ES2240963T3 - Complejos ligando-receptor liofilizado para ensayos y sensores. - Google Patents
Complejos ligando-receptor liofilizado para ensayos y sensores.Info
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Abstract
UN REACTIVO COLORANTE PREPARADO MEDIANTE LA LIOFILIZACION DE UN COMPLEJO RECEPTOR CON LIGANDO INMOVILIZADO ROTULADO O UN COMPLEJO DE LIGANDO CON RECEPTOR INMOVILIZADO ROTULADO ES, BAJO REHIDRATACION, UTIL PARA DETECTAR ANALITAS EN MUESTRAS EN UNA VARIEDAD DE ENSAYOS DE DESPLAZAMIENTO.
Description
Complejos ligando-receptor
liofilizados para ensayos y sensores.
La presente invención trata de complejos
ligando-receptor liofilizados, que son útiles para
ensayos y sensores, y de procedimientos para preparar dichos
complejos ligando-receptor liofilizados. La presente
invención también trata de nuevos inmunoensayos que utilizan dichos
complejos ligando-receptor liofilizados, y de kits
que contienen dichos complejos ligando-receptor
liofilizados.
Puede considerarse que los ensayos de unión
ligando-receptor son de cuatro tipos: unión directa,
ensayos en sándwich, ensayos de competición y ensayos de
desplazamiento. Dado que la disposición exacta de los ligando y de
los receptores varía ampliamente al hacerlo el tipo de sistema de
lectura implicado, los cuatro tipos pueden ser generalmente (pero no
exclusivamente) descritos como sigue. En un ensayo de unión directa,
bien en ligando o bien el receptor está marcado, y hay un medio para
medir el número de complejos formados. En un ensayo en sándwich se
mide la formación de un complejo de al menos tres componentes (es
decir, receptor-ligando-receptor
marcado). En un ensayo de competición, el ligando marcado y el
ligando no marcado compiten por unirse al receptor, y se mide bien
el componente unido o bien el componente libre. En un ensayo de
desplazamiento, él ligando marcado se preune al receptor, y se mide
un cambio en la señal según el ligando no marcado desplaza al
ligando marcado unido del recep-
tor.
tor.
Los ensayos de desplazamiento y los
inmunosensores de flujo útiles para llevar a cabo los ensayos de
desplazamiento se describen en: (1) Kusterbeck y col.,
"Antibody-Based Biosensor for Continuous
Monitoring", en Biosensor Technology, R. P. Buck y col.,
eds., Marcel Dekker, Nueva York págs. 345-350
(1990); Kusterbeck y col., "A Continuous Flow Immunoassay for
Rapid and Sensitive Detection of Small Molecules", Journal of
Immunological Methods, vol. 135, págs. 191-197
(1990); Ligler y col., "Drug Detection Using the Flow
Immunosensor", en Biosensor Design and Application, J.
Findley y col., eds., American Chemical Society Press, págs.
73-80 (1992); y Ogert y col., "Detection of
Cocaine Using the Flow Immunosensor", Analytical Letters,
vol. 25, págs. 1999-2019 (1992). Los ensayos de
desplazamiento y los inmunosensores de flujo también se describen en
la patente de EE.UU. nº 5.183.740. El inmunoensayo de
desplazamiento, al contrario que la mayoría de los inmunoensayos
competitivos usados para detectar moléculas pequeñas, puede generar
una señal positiva con un aumento de la concentración de
antígeno.
En los sistemas de ensayo de desplazamiento, una
característica crítica del ensayo es el lavado para eliminar el
ligando marcado no unido antes de la adición del ligando no marcado.
Cuando la cantidad de antígeno marcado desplazado es la
"señal", cualquier molécula marcada presente en el sistema pero
no unida inicialmente al receptor es considerada como fondo, y
disminuye la sensibilidad del ensayo.
Los sustratos se preparan típicamente para los
ensayos de desplazamiento inmovilizando primero el receptor (o el
ligando) y saturando después los sitios de unión del receptor con un
exceso de ligando (o receptor) marcado. Los receptores inmovilizados
se almacenan típicamente en tampón salino con un exceso de ligandos
marcados durante largos periodos (más de 1 año) antes de su uso.
Dado que el ligando marcado está en exceso, el complejo no se
disocia. Sin embargo, se requiere un lavado para eliminar el exceso
de antígeno marcado en el momento de su uso. Dado que el lavado debe
realizarse justo antes del uso del conjugado
receptor-ligando inmovilizado, dichos lavados serían
realizados típicamente por el usuario, en lugar de por el
fabricante. Por tanto, es necesario que el usuario tenga la
experiencia suficiente para realizar la etapa de lavado, y que estos
lavados se realicen uniformemente y meticulosamente con objeto de
conseguir unos buenos resultados con el ensayo. Sería deseable, si
la etapa de lavado la llevará a cabo el fabricante, asegurarse de
que se realiza correctamente. Sin embargo, si la etapa de lavado se
realiza demasiado antes del uso, es posible que parte del ligando
(receptor) marcado unido se disocia del receptor (ligando)
inmovilizado, lo que daría como resultado una pérdida de
sensibilidad. Además, el almacenamiento a largo plazo de muchos
complejos ligando-receptor inmovilizados requiere un
almacenamiento en el frigorífico a temperaturas por debajo de 5ºC,
un requerimiento que se cumple con dificultad en algunas zonas del
mundo o cuando el ensayo se realiza en condiciones de campo.
La patente de EE.UU. nº 3.789.116 describe un
reactivo de anticuerpo marcado liofilizado que contiene un
polisacárido no reductor, suero normal y un anticuerpo marcado. Sin
embargo, el reactivo de esta patente no es adecuado para su uso en
un ensayo de desplazamiento, ya que el anticuerpo (receptor) marcado
no está unido a un antígeno o hapteno (ligando) inmovilizado.
La patente de EE.UU. nº 4.461.829 describe un
elemento homogéneo de ensayo de unión especifica que se preparan
mediante un procedimiento que implica: (a) incorporar un vehículo
con un reactivo con un conjugado marcado en un primer líquido; (b)
someter el vehículo de (a) a unas condiciones eficaces para
suspender o reducir reversiblemente la actividad del reactivo del
mismo; (c) incorporar el vehículo de (b) con el conjugado marcado;
(d) someter el vehículo de (c) a una temperatura eficaz para
congelar el reactivo con el conjugado marcado y el conjugado
marcado; y (e) liofilizar el reactivo y el conjugado marcado en el
vehículo de (d). De nuevo, el elemento del ensayo de unión de esta
patente no es adecuado para su uso en un ensayo de desplazamiento,
ya que él "conjugado marcado" (ligando marcado) no está unido
al "reactivo" (receptor). De hecho, el procedimiento está
diseñado para asegurar que la unión del reactivo y del conjugado
marcado no pueda producirse antes de la rehidratación.
La patente de EE.UU. nº 4.692.331 describe una
preparación en seco de una \gamma-globulina
preparada mediante la liofilización de una disolución de una
fracción de la \gamma-globulina purificada y
glucosa. Por razones obvias, esta preparación tampoco se puede usar
en un ensayo de desplazamiento. En primer lugar, el anticuerpo no
está inmovilizando, y en segundo lugar, el anticuerpo no está unido
a un antígeno o hapteno marcado.
La patente de EE.UU. nº 4.693.912 enseña un
procedimiento para liofilizar partículas de látex recubiertas con un
reactivo. Específicamente, una partícula recubierta con reactivo,
tal como un antígeno o un anticuerpo inmovilizando sobre un lecho de
látex, se combina con un agente crioprotector, y la mezcla se
liofiliza. De nuevo, la preparación descrita no es adecuada para un
ensayo de desplazamiento, ya que el reactivo inmovilizado (ligando o
receptor) no está unido a un compañero de unión marcado (ligando
marcado o receptor marcado).
La patente de EE.UU. nº 5.102.788 describe un
inmunoensayo que utiliza una mezcla reactiva liofilizada. La mezcla
reactiva incluye conjugados de partículas
anticuerpo-oro en sol, conjugados de partículas
anticuerpo-látex, polietilenglicol, detergente de
p-isooctilfenil éter y un azúcar, tal como dextrosa
o trealosa. Como en las preparaciones descritas anteriormente, el
anticuerpo no está unido a un antígeno o hapteno marcado, y por
tanto, estas preparaciones tampoco son adecuadas para su uso en un
ensayo de desplazamiento.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad de
complejos ligando-receptor inmovilizados que sean
adecuados para su uso en un ensayo de desplazamiento y que no
requieran un lavado inmediatamente antes de su uso y que sean
adecuados para su almacenamiento a largo plazo a temperatura
ambiente.
También sigue habiendo una necesidad de un
procedimiento para preparar dichos complejos
ligando-receptor.
El documento
US-A-4388295 describe un
procedimiento en el que se unen covalentemente anticuerpos
anti-HCS a un disco de celulosa y se criodesecan
individualmente. Entonces, el disco se empapa en una disolución
tamponada de ^{123}I-HCS para formar un complejo
^{123}I-HCS-anti-HCS,
dicho complejo unido se lava y se seca al aire, y se guarda
herméticamente en bolsas de plástico y aluminio termoselladas y
mantenidas a 4ºC hasta el momento de su uso.
El documento
WO-A-90007114 describe la
inmovilización de una preparación de captura de anticuerpos
especifica para el parvovirus canino en un tubo o pocillo, y de un
conjugado que es un anticuerpo marcado con una enzima específico
para el antígeno (parvovirus canino). Las moléculas que están
inmovilizadas sobre el soporte son las dos anticuerpos, y no están
unidas o ligadas a los correspondientes antígenos. El ligando
marcado puede estar liofiliza-
do.
do.
El documento
WO-A-9307466 describe unas
partículas de captura recubiertas de reactivo formadas por una fase
de micropartículas sólidas recubiertas con un anticuerpo
anti-CEA de ratón. Un reactivo indicador que
contiene un conjugado de un anticuerpo anti-CEA y
peroxidasa de rábano picante se añade entonces a las partículas
recubiertas para obtener una mezcla reactiva. La mezcla reactiva se
añade entonces a una disolución de matriz vehicular para formar una
composición reactiva. Entonces ésta última se liofiliza.
Consecuentemente, es un objeto de la presente
invención proporcionar nuevos complejos
ligando-receptor que son adecuados para su uso en un
ensayo de desplazamiento.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar nuevos complejos ligando-receptor que
son adecuados para su uso en un ensayo de desplazamiento y que no
requieren un lavado antes de su uso.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar nuevos complejos ligando-receptor que
son adecuados para su uso en un ensayo de desplazamiento y que
pueden almacenarse durante periodos prolongados de tiempo a
temperatura ambiente.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar procedimientos para preparar dichos complejos
ligando-receptor.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un ensayo de desplazamiento simplificado que no
requiera el lavado del complejo ligando-receptor
inmediatamente antes de su uso.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar kits que puedan utilizarse para llevar a cabo dichos
ensayos de desplazamiento simplificados.
Estos y otros objetos, que serán apreciables
durante el transcurso de la siguiente descripción detallada, han
sido conseguidos por el descubrimiento del inventor de que un
complejo ligando-receptor preparado mediante un
procedimiento que implica:
- (i)
- unir un ligando marcado o un receptor marcado a un receptor inmovilizado o a un ligando inmovilizado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado;
- (ii)
- lavar dicho complejo ligando-receptor inmovilizado para eliminar cualquier exceso de ligando marcado o cualquier exceso de receptor marcado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado lavado; y
- (iii)
- liofilizar dicho complejo ligando-receptor inmovilizado lavado para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado liofilizado,
es útil en ensayos de desplazamiento, no requiere
un lavado inmediatamente antes de su uso y es adecuado para su
almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente.
Antes de la presente invención, se desconocía si
un complejo ligando-receptor con una constante de
unión en equilibrio, K, de 10^{5} a 10^{9}, se disociaría o no
durante un ciclo de liofilización y rehidratación. Si el complejo
receptor-ligando marcado inmovilizado pudiera
lavarse antes de la liofilización, no se necesitaría ninguna etapa
de lavado del operador en el momento de realizar el ensayo o el
análisis del biosensor. Sin embargo, el ligando marcado no estaría
en exceso en el momento de la rehidratación, y si se disociara del
receptor, no se volvería a unir en una proporción suficiente para
realizar el ensayo de desplazamiento. Adicionalmente, todo el
ligando marcado disociado contribuiría como fondo en el ensayo.
Una apreciación más completa de la invención y
muchas de las ventajas acompañantes de la misma se obtendrán
fácilmente cuando la misma se comprenda mejor mediante referencia a
la siguiente descripción detallada, cuando se considera en conexión
con los dibujos anexos, en los que:
la Figura 1 representa la relación entre la señal
de fluorescencia y la concentración del antígeno aplicado (BE) en un
ensayo en el que hay trealosa presente en el complejo
ligando-receptor liofilizado (\blacktriangle) y en
un ensayo en el que no hay trealosa presente en el complejo
ligando-receptor liofilizado (O); y
la Figura 2 muestra los resultados de una forma
de realización del presente ensayo llevada a cabo en una placa de
microtitulación de 96 pocillos (\blacksquare, 5 minutos de
incubación; \blacktriangle, 30 minutos de incubación).
Por tanto, en una primera forma de realización,
la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un
reactivo que es útil en ensayos de desplazamiento. En particular, la
presente invención proporciona un procedimiento para preparar
complejos ligando-receptor liofilizados mediante
- (i)
- la unión de un ligando marcado o un receptor marcado a un receptor inmovilizado o a un ligando inmovilizado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado;
- (ii)
- el lavado de dicho complejo ligando-receptor inmovilizado para eliminar cualquier exceso de ligando marcado o cualquier exceso de receptor marcado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado lavado; y
- (iii)
- la liofilización de dicho complejo ligando-receptor inmovilizado lavado para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado liofilizado.
En la primera etapa, un ligando marcado o un
receptor marcado se une a un receptor inmovilizado o a un ligando
inmovilizado. Cuando se usa un receptor inmovilizado, entonces se
unirá a un ligando complementario que ha sido marcado. Por otro
lado, cuando se usa un ligando inmovilizado, entonces se unirá a un
receptor complementario que ha sido marcado. Mediante el descriptor
"complementario" se entiende que ese par
ligando-receptor en particular es capaz de unirse
específicamente el uno al otro.
Consecuentemente, la elección del receptor
inmovilizado o del ligando inmovilizado dependerá de la identidad
del ligando marcado o del receptor marcado. Adicionalmente, la
elección del ligando marcado o del receptor marcado dependerá de la
identidad del analito a detectar. Por tanto, la elección del
receptor inmovilizado o del ligando inmovilizado dependerá
finalmente de la identidad del analito a detectar. Más simplemente,
el par ligando marcado-receptor inmovilizado o el
par receptor marcado-ligando inmovilizado debe
elegirse de forma que se desplacen cantidades detectables del
ligando marcado o del receptor marcado de su respectivo compañero de
unión cuando entren en contacto con una muestra que contenga un
analito en una cantidad correspondiente a un análisis positivo en
las condiciones del ensayo. Esto significa que el analito también se
unirá específicamente al receptor inmovilizado o al ligando
inmovilizado. Como corolario, el propio analito puede ser un ligando
o un receptor.
Como se explicará más completamente a
continuación, los complejos ligando-receptor
liofilizados de la presente invención pueden usarse en varios tipos
de ensayos, incluyendo aquellos representativos de las condiciones
de equilibrio y aquellos de las condiciones del estado estacionario.
Adicionalmente, estos ensayos pueden usarse para detectar analitos
con un amplio intervalo de concentraciones en las muestras.
Consecuentemente, son adecuados los pares ligando
marcado-receptor inmovilizado y receptor
marcado-ligando inmovilizado con un amplio intervalo
de afinidades ligando-receptor. Hablando de forma
general, la fuerza de la unión del ligando-receptor
puede describirse mediante la constante de unión en equilibrio (K)
para el equilibrio entre el ligando libre y el receptor libre, por
un lado, y para el par ligando-receptor unido, por
otro:
ligando_{libre} +
receptor_{libre}
\hskip0.5cm\frac{k_{1}}{k_{2}}
\hskip0.5cmligando-receptor_{par \ unido}
K =
\frac{[ligando-receptor_{par \ unido
}]}{[ligando_{libre}][receptor_{libre}]} =
\frac{k_{1}}{k_{2}}
Dependiendo del tipo de ensayo en el que se va a
usar el complejo ligando-receptor liofilizado, el
par ligando marcado-receptor inmovilizado o receptor
marcado-ligando inmovilizado tendrá típicamente una
K de desde 10^{4} hasta 10^{12}. En los ensayos en los que la
señal detectada surja a partir del ligando marcado o del receptor
marcado desplazado del compañero de unión inmovilizado, tales como
aquellos que utilizan un inmunosensor de flujo, la K es más
preferiblemente de 10^{5} a 10^{9}. En los ensayos en los que la
señal detectada surja a partir del ligando marcado o del receptor
marcado que permanece unido al compañero de unión inmovilizado tras
la incubación con la muestra, tales como aquellos que utilizan una
placa de microtitulación, la K es más preferiblemente de 10^{4} a
10^{8}. Sin embargo, el experto en la materia reconocerá que
variando el tiempo de incubación y/o la tasa de flujo de la muestra
que contiene el analito o el soporte de inmovilización y/o el
procedimiento de inmovilización, es posible obtener buenos
resultados para los pares ligando-receptor con una K
fuera de estos intervalos.
En general, el par
ligando-receptor puede comprender cualquier tipo de
molécula capaz de una unión específica. Algunos ejemplos de dichos
tipos de pares de moléculas incluyen: (1)
antígeno-anticuerpo o hapteno; (2) receptor de
superficie celular-hormona, citocina, fármaco o
antibiótico; (3) lectina-carbohidrato (incluyendo
glucoproteínas y glucolípidos); (4) proteína de unión al
ADN-ADN; (5) metal-quelatantes de
metales (incluyendo proteínas, péptidos sintéticos, éteres en
corona, porfirinas, etc.); (6) enzima-sustrato; (7)
proteína de unión a nucleótido-nucleótido; (8)
hapteno-molécula de unión manipulada aleatoria o
genéticamente (por ejemplo, un polipéptido de un fago producido
aleatoriamente); etc. Se han conseguido unos resultados
especialmente buenos usando pares
anticuerpo-antígeno o haptenos como el par
receptor-ligando. El uso de pares
anticuerpo-antígeno o haptenos como el par
receptor-ligando es especialmente conveniente
debido, en parte, a la amplia variedad de anticuerpos monoclonales
disponibles comercialmente, que son específicos para un amplio
número de antígenos y haptenos.
Una amplia lista de los anticuerpos aplicables
para su uso en la presente invención está disponible comercialmente
o puede elaborarse a partir de descripciones de procedimientos de
preparación disponibles en la bibliografía. El Linscott's Directory
proporciona su lista individual más completa de los anticuerpos
disponibles comercialmente ("Linscott's Directory", 40 Glen
Drive, Mill Valley, CA 94941). Cualquier anticuerpo descrito en la
bibliografía puede emplearse o adaptarse al procedimiento de esta
invención.
Según se mencionó anteriormente, la elección del
par ligando marcado-receptor inmovilizado o receptor
marcado-ligando inmovilizado dependerá finalmente
del analito que se va a detectar. Algunos ejemplos de los analitos
que pueden ensayarse según la presente invención incluyen
biomoléculas ensayadas en análisis clínicos; fármacos de abuso;
fármacos terapéuticos; contaminantes medioambientales; sustratos,
contaminantes y productos de procesos industriales; explosivos; y
agentes de guerra biológica.
Algunos ejemplos de las biomoléculas que se
ensayan en análisis clínicos incluyen el anticuerpo del receptor de
la acetilcolina, antígenos de adenovirus, anticuerpos contra
adenovirus, aldosterona, fosfatasa ácida,
alfa-1-fetoproteína, enzima
conversora de la angiotensina, anticuerpos antiADN, anticuerpos
antimitocondriales,
beta-2-microglobulina, enzimas
cardiacas (incluyendo las isoenzimas de la creatina cinasa y las
isoenzimas de la lactato deshidrogenasa), componentes del
complemento (incluyendo C_{1}, C_{1q}, C_{3}), antígenos de
clamidia, anticuerpos contra clamidia, cortisol, péptido C, AMP
cíclico, eritropoyetina, estradiol, ferritina, ácido fólico, hormona
foliculoestimulante, gastrina, glucagón, hormona del crecimiento,
antígenos de histocompatibilidad, antígenos sanguíneos A y B,
haptoglobina, anticuerpos contra hepatitis A y B, antígenos de la
hepatitis A y B, anticuerpos contra el herpes, antígenos del herpes,
gonadotropina coriónica humana, antígenos del VIH, anticuerpos
contra el VIH, anticuerpos contra la insulina, insulina, IgA, IgD,
IgE, IgG, IgM, antígenos de H. influenzae, anticuerpos contra
el virus de H. influenzae, anticuerpos del factor intrínseco,
antígenos de Borrelia burgdorferi, anticuerpos contra
Borrelia burgdorferi, hormona luteinizante, metirapona,
mioglobina, enolasa específica de neuronas, p24, polipéptido
pancreático, hormona paratioridea, lactógeno placentario,
progesterona, prolactina, antígeno específico prostático, antígenos
de rotavirus, anticuerpos contra rotavirus, anticuerpos contra
rubela, salmonela, serotonina, somatomedina-C,
T_{3}, T_{4}, testosterona, tiroglobulina, hormona estimulante
del tiroides, tiroxina, globulina de unión a tiroxina, transferrina,
triyodotironina, polipéptido intestinal vasoactivo, vitaminas
B_{6} y B_{12}, antígenos de estafilococos, anticuerpos contra
estafilococos, enterotoxinas, ricino, endotoxina, toxina botulínica
y venenos (de sapo, avispa, araña, serpiente, pez, etc.).
Algunos ejemplos de fármacos de abuso incluyen
anfetamina, metanfetamina, fenobarbital, cocaína, metadona,
metacualona, opiáceos (morfina, heroína), tetrahidrocanabinol (THC),
fenciclidina (PCP), dietilamida del ácido lisérgico (LSD),
esteroides anabolizantes y fenilbutazona.
Algunos ejemplos de fármacos terapéuticos
incluyen amicacina, azidotimidina, benzodiacepinas (diacepam y
clordiacepóxido), carbamacina, cloranfenicol, ciclosporina,
digitoxina, digoxina, etosuximida, gentamicina, imipramina,
lidocaína, fenitoína, primidona, procainamida, propoxifeno,
propranolol, quinidina, teofilina, tobramicina y ácido
valproico.
Algunos ejemplos de explosivos adecuados incluyen
trinitrotolueno (TNT), ciclonita (RDX), tetranitrato de
pentaeritritol (PETN), ácido pícrico y nitroglicerina.
Algunos ejemplos de contaminantes
medioambientales adecuados incluyen herbicidas (alaclor, atracina,
etc.), insecticidas (por ejemplo, DDT), bifenilos policlorados
(PCB), hidrocarburos poliaromáticos (PAH) y metales pesados (Hg, Pb,
Cd, etc.).
Algunos ejemplos de sustratos, contaminantes y
productos de procesos industriales incluyen, por ejemplo, salmonela
en alimentos y bebidas; glucosa y/o bacterias contaminantes en
procesos de fermentación; y endotoxina en procesos de preparación
farmacéuticos.
Algunos ejemplos de agentes de guerra biológica
incluyen enterotoxina, ricino, toxina botulínica, antígeno F1 de
Y. pestis, factor letal o antígeno PA de B.
antracis, micotoxinas y venenos.
Debería entenderse que, en algunos casos, el
analito realmente detectado será un metabolito de uno de los
analitos enumerados anteriormente. Este puede ser el caso cuando se
está ensayando una muestra de origen biológico en busca de un
fármaco. Por ejemplo, en el caso de la cocaína cuando se comprueba
la orina, es apropiado detectar el metabolito, benzoilecgonina. En
tales casos, el artesano experto será fácilmente capaz de elegir un
par ligando-receptor apropiado.
La inspección de la enumeración dada
anteriormente de los analitos adecuados revela que, en algunos
casos, el propio analito es un anticuerpo u otro tipo de receptor.
En estos casos es posible utilizar bien (1) un par ligando
marcado-receptor inmovilizado, en el que el ligando
marcado es un análogo de unión del analito, y el receptor
inmovilizado es, por ejemplo, un anticuerpo que se une
específicamente tanto al analito como al ligando marcado; o bien (2)
un par receptor marcado-ligando inmovilizado, en el
que el receptor marcado es un análogo de unión del analito y el
ligando inmovilizado es, por ejemplo, un hapteno o un antígeno (en
el caso de un analito anticuerpo) que se une específicamente tanto
al analito como al receptor marcado. Es preferible utilizar un par
ligando marcado-receptor inmovilizado en el que el
ligando marcado es un análogo de unión del analito, y el receptor
inmovilizado es un anticuerpo que se une específicamente tanto al
analito como al ligando marcado, en los casos en los que esté
disponible dicho anticuerpo.
El ligando marcado o el receptor marcado pueden
ser una molécula idéntica al analito, salvo por tener un marcaje
unido covalentemente al mismo. Alternativamente, el ligando marcado
o el receptor marcado pueden ser estructuralmente distintos al
analito, siempre que tanto él como el analito se unan
específicamente al receptor inmovilizado o al ligando inmovilizado.
Algunos ejemplos de ligandos marcados o de receptores marcados que
son estructuralmente distintos al analito incluyen un fragmento de
anticuerpo marcado cuando el analito es un anticuerpo. Además, puede
usarse dinitrofenol marcado como el ligando marcado en un ensayo en
busca de dinitrofenol, TNT o mezclas de los mismos. De forma
similar, un anticuerpo contra la benzoilegconina puede reconocer
benzoilegconina y cocaína.
La preparación del ligando marcado o del receptor
marcado puede llevarse a cabo por medio de procedimientos
convencionales conocidos en la técnica. El propio marcaje puede ser
adecuadamente un fluoróforo, un cromóforo, un radiomarcaje, un
coloide metálico, una enzima o una molécula quimioluminiscente o
bioluminiscente. Algunos fluoróforos y cromóforos adecuados se
describen en R. P. Haugland, Molecular Probes, Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5ª ed., Molecular
Probes, Inc., Eugene, Oregon, 1992. Algunos ejemplos de fluoróforos
preferibles incluyen fluoresceína, rodamina, y colorante de
sulfoindocianina Cy5 (Mujumdar, R. B., y col., Bioconjugate
Chemistry, vol. 4, pág. 105 (1992). Algunos radiomarcajes
preferibles incluyen ^{123}I, ^{32}P, ^{14}C y ^{3}H.
Algunas enzimas preferibles incluyen peroxidasa de rábano picante,
fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y ureasa.
Típicamente, el marcaje se fija al ligando o al
receptor mediante un agente de entrecruzamiento. Algunos ejemplos de
agentes de entrecruzamiento se describen en Pierce Catalog,
Pierce, Rockford, IL 1993; y S. S. Wong, Chemistry of Protein
Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton, FL, (1993),
340 páginas. Los procedimientos utilizados para formar los enlaces
entre el receptor o el ligando y el agente de entrecruzamiento y
entre el marcaje y el agente de entrecruzamiento son por sí mismos
conocidos por los expertos en la técnica.
Aunque la discusión dada anteriormente ha
destacado el uso de agentes de entrecruzamiento para unir el marcaje
al ligando o al receptor a marcar, debería entenderse que, en
algunos casos, es posible fijar el marcaje directamente al ligando o
al receptor. Por ejemplo, muchos fluoróforos incluyen grupos
succinimida que pueden fijarse directamente a los grupos amino de
ligandos y receptores.
El soporte para el receptor inmovilizado o el
ligando inmovilizado puede estar hecho de vidrio, silicio, cuarzo,
papel, nitrocelulosa o polímeros, tales como, látex, plástico e
hidrogeles, y puede estar en forma de un portaobjetos, perlas, una
membrana, tubos, etc.. En algunos casos, es preferible que el
soporte sobre el cual está inmovilizado el receptor o el ligando
inmovilizado es una pared lateral de un recipiente de reacción en el
que se lleva a cabo el ensayo, tal como un tubo de vidrio o de
plástico o el pocillo de una placa de microtitulación. La
inmovilización del ligando o del receptor a inmovilizar sobre el
soporte puede llevarse a cabo por medio de procedimientos
convencionales que son conocidos por los expertos en la técnica. Se
entiende que el término inmovilización incluye tanto la unión
covalente como la adsorción física. Dichos procedimientos se
describen en Protein Immobilization Fundamentals and
Applications, R. M. Taylor, Ed., M. Dekker, NY, 1991, 377
páginas; y Goldstein, L. y col., "Chemistry of Enzyme
Immobilization" en Immobilized Enzyme Principals, L. G.
Wingard, Jr., ed., Academic Press, NY, págs. 23-126
(1976).
La formación del complejo ligando
marcado-receptor inmovilizado o receptor
marcado-ligando inmovilizado puede llevarse a cabo
incubando el ligando marcado o el receptor marcado con el receptor
inmovilizado o el ligando inmovilizado. Cuando se usa un par
anticuerpo-antígeno o hapteno como el complejo
ligando-receptor, esta incubación se lleva a cabo
típicamente en un medio acuoso tal como un tampón con un pH de 5 a
8,5, preferiblemente de 6 a 8. Para maximizar la sensibilidad del
ensayo, es preferible que todos los sitios de unión del receptor
inmovilizado o del ligando inmovilizado estén saturados con el
compañero de unión marcado. Por tanto, la incubación se lleva a cabo
habitualmente usando un exceso de ligando marcado o de receptor
marcado en comparación con la cantidad de receptor inmovilizado o de
ligando inmovilizado presente en la mezcla de incubación, para
asegurar la saturación del receptor inmovilizado o del ligando
inmovilizado con ligando marcado o receptor marcado. Adecuadamente,
el ligando marcado o el receptor marcado esta presente en una
cantidad igual a de 1 a 500, preferiblemente de 1 a 100 veces la
cantidad teórica necesaria para unir todo el receptor inmovilizado o
ligando inmovilizado en la mezcla de incubación. La incubación se
lleva a cabo adecuadamente a una temperatura de cuatro a 37ºC,
preferiblemente de cuatro a 25ºC, durante un tiempo de 2 min a 24
horas, preferiblemente de 1 a 12 horas.
Una vez completada la incubación, el complejo
ligando marcado-receptor inmovilizado o receptor
marcado-ligando inmovilizado se lava entonces para
eliminar el exceso de ligando marcado o de receptor marcado no
unido. El lavado puede llevarse a cabo por medio de cualquier
técnica convencional en la que, el medio líquido que rodea al
complejo ligando marcado-receptor inmovilizado o
receptor marcado-ligando inmovilizado y que contiene
el exceso de ligando marcado o el exceso de receptor marcado, es
reemplazado por medio líquido que no contiene ligando marcado o
receptor marcado. Típicamente, este lavado se lleva a cabo usando el
mismo tipo de tampones acuosos usados en la etapa de incubación.
El lavado puede llevarse a cabo por etapas usando
un procedimiento iterativo en el que: (i) el ligando
marcado-receptor inmovilizado o el receptor
marcado-ligando inmovilizado se separa (mediante,
por ejemplo, filtración, decantación, etc.) del medio líquido usado
en la incubación; (ii) el complejo separado ligando
marcado-receptor inmovilizado o receptor
marcado-ligando inmovilizado se expone entonces y se
incuba en nuevo medio líquido que no contiene nada de ligando
marcado ni receptor marcado; (iii) el complejo ligando
marcado-receptor inmovilizado o receptor
marcado-inmovilizado se separa de nuevo del medio
líquido de la etapa (ii); y (iv) se repiten las etapas (ii) y (iii)
hasta que el lavado se complete. Alternativamente, el lavado puede
llevarse a cabo de una forma continua. Por ejemplo, el complejo
ligando marcado-receptor inmovilizado o receptor
marcado-ligando inmovilizado puede introducirse en
una columna, y por la columna se hace pasar un medio líquido que no
contiene ligando marcado ni receptor marcado. Es posible controlar
el lavado mediante, por ejemplo, la medida de la cantidad de señal
presente en el medio líquido que se separa del complejo
ligando-receptor en la etapa (iii) del procedimiento
iterativo descrito anteriormente o del medio líquido que sale de la
columna en el procedimiento continuo descrito anteriormente.
Una vez completada la etapa de lavado, el ligando
marcado-receptor inmovilizado o el receptor
marcado-ligando inmovilizado lavado se liofiliza. La
liofilización puede llevarse a cabo usando cualquier aparato de
liofilización convencional. Algunas técnicas y aparatos de
liofilización se describen en Flosdorf, E. W.,
Freeze-Drying, Reinhold Publishing Corp.,
Nueva York (1949); Harris, R. J. C., ed., Biological Applications
of Freezing and Drying, Academic Press, Nueva York (1954);
Parkes and Smith, eds., Recent Research in Freezing and
Drying, Blackwell Oxford (1960); Meryman, H. T.,
"Freeze-Drying", en Cryobiology,
Meryman, ed., Academic Press, Nueva York (1966); y
Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical
Technology, 3ª ed., vol. 8, págs. 109-110,
Wiley, Nueva York (1979).
En algunas formas de realización es preferible
que la liofilización del complejo ligando
marcado-receptor inmovilizado o receptor
marcado-ligando inmovilizado se lleve a cabo en
presencia de un crioprotector. Algunos crioprotectores adecuados
incluyen disacáridos, polisacáridos, glicerol, proteínas,
tensioactivos, suero, las formulaciones tamponadas mencionadas
previamente para la liofilización de proteínas, polietilenglicol y
dimetilsulfóxido. Dichos crioprotectores y la liofilización usando
dichos crioprotectores se describen en las patentes de EE.UU.
n^{os} 5.200.399, 5.192.743, 5.089.181, 5.071.598, 4.963.362,
4.931.361, 4.915.951, 4.897.353 y 4.806.343. Típicamente, el
crioprotector se mezclará con la muestra que contiene el medio
líquido y el complejo ligando marcado-receptor
inmovilizado o receptor marcado-ligando inmovilizado
antes de la liofilización. Aunque la cantidad exacta de
crioprotector dependerá, en parte, de la identidad del crioprotector
y de la sensibilidad del par ligando-receptor en
particular, el crioprotector está presente habitualmente en una
cantidad suficiente para reemplazar las moléculas de agua asociadas
con el complejo ligando-receptor. La cantidad
preferible de crioprotector puede determinarse experimentalmente
probando un intervalo de concentraciones para un sistema dado y
determinando qué concentración da los mejores resultados, con
respecto a la actividad del sistema rehidratado. Los crioprotectores
preferibles son trealosa, glucosa y lisina.
El procedimiento descrito anteriormente da lugar
a un reactivo seco que comprende un ligando marcado o un receptor
marcado unido a un receptor complementario o a un ligando
complementario, en el que el receptor complementario o el ligando
complementario está inmovilizado sobre un soporte sólido.
El uso de los reactivos secos de la presente
invención se escribirá más completamente a continuación con respecto
a los ensayos llevados a cabo en inmunosensores de flujo o en placas
de microtitulación. Sin embargo, debe entenderse que los reactivos
secos de la presente invención pueden utilizarse asimismo en otros
tipos de ensayos y aparatos.
Según se mencionó anteriormente, el aparato y las
condiciones para llevar a cabo un ensayo con un inmunosensor de
flujo se describen en la patente EE.UU. nº 5.183.740. En dichos
ensayos la muestra que contiene el analito se hace pasar típicamente
a través de una columna que contiene un complejo ligando
marcado-receptor inmovilizado, y la cantidad de
ligando marcado desplazado por el analito se detecta en la fase
líquida que sale de la columna.
Para utilizar el presente reactivo seco en dicho
aparato sólo es necesario rehidratar el reactivo seco antes de pasar
la muestra a través de la columna. Además, el reactivo seco puede
rehidratarse antes o después del empaquetamiento de la columna. De
hecho, también es posible llevar a cabo las etapas de lavado y
liofilización después de que la columna haya sido empaquetada. Por
tanto, en una forma de realización preferible, la columna se
proporciona al consumidor conteniendo ya el complejo
ligando-receptor liofilizado. Para maximizar la
sensibilidad de este tipo de ensayo, el reactivo seco de la columna
debería rehidratarse antes de hacer pasar la muestra a través de la
columna. El reactivo seco puede rehidratarse con agua o con un
tampón acuoso.
Alternativamente, el presente reactivo seco puede
usarse en un ensayo en el que se mide la cantidad de ligando marcado
o de receptor marcado que permanece unida a su compañero de unión
inmovilizado. Una forma de realización preferible de dicho ensayo es
llevarlo a cabo usando una placa de microtitulación en la que los
pocillos de la placa contienen el presente reactivo seco. En una
forma de realización particularmente preferible, los pocillos de la
placa de microtitulación son el soporte sólido sobre el que se
inmovilizan el receptor inmovilizado o el ligando inmovilizado. En
esta forma de realización la muestra puede añadirse directamente a
los pocillos de la placa y después incubarse. El tiempo de
incubación por elegirse según convenga, pero habitualmente es de 1 a
60 min. Con un tiempo de incubación largo, este ensayo se aproxima a
un sistema en el que la unión competitiva del analito y del ligando
marcado o el receptor marcado al compañero de unión inmovilizado
está en equilibrio. Una característica ventajosa de esta forma de
realización es que la muestra también puede servir como el medio
líquido para rehidratar el reactivo seco.
Una vez completada la incubación, el medio
líquido (es decir, la muestra) se extrae de los pocillos, y se mide
la cantidad ligando marcado o receptor marcado que permanece en el
pocillo. Por supuesto, también es posible medir la cantidad de
ligando marcado o de receptor marcado presente en el medio líquido
extraído de los pocillos.
Esta forma de realización puede llevarse a cabo
usando cualquier placa de microtitulación convencional y cualquier
medio convencional de adición y extracción del líquido de los
pocillos de la placa. Alternativamente, es posible usar una placa,
tal como la descrita en la patente EE.UU. nº 4.777.021. En este tipo
de placa los pocillos descansan sobre una cámara de desechos
conectada a un medio de vacío, y el fondo de cada pocillo es una
membrana a través de la cual el fluido puede extraerse tras la
aplicación de vacío. Por tanto, con este tipo de placa, el líquido
puede extraerse mediante filtración con succión.
Típicamente, las placas de microtitulación
contienen 96 pocillos. Esto significa que una única placa podría
usarse para aprobar una dilución seriada de muchas muestras, y
también contener suficientes pocillos para los estándares
internos.
Las muestras usadas en los presentes ensayos
pueden ser de cualquier origen y pueden incluir incluso aquéllas que
originalmente son sólidas o aerotransportadas, siempre que puedan
disolverse, suspenderse o capturarse en un medio líquido adecuado
para su uso en los presentes ensayos. Cuando la muestra es de origen
biológico, fluidos tales como sangre, suelo, saliva, líquido
cefalorraquídeo, orina, sudor, líquido amniótico, extractos de los
mismos, etc., son adecuadas para la prueba. Algunos ejemplos de
otros tipos de muestras incluyen agua del suelo, aerosoles, fluidos
de tomadores de muestras aéreas (tales como ciclones o dispositivos
de impacto), extractos líquidos de sólidos (suciedad, alimentos,
tejidos, etc.), caldos de fermentación y corrientes de desecho de
fábricas.
La detección de la señal generada por el marcaje
en el ligando marcado o el receptor marcado que ha sido desplazado
de o permanece unido al compañero de unión inmovilizado puede
llevarse a cabo mediante cualquier medio convencional. Por supuesto,
la elección del detector dependerá de la naturaleza del marcaje.
El tipo de ensayos que pueden realizarse como
ensayos de desplazamiento incluyen, pero no se limitan a,
radioinmunoensayos, ensayos de inmunoabsorción con enzima ligada
(ELISA), ensayos de fluorescencia, ensayos basados en biosensores
(mostrados usando el inmunosensor de flujo y el biosensor de fibra
óptica), ensayos de inyección de flujo, análisis de "inmersión de
la varilla", inmunoensayos por ondas acústicas, análisis
piezoeléctricos, ensayos de resonancia de plasmones de superficie,
ensayos luminiscentes y análisis electroquímicos.
La presente invención también proporciona nuevos
kits que contienen el presente reactivo seco liofilizado para su uso
en los presentes ensayos de desplazamiento. Dichos kits contendrán
un medio recipiente que contiene el presente reactivo seco
liofilizado. El medio recipiente puede ser cualquier recipiente
adecuado, pero típicamente será un vial o un frasco de vidrio, un
envase de plástico, etc.. En algunas formas de realización, el medio
recipiente puede ser una bolsa de aluminio o de plástico que
contiene el reactivo seco inmovilizado sobre una placa de
microtitulación. En otras formas de realización, el medio recipiente
puede ser un tubo de plástico, de vidrio o de metal que contiene el
reactivo seco, y el tubo puede poseer un medio de entrada en un
extremo y un medio de salida en el otro extremo; este tipo de medio
recipiente puede usarse como columna en un inmunosensor de flujo, y
puede estar contenido en un segundo medio recipiente.
El kit puede comprender además una muestra de
control negativa. Dicha muestra de control negativa contendrá o nada
de analito o una cantidad muy pequeña de analito. El kit también
puede comprender una muestra de control positiva, que comprenderá,
típicamente, una cantidad de analito que es igual o mayor a la
cantidad de analito que se considera un resultado positivo. El kit
también puede contener productos químicos tales como tampones o
diluyentes, y medios para manipular la muestra, tales como pipetas,
viales de reacción, vasijas, tubos o filtros.
Además, el kit puede comprender unas
instrucciones escritas en un papel separado, o cualquiera de los
medios recipiente, o cualquier otro envase. Estas instrucciones
establecerán habitualmente las condiciones para llevar a cabo el
ensayo de desplazamiento, tales como proporciones de mezcla,
cantidades, tiempos de incubación, etc., y los criterios para
evaluar los resultados del ensayo, incluyendo diagramas de
color.
La presente invención reduce significativamente
tanto el tiempo como el número de etapas implicadas para que un
operador realice un inmunoensayo de desplazamiento. La capacidad de
liofilizar y rehidratar el receptor (o ligando) con el ligando (o
receptor) marcado, sin disociar el complejo, es una característica
nueva. La presente invención significa que los materiales de un
conjunto de ensayos o kits pueden prepararse (en cantidad) y
almacenarse hasta que sean necesarios.
Una parte crítica de la preparación inicial de
los materiales es el lavado del ligando marcado no unido antes de la
liofilización. Dado que el operador del ensayo no tiene que realizar
una etapa de lavado en el momento de la rehidratación, su operación
es más rápida y menos complicada. Consecuentemente, los presentes
ensayos son más susceptibles de automatización y uso en
biosensores.
Adicionalmente, hay una menor variación en el
fondo procedente del ligando (o receptor) marcado no unido si los
materiales de muchos ensayos se lavan simultáneamente que si los
materiales de cada ensayo individual se lavan por separado.
Según se expuso anteriormente, antes de la
presente invención, el artesano experto no habría esperado que un
complejo ligando-receptor permaneciera intacto tras
la liofilización y la rehidratación. Según se muestra en el Ejemplo
2, descrito a continuación, la rehidratación con un líquido que
contiene el analito da como resultado un aumento en el
desplazamiento del antígeno marcado según aumenta el tiempo de
incubación. Si el ligando marcado y el receptor inmovilizado
estuvieran disociados en el estado liofilizado, se habría observado
el efecto opuesto.
Habiendo descrito de forma general esta
invención, puede obtenerse una comprensión adicional mediante
referencia a ciertos ejemplos específicos que se proporcionan en
este documento únicamente con propósitos ilustrativos, y que no
pretenden ser limitantes salvo que se especifique de otro modo.
- 1)
- Transferir 1,0 ml de perlas de vidrio de poro controlado (de 24,2 nm de tamaño de poro), recubiertas con anticuerpo anti-benzoilecgonina, a una jeringa de 5 cm^{3} con un tubo de vidrio.
- 2)
- Extraer el tampón de la matriz con un aspirador de vacío.
- 3)
- Aplicar una disolución de benzoilecgonina-Cy5 (300 - exceso molar) directamente a las perlas de vidrio. El Cy5 es un colorante fluorescente vendido por BDS and Research Organics. (La disolución de benzoilecgonina-Cy5 debería estar en PBS, pH 7,3, con una proporción de volumen del lecho proporcional al lecho de la matriz).
- 4)
- Taponar la jeringa para mezclar uniformemente la matriz con él antígeno fluorescente.
- 5)
- Saturar la columna con fluoróforo hasta el día siguiente a 4ºC.
- 6)
- Preparar las concentraciones apropiadas de tampones de trealosa-fosfato.
- A)
- trealosa 50 mM + fosfato 50 mM, pH 7,3
- B)
- sin trealosa + fosfato 50 mM, pH 7,3
- 7)
- Vaciar la columna del exceso de benzoilecgonina-Cy5 por gravedad. Recoger el exceso en un tubo de15 ml).
\newpage
- 8)
- Aplicar 1,0 ml de PBS, pH 7,3, de PBS, pH 7,3, (3 X) a la columna para lavar en exceso. (Guardar todas las fracciones de benzoilecgonina-Cy5 recogidas).
- 9)
- Añadir 1,0 ml de tampón PBS a la matriz.
- 10)
- Alicuotar 100 \mul de perlas de vidrio en microcolumnas separadas.
- 11)
- Vaciar cada columna de tampón por gravedad.
- 12)
- Añadir 0,5 ml de cada fosfato, con o sin trealosa, a las respectivas columnas.
- 13)
- Vaciar las columnas de los tampones por gravedad dejando un volumen de cabeza mínimo.
- 14)
- Taponar la parte inferior y la parte superior de la columna.
- 15)
- Colocar las columnas en un congelador (-70ºC) durante 10 minutos.
- 16)
- Retirar las columnas del congelador. Reemplazar los tapones superiores por una tira de parafilm.
- 17)
- Colocar las columnas en un recipiente de liofilización para su criodesecación hasta el día siguiente. (Cubrir el recipiente con aluminio para evitar la fotodegradación del colorante).
- 18)
- Retirar las columnas del liofilizador y almacenar desecadas.
- 19)
- Añadir entre 0,3 ml y 1,0 ml de PBS para rehidratar la matriz.
- 20)
- Dejar reposar la matriz y extraer el sobrenadante.
- 21)
- Añadir de 0,5 a 1,0 ml de PBS a la matriz.
- 22)
- Fijar la columna a un sistema de flujo continuo.
- 23)
- introducir varias concentraciones de benzoilecgonina (BE) en las columnas y medir el desplazamiento de la benzoilecgonina-Cy5 en la columna.
- 24)
- La columna liofilizada, en presencia de trealosa, dio unos resultados comparables a una columna no liofilizada. Por el contrario, según se muestra mediante los resultados de la Figura 1, la columna liofilizada sin trealosa no generó una señal de desplazamiento tras la introducción de la benzoilecgonina, indicando que el antígeno marcado no permanecía unido durante la liofilización y la rehidratación en ausencia del crioprotector. En la Figura 1, los experimentos que usaron las columnas preparadas usando el tampón A de la etapa 6) están representados por \blacktriangle, mientras que los experimentos que usaron las columnas preparadas usando el tampón B están representados por O.
El objetivo de este ensayo es preparar
anticuerpos inmovilizados que estén presaturados con antígenos
marcados, lavados y criodesecados en un formato de placa de
microtitulación de 96 pocillos, y mostrar el uso de dichas placas
preparadas en un inmunoensayo. Estas placas de ensayo se usan
rutinariamente en las pruebas de investigación y de diagnóstico, y
permiten el tratamiento paralelo de muchas muestras (o parámetros)
al mismo tiempo.
Se adsorbió un anticuerpo monoclonal específico
para el metabolito de la cocaína (benzoilecgonina) en los pocillos
de una placa de ensayo a una concentración de 4 microgramos/ml hasta
el día siguiente. Las placas se lavan para eliminar el exceso de
anticuerpo y se saturan con el metabolito de la cocaína
(benzoilecgonina) marcado fluorescentemente a una concentración de 5
micromolar durante 2 horas. Las placas se lavan entonces para
eliminar el exceso de colorante, y los pocillos se llenan entonces
con una disolución de tampón fosfato 50 milimolar, pH 7,4, que
contiene trealosa 50 milimolar. Las placas se congelan entonces
rápidamente en una disolución de hielo seco/metanol, y se
deshidratan en la estantería del liofilizador durante 24 horas.
Las muestras se añadieron directamente a los
pocillos de la placa (por triplicado). Las muestras contenían bien
nada de fármaco o bien fármaco (benzoilecgonina, BE) a unas
concentraciones de entre 15-250 nanogramos/ml en
PBS. Las muestras se incubaron durante bien 5 o bien 30 minutos, se
aspiraron y se inyectaron a través del espectrofluorímetro Jasco.
Las áreas de señal se obtuvieron a partir de un integrador
Hewlett-Packard fijado al fluorímetro. Los
resultados se muestran en la Figura 2, en la que las señales
mostradas son después de restar los niveles de fondo (sin fármaco).
Los resultados de los experimentos de incubación de 5 minutos están
indicados mediante \blacksquare, y los resultados de los
experimentos de incubación de 30 minutos están indicados mediante
\blacktriangle. Las barras de error representan el EEM.
Obviamente, son posibles numerosas modificaciones
y variaciones de la presente invención a la luz de las anteriores
enseñanzas. Debe entenderse por tanto que, dentro del ámbito de las
reivindicaciones anexas, la invención puede llevarse a la práctica
de otro modo al descrito específicamente en este documento.
Claims (22)
1. Un complejo ligando-receptor
liofilizado, preparado mediante un procedimiento que comprende:
- (i)
- unir un ligando marcado o un receptor marcado a un receptor inmovilizado o a un ligando inmovilizado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado;
- (ii)
- lavar dicho complejo ligando-receptor inmovilizado para eliminar cualquier exceso de ligando marcado o cualquier exceso de receptor marcado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado lavado; y
- (iii)
- liofilizar dicho complejo ligando-receptor inmovilizado lavado para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado liofilizado,
en el que dicha liofilización se lleva a cabo en
presencia de un crioprotector.
2. El complejo ligando-receptor
liofilizado de la Reivindicación 1, en el que la etapa (i) se lleva
a cabo uniendo un antígeno marcado o un hapteno marcado a un
anticuerpo inmovilizado, y en el que dicho complejo
ligando-receptor inmovilizado liofilizado es un
complejo antígeno marcado-anticuerpo inmovilizado
liofilizado o un complejo hapteno marcado-anticuerpo
inmovilizado liofilizado.
3. El complejo ligando-receptor
liofilizado de la Reivindicación 1, en el que dicho crioprotector se
elige del grupo formado por disacáridos, polisacáridos, glicerol,
proteínas, tensioactivos, suero, tampones, polietilenglicol y
dimetilsulfóxido.
4. El complejo ligando-receptor
liofilizado de la Reivindicación 1, en el que dicho receptor
inmovilizado o ligando inmovilizado es capaz de unirse
específicamente a un analito elegido del grupo formado por el
anticuerpo del receptor de la acetilcolina, antígenos de adenovirus,
anticuerpos contra adenovirus, aldosterona, fosfatasa ácida,
alfa-1-fetoproteína, enzima
conversora de la angiotensina, anticuerpos antiADN, anticuerpos
antimitocondriales,
beta-2-microglobulina, isoenzimas de
la creatina cinasa, isoenzimas de la lactato deshidrogenasa,
componentes del complemento, antígenos de clamidia, anticuerpos
contra clamidia, cortisol, péptido C, AMP cíclico, eritropoyetina,
estradiol, ferritina, ácido fólico, hormona foliculoestimulante,
gastrina, glucagón, hormona del crecimiento, antígenos de
histocompatibilidad, antígenos sanguíneos A y B, haptoglobina,
anticuerpos contra hepatitis A y B, antígenos de la hepatitis A y B,
anticuerpos contra el herpes, antígenos del herpes, gonadotropina
coriónica humana, antígenos del VIH, anticuerpos contra el VIH,
anticuerpos contra la insulina, insulina, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM,
antígenos de H. influenzae, anticuerpos contra el virus de
H. influenzae, anticuerpos del factor intrínseco, antígenos
de Borrelia burgdorferi, anticuerpos contra Borrelia
burgdorferi, hormona luteinizante, metirapona, mioglobina,
enolasa específica de neuronas, p24, polipéptido pancreático,
hormona paratioridea, lactógeno placentario, progesterona,
prolactina, antígeno específico prostático, antígenos de rotavirus,
anticuerpos contra rotavirus, anticuerpos contra rubela, salmonela,
serotonina, somatomedina-C, T_{3}, T_{4},
testosterona, tiroglobulina, hormona estimulante del tiroides,
tiroxina, globulina de unión a tiroxina, transferrina,
triyodotironina, polipéptido intestinal vasoactivo, vitaminas
B_{6} y B_{12}, antígenos de estafilococos, anticuerpos contra
estafilococos, enterotoxinas, ricino, endotoxina, toxina botulínica,
venenos, anfetamina, metanfetamina, fenobarbital, cocaína,
metadona, metacualona, opiáceos (morfina, heroína),
tetrahidrocanabinol (THC), fenciclidina (PCP), dietilamida del ácido
lisérgico (LSD), esteroides anabolizantes, fenilbutazona, amicacina,
azidotimidina, benzodiacepinas (diacepam y clordiacepóxido),
carbamacina, cloranfenicol, ciclosporina, digitoxina, digoxina,
etosuximida, gentamicina, imipramina, lidocaína, fenitoína,
primidona, procainamida, propoxifeno, propranolol, quinidina,
teofilina, tobramicina, ácido valproico, trinitrotolueno, ciclonita,
tetranitrato de pentaeritritol, ácido pícrico, nitroglicerina,
herbicidas, insecticidas, bifenilos policlorados, hidrocarburos
poliaromáticos, metales pesados, glucosa, antígeno F1 de Y.
pestis, factor letal o antígeno PA de B. antracis
y micotoxinas.
5. Un procedimiento para preparar un complejo
ligando-receptor liofilizado, que comprende:
- (i)
- unir un ligando marcado o un receptor marcado a un receptor inmovilizado o a un ligando inmovilizado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado;
- (ii)
- lavar dicho complejo ligando-receptor inmovilizado para eliminar cualquier exceso de ligando marcado o cualquier exceso de receptor marcado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado lavado; y
- (iii)
- liofilizar dicho complejo ligando-receptor inmovilizado lavado para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado liofilizado,
en el que dicha liofilización se lleva a cabo en
presencia de un crioprotector.
6. El procedimiento de la Reivindicación 5, en el
que la etapa (i) se lleva a cabo uniendo un antígeno marcado o un
hapteno marcado a un anticuerpo inmovilizado, y en el que dicho
complejo ligando-receptor inmovilizado liofilizado
es un complejo antígeno marcado-anticuerpo
inmovilizado liofilizado o un complejo hapteno
marcado-anticuerpo inmovilizado liofilizado.
7. El procedimiento de la Reivindicación 5, en el
que dicho crioprotector se elige del grupo formado por disacáridos,
polisacáridos, glicerol, proteínas, tensioactivos, suero, tampones,
polietilenglicol y dimetilsulfóxido.
8. El procedimiento de la Reivindicación 5, en el
que dicho receptor inmovilizado o ligando inmovilizado es capaz de
unirse específicamente a un analito elegido del grupo formado por el
anticuerpo del receptor de la acetilcolina, antígenos de adenovirus,
anticuerpos contra adenovirus, aldosterona, fosfatasa ácida,
alfa-1-fetoproteína, enzima
conversora de la angiotensina, anticuerpos antiADN, anticuerpos
antimitocondriales,
beta-2-microglobulina, isoenzimas de
la creatina cinasa, isoenzimas de la lactato deshidrogenasa,
componentes del complemento, antígenos de clamidia, anticuerpos
contra clamidia, cortisol, péptido C, AMP cíclico, eritropoyetina,
estradiol, ferritina, ácido fólico, hormona foliculoestimulante,
gastrina, glucagón, hormona del crecimiento, antígenos de
histocompatibilidad, antígenos sanguíneos A y B, haptoglobina,
anticuerpos contra hepatitis A y B, antígenos de la hepatitis A y B,
anticuerpos contra el herpes, antígenos del herpes, gonadotropina
coriónica humana, antígenos del VIH, anticuerpos contra el VIH,
anticuerpos contra la insulina, insulina, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM,
antígenos de H. influenzae, anticuerpos contra el virus de
H. influenzae, anticuerpos del factor intrínseco, antígenos
de Borrelia burgdorferi, anticuerpos contra Borrelia
burgdorferi, hormona luteinizante, metirapona, mioglobina,
enolasa específica de neuronas, p24, polipéptido pancreático,
hormona paratioridea, lactógeno placentario, progesterona,
prolactina, antígeno específico prostático, antígenos de rotavirus,
anticuerpos contra rotavirus, anticuerpos contra rubela, salmonela,
serotonina, somatomedina-C, T_{3}, T_{4},
testosterona, tiroglobulina, hormona estimulante del tiroides,
tiroxina, globulina de unión a tiroxina, transferrina,
triyodotironina, polipéptido intestinal vasoactivo, vitaminas
B_{6} y B_{12}, antígenos de estafilococos, anticuerpos contra
estafilococos, enterotoxinas, ricino, endotoxina, toxina botulínica,
venenos, anfetamina, metanfetamina, fenobarbital, cocaína,
metadona, metacualona, opiáceos (morfina, heroína),
tetrahidrocanabinol (THC), fenciclidina (PCP), dietilamida del ácido
lisérgico (LSD), esteroides anabolizantes, fenilbutazona, amicacina,
azidotimidina, benzodiacepinas (diacepam y clordiacepóxido),
carbamacina, cloranfenicol, ciclosporina, digitoxina, digoxina,
etosuximida, gentamicina, imipramina, lidocaína, fenitoína,
primidona, procainamida, propoxifeno, propranolol, quinidina,
teofilina, tobramicina, ácido valproico, trinitrotolueno, ciclonita,
tetranitrato de pentaeritritol, ácido pícrico, nitroglicerina,
herbicidas, insecticidas, bifenilos policlorados, hidrocarburos
poliaromáticos, metales pesados, glucosa, antígeno F1 de Y.
pestis, factor letal o antígeno PA de B. antracis
y micotoxinas.
9. Un reactivo seco liofilizado, que comprende
(a) un ligando marcado o un receptor marcado unido a (b) un receptor
complementario o a un ligando complementario, en el que dicho
receptor complementario o ligando complementario está inmovilizado
sobre un soporte sólido, en el que dicho reactivo seco liofilizado
se prepara mediante liofilización en presencia de un
crioprotector.
10. El reactivo seco de la Reivindicación 9, que
comprende un antígeno marcado o un hapteno marcado unido a un
anticuerpo complementario, en el que dicho anticuerpo complementario
está inmovilizado sobre un soporte sólido.
11. El reactivo seco liofilizado de la
Reivindicación 9, en el que dicho receptor inmovilizado o ligando
inmovilizado es capaz de unirse específicamente a un analito elegido
del grupo formado por el anticuerpo del receptor de la acetilcolina,
antígenos de adenovirus, anticuerpos contra adenovirus, aldosterona,
fosfatasa ácida,
alfa-1-fetoproteína, enzima
conversora de la angiotensina, anticuerpos antiADN, anticuerpos
antimitocondriales,
beta-2-microglobulina, isoenzimas de
la creatina cinasa, isoenzimas de la lactato deshidrogenasa,
componentes del complemento, antígenos de clamidia, anticuerpos
contra clamidia, cortisol, péptido C, AMP cíclico, eritropoyetina,
estradiol, ferritina, ácido fólico, hormona foliculoestimulante,
gastrina, glucagón, hormona del crecimiento, antígenos de
histocompatibilidad, antígenos sanguíneos A y B, haptoglobina,
anticuerpos contra hepatitis A y B, antígenos de la hepatitis A y B,
anticuerpos contra el herpes, antígenos del herpes, gonadotropina
coriónica humana, antígenos del VIH, anticuerpos contra el VIH,
anticuerpos contra la insulina, insulina, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM,
antígenos de H. influenzae, anticuerpos contra el virus de
H. influenzae, anticuerpos del factor intrínseco, antígenos
de Borrelia burgdorferi, anticuerpos contra Borrelia
burgdorferi, hormona luteinizante, metirapona, mioglobina,
enolasa específica de neuronas, p24, polipéptido pancreático,
hormona paratioridea, lactógeno placentario, progesterona,
prolactina, antígeno específico prostático, antígenos de rotavirus,
anticuerpos contra rotavirus, anticuerpos contra rubela, salmonela,
serotonina, somatomedina-C, T_{3}, T_{4},
testosterona, tiroglobulina, hormona estimulante del tiroides,
tiroxina, globulina de unión a tiroxina, transferrina,
triyodotironina, polipéptido intestinal vasoactivo, vitaminas
B_{6} y B_{12}, antígenos de estafilococos, anticuerpos contra
estafilococos, enterotoxinas, ricino, endotoxina, toxina botulínica,
venenos, anfetamina, metanfetamina, fenobarbital, cocaína,
metadona, metacualona, opiáceos (morfina, heroína),
tetrahidrocanabinol (THC), fenciclidina (PCP), dietilamida del ácido
lisérgico (LSD), esteroides anabolizantes, fenilbutazona, amicacina,
azidotimidina, benzodiacepinas (diacepam y clordiacepóxido),
carbamacina, cloranfenicol, ciclosporina, digitoxina, digoxina,
etosuximida, gentamicina, imipramina, lidocaína, fenitoína,
primidona, procainamida, propoxifeno, propranolol, quinidina,
teofilina, tobramicina, ácido valproico, trinitrotolueno, ciclonita,
tetranitrato de pentaeritritol, ácido pícrico, nitroglicerina,
herbicidas, insecticidas, bifenilos policlorados, hidrocarburos
poliaromáticos, metales pesados, glucosa, antígeno F1 de Y.
pestis, factor letal o antígeno PA de B. antracis
y micotoxinas.
12. Un ensayo de desplazamiento para detectar un
analito en una muestra, que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra que puede contener dicho analito con un complejo ligando- receptor inmovilizado preparado mediante un procedimiento que comprende:
- (i)
- unir un ligando marcado o un receptor marcado a un receptor inmovilizado o a un ligando inmovilizado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado;
- (ii)
- lavar dicho complejo ligando-receptor inmovilizado para eliminar cualquier exceso de ligando marcado o cualquier exceso de receptor marcado, para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado lavado;
- (iii)
- liofilizar dicho complejo ligando-receptor inmovilizado lavado para obtener un complejo ligando-receptor inmovilizado liofilizado, en el que dicha liofilización se lleva a cabo en presencia de un crioprotector; y
- (iv)
- rehidratar dicho complejo ligando-receptor inmovilizado liofilizado; y
- (b)
- medir (1) la cantidad de ligando marcado o de receptor marcado desplazado de dicho receptor inmovilizado o de dicho ligando inmovilizado, o (2) la cantidad de ligando marcado o de receptor marcado que permanece unido a dicho receptor inmovilizado o a dicho ligando inmovilizado.
13. El ensayo de desplazamiento de la
Reivindicación 12, en el que la etapa (i) se lleva a cabo uniendo un
antígeno marcado o un hapteno marcado a un anticuerpo inmovilizado,
y en el que dicho complejo ligando-receptor
inmovilizado liofilizado es un complejo antígeno
marcado-anticuerpo inmovilizado liofilizado o un
complejo hapteno marcado-anticuerpo inmovilizado
liofilizado.
14. El ensayo de desplazamiento de la
Reivindicación 12, en el que dicho crioprotector se elige del grupo
formado por disacáridos, polisacáridos, glicerol, proteínas,
tensioactivos, suero, tampones, polietilenglicol y
dimetilsulfóxido.
15. El ensayo de desplazamiento de la
Reivindicación 12, en el que dicho receptor inmovilizado o ligando
inmovilizado es capaz de unirse específicamente a un analito elegido
del grupo formado por el anticuerpo del receptor de la acetilcolina,
antígenos de adenovirus, anticuerpos contra adenovirus, aldosterona,
fosfatasa ácida,
alfa-1-fetoproteína, enzima
conversora de la angiotensina, anticuerpos antiADN, anticuerpos
antimitocondriales,
beta-2-microglobulina, isoenzimas de
la creatina cinasa, isoenzimas de la lactato deshidrogenasa,
componentes del complemento, antígenos de clamidia, anticuerpos
contra clamidia, cortisol, péptido C, AMP cíclico, eritropoyetina,
estradiol, ferritina, ácido fólico, hormona foliculoestimulante,
gastrina, glucagón, hormona del crecimiento, antígenos de
histocompatibilidad, antígenos sanguíneos A y B, haptoglobina,
anticuerpos contra hepatitis A y B, antígenos de la hepatitis A y B,
anticuerpos contra el herpes, antígenos del herpes, gonadotropina
coriónica humana, antígenos del VIH, anticuerpos contra el VIH,
anticuerpos contra la insulina, insulina, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM,
antígenos de H. influenzae, anticuerpos contra el virus de
H. influenzae, anticuerpos del factor intrínseco, antígenos
de Borrelia burgdorferi, anticuerpos contra Borrelia
burgdorferi, hormona luteinizante, metirapona, mioglobina,
enolasa específica de neuronas, p24, polipéptido pancreático,
hormona paratioridea, lactógeno placentario, progesterona,
prolactina, antígeno específico prostático, antígenos de rotavirus,
anticuerpos contra rotavirus, anticuerpos contra rubela, salmonela,
serotonina, somatomedina-C, T_{3}, T_{4},
testosterona, tiroglobulina, hormona estimulante del tiroides,
tiroxina, globulina de unión a tiroxina, transferrina,
triyodotironina, polipéptido intestinal vasoactivo, vitaminas
B_{6} y B_{12}, antígenos de estafilococos, anticuerpos contra
estafilococos, enterotoxinas, ricino, endotoxina, toxina botulínica,
venenos, anfetamina, metanfetamina, fenobarbital, cocaína,
metadona, metacualona, opiáceos (morfina, heroína),
tetrahidrocanabinol (THC), fenciclidina (PCP), dietilamida del ácido
lisérgico (LSD), esteroides anabolizantes, fenilbutazona, amicacina,
azidotimidina, benzodiacepinas (diacepam y clordiacepóxido),
carbamacina, cloranfenicol, ciclosporina, digitoxina, digoxina,
etosuximida, gentamicina, imipramina, lidocaína, fenitoína,
primidona, procainamida, propoxifeno, propranolol, quinidina,
teofilina, tobramicina, ácido valproico, trinitrotolueno, ciclonita,
tetranitrato de pentaeritritol, ácido pícrico, nitroglicerina,
herbicidas, insecticidas, bifenilos policlorados, hidrocarburos
poliaromáticos, metales pesados, glucosa, antígeno F1 de Y.
pestis, factor letal o antígeno PA de B. antracis
y micotoxinas.
16. El ensayo de desplazamiento de la
Reivindicación 12, en el que dicho contacto comprende hacer fluir
dicha muestra a través de dicho complejo
ligando-receptor inmovilizado a una tasa de flujo
que permita a dicho analito desplazar a dicho ligando marcado o a
dicho receptor marcado de dicho complejo
ligando-receptor en condiciones de no
equilibrio.
17. El ensayo de desplazamiento de la
Reivindicación 16, en el que dicho flujo de dicha muestra a través
de dicho complejo ligando-receptor inmovilizado se
lleva a cabo en una columna.
18. El ensayo de desplazamiento de la
Reivindicación 16, en el que dicho flujo de dicha muestra a través
de dicho complejo ligando-receptor se lleva a cabo a
una tasa de flujo de entre 0,1 y 2,0 mililitros por minuto.
19. El ensayo de desplazamiento de la
Reivindicación 16, en el que dicho flujo de dicha muestra a través
de dicho complejo ligando-receptor se lleva a cabo a
una tasa de flujo de entre 0,3 y 0,8 mililitros por minuto.
20. Un kit, que comprende un reactivo seco
liofilizado que comprende (a) un ligando marcado o un receptor
marcado unido a (b) un receptor complementario o a un ligando
complementario, en el que dicho receptor complementario o ligando
complementario está inmovilizado sobre un soporte sólido, en el que
dicho reactivo seco liofilizado se prepara mediante liofilización en
presencia de un crioprotector.
21. El kit de la Reivindicación 20, que comprende
un antígeno marcado o un hapteno marcado unido a un anticuerpo
complementario, en el que dicho anticuerpo complementario está
inmovilizado sobre un soporte sólido.
22. El kit de la Reivindicación 20, en el que
dicho receptor complementario o ligando complementario es capaz de
unirse específicamente a un analito elegido del grupo formado por el
anticuerpo del receptor de la acetilcolina, antígenos de adenovirus,
anticuerpos contra adenovirus, aldosterona, fosfatasa ácida,
alfa-1-fetoproteína, enzima
conversora de la angiotensina, anticuerpos antiADN, anticuerpos
antimitocondriales,
beta-2-microglobulina, isoenzimas de
la creatina cinasa, isoenzimas de la lactato deshidrogenasa,
componentes del complemento, antígenos de clamidia, anticuerpos
contra clamidia, cortisol, péptido C, AMP cíclico, eritropoyetina,
estradiol, ferritina, ácido fólico, hormona foliculoestimulante,
gastrina, glucagón, hormona del crecimiento, antígenos de
histocompatibilidad, antígenos sanguíneos A y B, haptoglobina,
anticuerpos contra hepatitis A y B, antígenos de la hepatitis A y B,
anticuerpos contra el herpes, antígenos del herpes, gonadotropina
coriónica humana, antígenos del VIH, anticuerpos contra el VIH,
anticuerpos contra la insulina, insulina, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM,
antígenos de H. influenzae, anticuerpos contra el virus de
H. influenzae, anticuerpos del factor intrínseco, antígenos
de Borrelia burgdorferi, anticuerpos contra Borrelia
burgdorferi, hormona luteinizante, metirapona, mioglobina,
enolasa específica de neuronas, p24, polipéptido pancreático,
hormona paratioridea, lactógeno placentario, progesterona,
prolactina, antígeno específico prostático, antígenos de rotavirus,
anticuerpos contra rotavirus, anticuerpos contra rubela, salmonela,
serotonina, somatomedina-C, T_{3}, T_{4},
testosterona, tiroglobulina, hormona estimulante del tiroides,
tiroxina, globulina de unión a tiroxina, transferrina,
triyodotironina, polipéptido intestinal vasoactivo, vitaminas
B_{6} y B_{12}, antígenos de estafilococos, anticuerpos contra
estafilococos, enterotoxinas, ricino, endotoxina, toxina botulínica,
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