es una curva de tipo
curva de Gauss, que muestra que a una señal dada (S) corresponden
dos concentraciones posibles del analito (C1 y C2), una baja (C1) y
la otra elevada (C2) durante la lectura del resultado a un tiempo
definido.
La figura 2 representa una curva
señal/concentración para una dosificación mediante competición. Se
observa la obtención de dos señales diferentes (S1 y S2) para dos
concentraciones (C1 y C2) del analito a dosificar. Sin embargo, se
observa una extinción de la señal a unas concentraciones
relativamente poco elevadas de analito.
La figura 3 representa un dispositivo de
dosificación simultánea de un analito según la presente invención,
presentando la vista A) el dispositivo sin soporte de asido y la
vista B) el dispositivo que comprende un soporte de asido.
La vista 3A) representa el dispositivo que
comprende un medio de difusión capilar (1) que comprende en la
dirección de difusión capilar (2):
- a)
- una zona de depósito o de recepción de la muestra (3) sobre un primer material capilar 20;
- b)
- un primer anticuerpo específico del analito (4), conjugado con un marcador visible y/o medible, libre de migrar por difusión capilar en el estado húmedo en el medio de difusión capilar (1); este primer anticuerpo marcado se deposita, en el estado seco, sobre un segundo material capilar 21, en continuidad de flujo capilar con el primer material capilar 20;
- c)
- una zona de detección del analito (5) que comprende sucesivamente, en la dirección de difusión capilar (2), por un lado, un segundo anticuerpo (6) específico del analito inmovilizado y, por otro lado, el analito, o un análogo del analito, inmovilizado (7); el segundo anticuerpo y el analito (o análogo del analito) están dispuestos o depositados sobre un tercer material capilar, en continuidad de flujo capilar con el segundo material capilar 21;
La vista B) representa el medio de difusión
capilar (1) integrado en un soporte de asido (8) provisto de por lo
menos una ventana de observación (9) que permite observar la zona de
detección (5), y de una abertura 23 de recogida, depósito o
recepción de la muestra líquida.
La figura 4 representa la vista exterior de un
ensayo rápido de tipo caja en el que se inserta una cinta
cromatográfica según la presente invención.
La cinta 1 contiene un anticuerpo monoclonal
anti \beta-hCG 4 marcado con oro coloidal,
depositado sobre fibra de vidrio 21 y deshidratado (conjugado).
Este marcador particular es disuelto por la muestra líquida durante
su depósito en el pocillo de muestras (S), y después entra en
contacto sucesivamente, mediante migración sobre la cinta, con una
primera zona que contiene un anticuerpo policlonal
anti-hCG fijado (T1), una segunda zona que contiene
el hCG fijado (T2) y una tercera zona que contiene un anticuerpo
policlonal de cabra anti-inmunoglobulina de ratón
(C), véase la figura 5.
En caso de ausencia (o de concentración muy
baja) de hormona hCG en la muestra depositada, no se producirá
prácticamente ninguna reacción visible en la zona T1, mientras que
aparecerá una línea en la zona T2 y en la zona C (figura 6). En
caso de alta concentración en hCG en la muestra, la reacción en la
zona T1 será muy baja o inexistente (debido al efecto "gancho"
o "hook" descrito anteriormente); no se producirá ninguna
reacción visible en la zona T2, puesto que, habiendo reaccionado
casi la totalidad del anticuerpo anti \beta-hCG
marcado con oro coloidal con el analito (hCG) de la muestra, ya no
está disponible para reaccionar con el analito (o cualquier análogo
del analito), y la zona C será positiva (figura 7).
Este sistema permite por lo tanto diferenciar
efectivamente la interpretación del resultado en caso de baja
concentración de analito (2 líneas positivas: T2+C) o de alta
concentración de analito (1 línea positiva: C). Además, la
aparición de las líneas se realizará en unos sitios diferentes (T1 o
T2).
La tabla siguiente resume los resultados
obtenidos en la zona de detección (T1, T2 y C) en función de la
concentración en analito en la muestra con la ayuda de una lectura
visual del ensayo.
Además de una interpretación visual de los
resultados, resulta muy posible realizar una lectura con la ayuda
de un autómata, que es entonces capaz de proporcionar un resultado
cuantitativo o semi-cuantitativo de la
concentración del analito, sin dilución previa de la muestra y sin
realizar gamas de concentración. En efecto, en función de la zona
de concentración, los resultados obtenidos en la zona de detección
son diferentes, y la interpretación de esta diferencia permite,
después del calibrado o mediante observación visual, cuantificar las
concentraciones del analito.
Claims (9)
1. Dispositivo de determinación de un analito en
una muestra líquida, que comprende:
- -
- un medio de difusión capilar (1), mediante migración lateral que determina una dirección de referencia (2) de difusión capilar, que comprende una zona de depósito (3) de la muestra líquida, y una zona de detección (5) del analito, dispuesta corriente abajo de dicha zona de depósito (3),
- -
- un primer agente reactivo (4) de unión específica del analito, conjugado con un marcador visible y/o medible, libre de migrar en el estado húmedo, por difusión capilar, en el medio de difusión capilar (1), según la dirección de referencia, estando la zona de disposición del primer agente reactivo de unión confundida con la zona de depósito (3) de la muestra, o estando dispuesta corriente abajo de esta última, pero corriente arriba de la zona de detección (5),
- -
- un segundo agente reactivo (6) de unión específica del analito, inmovilizado en la zona de detección (5),
caracterizado porque la zona de detección
(5) comprende un tercer agente reactivo constituido por el analito
(7), o un análogo del analito, inmovilizado, y dispuesto a distancia
del segundo agente reactivo (6) de unión específica, corriente
abajo de éste.
2. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende un órgano de captación de la
muestra líquida independiente del medio de difusión capilar,
susceptible de ser llevado en contacto con la zona de depósito,
para un flujo de dicha muestra en dicha zona de depósito.
3. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el medio de difusión capilar (1)
comprende una zona de disposición del primer agente reactivo (4) de
unión, en el estado seco y libre, en o sobre dicho medio de
difusión capilar.
4. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el segundo agente reactivo (6) de unión
específica, y/o el analito (7), o el análogo del analito, están
dispuestos sobre el medio de difusión capilar según una línea
transversal a la dirección de referencia.
5. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el medio de difusión capilar comprende
una zona de control (C), corriente abajo de la zona de detección
(5).
6. Procedimiento de determinación de un analito
en una muestra líquida mediante la utilización de un dispositivo
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado
porque:
- -
- se deposita una muestra líquida en la zona de depósito (3) del medio de difusión capilar (1),
- -
- se espera un tiempo suficiente para la migración por difusión capilar de la muestra líquida hasta la zona de detección (5),
- -
- se observa en la zona de detección (5) la medición en la que, por un lado, el primer agente reactivo (4) de unión específica complejado con el analito se fija al segundo agente reactivo (6) de unión específica, obteniendo una primera señal y, por otro lado, el primer agente reactivo (4) de unión no complejado se fija al tercer agente reactivo constituido por el analito (7) o un análogo del analito, obteniendo una segunda señal,
- -
- se determina el analito a partir de las primera y segunda señales.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque la cantidad del primer agente reactivo
(4) de unión es excedentaria con relación a la cantidad del analito
presente en la muestra líquida, o del número de sitios de
complejación presentes en dicha muestra líquida.
8. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque una concentración baja en analito se
detecta mediante la ausencia de la primera señal y la presencia de
la segunda señal.
9. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque una concentración importante en analito
se detecta mediante la ausencia de las dos señales.
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