ES2085257T5 - Procedimiento para la inmunocromatografia con particulas coloidales. - Google Patents

Procedimiento para la inmunocromatografia con particulas coloidales.

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ES2085257T5 ES88111134T ES88111134T ES2085257T5 ES 2085257 T5 ES2085257 T5 ES 2085257T5 ES 88111134 T ES88111134 T ES 88111134T ES 88111134 T ES88111134 T ES 88111134T ES 2085257 T5 ES2085257 T5 ES 2085257T5
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS DE ENSAYO DE ENLACE ESPECIFICO MEJORADOS, CONJUNTOS Y DISPOSITIVOS QUE UTILIZAN REACTIVOS DE ENLACE ESPECIFICO CROMATOGRAFICAMENTE MOVILES, MARCADOS CON PARTICULAS COLOIDALES. REACTIVOS DE ENLACE ESPECIFICO MARCADOS CON PARTICULAS COLOIDALES, TALES COMO ORO Y SELENIO, SE PUEDEN SOMETER A RAPIDO TRANSPORTE DE DISOLVENTE CROMATOGRAFICO EN MEDIOS CROMATOGRAFICOS POR MEDIO DE DISOLVENTES ELEGIDOS Y AGENTES QUE FACILITAN EL TRANSPORTE CROMATOGRAFICO. ADEMAS, LA IMPREGNACION DE MATERIALES DE SUBSTRATO SOLIDO CON MATERIALES PROTEINICOS LABILES, INCLUYENDO REACTIVOS MARCADOS CON ENZIMAS Y PARTICULAS COLOIDALES EN PRESENCIA DE PROTEINAS META-SOLUBLES, PROPORCIONA LA RAPIDA SOLUBILIZACION DE LOS MATERIALES QUE SE HAN SECADO EN TALES MATERIALES DE SUBSTRATO.

Description

Procedimiento para la inmunocromatografía con partículas coloidales.
Antecedentes
La presente invención se relaciona en general con dispositivos de ensayo y, concretamente, con aquellos dispositivos que hacen uso de técnicas cromatográficas al realizar ensayos de unión específica. Según un aspecto de la invención, se proporcionan métodos que utilizan materiales de unión específica marcados con partículas coloidales, que son cromatográficamente transportados en presencia de un agente facilitador del transporte cromatográfico, que comprende una proteína meta-soluble tratada químicamente para hacerla más hidrófila que en su forma natural, siendo dicho marcaje capaz de producir señales visualmente detectables. Según otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos y dispositivos que utilizan materiales marcados con partículas coloidales que son secados sobre un medio cromatográfico en presencia de una proteína meta-soluble que actúa como agente facilitador de transporte cromatográfico y son capaces de ser rápidamente solubilizados de nuevo en presencia de un solvente apropiado, tal como la muestra o un solvente de transporte cromatográfico.
Los ensayos inmunológicos han mostrado ser de gran valor en una variedad de aplicaciones clínicas. Dichos ensayos dependen de reacciones de unión específica entre inmunoglobulinas (anticuerpos) y materiales que presentan determinantes antigénicos específicos (antígenos). Los anticuerpos se unen de manera selectiva a materiales ligando que presentan el antígeno para el que son especificamente reactivos y son capaces de distinguir el ligando de otros materiales que tienen características similares.
Dado que los resultados de las reacciones inmunológicas y otras reacciones de unión específica con frecuencia no son directamente observables, se han ideado diversas técnicas para su observación indirecta. Dichas técnicas incluyen el marcaje de uno de los miembros del par de unión especifica con un radioisótopo, cromóforo, fluoróforo o marcaje enzimático. Los radiomarcajes, cromóforos y fluoróforos pueden ser detectados mediante el uso de detectores de radiación, espectrofotómetros o a simple vista. Cuando se marcan los miembros de un par de unión específica con un marcaje enzimático, su presencia puede ser detectada por la activación enzimática de un sistema de reacción en el que se activa un compuesto, tal como un colorante, para producir una señal detectable.
Existen tres tipos bien conocidos de ensayos inmunológicos de unión específica. En los ensayos de unión competitiva, los reactivos marcados y los compuestos analito no marcados compiten por los sitios de unión sobre un material de unión. Después de un periodo de incubación, los materiales no unidos son lavados y eliminados y se compara la cantidad de reactivo marcado unido al sitio con cantidades de referencia para una determinación de la concentración de analito en la solución de la muestra. Un segundo tipo de ensayo inmunológico es conocido como un ensayo en emparedado y, en general, implica el contacto de un material de unión inmunológicamente especifico para ese analito. Después de una etapa de lavado, se añade entonces al ensayo una solución consistente en un segundo material de unión marcado específicamente reactivo con el analito que ha de ser detectado. El segundo material de unión marcado se unirá a cualquier analito que esté a su vez unido al primer material de unión. El sistema de ensayo es ,entonces sometido a una etapa de lavado para separar cualquier segundo material de unión marcado que no haya podido unirse al analito. La cantidad de material marcado que queda puede ser entonces determinada y será indicativa de la cantidad de analito presente en la muestra. Aunque se entiende frecuentemente que el término ensayo en emparedado está relacionado con ensayos inmunológicos en los que. los materiales reactivos primero y marcado son ambos anticuerpos o son ambos antígenos, de tal manera que el "emparedado" es de la forma anticuerpo/antígeno/anticuerpo marcado, se entiende que una más amplia definición del término ensayo de tipo emparedado incluye otros tipos de ensayos de tres componentes, incluyendo lo que a veces se llama "emparedados indirectos", que pueden ser de la forma antígeno/anticuerpo/anticuerpo (anti-inmunoglobulina) marcado.
Un tercer tipo de ensayo inmunológico es el ensayo de aglutinación, que queda ejemplificado por ensayos bien conocidos para antígenos de la sangre y tipos de suero. La reactividad inmunológica entre anticuerpos del suero y antígenos presentados sobre las superficies de las células rojas de la sangre está indicada por la formación de una red entrecruzada tridimensional de antígeno (células rojas de la sangre) y anticuerpos. La aglutinación de la mezcla suero/células rojas de la sangre da lugar a la formación de un gránulo microscópico en el pocillo de ensayo, que puede ser visible a simple vista.
Estos diversos procedimientos de inmunoensayo fueron originalmente realizados como ensayos de "fase líquida" en aparatos tales como tubos de ensayo, en los que se centrifugaban y precipitaban conjugados de antígeno/anticuerpo. Más recientemente, se han desarrollado métodos en los que se depositan anticuerpos o antígenos sobre la superficie de pocillos de microtitulación y las reacciones son llevadas a cabo en solución en dichos pocillos. También se han desarrollado métodos para llevar a cabo ensayos de "fase sólida", en los que las reacciones inmunológicas son llevadas a cabo en solución en substratos sólidos, incluyendo los que son materiales porosos o fibrosos. Según dichos procedimientos, se da forma a los materiales portadores porosos de tiras u otras formas sobre las que se inmovilizan anticuerpos o antígenos por adsorción, absorción o enlace covalente. Los materiales de la muestra que contienen un analito específicamente reactivo con el miembro inmovilizado del par de unión son aplicados al material portador en el que está inmovilizado el analito por reacción con su correspondiente miembro del par de unión. Los materiales de la muestra que. no han reaccionado son entonces eliminados por una etapa de lavado, tras de la cual, en el caso de un ensayo de tipo emparedado, se aplica un reactivo marcado al material portador, que es capaz de reaccionar con y ser inmovilizado por el analito inmovilizado. El material portador es entonces lavado para que la presencia del reactivo marcado y, por lo tanto, del analito, pueda ser detectada.
Se conocen modificaciones de dichos ensayos de "fase sólida" en las que uno o más de los componentes de la muestra o de los reactivos son movidos por medio de transporte por solvente cromatográfico. La Patente EE.UU. Nº 4.168.146 de Grubb y col. describe tiras de ensayo porosas a las que se han inmovilizando anticuerpos. Las tiras son puestas entonces en contacto con cantidades medidas de solución acuosa que contiene el antígeno analito. Las moléculas de antígeno en la solución de ensayo migran por acción capilar a través de la tira de ensayo, pero, debido a que los anticuerpos unidos retrasan la migración de los antígenos para los cuales son específicos, el grado de migración de las moléculas de antígeno a lo largo de un periodo de tiempo fijado es una función de la concentración de antígeno en la solución de ensayo. Las áreas que contienen antígeno del dispositivo diagnóstico son entonces indicadas por la adición de anticuerpos marcados con enzimas o cromóforos fluorescentes.
La Patente EE.UU. Nº 4.517.288 de Giegel y col. describe métodos para llevar a cabo inmunoensayos de fase sólida sobre materiales porosos inertes. La patente describe la inmovilización inmunológica de un material de unión en una zona especificada del material poroso y la aplicación de la muestra a la zona que contiene el material de unión inmovilizado. Se aplica entonces un material indicador marcado con enzima, que se unirá al analito, a la zona en la que quedará inmovilizado en una cantidad correlacionada con la cantidad de analito en la zona. Se aplica entonces un solvente al centro de la zona para separar cromatográficamente el indicador marcado no unido de la zona, de tal manera que la cantidad de indicador marcado que queda en la zona puede ser medida.
Son de interés para la presente invención las descripciones de las Patentes de Deutsch y col. Nº 4.094.647, Nº 4.235.601 y Nº 4.361.537, que se relacionan con ensayos de unión específica inmunológicos y de otros tipos donde los reactivos son transportados por transporte en solvente cromatográfico. Según una realización, un kit de ensayo de unión competitiva radiomarcado consiste en una tira capaz de transportar un líquido de revelado por capilaridad que tiene una primera zona para recibir una muestra, una segunda zona impregnada con un primer reactivo capaz de ser transportado por el liquido de revelado y una tercera zona impregnada con un segundo reactivo. Además, los dispositivos consisten en una zona de medición y un elemento retardante que puede ser el segundo reactivo o el material de la tira. El primer reactivo es capaz de reaccionar con uno del grupo consistente en (1) la muestra, (2) la muestra y el segundo reactivo o (3) el segundo reactivo en competición con la muestra, para formar un producto en una cantidad dependiente de la característica que se está determinando. Se pone en contacto una muestra con la primera zona y se sumerge entonces la tira en el liquido de revelado para dar lugar al transporte de la muestra y el primer reactivo para formar el producto de reacción. El elemento retardante hace más lento el transporte del producto o del primer reactivo (el reactivo móvil) para separar espacialmente los dos y se mide entonces la cantidad del elemento móvil en la localización de
medición.
Las patentes de Deutsch y col. se relacionan con métodos en los que los reactivos localizados en el material cromatográfico son mezclados con el material de la muestra y otros reactivos durante el curso del transporte cromatográfico. Dicha mezcla no es perjudicial y puede incluso ser deseable para los ensayos de unión competitiva. Puede ser, sin embargo, no deseable para ensayos de unión de tipo emparedado en los que es necesario evitar el contacto entre materiales no analitos de la muestra y reactivos de unión específica marcados.
Es de interés para la presente invención la descripción de la Patente EE.UU. 4.452.901 de Gordon, que se relaciona con el uso de soportes porosos de nitrocelulosa para la inmovilización de proteínas. Se describe que dichas láminas de nitrocelulosa pueden ser utilizadas en procedimientos de inmunoensayo si las capacidades de unión residual de las láminas de nitrocelulosa son saturadas por tratamiento de bloqueo con uno o más tipos de proteínas, diferentes de las inmovilizadas y que no tienen reacción cruzada con ninguno de los anticuerpos posteriormente utilizados en el ensayo.
De interés también para los antecedentes de la invención son las descripciones de Gordon, Solicitud EPO 63.810, publicada el 3 de Noviembre de 1982, en relación con dispositivos para llevar a cabo ensayos inmunológicos. Los dispositivos consisten en un soporte sólido poroso que contiene una disposición preseleccionada de áreas de adsorción delimitadas de antígenos, anticuerpos o ambos, donde los sitios de adsorción residual sobre el substrato son saturados por agentes bloqueantes proteicos, tales como seroalbúmina bovina. Los soportes sólidos porosos son seleccionados entre una variedad de polímeros naturales y sintéticos y derivados, pero son preferiblemente láminas de nitrocelulosa de 0,1 mm de grosor con un tamaño de poro de entre aproximadamente 0,15 \mum y aproximadamente 15 \mum. Los antígenos o los anticuerpos son aplicados al soporte sólido poroso por contacto directo, seguido de incubación con agentes bloqueantes. Los ensayos para la detección de antígenos o anticuerpos desconocidos son entonces llevados a cabo a través del uso de anticuerpos marcados, que también pueden ser anticuerpos anti-inmunoglobulinas.
También de interés particular para la presente solicitud es la descripción de EP-A-026232 de Gordon y col., que se relaciona con dispositivos para realizar ensayos de unión específica que utilizan el transporte cromatográfico secuencial de analito y materiales reactivos. Las etapas de lavado y adición son inherentemente llevadas a cabo y se puede programar "microcircuitos" líquidos para realizar una variedad de procedimientos de múltiples etapas y para evitar la mezcla prematura de materiales de la muestra y reactivos. Como soluciones bloqueantes preferidas para el tratamiento de materiales de tira se incluyen gelatina LB 1% (Inotech, Wohlen, suiza) en solución de TBS consistente en NaCl 0,15 M, Tris-HC1 0,02, pH 7,6, o solución de seroalbúmina bovina 3% (BSA) en solución salina fisiológica.
Concretamente, la solicitud de transporte secuencial de Gordon y col. se relaciona con dispositivos que consisten en una tira de ensayo para la detección de un analito en una muestra, consistente en una longitud de material cromatográfico que tiene la capacidad de transporte rápido por solvente cromatográfico de reactivos no inmovilizados y componentes reactivas de la muestra por medio de un solvente cromatográfico seleccionado. La tira incluye un primer extremo en el que comienza el transporte cromatográfico, un segundo extremo en el que finaliza el transporte cromatográfico y una pluralidad de zonas posicionadas entre los dos extremos. Las zonas incluyen una primera zona (impregnada con un primer reactivo que es móvil en el solvente y capaz de reaccionar con, e inmovilizarse contra, el transporte de solvente por el analito cuando el analito está en forma inmovilizada), una segunda zona (para recibir a la muestra sospechosa de contener un analito) y una tercera zona (situada corriente abajo de la primera zona e impregnada con un segundo reactivo inmovilizado contra el transporte de solvente y capaz de reaccionar selectivamente con el analito para hacer que el analito quede en forma inmovilizada en la tercera zona). El dispositivo se caracteriza, además, porque después de que la muestra sea recibida en la segunda zona y después de que el primer extremo haya sido sumergido en el solvente cromatográfico, la movilidad relativa del analito y del primer reactivo o la relación de sitio entre la segunda y la tercera zona es tal que el analito está dispuesto e inmovilizado contra el trasporte de solvente en la tercera zona antes de que el primer reactivo alcance la tercera zona, mediante lo cual los componentes que interfieren de la muestra y los componentes no analito de la muestra que reaccionan con el primer reactivo son eliminados de la tercera zona por transporte por solvente cromatográfico antes del transporte del primer reactivo a la tercera zona. La presencia de primer reactivo inmovilizado en la tercera zona puede ser detectada por medio de marcajes enzimáticos, por radioisótopos u otros marcajes. El dispositivo es particularmente adecuado para uso con reactivos marcados enzimáticamente como substratos enzimáticos y se pueden incorporar reactivos colorantes indicadores en zonas separadas de la tira y transportarlos a la tercera zona en una secuencia apropiada por transporte cromatográfico.
De interés para la presente invención son aquellas referencias relacionadas con el uso de dispersiones de partículas coloidales en procedimientos de ensayo inmunológicos. Frens, Nature, 241, 20-23 (1973) describe métodos para la preparación de soles de oro monodispersos de diversos tamaños de partícula a través de la reducción de cloruro de oro con citrato de sodio acuoso. La variación. en la concentración de citrato de sodio durante la nucleación de las partículas puede ser usada para variar el tamaño de partícula de los soles resultantes. Se describe que los soles de partículas de oro tonodispersas tienen tamaños de partícula que varían entre 16 nm y aproximadamente 150 nm y que exhiben colores que varían del naranja al rojo al violeta en ese rango.
Romano y col., Immunochemistry, 11 521-22 (1974) describen el marcaje de inmunoglobulinas con partículas de oro coloidal para uso en la imagen de antígenos de células rojas de la sangre humanas por medio de microscopia electrónica. El sol de oro, que tiene un diámetro medio de partícula de aproximadamente 3 nm, tiene una tendencia a flocular, pero se estabiliza mediante la presencia de suero de caballo o de BSA.
Geoghegan y col., J. Immuno. Meth., 34 11-21 (1980) describen el revestimiento de partículas de oro coloidal con inmunoglobulinas para uso en procedimientos de aglutinación pasiva. La referencia (en la página 14) describe la resuspensión de conjuntos centrifugados de inmunoglobulinas marcadas con oro con solución salina tamponada con fosfatos (PBS) 0,01 M (pH 7,2) que contiene 1% de polietilenglicol (PEG). La referencia también hace notar que, aunque los complejos de oro-proteína no se agregan durante la centrifugación, están frecuentemente sujetos a agregación no específica en presencia de cualquier proteína seriadamente diluida en una placa de microtitulación.
Surek y col., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 121, 284-289 (1984) describen el uso de partículas de oro coloidal marcadas con proteína A para la detección de antígenos específicos inmovilizados sobre membranas de nitrocelulosa. Según el procedimiento, se mancha con un gel de electroforesis un filtro de nitrocelulosa, que es entonces tratado con una solución al 2% de BSA en PBS para evitar la unión no específica. Se trata el filtro con antisuero o suero preinmune diluido y se lava con PBS-BSA. Se incuba entonces la tira durante 30 a 60 minutos con proteína A conjugada con oro coloidal, que detecta la presencia de anticuerpos no unidos. Se separa entonces el exceso de partículas de oro coloidal no unidas por medio de varios lavados cortos con tampón.
Leuvering, Patente EE.UU. Nº 4.313.734, describe el uso de partículas de sol metálico como marcajes para la determinación in vitro de componentes inmunológicos en un medio de ensayo acuoso. Se describe específicamente kits de inmunoensayo para la detección de antígenos o anticuerpos que emplean uno o más componentes marcados obtenidos por acoplamiento del componente a partículas de una dispersión de sol acuoso de un metal o compuesto metálico que tiene un tamaño de partícula de al menos 5 nm. Según un ejemplo, se lleva a cabo un ensayo para el lactógeno placentario humano (HPL) con el uso de anticuerpos de conejo anti-HPL que han sido marcados con partículas de oro. Se depositan los anticuerpos de conejo anti-HPL no marcados sobre las paredes de los pocillos de placas de microtitulación por incubación con solución de BSA y tampón fosfato al que se ha añadido mertiolato. Se añaden soluciones patrón de HPL a los pocillos y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añade una solución consistente en anticuerpos anti-HPL de conejo que han sido conjugados con partículas de oro que tienen diámetros de entre 45 y 70 nm a los pocillos y se incuba a temperatura ambiente durante la noche. Se lavan entonces los pocillos y se mide la absorción luminosa con un espectrofotómetro de pequeño volumen.
Hsu, Anal. Biochem., 142, 221-225 (1984) describe el uso de sistemas marcadores de inmunooro para procedimientos de inmunoensayo por mancha donde se someten a electroforesis diluciones seriadas de virus del mosaico del tabaco (TMV) purificados en un gel de poliacrilamida y luego se electrotransfieren a láminas de filtro de nitrocelulosa. Las láminas de nitrocelulosa son horneadas para estabilizar la unión y tratadas con suero de cabra normal 5% o en Tween® 20 0,05% en PBS para bloquear la unión no específica de anticuerpos. Se incuba el filtro durante la noche a 4ºC con anticuerpos de conejo anti-TMV diluidos en solución bloqueante, seguido de lavado en PBS y se detecta entonces el complejo antígeno-anticuerpo empapando el filtro el IgG de cabra anti-conejo marcada con oro en solución bloqueante. Según el procedimiento, se puede detectar hasta incluso tan sólo 8 ng de la proteína TMV con una exposición de aproximadamente 30 minutos a la IgG marcada con oro. La referencia también describe que agentes tales como el polietilenglicol, la polivinilpirrolidona y la seroalbúmina bovina pueden aumentar la estabilidad de los marcadores de oro. El uso de Tween® 20 para evitar la unión inespecífica de proteína a la nitrocelulosa está descrito junto con la observación de que un 0,05% de Tween® 20 en PbS puede ser utilizado en el procedimiento de tinción sin alterar la especificidad de los complejos oro-IgG. Se identifica el suero normal de cabra como agente bloqueante preferido a la luz de su tendencia a adsorber partículas de oro que puedan disociarse de la sonda durante el almacenamiento.
Moeremans y col., Solicitud EPO Nº 158.746 describe el uso de partículas metálicas coloidales como marcaje en ensayos de sobrecapa de mancha en emparedado. Los materiales de unión específica específicamente reactivos con el analito que ha de ser detectado son aplicados a tiras de nitrocelulosa y secados. Los sitios de unión de proteína en la tira son entonces bloqueados por medio de tratamiento con seroalbúmina bovina, gelatina, polietilenglicol o Tween® 20. Se aplica entonces el material de la muestra que contiene analito a la tira y se incuba durante 2 horas. Se lava la tira tratada y se seca al aire y se incuba durante 2 horas con un agente de unión específica que ha sido marcado con partículas metálicas coloidales. Según un ejemplo, se detectan anticuerpos anti-tubulina por medio de reactivos marcados con partículas de oro que producen un color rosa-rojizo (partículas de 20 nm) o un color purpúreo (partículas de 40 nm). Se describe que los ensayos tienen una sensibilidad en el orden de 5 ng/\mul.
Es de interés para la presente invención la descripción de Hoye J. Chromatog., 28, 379-384 (1967) en relación con la purificación cromatográfica de productos radioquímicos. Se describe que la aplicación de técnicas de cromatografía en papel, cromatografía en capa fina y electroforesis de alto voltaje mueve iones de oro con grados variables de éxito, pero estas técnicas son generalmente inadecuadas para transportar partículas de oro coloidal.
El uso de materiales colorantes polimerizados en forma coloidal para ensayos de unión específica es también conocido. Es de interés para la presente solicitud la descripción de Hirschfeld, Patente EE.UU. Nº 4.166.105, que se relaciona con reactivos de unión específica marcados que pueden reaccionar con antígenos específicos preparados por unión de moléculas colorantes fluorescentes a anticuerpos específicos de analito a través de polímeros que contienen grupos funcionales reactivos. También de interés para la presente solicitud es la descripción de Henry, Patente EE.UU. Nº 4.452.886, que se relaciona con reactivos de unión específica consistentes en antígenos o anticuerpos unidos a un polímero hidrosoluble consistente esencialmente en una cantidad de entre 40 y 600 monómeros que contienen grupos cromóforos o fluorescentes.
Yost y col., Solicitud de Patente Europea Nº 298.368, que se considera como técnica anterior en los términos del Articulo 54(3) y (4) EPC, describen un inmunoensayo de tipo emparedado, donde se mezcla una muestra de suero de un anticuerpo antitrichina con una solución tamponada de anticuerpo de cabra anti-cerdo marcado con selenio coloidal y caseína y se pone en contacto con una tira de nitrocelulosa que tiene un solo sitio de reacción en el que el antígeno de la trichina está inmovilizado, es excluido.
Mochnal y col., Solicitud de Patente Europea Nº 250.137, que se considera como técnica anterior en los términos del Articulo 54(3) y (4) EPC describen un inmunoensayo de tipo emparedado que emplea una tira de papel cromatográfico que tiene una banda inferior revestida con un anticuerpo anti-hCG y una banda de control/calibración revestida con hCG, donde se mancha con una muestra de sangre completa la tira en la posición entre la banda inferior y el extremo del fondo y se inserta entonces la tira en una solución tamponada de anticuerpo anti-hCG marcado con oro coloidal y seroalbúmina bovina al 4%. Mochnal y col. describen además un inmunoensayo de tipo emparedado que emplea una tira de papel cromatográfico que tiene una banda inferior revestida con antígeno de la rubeola y una banda de control/calibración revestida con IgG humana, donde un extremo de la tira es insertado en una solución tamponada de una muestra de suero y seroalbúmina bovina y donde la tira es entonces transferida a una solución tamponada de anticuerpo de ratón anti-humano marcado con oro coloidal y seroalbúmina bovina al 3,8%.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona mejores métodos, kits y dispositivos de ensayo cromatográfico de unión específica. Según un aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar la presencia o cantidad de una substancia en una muestra; cuyo método comprende:
a)
poner en contacto dicha muestra, con un medio cromatográfico, teniendo dicho medio al menos un sitio de reacción que incluye un reactivo inmovilizado capaz de unirse a un miembro seleccionado entre el grupo consistente en la substancia y un material marcado con partículas coloidales capaz de producir una respuesta detectable;
b)
transportar cromatográficamente en dicho medio cromatográfico dicho material marcado con partículas coloidales en presencia de un agente facilitador del transporte cromatográfico, que comprende una proteína meta-soluble tratada químicamente para hacerla más hidrofílica que en su forma natural, evitando dicho agente la agregación e inactivación de materiales y reactivos de unión específica en solución y promoviendo su transporte cromatográfico, mediante lo cual al menos una porción de dicho material marcado con partículas coloidales es cromatográficamente transportado al sitio de reacción para unirse al mismo, y
c)
determinar la respuesta detectable producida por dicho material marcado con partículas coloidales en el sitio de reacción como una indicación de la presencia o cantidad de la substancia de la muestra.
En una realización de dicho método, el mencionado medio cromatográfico comprende un segundo sitio de reacción que incluye un segundo reactivo inmovilizado que puede ser el mismo o diferente de dicho primer reactivo inmovilizado y que es capaz de unirse con dicho material marcado con partículas coloidales, comprendiendo dicho método las etapas de
d)
determinar la respuesta detectable producida por dicho material marcado con partículas coloidales en el segundo sitio de reacción como una indicación de la presencia o cantidad de la substancia de la muestra.
La presente invención proporciona además un
método para determinar la presencia o cantidad de una substancia en una muestra, cuyo método comprende:
a)
poner en contacto la muestra con un medio cromatográfico, teniendo dicho medio al menos dos sitios de reacción, incluyendo el primer sitio de reacción una solución desecada de un material marcado con partículas coloidales en presencia de una proteína meta-soluble, evitando dicha proteína meta-soluble la agregación y la inactivación de los materiales y reactivos de unión específica en solución y promoviendo su transporte cromatográfico e incluyendo el segundo sitio de reacción un reactivo inmovilizado capaz de unirse a un miembro seleccionado entre el grupo consistente en la substancia y dicho material marcado con partículas coloidales;
b)
solubilizar dicho material marcado con partículas coloidales y transportar cromatográficamente al menos una porción de dicho material marcado con partículas coloidales al segundo sitio de reacción para unirse al 
\hbox{mismo, y}
c)
determinar la respuesta detectable producida por dicho material marcado con partículas coloidales en el segundo sitio de reacción como una indicación de la presencia o de la cantidad de la substancia en la muestra.
En una realización de dicho método, dicho medio cromatográfico incluye un tercer sitio de reacción que incluye un segundo reactivo inmovilizado que puede ser el mismo o diferente de dicho primer reactivo inmovilizado y que es capaz de unirse a dicho material marcado con partículas coloidales, incluyendo dicho método las etapas de:
d)
determinar la respuesta detectable producida por dicho material marcado con partículas coloidales en dicho tercer sitio de reacción como indicación de la presencia o cantidad de la substancia en la muestra.
La presente invención también proporciona un
dispositivo de ensayo para determinar la presencia o cantidad de una substancia en una muestra por medio de una o más reacciones de unión específica que comprende:
un medio cromatográfico que tiene capilaridad y capacidad para un rápido transporte por solvente cromatográfico de uno o más reactivos y componentes reactivos de la muestra no inmovilizados por medio de un solvente cromatográfico seleccionado, que incluye
un primer sitio de reacción que incluye una solución desecada de un material marcado con partículas coloidales en presencia de una proteína meta-soluble, donde dicho material marcado con partículas coloidales es capaz de sufrir una rápida solubilización y donde dicha proteína meta-soluble evita la agregación e inactivación de los materiales y reactivos de unión específica en solución y promueve su transporte cromatográfico en dicho solvente, y
un segundo sitio de reacción que incluye un reactivo inmovilizado capaz de unirse a un miembro seleccionado entre el grupo consistente en dicha substancia y dicho material marcado con partículas coloidales.
Además, la presente invención proporciona un
kit para uso en ensayos de unión específica para determinar la presencia o cantidad de una substancia en una muestra, que comprende:
(1)
una solución consistente en un material marcado con partículas coloidales en presencia de un agente facilitador del transporte cromatográfico, que comprende una proteína meta-soluble, cuyo agente evita la agregación e inactivación de materiales y reactivos de unión específica en solución y promueve su transporte cromatográfico, y
(2)
un medio cromatográfico que tiene capilaridad y capacidad de transporte por solvente cromatográfico de reactivos y componentes reactivos de la muestra no inmovilizados por medio de un solvente cromatográfico seleccionado que incluye al menos un sitio de reacción que comprende un reactivo inmovilizado capaz de unirse a un miembro seleccionado entre el grupo consistente en dicha substancia y dicho material marcado con partículas coloidales.
Se ha descubierto que los materiales de unión específica marcados con partículas coloidales, tales como oro, pueden ser sentidos a un rápido transporte cromatográfico en un medio cromatográfico por medio de solventes seleccionados y agentes facilitadores del transporte cromatográfico como se ha mencionado anteriormente y que el uso de técnicas de ensayo de transporte por solvente cromatográfico reduce significativamente el tiempo necesario para la reacción de unión de un material marcado con partículas coloidales con su compañero de unión específica en comparación con métodos convencionales. También se ha descubierto que la impregnación de un medio cromatográfico con materiales proteicos lábiles de unión específica marcados con partículas coloidales en presencia de un medio acuoso que contiene proteínas metasolubles tal como caseína, permite la rápida resolubilización de dichas proteínas marcadas con partículas coloidales, que han sido secadas sobre el medio cromatográfico en una forma estable y conveniente para el transporte a lo largo del medio cromatográfico para llevar a cabo procedimientos de ensayo de unión específica de la invención.
En consecuencia, la invención proporciona mejores dispositivos, kits y métodos de ensayo de unión específica para determinar la presencia o cantidad de una substancia en una muestra. Los ensayos marcados con partículas coloidales proporcionan una señal visualmente detectable y no requieren el uso de materiales tales como radioisótopos o marcajes enzimáticos con el consiguiente requerimiento de un equipo de detección o de la adición de conjugados enzimáticos y colorantes indicadores. La invención proporciona medios para llevar a cabo ensayos de unión competitiva y de unión directa (de tipo emparedado). Se proporcionan métodos y kits de ensayo preferidos para determinar la presencia o la cantidad de una substancia en una muestra, mediante los cuales se mezclan un material marcado con partículas coloidales y un agente facilitador del transporte cromatográfico caro se ha mencionado anteriormente con la muestra. Se pone entonces en contacto un medio cromatográfico que contiene uno o más sitios de reacción impregnados con uno o más reactivos útiles para llevar a cabo el ensayo con la mezcla de nuestra, material marcado con partículas coloidales y agente facilitador del transporte cromatográfico, con objeto de transportar cromatográficamente la nuestra y el material marcado a lo largo del medio cromatográfico y llevar a cabo el ensayo deseado.
La invención proporciona también métodos y dispositivos de ensayo en los que se impregnan materiales marcados que incluyen materiales marcados con partículas coloidales y se secan sobre un sitio de reacción en un material de substrato cromatográfico en presencia de proteínas meta-solubles. Los medios cromatográficos de los dispositivos pueden contener uno o más sitios adicionales de reacción donde no se necesita que tengan lugar reacciones químicas per se, pero donde se pueden depositar o inmovilizar materiales adicionales o donde se pueden depositar materiales de la muestra que contiene la substancia analito. Se pone en contacto el medio cromatográfico con un solvente cromatográfico que solubiliza y transporta a lo largo del medio el material de unión especifica marcado con partículas coloidales, así como la substancia de la muestra y otros materiales y reactivos eventuales. La afinidad del reactivo de unión específica inmovilizado es tal que captura de manera eficaz el material marcado en el material que fluye, de tal modo que el componente de unión marcado se acumula en la zona.
Una ventaja importante proporcionada por la presente invención es que la afinidad de unión del reactivo inmovilizado puede ser tal que sea capaz de capturar un componente marcado en el flujo de corriente cromatográfica, de tal manera que el componente de unión marcado se acumule en la zona de captura y sea claramente discernible en la corriente de fondo de material marcado con partículas coloidales no concentrado.
Breve descripción de los dibujos
Las Figs. 1a, 2a, 3a, 4a y 5a son vistas de plano frontal de cinco formas diferentes de los dispositivos de ensayo de la presente invención.
Las Figs. 1b, 2b, 3b, 4b y 5b son vistas transversales de los dispositivos de ensayo mostrados en las Figs. la, 2a, 3a, 4a y 5a, respectivamente, tomadas a lo largo de las lineas 1b-1b, 2b-2b, 3b-3b, 4b-4b y 5b-5b.
Las Figs. 1c, 2c y 3c son vistas transversales de los dispositivos de ensayo mostrados en las Figs. 1a, 2a y 3a, respectivamente, en contacto con un volumen de material de muestra y solución indicadora.
Las Figs. 4c y 5c son vistas transversales de los dispositivos de ensayo mostrados en las Figs. 4a y 5a, respectivamente, en contacto con un volumen de solvente cromatográfico.
La Fig. 6 es una vista transversal del dispositivo de ensayo de la Fig. 4a tomada a lo largo de las líneas 6-6.
Descripción detallada
La presente invención proporciona mejores métodos, kits y dispositivos de ensayo cromatográfico inmunológico y otros ídem de unión específica.
Los materiales de unión específica marcados con partículas coloidales son altamente susceptibles de agregación y son, por lo tanto, generalmente incapaces de ser rápida y eficientemente transportados en medios cromatográficos según métodos de ensayo de transporte por solventes cromatográficos. La invención está basada en el descubrimiento de que los materiales de unión específica marcados con partículas coloidales y, particularmente, con partículas coloidales mayores de aproximadamente 1 nm de diámetro, que están especialmente sujetos a agregación, pueden ser sometidos a un rápido transporte cromatográfico en medios cromatográficos por medio de solventes seleccionados y agentes facilitadores del transporte cromatográfico como se ha mencionado anteriormente. Aunque los materiales marcados con partículas coloidales y, particularmente, aquéllos que tienen menos de aproximadamente 1 nm de diámetro, pueden ser capaces de transporte cromatográfico sin la presencia de los agentes facilitadores del transporte cromatográfico de la presente invención, el uso de dichos agentes ayuda al rápido transporte cromatográfico de todos los reactives marcados con partículas coloidales de la invención. Como descubrimiento relacionado, se ha visto que el transporte por solventes cromatográficos de materiales marcados con partículas coloidales reduce significativamente el tiempo necesario para la reacción de unión de esos materiales con sus compañeros de unión específica en comparación con los métodos convencionales. Mientras que los procedimientos convencionales de inmunoensayo tales como los de Leuvering, Patente EE.UU. Nº 4.313.734, muestran la incubación de materiales de unión específica marcados con partículas coloidales por un tiempo de desde 1 hora hasta toda la noche (16 horas), los métodos cromatográficos de la presente invención proporcionan generalmente la rápida consecución del. transporte y de las reacciones de unión específica en menos de aproximadamente 5 y, preferiblemente, menos de aproximadamente 2, minutos.
Se ha descubierto, además, que los materiales proteicos lábiles de unión específica marcados con partículas coloidales que son impregnados y secados sobre medios cromatográficos en presencia de materiales proteicos metasolubles seleccionados, pueden ser rápidamente solubilizados por medio de solventes adecuados y transportados a lo largo del medio cromatográfico en los métodos de ensayo de la invención. Como consecuencia de este descubrimiento, se proporcionan dispositivos de ensayo de unión especifica en los que se incorporan materiales de unión específica marcados con partículas coloidales en forma seca estable en el dispositivo y sólo el material de la muestra y un solvente cromatográfico necesitan ser añadidos para llevar a cabo un ensayo.
Según la invención, se pueden producir kits y se pueden practicar métodos de ensayo de unión específica para análisis de un substrato en una muestra según un método que emplea una solución consistente en un material marcado con partículas coloidales en presencia de un agente facilitador del transporte cromatográfico caro se ha mencionado anteriormente. El método también emplea un medio cromatográfico que tiene capilaridad y capacidad de transporte por solvente cromatográfico de reactivos no inmovilizados y componentes reactives de la nuestra por medio de un solvente cromatográfico seleccionado que incluye un sitio de reacción que incluye un reactivo inmovilizado capaz de unir un miembro seleccionado entre el grupo consistente en la substancia que ha de ser analizada y el material marcado con partículas coloidales. El método consiste en (a) poner en contacto la nuestra que ha de ser analizada por el medio cromatográfico, (b) transportar cromatográficamente sobre dicho medio cromatográfico dicho material marcado con partículas coloidales en presencia de un agente facilitador del transporte cromatográfico coma se ha mencionado anteriormente, mediante lo cual se transporta cromatográficamente al menos una porción de dicho material marcado con partículas coloidales al sitio de reacción para unirse al mismo y (c) determinar la respuesta detectable producida por dicho material coloidal en el sitio de reacción caro indicación de la presencia o cantidad de la substancia en la muestra.
Según realizaciones preferidas de la invención, un experto en la técnica puede seleccionar la afinidad del reactivo inmovilizado y las concentraciones de reactivos y materiales de la muestra, de tal manera que el material marcado con partículas coloidales se acumula en el sitio de reacción y es detectable sobre la corriente de fondo del material cargado con partículas coloidales no concentrado. Cuando éste no es el caso, el medio cromatográfico puede ser sometido a una etapa de lavado o aclarado para separar el material marcado no unido. Dichas etapas de lavado pueden ser también inherentemente llevadas a cabo según los procedimientos de la Solicitud de Patente Europea Nº 262.328.
También hay que entender que dicha muestra que ha de ser analizada, dicho material marcado con partículas coloidales, dicho agente facilitador del transporte cromatográfico, dicho solvente cromatográfico y otros solventes y reactivos pueden ser mezclados entre sí según las diversas combinaciones posibles antes de su contacto con el medio cromatográfico y de que estas mezclas y diversos componentes pueden ser puestos en contacto con el medio cromatográfico en diversas secuencias, como resultaría evidente según los conocimientos en la técnica. También hay que entender que el solvente cromatográfico puede ser substituido por la muestra o por la solución que contiene el material marcado con partículas coloidales cuando estos materiales son capaces de transportar el material marcado con partículas coloidales al sitio de reacción en el que está inmovilizado el reactivo. También hay que entender que el solvente cromatográfico puede ser inherentemente utilizado según los métodos de la Solicitud de Patente Europea Nº 262.328 para lavar los materiales marcados que no han reaccionado y otros componentes no inmovilizados de la muestra del sitio de reacción en el que está inmovilizado el reactivo. Cuando el material marcado contacta con el medio cromatográfico en el sitio de reacción en el que el reactivo está dispuesto, el transporte por solvente cromatográfico puede ser usado para acelerar la reacción de unión entre el material marcado con partículas coloidales y otros reactivos de unión especifica, así como para lavar el material marcado no inmovilizado de la zona.
Una realización preferida de la invención es aquélla en la que la solución indicadora contiene adicionalmente un agente facilitador del transporte cromatográfico como se ha mencionado anteriormente y ésta y la muestra son mezcladas y puestas en contacto con el medio cromatográfico para dar lugar al transporte cromatográfico de la substancia analito y el material de unión específica marcado. Según otras realizaciones, el material de la muestra y el material marcado con partículas coloidales pueden ser puestos en contacto con uno o más sitios de reacción en el dispositivo de ensayo corriente arriba del sitio de reacción en el que el reactivo está inmovilizado y el medio cromatográfico es puesto en contacto con el solvente cromatográfico para transportar la muestra y el material marcado, en presencia de un agente facilitador del transporte cromatográfico, al sitio de reacción en el que está inmovilizado el segundo reactivo.
Se pueden practicar ensayos de tipo emparedado según el método en el que el material marcado con partículas coloidales es capaz de participar en una reacción de unión específica con la substancia analito. También se pueden practicar métodos de ensayo de unión competitiva donde el material marcado con partículas coloidales es capaz de participar en una reacción de unión específica con el reactivo inmovilizado. Se pueden producir kits y se puede practicar también el método donde el medio cromatográfico contiene un segundo sitio de reacción impregnado con un segundo reactivo que está inmovilizado frente al transporte por solvente y es capaz de reacción selectiva con el material marcado con partículas coloidales para hacer que éste esté en forma inmovilizada en el segundo sitio de reacción, donde puede ser detectado. En los ensayos de tipo emparedado, la presencia de material marcado con partículas coloidales en el segundo sitio de reacción actúa como control y confirma la reactividad del primer reactivo. En los ensayos de unión competitiva, la presencia de material marcado con partículas coloidales en el segundo sitio de reacción indica el grado de competición entre la substancia analito y el reactivo inmovilizado.
Según la invención, se proporcionan otros métodos y dispositivos donde una solución desecada de una proteína meta-soluble y un material de unión específica marcado con partículas coloidales es incorporada al medio cromatográfico de un dispositivo de ensayo, siendo dicha forma seca capaz de ser rápidamente resolubilizada y cromatográficamente transportada a lo largo del medio por solventes cromatográficos seleccionados. Dichos dispositivos de ensayo de unión específica contienen un medio cromatográfico que tiene capilaridad y capacidad de transporte por solvente cromatográfico de uno o más reactivos no inmovilizados y componentes reactivos de la muestra por medio de un solvente cromatográfico seleccionado. Los dispositivos consisten en un primer sitio de reacción impregnado con la solución desecada anteriormente mencionada de un material marcado en presencia de una proteína meta-soluble, donde el material marcado es capaz de rápida solubilización y de transporte por solvente cromatográfico en el solvente y un segundo sitio de reacción en el que está inmovilizado un reactivo capaz de unirse con un miembro seleccionado entre el grupo consistente en la substancia analito y el material marcado con partículas coloidales. El dispositivo puede ser utilizado (a) poniendo en contacto la muestra con el medio cromatográfico, (b) solubilizando el material marcado con partículas coloidales y transportando cromatográficamente al menos una porción del material marcado con partículas coloidales al segundo sitio de reacción para su unión al mismo y (c) determinando la respuesta detectable producida por dicho material marcado con partículas coloidales en el segundo sitio de reacción como indicación de la presencia o de la cantidad de la substancia en la muestra.
Hay que entender también que la muestra que ha de ser analizada puede ser mezclada con el solvente cromatográfico y que el medio cromatográfico puede contactar con la mezcla de ambos. Hay que entender así mismo que el solvente cromatográfico puede ser substituido por dicha muestra, siendo capaz dicha muestra de solubilizar a dicho primer reactivo inmovilizado y de transportarse cromatográficamente a sí misma y a dicho primer reactivo marcado con partículas coloidales a la segunda zona en la que se dispone el segundo reactivo.
Una realización preferida de la presente invención es aquélla en la que el solvente cromatográfico es substituido por la muestra, que es capaz de solubilizar el material marcado con partículas coloidales desecado y de transportar la substancia analito y el material marcado con partículas coloidales al segundo sitio de reacción que contiene el reactivo inmovilizado.
Los ensayos de tipo emparedado pueden ser practicados según el método en el que el material marcado con partículas coloidales es capaz de participar en una reacción de unión específica con la substancia analito. También se pueden practicar métodos de ensayo de unión competitiva en los que el material marcado con partículas coloidales es capaz de participar en una reacción de unión específica con el reactivo inmovilizado. Se pueden producir dispositivos y se pueden también practicar métodos en los que el medio cromatográfico contiene un tercer sitio de reacción impregnado con un segundo reactivo que está inmovilizado frente al transporte por solvente y es capaz de reacción selectiva con el material marcado con partículas coloidales para hacer que el material marcado con partículas coloidales está en forma inmovilizada en el tercer sitio de reacción, en donde puede ser detectado. En los ensayos de tipo emparedado, la presencia de material marcado con partículas coloidales en el tercer sitio de reacción actúa como control y confirma la reactividad del material marcado. En los ensayos de unión competitiva, la presencia de material marcado con partículas coloidales en el tercer sitio de reacción indica el grado de competición entre la substancia analito y el reactivo marcado.
El método de ensayo de la invención puede también emplear materiales proteicos lábiles de unión especifica marcados con partículas coloidales, donde los materiales proteicos son almacenados con una proteína metasoluble en una condición estable como solución desecada en el medio cromatográfico del dispositivo de la invención y pueden ser rápidamente solubilizados por aplicación de un solvente adecuado. El método para preparar dicho medio cromatográfico consiste en desecar el material proteico lábil de unión específica marcado con partículas coloidales, preferiblemente bajo una corriente de aire, en un medio cromatográfico y en presencia de un medio acuoso que contiene una proteína meta-soluble. El producto resultante consiste en un medio cromatográfico sobre el que se impregna y deseca un material proteico lábil de unión específica marcado con partículas coloidales en presencia de un medio acuoso que contiene una proteína meta-soluble. El medio cromatográfico es preferiblemente papel o nitrocelulosa. El medio cromatográfico puede estar en diversas formas, tales como tiras. La solución acuosa que contiene la proteína meta-soluble, preferiblemente caseína, puede contener eventualmente otros agentes facilitadores del transporte cromatográfico, tales como polietilenglicol, gelatina, seroalbúmina bovina y detergentes.
Dispositivos de ensayo de mezcla y operación
Según un aspecto de la presente invención, se pueden llevar a cabo ensayos de unión específica según técnicas de mezcla y operación, donde se mezcla una solución indicadora que contiene un primer reactivo de unión específica marcado con partículas coloidales disuelto en un agente facilitador del transporte cromatográfico caro se ha mencionado anteriormente, con la muestra que contiene la substancia analito. Se sumergen entonces los dispositivos de ensayo según la invención en la mezcla de muestra y solución indicadora, que es transportada cromatográficamente a una primera zona en la que ha sido inmovilizado un segundo reactivo. Según una realización de un procedimiento de ensayo de tipo emparedado, los reactivos primero y segundo son capaces de unirse específicamente con el analito. En esta realización, el primer reactivo marcado se une con el analito después de haber sido mezclados. El conjugado del primer reactivo marcado y el analito es entonces sometido a inmovilización por reacción con el segundo reactivo y producción de una señal visualmente detectable en la primera zona. En ausencia de analito, el primer reactivo marcado no se unirá en la zona y no se producirá ahí ninguna señal. Se pueden seguir procedimientos de ensayo de tipo emparedado alternativos donde un tercer reactivo que es específicamente reactivo con el primer reactivo marcado está inmovilizado en una segunda zona para proporcionar un control. Aún se puede disponer de otros métodos y dispositivos de ensayo de tipo competitivo en los que el segundo reactivo inmovilizado es específicamente reactivo tanto con el analito como con el primer reactivo marcado, que compiten por la unión con el reactivo inmovilizado.
Haciendo referencia a los dibujos, las Figuras 1a, 1b y 1c representan un dispositivo de ensayo (10) para la detección de un analito en un liquido de muestra que contiene una longitud de material substrato cromatográfico (11) con un primer extremo (14) en el que comienza el transporte por solvente cromatográfico, un segundo extremo (15) en el que finaliza el transporte por solvente cromatográfico y una primera zona (13) impregnada con un segundo reactivo que está inmovilizado frente al transporte por solvente y es capaz de reacción selectiva con el analito para hacer que el analito esté en forma inmovilizada. El dispositivo consiste además en una tira de soporte inerte (12) a la que se fija la longitud de material cromatográfico (11).
Según un procedimiento para uso del dispositivo (10), se mezcla una cantidad de la muestra que ha de ser estudiada con una solución indicadora consistente en un primer reactivo marcado con partículas coloidales y un agente facilitador del transporte cromatográfico como se ha mencionado anteriormente. La cantidad y concentración del agente facilitador del transporte cromatográfico en la solución indicadora añadida a la muestra son seleccionadas de tal manera que se evita la agregación y se obtiene un rápido transporte por solvente cromatográfico del reactivo de unión específica marcado con partículas coloidales. En los ensayos de tipo emparedado de mezcla y operación, el primer reactivo marcado reaccionará para unirse específicamente con el analito. El dispositivo de ensayo (10) es entonces sumergido en su primer extremo (14) en un recipiente (16) que contiene la mezcla de muestra y solución indicadora (17) y la mezcla de muestra/solución indicadora que contiene el conjugado de primer reactivo marcado/analito progresa a través del material cromatográfico (11) a la primera zona (13). El segundo reactivo de unión especifica inmovilizado en la primera zona (13) es entonces específicamente reactivo con el analito y reaccionará con el analito o con conjugado de primer reactivo/analito para inmovilizarlo en la primera zona (13). El transporte por solvente cromatográfico es tal, sin embargo, que el primer reactivo marcado que no está conjugado con el analito junto con otros materiales de muestra y solución indicadora que no están inmovilizados en una primera zona (13) son transportados lejos de esa zona. El transporte por solvente cromatográfico continúa hasta que la mezcla de muestra/solución indicadora es agotada o hasta el frente de muestra/solución indicadora alcanza el segundo extremo (15) del dispositivo.
El analito presente en uña muestra se unirá con el primer reactivo marcado y será cromatográficamente transportado a la primera zona (13), donde será inmovilizado por una reacción de unión especifica con el segundo reactivo. Cuando está presente suficiente analito en una muestra, el número de partículas coloidales así inmovilizadas en la primera zona (13) será tal que produzca una señal visualmente detectable. Por supuesto, si no está presente ningún analito en la muestra, no se inmovilizará ni analito ni primer reactivo marcado en la primera zona y no se producirá ninguna señal.
Dispositivos de ensayo de mezcla y operación (tipo competitivo)
El dispositivo (10) según la Figura 1 puede ser también modificado para realizar ensayos de unión específica de tipo competitivo. Concretamente, el primer reactivo marcado con partículas coloidales puede ser seleccionado para que compita con el analito por la unión al segundo reactivo inmovilizado. Haciendo referencia al dibujo, la Figura 1 representa un dispositivo de ensayo para realizar ensayos de mezcla y operación de tipo competitivo. El dispositivo en sí mismo y la identidad del segundo reactivo inmovilizado son los mismos en el ensayo de tipo competitivo que en el ensayo de tipo emparedado. La única diferencia en los kits de ensayo reside en la identidad del primer material reactivo marcado con partículas coloidales. En los kits de ensayo de tipo emparedado de la invención, el primer reactivo marcado es específicamente reactivo con el analito, mientras que, en los ensayos de tipo competitivo, el primer reactivo marcado es un análogo de unión especifica del analito que ha de ser estudiado y es concretamente reactivo con el segundo reactivo inmovilizado en competición con el analito.
Según un procedimiento para uso del dispositivo (10), se mezcla una cantidad de la muestra que ha de ser estudiada con una solución indicadora que contiene un primer reactivo marcado con partículas coloidales en presencia de un agente facilitador del transporte cromatográfico como se ha mencionado anteriormente. El dispositivo de ensayo (10) es entonces sumergido en su primer extremo (14) en un recipiente (16) lleno de la mezcla de muestra y solución indicadora (17). La mezcla de muestra/solución indicadora que contiene el primer reactivo marcado y el analito progresa a través del material substrato cromatográfico (11) hasta la primera zona (13). El primer reactivo marcado y el analito compiten entonces por la unión al segundo reactivo de unión específica inmovilizado en la primera zona (13). El transporte por solvente cromatográfico es tal, sin embargo, que el analito y los primeros materiales reactivos marcados con partículas coloidales que no se unen específicamente al segundo reactivo inmovilizado son separados de la primera zona (13) por el solvente cromatográfico. El transporte por solvente cromatográfico continuará hasta que la cantidad de muestra/solución indicadora quede gastada o hasta que el frente de solución alcance el segundo extremo (15) del dispositivo.
La cantidad de analito presente en la muestra determinará la cantidad de primer reactivo marcado que se una en la primera zona (13). Se pueden realizar ajustes de la cantidad y/o de la afinidad de unión del primer reactivo marcado con objeto de determinar la cantidad de analito presente en la muestra.
Mezcla y operación alternativas (ensayo en emparedado)
Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan dispositivos y kits de ensayo para realizar ensayos de tipo emparedado que incluyen una función control y que proporcionan una señal positiva o negativa para la detección de un analito en particular. Haciendo referencia al dibujo, la Figura 2 representa un dispositivo de ensayo (20) consistente en una longitud de material substrato cromatográfico (21) con un primer extremo (25) en el que comienza el transporte por solvente cromatográfico y un segundo extremo (26) en el que finaliza el transporte por solvente cromatográfico. El dispositivo contiene también una primera zona (23) que puede ser separada y rota en dos o más áreas y que está impregnada con un segundo reactivo que está inmovilizado frente al transporte por solvente y es capaz de reacción selectiva con el analito para hacer que el analito está en forma inmovilizada. El dispositivo (20) contiene también una segunda zona (24) que está impregnada con un tercer reactivo que está inmovilizado frente al transporte por solvente y puede reaccionar selectivamente con el primer reactivo marcado con partículas coloidales.
La primera y segunda zona (23) y (24) pueden se dotadas de forma de manera que proporcionen una señal de forma distinta cuando una, pero no la otra, o cuando ambas contengan un reactivo inmovilizado. Por ejemplo, las formas de la primera y segunda zona (23) y (24) son tales en la Figura 2 que, cuando se inmovilice el marcaje en la segunda zona (24), sólo se indica un signo menos (-). Cuando, por otra parte, el marcaje está inmovilizado tanto en la primera (23) como en la segunda (24) zona, se indica un signo más (+).
Se prefiere que la primera zona impregnada con un reactivo que reacciona específicamente con el analito que ha de ser detectado esté orientada esencialmente perpendicular a la dirección de flujo cromatográfico. Esto es debido a que el analito y, por tanto, el reactivo de unión específica marcado tienden a inmovilizarse en el borde líder más que en el de arrastre de la zona. Cuando se orienta una zona alargada con su dimensión mayor paralela a la dirección del flujo cromatográfico, la porción líder de la zona atrapará a una mayoría del analito, con el resultado de gue el extremo de arrastre atrapa poco analito y la señal visible resultante tiene una forma que puede ser malinterpretada. Orientando la primera zona perpendicular a la dirección de flujo cromatográfico, se produce una señal de detección positiva más fuerte y más distinta.
Según un procedimiento para uso del dispositivo (20), se mezcla una cantidad de la muestra de ensayo con una solución indicadora que incluye un primer reactivo marcado con partículas coloidales en presencia de un agente facilitador de transporte cromatográfico caro se ha mencionado anteriormente. El dispositivo de ensayo (20) es entonces sumergido en su primer extremo (25) en un recipiente (27) que contiene una mezcla de muestra y solución indicadora (28) y la muestra/solución indicadora que contiene el conjugado primar reactivo marcado/analito progresa a través del material cromatográfico (21) hasta la primera (23) y segunda (24) zona. El segundo material reactivo inmovilizado en la primera zona (23) es específicamente reactivo con el analito e inmovilizará al analito así caro a cualquier conjugado de analito/primer reactivo marcado. Además, el tercer material reactivo inmovilizado en la segunda zona (24) es específicamente reactivo con el primer reactivo marcado e inmovilizará al primer reactivo, así caro a cualquier conjugado de analito/primer reactivo marcado.
Cuando está presente analito en la muestra, se formará el conjugado de analito/primer reactivo marcado en la mezcla de solución indicadora y muestra y el conjugado quedará inmovilizado tanto en la primera (23) como en la segunda (24) zona, produciendo así, según una realización, una signo más (+) y una señal positiva. Cuando no está presente nada de analito o menos de una cantidad umbral en la muestra, el primer reactivo reaccionará con el tercer reactivo en la segunda zona (24) y quedará inmovilizado en esa zona, produciendo una señal visual. Dado que no hay presencia de analito, nada quedará inmovilizado en la primera zona (23) y no se producirá. ninguna señal y sólo aparecerá un signo menos (-), indicando la ausencia de analito. la presencia de la señal en la segunda zona (24), pero no en la primera (23), además de indicar la ausencia de analito, indicará la movilidad del primer reactivo, marcado y servirá como control en relación con la utilidad del dispositivo de ensayo.
Mezcla y operación alternativas (ensayo de tipo competitivo)
Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan dispositivos y kits de ensayo para llevar a cabo ensayos de mezcla y operación de tipo competitivo que consisten en una primera zona impregnada con un segundo reactivo que reacciona específicamente con el analito que ha de ser detectado y el primer reactivo marcado con partículas coloidales y una o más segundas zonas impregnadas con un tercer reactivo que reacciona específicamente con el primer reactivo marcado y no con el analito.
Haciendo referencia al dibujo, las Figuras 3a, 3b y 3c representan un dispositivo de ensayo (30) para la detección de un analito en un líquido de muestra (40). El dispositivo (30) consiste en una longitud de material substrato cromatográfico (31) con un primer extremo (33) en el que comienza el transporte por solvente cromatográfico y un segundo extremo (34) (que no es necesariamente el segundo extremo físico de la tira) en el que finaliza el transporte por solvente cromatográfico. El dispositivo (30) consiste además en una primera zona (35) impregnada con un segundo reactivo que está inmovilizado frente al transporte por solvente y es capaz de reaccionar selectivamente con un miembro del grupo consistente en el analito y un primer reactivo marcado con partículas coloidales. Corriente abajo de la primera zona (35) se localiza la segunda zona (36), que puede consistir eventualmente en más de un área y que está impregnada con un tercer reactivo que está inmovilizado frente al transporte por solvente y es específicamente reactivo con el primer reactivo marcado pero no con el analito. El dispositivo consiste también en un medio de barrera para solvente a la derecha (37) y un medio de barrera para solvente a la izquierda (38) que enfocan el flujo cromatográfico de material desde el primer extremo (33) hasta la primera (35) y segunda (36) zona. Los medios de barrera para solvente (37) y (38) alargan también de manera efectiva el material substrato cromatográfico (31) proporcionando vías de transporte cromatográfico prolongadas al segundo extremo (34).
Según un procedimiento para uso del dispositivo (30), se mezcla una cantidad de la muestra de ensayo con una solución indicadora consistente en un primer reactivo marcado con partículas coloidales en presencia de un agente facilitador del transporte cromatográfico como se ha mencionado anteriormente. El primer reactivo es un análogo de unión específica del analito que ha de ser estudiado y reacciona específicamente con el segundo reactivo inmovilizado en la primera zona (35). El dispositivo de ensayo (30) es sumergido entonces en su primar extremo (33) en un recipiente (39) lleno de la mezcla (40) de nuestra y solución indicadora. La mezcla de nuestra/solución indicadora que contiene el primer reactivo marcado y el analito progresa a través del material cromatográfico (31) a la primera zona (35). El primer reactivo marcado con partículas coloidales y el analito compiten entonces por la unión al segundo reactivo de unión específica inmovilizado en la primera zona (35). El transporte por solvente cromatográfico es tal, sin embargo, que el analito y los primeros materiales reactivos marcados que no se unen específicamente al segundo reactivo inmovilizado son eliminados de la primera zona (35) por el solvente cromatográfico y son transportados hacia el segundo extremo (34) y a la(s) segunda(s) zona(s) (36). El primer reactivo marcado, que puede ser un anticuerpo de ratón anti-segundo reactivo cuando el analito que ha de ser detectado es un anticuerpo humano anti-segundo reactivo, reacciona entonces con el tercer reactivo (que puede ser anticuerpos anti-IgG de ratón) inmovilizado en la segunda zona (36), que es específicamente reactiva con el primer reactivo marcado, pero no con el analito. El tercer reactivo reacciona con el primer reactivo marcado, inmovilizándolo en la segunda zona (36), produciendo una señal detectable. El dispositivo puede consistir eventualmente en "segundas zonas" adicionales, de tal manera que, cuando se mezcla un exceso de primer reactivo marcado con el material de la muestra y se desplaza parcial o totalmente el primer reactivo marcado de la unión en la primera zona (35), se puede determinar el grado de desplazamiento por el grado de unión a la(s) segunda(s) zona(s) (36). El transporte por solvente cromatográfico continuará y la muestra/solución indicadora progresará a través del dispositivo hasta que se gaste la cantidad de muestra/solución indicadora o hasta que el frente de la solución progrese alrededor del medio de barrera para solvente derecho (37) e izquierdo (38) y alcance el segundo extremo (34) del dispositivo.
Dispositivos de material de unión específica marcados preimpregnados
Un aspecto alternativo de la presente invención se relaciona con dispositivos de ensayo de unión específica donde se impregna una solución de reactivos de unión específica marcados con partículas coloidales que son capaces de transporte por solvente cromatográfico y una proteína meta-soluble y se seca sobre los materiales substrato cromatográficos de los dispositivos. Se ha visto, sorprendentemente, que al secar los materiales reactivos de unión específica marcados con partículas coloidales en presencia de proteínas meta-solubles, tales como caseína, no sólo se obtiene un rápido transporte por solvente cromatográfico de materiales marcados, sino que también se obtiene la rápida resolubilización de dichos materiales marcados impregnados y secados sobre los materiales substrato cromatográficos. Los reactivos marcados así resolubilizados son capaces de ser transportados de manera eficiente por medio de sistemas convencionales de solventes cromatográficos y de reaccionar en los ensayos de unión especifica.
La capacidad de impregnar materiales substrato cromatográficos con los reactivos de unión especifica marcados, que pueden entonces ser resolubilizados, hace posible la práctica de una variedad de procedimientos de ensayo que evitan el uso de etapas de adición de reactivos marcados. Se pueden llevar a cabo tanto ensayos de tipo emparedado como de tipo competitivo utilizando los kits y tiras de la presente invención.
Dispositivo de ensayo en emparedado
Haciendo referencia al dibujo, las Figuras 4a, 4b y 4c representan un dispositivo de ensayo (50) para la detección de un analito en una muestra en la que un primer reactivo marcado con partículas coloidales y una proteína meta-soluble son impregnados y secados sobre el dispositivo (50). El dispositivo (50) consiste en una longitud de material substrato cromatográfico (51) con un primer extremo (54) en el que comienza el transporte por solvente cromatográfico y segundos extremos (58) en los que finaliza el transporte por solvente cromatográfico. La longitud de material (51) contiene una primera zona (55), una segunda zona (56) y una tercera zona (57).
Entre el primer extremo (54) y la primera zona (55) hay una caja retardante definida por un medio de barrera de solvente a la derecha (60), un medio de barrera de solvente a la izquierda (61) y un medio de barrera de solvente transversal (62). El medio de barrera de solvente a la derecha (60) y el borde derecho (63) del material definen una ruta de transporte por solvente cromatográfico a la derecha y el medio de barrera de solvente a la izquierda (61) y el borde izquierdo (64) del material definen una ruta de transporte por solvente cromatográfico a la izquierda. las rutas de transporte por solvente cromatográfico a la derecha y a la izquierda se encuentran corriente abajo de la primera zona (55) y de la caja retardante para formar una ruta central de transporte cromatográfico en la que se localizan dichas zonas segunda (56) y tercera (57) definidas por un medio de barrera de solvente a la derecha hacia atrás (65) y un medio de barrera de solvente a la izquierda hacia atrás (66). Corriente abajo de la tercera zona (57), el medio de barrera de solvente a la derecha hacia atrás (65) y el borde derecho (63) y el medio de barrera de solvente a la izquierda hacia atrás (66) y el borde izquierdo (64) definen rutas de transporte por solvente cromatográfico que llevan a segundos extremos (58) en los que finaliza el transporte por solvente cromatográfico.
La primera zona (55) es impregnada con una proteína meta-soluble y un primer reactivo de unión específica marcado con partículas coloidales que es móvil en un solvente cromatográfico (68) y puede reaccionar con e inmovilizarse frente al transporte por solvente por el analito cuando el analito está en forma inmovilizada. La segunda zona (56) está corriente abajo de la primera zona (55) y proporciona un sitio adecuado para recibir a la muestra que ha de ser analizada. La tercera zona (57) está corriente abajo-de la segunda zona (56) y está impregnada con un segundo reactivo que está inmovilizado frente al transporte por solvente y puede reaccionar selectivamente con el analito para hacer que el analito quede en forma inmovilizada. El dispositivo contiene también una tira de soporte inerte (52) a la que se fija la longitud del material substrato cromatográfico (51). El dispositivo contiene adicionalmente una placa de cubierta (53) que puede ser eventualmente transparente y puede estar colocada sobre la longitud del material cromatográfico (51), dejando expuesto el primer extremo (54) del material. La placa de cubierta (53) define una apertura correspondiente a la segunda zona (56) y que la deja expuesta. Una etiqueta separable (59) cubre la segunda zona (56).
Según un procedimiento para uso del dispositivo (50) de las Figuras 4a, 4b y 4c, se separa la primera etiqueta (59) del dispositivo (50), se aplica una muestra del material que ha de ser estudiado a la segunda zona (56) y se vuelve a colocar la etiqueta separable (59). Se pone en contacto entonces el dispositivo (50) en su primer extremo (54) en un-.recipiente (67) de solvente cromatográfico (68). El solvente cromatográfico (48) progresa entonces a través de la longitud de material cromatográfico que pasa a lo largo de las rutas de transporte por solvente cromatográfico a la derecha y a la izquierda á la ruta de transporte cromatográfico central. Parte del solvente es transportado hacia arriba hacia la segunda zona (56), mientras que parte del solventé es transportado hacia abajo hacia la primera- zona (55), solubilizando el primer reactivo marcado. Una parte del solvente cromatográfico (68) del primer extremo (54) pasa entre el medio de barrera de solvente a la derecha (60) y el medio de barrera de solvente a la izquierda (61) a la caja retardante. El solvente cromatográfico pasa alrededor del medio de barrera de solvente transversal (62), que retrasa su flujo antes de ser transportado hacia la primera zona (55). El primer reactivo marcado en la primera zona ha sido ya solubilizado por solvente de las rutas de transporte por solvente derecha e izquierda y el solvente que progresa a través de la caja retardante, al alcanzar el primer reactivo solubilizado, comienza a transportar el primer reactivo hacia la segunda zona (56). El solvente cromatográfico (68), que fue transportado a través de las rutas de transporte por solvente derecha e izquierda, contacta entonces con la muestra aplica a la segunda zona (56) y transporta la muestra a la tercera zona (57). Allí, el segundo material reactivo inmovilizado reacciona selectivamente con el analito presente en la muestra para inmovilizarlo. Los componentes no analito de la muestra son transportados lejos de la tercera zona (57). El primer reactivo marcado es transportado entonces a la tercera zona (57), donde es inmovilizado frente al transporte por solvente por el analito cuando cualquier analito está en forma inmovilizado. El transporte por solvente cromatográfico de la muestra exenta de analito y el primer reactivo continúa hasta que el solvente cromatográfico (68) alcanza el segundo extremo (58) del material.
Se puede producir una variedad de dispositivos de ensayo de tipo emparedado, incluyendo reactivos marcados con partículas coloidales desecados, según la invención. Es frecuentemente deseable evitar el contacto prematuro del analito y los materiales de la muestra con los reactivos y el contacto de los reactivos entre si. Así, se puede seleccionar la movilidad relativa de los componentes de la muestra y los diversos reactivos o la relación de sitios entre las zonas de tal manera que los reactivos y los componentes de la muestra se mezclen sólo en los momentos y localizaciones deseados. La Solicitud de Patente Europea Nº 262.328 describe varios métodos y dispositivos para llevar a cabo ensayos de transporte por solvente cromatográfico en los que se desea evitar el contacto de un primer material reactivo marcado (tal como `un anticuerpo antiinmunoglobulina humana) con material de la muestra (tal como suero) antes del momento en el que el anticuerpo analito es inmovilizado frente al transporte por solvente en una zona de reacción y otros anticuerpos no analito contenidos en la muestra de suero son eliminados de la tercera zona por transporte por solvente cromatográfico. El uso de rutas de aceleración y deceleración puede ser también particularmente útil para evitar la desecación de los materiales de la muestra u otros reactivos.
Dispositivo de ensayo competitivo
Los dispositivos de ensayo de la presente invención que contienen reactivos de unión especifica solubilizables son también adecuados para la práctica de ensayos de tipo de unión competitiva. Según dichos métodos, el segundo reactivo inmovilizado es seleccionado, como en los ensayos de tipo emparedado, para que se una específicamente al analito de interés. El primer reactivo marcado, sin embargo, es seleccionado de forma que sea un análogo de unión especifica del analito que se unirá competitivamente con el segundo reactivo inmovilizado. Al llevar a cabo los ensayos de tipo competitivo según la invención, generalmente no es necesario evitar que el analito y el reactivo marcado con partículas coloidales contacten entre sí antes de su contacto con el segundo reactivo inmovilizado. De este modo, el dispositivo puede ser diseñado para que mezcle la muestra que contiene analito y el primer reactivo marcado. Por supuesto, si así se desea, el dispositivo puede ser diseñado para que evite el contacto de la muestra y de los primeros reactivos marcados hasta después de que contacten con el segundo reactivo inmovilizado.
Haciendo referencia al dibujo, las Figuras 5a, 5b y 5c representan un dispositivo de ensayo (70) para llevar a cabo ensayos de unión competitiva para la detección de un analito en una muestra, donde se impregna un primer reactivo marcado con partículas coloidales en presencia de una proteína meta-soluble y se seca sobre el dispositivo (70). El dispositivo (70) consiste en una longitud de material substrato cromatográfico (71) con un primer extremo (74) en el que comienza el transporte por solvente cromatográfico y un segundo extremo (77) en el que finaliza el transporte por solvente cromatográfico. La longitud de material (71) consiste en una primera zona (75) y una segunda zona (76). La primera zona es impregnada con un primer reactivo marcado en presencia de una proteína meta-soluble que contiene tampón de anti-agregación. La segunda zona (76) está corriente abajo de la primera zona (75) y está impregnada con un segundo reactivo que es capaz de tener una reacción de unión selectiva tanto con el analito como con el primer reactivo marcado para hacer que el analito y el primer reactivo marcado estén en forma inmovilizada. El dispositivo contiene además una tira de soporte inerte (72) a la que se fija la longitud de material substrato cromatográfico (71). El dispositivo contiene adicionalmente una placa de cubierta (73) que se coloca sobre la longitud del material substrato cromatográfico (71), dejando expuesto el primer extremo (74) del material. La placa de cubierta (73) define una apertura correspondiente a la primera zona (75) y que la deja expuesta, la cual está cubierta por una etiqueta separable (78).
Según un procedimiento para uso del dispositivo (70) de las Figuras 5a, 5b y 5c, la etiqueta (78) es separada del dispositivo (70), se aplica una muestra del material que ha de ser estudiado a la primera zona (75) y se vuelve a colocar la etiqueta (78). Se pone entonces en contacto el dispositivo (70) en su primer extremo (74) en un recipiente (79) de solvente cromatográfico (80). El solvente cromatográfico (80) progresa entonces a través de la longitud del material substrato cromatográfico (71) que transporta el primer reactivo marcado impregnado en la primera zona (75) y la muestra allí depositada a la segunda zona (76). El analito y el primer reactivo marcado compiten allí por la unión al segundo reactivo inmovilizado, para el cual son ambos específicamente reactivos. Los componentes no analito, así como el analito y el primer material reactivo no unidos, son transportados lejos de la segunda zona (76) por medio del transporte por solvente cromatográfico, que continúa hasta que le solvente cromatográfico se ha agotado o hasta que el frente de solvente alcanza el segundo extremo (77) del material. Al concluir el transporte por solvente cromatográfico, la segunda zona (76) puede ser observada directamente para determinar la presencia de primer reactivo marcado con partículas coloidales inmovilizado en esa localización. La presencia de primer reactivo marcado en esa localización puede entonces relacionarse con la presencia de analito en la muestra.
Descripción de partículas coloidales
La presente invención va dirigida a medios para mejorar las características del transporte cromatográfico de partículas coloidales utilizadas como marcajes en ensayos de unión específica. Las partículas coloidales que pueden ser usadas junto con los métodos, kits y dispositivos de la presente invención son las que pueden ser utilizadas con los ensayos de unión específica en general. Es particularmente conocido el uso de partículas metálicas coloidales y, especialmente, oro coloidal para llevar a cabo inmunoensayos. Otras partículas coloidales, tales como partículas de colorantes polimerizadas, que pueden ser usadas como marcajes en métodos de ensayo especifico tales como los de Hirschfeld, EE.UU. Nº 4.166.105 y Henry, EE.UU. Nº 4.452.886, pueden ser ahora utilizadas en ensayos de unión específica por transporte cromatográfico. Como marcajes de partículas coloidales particularmente preferidos para uso en la presente invención se incluyen partículas no metálicas tales como selenio, teluro y azufre, siendo el selenio particularmente preferido.
Como partículas coloidales que son adecuadas como marcajes según la invención se incluyen las que pueden estar conjugadas con reactivos de unión específica sin interferir con la actividad de dichos reactivos o con otros reactivos o analitos. Las partículas deben ser detectables y, preferiblemente, producir una señal visualmente detectable cuando están presentes en concentraciones relativamente bajas. Las partículas que oscilan en cuanto a tamaño entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 200 nm de diámetro son generalmente adecuadas, aunque también son adecuadas partículas tanto mayores como menores para uso según la invención. Los métodos de la invención son particularmente útiles con partículas mayores de aproximadamente 1 nm de diámetro que son particularmente susceptibles de agregación. Las partículas mayores de aproximadamente 200 nm tienden a exhibir una menor movilidad y pueden tender a salirse de la suspensión incluso en presencia de los agentes facilitadores de transporte cromatográfico de la presente invención. Las partículas mucho mayores pueden tener también su transporte limitado por el tamaño de poro del material de transporte cromatográfico. Las partículas menores de aproximadamente 1 nm tienden a exhibir una movilidad cromatográfica superior a las partículas más grandes y, en algunos casos, pueden no requerir el uso de los agentes facilitadores de transporte cromatográfico de la presente invención. No obstante, las partículas menores de aproximadamente 1 nm tienden a proporcionar señales más débiles y son, por lo tanto, menos adecuadas para uso en los procedimientos de ensayo.
Las partículas metálicas coloidales son particularmente adecuadas como marcajes según la presente invención e incluyen aquellas partículas que están compuestas por metales o compuestos metálicos, incluyendo óxidos metálicos, hidróxidos metálicos o sales metálicas. Dichas partículas varían en general en cuanto a diámetro entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 200 nm, siendo particularmente preferidas las partículas que varían en cuanto a diámetro entre aproximadamente 40 nm y aproximadamente 80 nm. Las partículas pueden consistir en metal puro o en compuestos metálicos, pero pueden también consistir en núcleos poliméricos revestidos con metal o con compuestos metálicos. Se ha descrito que dichas partículas tienen propiedades similares a las de las partículas consistentes en metal puro o compuestos metálicos. Como metales y compuestos metálicos adecuados se incluyen los seleccionados entre el grupo consistentes en los metales platino, oro, plata y cobre y los compuestos metálicos yoduro de plata, bromuro de plata, hidróxido de cobre, óxido de hierro, hidróxido u óxido hidratado de hierro, hidróxido u óxido hidratado de aluminio, hidróxido o hidróxido hidratado de cromo, sulfuro de plomo, sulfuro de mercurio, sulfato de bario y dióxido de titanio. Como partículas metálicas preferidas se incluyen las hechas de óxido de oro, plata o hierro.
Las partículas metálicas coloidales pueden ser producidas según métodos generalmente conocidos en la técnica. Concretamente, Frens, Nature 241, 20 (1973), cuya descripción es aquí incorporada a modo de referencia, describe métodos para la producción de partículas de sol de oro de tamaños variables. Las partículas de oro pueden ser producidas por métodos en los cuales se calienta una solución de cloruro de oro a ebullición y se mezcla después con una solución de citrato de sodio para reducir al cloruro de oro. Poco después de la mezcla de las dos soluciones la solución en ebullición se vuelve de un color azul pálido, lo que indica la aparición de una nucleación, poco después de lo cual el color azul cambia a rojo, lo que indica la formación de partículas mono-dispersas. La reducción del cloruro de oro se completa después de sólo unos cuantos minutos más de ebullición. Los tamaños de partícula resultantes pueden ser controlados por la variación de la concentración de la solución de citrato de sodio. Se pueden obtener partículas consistentes en otros metales y compuestos metálicos, así como partículas consistentes en núcleos poliméricos por metodologías similares. Los colores de la señal visualmente detectable procedente del marcaje con partículas metálicas depende de la identidad y del tamaño de partícula de la partículas metálica. Por ejemplo, las partículas coloidales de oro producen colores que varían del naranja al rojo y al violeta dependiendo del tamaño de partícula del sol.
Conjugación de los reactivos de unión con las partículas coloidales
Los reactivos de unión especifica de la invención pueden ser conjugados con marcajes de partículas coloidales según métodos generalmente conocidos en al técnica. Según un procedimiento general, se mezclan rápidamente entre si reactivos proteicos de unión específica y partículas coloidales y se incuban en una solución a la que se añade un agente tal como seroalbúmina bovina o polietilenglicol. Se centrifuga la suspensión primeramente a una velocidad baja para separar cualquier agregado grande y luego a una velocidad alta para producir un gránulo del conjugado reactivo/partícula coloidal antes de que el sobrenadante sea aspirado y eliminado. Se resuspende el gránulo en una solución que contiene un agente facilitador del transporte cromatográfico según la invención.
Los marcajes de partículas coloidales no necesitan ser conjugados directamente a los reactivos de unión específica, pero necesitan ser revestidos o pretratados con otros reactivos. Leuvering, Patente EE.UU. Nº 4.313.734, describe métodos mediante los cuales las partículas de sol metálicas pueden estar revestidas con revestimientos de polímero y copolímero inerte. El sol metálico puede ser puesto en contacto con el polímero, o el sol puede ser colocado en un ambiente que contenga uno o más monómeros y se puede iniciar una reacción de polimerización. Después del revestimiento con el polímero inerte, el componente inmunológico de unión específica puede ser acoplado al material de revestimiento por adsorción o unión covalente.
Descripción de las proteínas meta-solubles
Tal como se usa aquí, el término proteína meta-soluble se refiere a aquellas proteínas que, en su forma nativa, son hidrofóbicas y pobremente solubles en agua, pero que, cuando son sometidas a tratamiento químico, como tratamiento de purificación alcalina, pueden convertirse en más hidrofílicas y, por lo tanto, capaces de formar soluciones o dispersiones uniformes en agua. Dichos tratamientos químicos sirven para escindir los grupos ácido graso hidrofóbicos de las moléculas de proteína por escisión de uniones éster u otras. Esta escisión deja residuos carboxi e hidroxi en la molécula, haciendo que la proteína sea más hidrofílica en esos sitios. Sin pretender limitarse a una única teoría de la invención, se cree que el tratamiento alcalino hace que las proteínas meta-solubles sean de tipo un poco detergente, es decir, que presentan tanto el aspecto hidrofóbico como hidrofílico. El tratamiento químico, siendo requerido para la práctica de la invención, no necesita ser un tratamiento alcalino, sino que puede hacerse también con ácidos, detergentes o solventes tales como alcohol o urea.
Las proteínas, cuando son tratadas de este modo, son capaces de funcionar como potentes agentes facilitadores del transporte cromatográfico, evitando de esta forma la agregación e inactivación de los reactivos marcados con partículas coloidales. Además, las proteínas meta-solubles tratadas, cuando son secadas con un material proteico lábil marcado con partículas coloidales en un medio cromatográfico para producir un dispositivo de ensayo de la presente invención, proporcionan un almacenamiento estable y evitan la agregación e inactivación cuando se mantiene en un estado seco, mientras que permiten a los materiales proteicos ser rápidamente resolubilizados y utilizados en los ensayos de transporte cromatográfico de la presente invención. Como proteínas meta-solubles preferidas se incluyen materiales tales como caseína, zeína y un componente no albúmina de la proteína de la clara del huevo, siendo la caseína en concentraciones del 1 al 5% particularmente preferida para uso en la invención. Como materiales preferidos se incluyen caseína libre de vitamina (Sigma Chemical. Co., St. Louis, MO, Nº de catálogo C-3400), Zeína (Sigma, Nº de catálogo Z-3625) y proteína de clara de huevo (Sigma, Nº de catálogo A-5253), que consiste tanto en la proteína meta-soluble responsable de la solubilización y del transporte como en las fracciones inactivas de albúmina. Es sabido que el componente de la clara del huevo responsable de la solubilización y del transporte no es albúmina de clara de huevo, ya que el material de albúmina pura no promueve la resolubilización y el transporte.
Descripción de los agentes facilitadores del transporte cromatográfico
Tal como se usa aquí, el término agentes facilitadores del transporte cromatográfico se refiere a aquellos materiales que evitan la agregación e inactivación de materiales y reactivos de unión específica en solución y, además, que promueven su transporte cromatográfico. Los agentes pueden ser líquidos o pueden ser sólidos, en cuyo caso son preferiblemente disueltos en una solución, tal como una solución salina tampón. Como agentes facilitadores adecuados del transporte cromatográfico se incluyen materiales tales como polietilenglicol, materiales proteicos tales como gelatina y seroalbúmina bovina y detergentes tales como dodecilsulfato de sodio (DSS), desoxicolato de sodio (DOC) y Triton® X 100.
De acuerdo con la invención, el agente facilitador de transporte cromatográfico comprende materiales proteicos metasolubles tales como caseína. También se pueden usar proteínas meta-solubles para impregnar y secar los reactivos marcados con partículas coloidales sobre materiales substrato cromatográficos para producir dispositivos de ensayo de la invención, de tal modo que los reactivos marcados pueden ser rápidamente resolubilizados y transportados por medio de transporte por solvente cromatográfico.
Cuando hay que mezclar el agente facilitador del transporte cromatográfico con el material marcado con partículas coloidales y utilizarlo como componente de una solución indicadora con kits de mezcla y operación, consiste preferiblemente en caseína u otra proteína metasoluble tratada en combinación con otros agentes facilitadores del transporte cromatográfico, tales como PEG, con solución salina tampón. Un agente facilitador del transporte cromatográfico particularmente preferido consiste en un 2% de caseína en combinación con un 0,1% dé PEG en PBS. La concentración de los componentes del tampón y de la solución indicadora son seleccionados en la práctica de los kits de mezcla y operación de la invención de tal manera que, para un tamaño de muestra dado, se proporcionen concentraciones suficientes de los componentes para evitar la agregación e inactivación de los reactivos marcados y promover su transporte por solvente cromatográfico.
Los reactivos de unión específica marcados con partículas coloidales en presencia de las soluciones que contienen caseína pueden tener valores de Rf que se aproximan a 1,0, mientras que los materiales con marcaje coloidal en tampones que contienen PEG pueden tener valores de Rf que se aproximan a 0,7. Las concentraciones de caseína en tampones facilitadores del transporte cromatográfico adecuados oscilan entre aproximadamente un 0,1% (p/v) y más de aproximadamente un 5%, siendo preferidas concentraciones de aproximadamente un 2%. Se observa que concentraciones mayores de aproximadamente un 5% no parecen ayudar a las cualidades de antiagregación o de facilitación del transporte cromatográfico del tampón, mientras que pueden, sin embargo, tender a interferir con la resolubilización de los reactivos marcados secados sobre las tiras de ensayo de la invención.
Las soluciones que contienen PEG como único agente facilitador del transporte cromatográfico son adecuadas para la práctica de algunos aspectos de la presente invención. Los tampones que contienen PEG tienen RFs de hasta 0,7. Las concentraciones preferidas de PEG en los tampones facilitadores del transporte cromatográfico adecuados oscilan entre aproximadamente un 0,05% y aproximadamente un 2%, siendo preferido aproximadamente un 1%. Los polímeros adecuados de PEG pueden tener una variedad de pesos moleculares, siendo particularmente preferidos pesos moleculares de aproximadamente 20.000.
La gelatina es generalmente inadecuada para ser usada sola como agente facilitador del transporte cromatográfico, ya que las soluciones que la contienen proporcionan un Rf de sólo aproximadamente 0,2. Puede ser útil, no obstante, cuando se combina con otros materiales antiagregación utilizados en la invención. La gelatina es generalmente inadecuada, sin embargo, cuando es utilizada en concentraciones mayores de aproximadamente un 2%, ya que contribuye a la tendencia a agregarse.
Las soluciones tampón adecuadas para uso con los agentes facilitadores del transporte cromatográfico de la invención deben tener un pH de entre aproximadamente 5 y 9 y no deben interferir con la reactividad del analito o de los reactivos o con su transporte cromatográfico. Las soluciones tampón preferidas tienen pHs de aproximadamente 7 e incluyen tampones tales como Tris y PBS.
Descripción de los medios cromatográficos
Los medios cromatográficos útiles con la presente invención incluyen aquellos materiales de substrato cromatográfico que tienen capilaridad y capacidad de transporte por solvente cromatográfico de reactivos no inmóvilizados y componentes reactivos de la muestra por medio de un solvente cromatográfico seleccionado. Los materiales de substrato cromatográfico utilizados en la invención están preferiblemente en forma de tiras, pero se contempla que puedan estar en otras formas, incluyendo, pero sin limitación, partículas o materiales gel en una columna cromatográfica. Aunque una amplia variedad de materiales de tiras cromatográficas, tales como materiales fibrosos tejidos y no tejidos utilizados para la cromatografía en papel es adecuada para uso en la invención, es particularmente preferido el uso de substratos de cromatografía en capa fina microporosos o microgranulares, ya que el uso de dichos substratos mejora la velocidad y la resolución de los ensayos según la invención. Los materiales deben ser preferiblemente inertes y no deben reaccionar en general física o químicamente con ninguno de los componentes de la muestra, reactivos, marcajes con partículas coloidales, tampones o productos de reacción.
Los materiales de substrato cromatográfico de capa fina particularmente adecuados para uso en la presente invención incluyen materiales cromatográficos de capa fina granulares, tales como sílice o celulosa microgranular. Como materiales microporosos no granulares preferidos se incluyen ésteres de celulosa microporosa, por ejemplo ésteres de celulosa con un ácido carboxílico alifático, tal como un ácido alcanocarboxílico de 1 a 7 átomos de carbono, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico o cualquiera de los ácidos butiricos o ácidos valéricos. Son especialmente preferidos los materiales microporosos hechos de nitrocelulosa, por cuyo término se quiere significar cualquier éster de ácido nítrico de celulosa. Como materiales adecuados se incluyen nitrocelulosa en combinación con cualquiera de dichos ésteres de celulosa de ácido carboxílico. Así, se pueden usar ésteres puros de nitrocelulosa como consistentes en un éster de celulosa que tiene aproximadamente 3 grupos nítricos por 6 átomos de carbono. Más preferido es un material de Tipo SMWP (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts), que tiene un tamaño de poro de 5 \mum.
Los diversos materiales de substrato cromatográfico pueden ser usados como tales en formas adecuadas, tales como películas, tiras o láminas. También pueden ser depositados sobre, o unidos o laminados a materiales de soporte inerte apropiados tales como papel, vidrio, plástico, metal o tejidos. (Un material de soporte inerte preferido es Mylar®). Dicho material de soporte no sólo tiene el efecto de proporcionar un soporte estructural al material de substrato cromatográfico, sino que también evita la evaporación del reactivo y de los materiales solventes durante el procedimiento de ensayo. También se pueden hacer las placas de cubierta de dichos materiales inertes. Las placas de cubierta, aunque no son necesarias para la práctica de la invención, proporcionan un soporte estructural adicional y, además, evitan la evaporación del reactivo y de los materiales solventes durante el procedimiento de ensayo. Dichas placas de cubierta pueden ser transparentes para ver la progresión del ensayo y pueden incluir puertas para la adición de materiales de muestra, solvente cromatográfico o reactivos.
El medio cromatográfico sobre el que se llevan a cabo los ensayos puede tener cualquier forma o tamaño, pero está preferiblemente en forma de tiras de un grosor en el rango de desde aproximadamente 0,01 mm hasta aproximadamente 0,5 mm y, más preferiblemente, de aproximadamente 0,1 mm. Las tiras pueden variar ampliamente en sus otras dimensiones, pero preferiblemente se mantienen bastante pequeñas con objeto de acortar el tiempo de desarrollo del ensayo y de minimizar el uso de material. Cuando las tiras son extremadamente pequeñas en cuanto a tamaño, pueden ser unidas a un mango o sujeción adecuados para ayudar a la manipulación y observación de los resultados. las tiras de aproximadamente 3 mm de ancho y hasta 75 mm de largo han resultado ser particularmente adecuadas en la fabricación de dispositivos de una sola vía según la presente invención. El tamaño de poro puede variar dentro de limites amplios, pero es preferiblemente de entre, aproximadamente 0,05 \mum y 20 \mum y, preferiblemente, de aproximadamente 5 \mum. El tamaño de poro está limitado en el extremo inferior por el tamaño de los analitos transportados, de los reactivos y de los marcajes de partículas coloidales. Si el tamaño de poro es demasiado pequeño, los materiales de ensayo pueden ser transportados lentamente o nada en absoluto. En el extremo superior, el tamaño de poro está limitado por la capacidad de unión. Generalmente se desea que el transporte cromatográfico sea rápido, completándose el transporte y el ensayo en menos de cinco minutos y, preferiblemente, menos de o aproximadamente dos minutos. El transporte cromatográfico no debería ser tan rápido que la capacidad de unión específica se pierda, ya que los reactivos no tienen tiempo de unirse específicamente entre sí. La combinación del tamaño de poro y del grosor del 1 substrato puede variar, por lo tanto, según. las características de los solventes cromatográficos, de los reactivos específicos, de los materiales de muestra y de los marcajes de partículas coloidales utilizados con objeto de obtener las propiedades deseadas de velocidad y resolución.
Se desea, en la formación de los materiales de la tira de la presente invención, evitar cualquier irregularidad en los materiales o en los bordes de los materiales, que podría causar un flujo desigual a través del material. Los medios para dar forma a los materiales de la tira incluyen el uso de una cortadora de papel con una cuchilla rotatoria de carburo de tungsteno. Un medio preferido, sin embargo, incluye el uso de corte por láser, que es particularmente adecuado para uso en las técnicas de producción en masa.
Debido a que el medio cromatográfico del dispositivo es preferiblemente inerte, puede tener que ser activado en cualquier zona en la que se desee inmovilizar un reactivo de unión especifica frente al transporte por solvente. Se requerirán diversos métodos para hacer que el reactivo quede inmovilizado según la naturaleza química concreta del material substrato y del segundo reactivo. En general, cuando el medio es nitrocelulosa o un éster mixto de nitrocelulosa, no se requiere ninguna unión química especial para la inmovilización de los reactivos. Se pueden emplear varias técnicas para otros materiales y reactivas, que incluyen la funcionalización con materiales tales como carbonildiimidazol, glutaraldehido o ácido succínico, o tratamiento con materiales tales como bromuro de cianógeno. Otras reacciones adecuadas incluyen el tratamiento con bases de Schiff y borohidruro para la reducción de grupos aldehidicos, carbonilo y amino. Se pueden inmovilizar ADN, ARN y determinados antígenos frente al transporte por solvente horneando sobre el material cromatográfico. El horneado puede ser realizado a temperaturas que varíen entre aproximadamente 60ºC y aproximadamente 120ºC durante periodos de tiempo que varíen entre aproximadamente cinco minutos y aproximadamente 12 horas, pero, preferiblemente, a aproximadamente 80ºC durante aproximadamente dos horas.
Barreras de transporte por solvente
Se conocen diversos medios para conseguir el transporte secuencial de reactivos y de materiales de muestra, tales como los descritos en la Solicitud de Patente Europea Nº 262.328.
Las barreras de solvente que bloquean el flujo cromatográfico según la invención pueden ser formadas por diversas técnicas físicas o químicas de decapado. Se ha visto que huecos de menos de 0,1 mm de anchura evitan el flujo de líquido. Un medio preferido para formar dichas barreras incluye el uso de técnicas de decapado por láser. Se puede usar un láser de CO_{2} según un procedimiento en el cual se monta nitrocelulosa soportada en Mylar® en una fijación de soporte que se monta en una tabla X-Y controlada por ordenador capaz de tolerancias de posicionamiento muy estrechas. Alternativamente, se puede usar un mecanismo de movimiento de haz. Utilizando una combinación de lentes ópticas adecuadas y un cuidadoso enfoque del haz, se puede enfocar una mancha de rayo láser, con un diámetro de aproximadamente: 0,13 mm (0,005 pulgadas) sobre la nitrocelulosa. Mediante el control cuidadoso de la potencia del láser, se puede eliminar o fundir un estrecho recorrido de nitrocelulosa, de aproximadamente 0,13 mm (0,005 pulgadas) de anchura con el soporte de Mylar®. El uso de un láser de CO_{2} es particularmente preferido debido al favorable efecto de acoplamiento de la luz del láser con la nitrocelulosa. No obstante, son adecuados otros tipos de láser, siempre que la longitud de onda del rayo láser produzca el efecto deseado sobre el material de transporte por solvente. A través del uso de un haz móvil o de una tabla X-Y, se pueden generar canales BAFFLED de recorridos de precisión u otras formas intrincadas sobre la nitrocelulosa.
Descripción de los reactivos de unión especifica
Como reactivos de unión específica útiles en la presente invención se incluyen aquellos materiales que son miembros de un par de unión específica y que consisten en un ligando y un receptor. El ligando y el receptor están relacionados en que el receptor se une específicamente al ligando, siendo capaz de distinguir al ligando de otros materiales que tengan características similares. Los métodos, kits y dispositivos según la presente invención son particularmente útiles en la práctica de las técnicas de ensayo inmunológico en las que los reactivos de unión específica son. antígenos y anticuerpos. También se pueden marcar materiales de unión específica tales como avidina, biotina, estreptavidina y antibiotina con partículas coloidales y se pueden utilizar en ensayos de transporte por solvente cromatográfico según la invención. Los métodos, kits y dispositivos pueden también resultar útiles en la práctica de ensayos de hibridación de ADN y ARN y otros ensayos de unión específica tales como los que implican a receptores para hormonas u otros agentes biológicamente activos.
Como anticuerpos útiles para llevar a cabo los inmunoensayos de la presente invención se incluyen aquéllos que son específicamente reactivos con diversos analitos, de los cuales se desea su detección en fluidos biológicos. Dichos anticuerpos son preferiblemente anticuerpos IgG o IgM o mezclas de los mismos, que están esencialmente libres de asociación con anticuerpos capaces de unirse a moléculas no analito. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden ser obtenidos comercialmente o pueden ser obtenidos por ascitis de ratón, cultivo de tejidos u otras técnicas conocidas en este campo. Una descripción típica del procedimiento de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales puede ser encontrada en Wands, J.R. y V.R. Zurawski, Gastroenterology 80:225 (1981); Marshak-Rothstein, A. y col., .J. Immunol. 122:2491 (1979); oi, V.Y. y L.A. Herzenberg, "Immunoglobulin Producing Hybrid", Mishell, B.B. y S.M. Shiigi (eds.) Selected Methods in Celular Immunology, San Francisco: W.H. Freeman Publishing, 1979, y en la Patente EE.UU. Nº 4.515.893, concedida a Kung y col. Se puede desear utilizar mezclas de anticuerpos monoclonales de especificidades antigénicas diferentes o de anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. También se contempla que puedan ser usados fragmentos de moléculas de anticuerpo como reactivos de unión específica según la invención, incluyendo medias moléculas de anticuerpo y los fragmentos Fab, Fab' o F(ab')_{2} conocidos en la técnica. Independientemente de la fuente o del tipo particular de anticuerpos, sin embargo, se prefiere que estén generalmente libres de impurezas. Los anticuerpos pueden ser purificados por cromatografía en columna u otro medio convencional, pero son preferiblemente purificados según técnicas conocidas de purificación por afinidad.
Como antígenos y haptenos útiles para llevar a cabo los inmunoensayos de la presente invención se incluyen aquellos materiales, ya sean naturales o sintéticos, que presentan determinantes antigénicos para los cuales son específicamente reactivos los anticuerpos analito cuando se presentan en los materiales de la tira cromatográfica de la invención. Entre los antígenos sintéticos se incluyen aquéllos que son construidos según síntesis químicas convencionales, así como aquéllos que son construidos según técnicas de ADN recombinante. También se pueden marcar los materiales antigénicos con partículas coloidales según la invención y se pueden utilizar en ensayos de tipo emparedado para la detección de analitos anticuerpo o en ensayos competitivos para la detección de analitos antígeno.
Se espera que los métodos y dispositivos según la presente invención sean útiles en la práctica de una amplia variedad de ensayos de unión específica, incluyendo los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos. Entre los materiales de hibridación de ADN y ARN útiles según la presente invención se incluirían las sondas polinucleotídicas de ADN y ARN que tienen secuencias de bases generalmente complementarias a las de los materiales génicos del analito. Las sondas de la invención tendrán, en general, entre aproximadamente 25 y aproximadamente 10.000 bases y, preferiblemente, entre aproximadamente 30 y aproximadamente 5.000 bases. Las sondas no necesitan ser perfectamente complementarias a las secuencias de bases de los materiales génicos del analito y, en general, se hibridarán siempre que exista una homología de aproximadamente un 70% o más entre las secuencias de bases. Las condiciones relacionadas con la hibridación de ADN y ARN están descritas en general en Crosa y col., J. Bact. 115(3), 904-911 (1973). Los materiales de las sondas polinucleotídicas pueden ser obtenidos según técnicas bien conocidas en este campo. Véase, por ejemplo, Kornberg, DNA Replication, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 670-679 (1978); Dallas y col., J. Bacteriol. 139, 850-858 (1979), y So y col., Nature, 277, 453-456 (1979).
Descripción de los agentes bloqueantes
Los agentes bloqueantes útiles en la preparación de dispositivos para la unión especifica de la presente invención son aquellos agentes capaces de bloquear el exceso de sitios de unión en el medio cromatográfico que podrían obstaculizar el transporte por solvente cromatográfico de los materiales de la muestra o reactivos de la invención. En general, no es necesario bloquear el material del substrato cromatográfico en la práctica de los ensayos de mezcla y operación en los que se mezclan los reactivos de unión específica con el material de la muestra y el solvente cromatográfico. El bloqueo del exceso de sitios de unión en el material del solvente cromatográfico es particularmente útil, sin embargo, cuando la muestra o cualquier reactivo están impregnados sobre la tira en ausencia de solvente cromatográfico. En la construcción de dispositivos de la presente invención, el medio cromatográfico está impregnado con el(los) reactivo(s) que ha(n) de ser inmovilizado(s) en la(s) localización(es) deseada(s). Una vez que el(los) reactivo(s) ha(n) sido inmovilizado(s) en las zonas deseadas, la tira es entonces procesada para bloquear el exceso de sitios de unión del material cromatográfico que podrían interferir con el transporte por solvente cromatográfico de otros reactivos o materiales de la muestra. Es particularmente adecuado el uso de soluciones bloqueantes consistentes en proteínas de fuentes tales como caseína, gelatina o suero total. Dichas proteínas son seleccionadas para que no interfieran o tengan reacción cruzada con los materiales reactivos de los ensayos. El bloqueo de los sitios puede ser preferiblemente llevado a cabo sumergiendo los materiales del substrato cromatográfico en una solución de caseína al 0,2% en solución salina fisiológica y secando al aire los materiales de la tira. Otros métodos incluyen la inmersión en soluciones de gelatina al 0,1% o BSA al 0,1%, seguido de secado al aire de los materiales del substrato.
Descripción del sistema solvente cromatográfico
Los kits para llevar a cabo ensayos de "inmersión y operación" según la invención utilizan mezclas de los materiales de la muestra y soluciones indicadoras en sí mismas para el transporte cromatográfico de los elementos móviles de los ensayos. Cuando los dispositivos de ensayo no son del formato inmersión, y operación y los materiales de la muestra son aplicados en cantidades menores en localizaciones que no están en el primer extremo de los dispositivos de ensayo, se requieren solventes cromatográficos para el transporte de los diversos reactivos y componentes de la muestra en los dispositivos de ensayo.
Son sistemas de solventes cromatográficos adecuados para los ensayos de unión específica según la invención aquéllos que son capaces de solubilizar el analito, los agentes facilitadores del transporte cromatográfico, los reactivos marcados con partículas coloidales y cualquier reactivo y material adicionales y de transportarlos en el material cromatográfico. Dichos solventes deben tener suficiente fuerza iónica para evitar la interacción electrostática de los materiales transportados con el material de la tira. Un solvente preferido para uso en procedimientos de inmunoensayo según la invención es la solución salina fisiológica, con un pH en el rango neutro. Se pueden incorporar proteínas, así como detergentes tales como dodecilsulfato de sodio (SDS), Triton® X-100 y desoxicolato de sodio (DOC) en el solvente cromatográfico en cantidades que minimicen la unión no especifica con el material de la tira, pero no en un exceso tal que se eviten las reacciones deseadas de unión e inmovilización. Se pueden usar también otros solventes cromatográficos tales como los solventes para cromatografía líquida de alto rendimiento (RPLC) y los solventes para cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC), que favorecen la solubilización de proteínas y otros reactivos y minimizan la unión a los materiales de la tira, tales como nitrocelulosa.
Ejemplo 1
Según este ejemplo, se sometió caseína a un procedimiento de purificación por tratamiento alcalino. Se mezclaron 200 g de caseína esencialmente libre de vitaminas {Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, nº de catálogo C-3400) con 800 ml de agua destilada. Se añadió entonces 1 litro de hidróxido de sodio 2 M, seguido de 4 ml de peróxido de hidrógeno al 30% y se mezcló la mezcla durante la noche a temperatura ambiente.
Se filtró el material a través de papel de filtro Whatman Nº 1 en un embudo Buchner y se añadieron aproximadamente 94,6 ml de ácido acético 100% (glacial) al filtrado para llevar el pH a 7,5. Se filtró de nuevo la mezcla, como antes, y se añadieron aproximadamente 220 ml de ácido acético al filtrado para llevar el pH a aproximadamente 4,5. Se incubó la mezcla durante 30 minutos, durante cuyo tiempo cayó fuera de la solución una gran masa de tipo caramelo. Se centrifugó el sobrenadante a 2800 rpm en una pequeña centrifuga RC5C durante 30 minutos y se añadió el gránulo a la masa de tipo caramelo, que fue lavado entonces con agua desionizada.
Se agitó después el material de tipo caramelo y se disolvió en un litro de una solución acuosa 0,15 M de amoníaco. (En el caso de que la caseína no se disuelva, habría que añadir una solución concentrada (15 M) de hidróxido de amonio hasta que el pH alcance 7,5). Se liofilizó entonces la caseína durante la noche, cuando estuvo completamente seca, con un rendimiento de 136 gramos.
Ejemplo 2
Según este ejemplo, se produjo un conjugado de oro coloidal/anticuerpo para la práctica de los métodos de la presente invención. Se utilizó material de vidrio siliconizado (Sigma silicote) a lo largo de todo el procedimiento, donde se llevaron 200 ml de cloruro de oro 0,01% (HAuC1_{4}\cdot3H_{2}O) (Fisher Scientific, G-54-1) a ebullición y se añadieron 2 ml de una solución 1% de citrato de sodio y se continua hirviendo durante 5 minutos, hasta que el color de la solución cambia de amarillo claro a púrpura a rojo. se añadió una solución de carbonato de potasio (0,02 M) a la suspensión con objeto de ajustar el pH a 7,6, seguido de adición de IgG de cabra anti-humano (1 mg/mi) (Kirkegaard-Perry, Gaithersburg, MD), de tal manera que se añadieron aproximadamente 10 \mug de IgG por ml de suspensión de oro (oro 0,01%).
Después de un minuto de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 0,1 ml de una solución de seroalbúmina bovina 30% en agua a 10 ml de la suspensión de oro. Se separó el. material agregado por centrifugación a 3000 rpm en el rotor SS34 de una centrífuga Sorval RC5C durante 10 minutos. Se sometió el sobrenadante a una etapa adicional de centrifugación a 6000 rpm durante una hora. Se volvió a suspender el conjugado de oro coloidal del gránulo en seroalbúmina bovina 2% en PBS (tampón fosfato de potasio 0,05 M, pH 7,4, en NaCl 0,9%), siendo las condiciones preferidas para el almacenamiento del liquido a 4ºC). Se añadió la preparación metasoluble de caseína, preparada como en el Ejemplo 1, para dar una concentración del 1% inmediatamente antes de la aplicación a la membrana. Se almacenó entonces el conjugado durante periodos prolongados en estado seco, sin pérdida de actividad después de 6 meses de almacenamiento a 37ºC en estado seco.
Ejemplo 3
Según este ejemplo, se construyeron y utilizaron dispositivos de inmunoensayo de tipo emparedado para la detección de anticuerpos de rubeola. Se laminó material de nitrocelulosa microporoso con un espesor de aproximadamente 0,1 mm y un tamaño medio de poro de 5 \mum con Mylar® y adhesivo (Monokote®, Top Flite Models,Inc., Chicago, IL.). Se cortaron tiras que medían 1 cm por 3,5 cm por láser de alta potencia y se modelaron senderos de transporte por solvente y una caja retardante por decapado por láser según el diseño general del dispositivo de la Fig. 4. Se aplicó antígeno de rubeola (Abbott Laboratories, North Chicago, IL.) (0,2 \mul, titulo 2500 HA) alas tiras en una tercera zona, en la que fue inmovilizado y secado al aire. Se bloquearon entonces los sitios de unión inespecífica en los materiales cromatográficos de la tira por incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente con una solución al 0,1% de gelatina LB en agua (Inotech, Wohlen, Suiza) y se dejó que las tiras se secaran en un corriente de aire. Se aplicó entonces 1 \mul de IgG de cabra anti-humana marcada con partículas de oro en un tampón anti-agregación producido según el Ejemplo 2 a una primera zona de cada tira (adyacente a la caja retardadora) y se secó.
Se aplicaron entonces muestras de suero positivas y negativas para el anticuerpo de rubeola a las segundas zonas entre las zonas primera y tercera y el primer extremo de las tiras fue sumergido en un solvente de transporte cromatográfico consistente en TBS y Triton® X 100 1%. Se dejó que el frente liquido progresara a los segundos extremos de los dispositivos durante un período de aproximadamente 2,5 minutos, transportando el material de la muestra y la IgG de cabra anti-humana marcada con oro a la tercera zona. Los sueros positivos y la inmovilización del primer reactivo marcado dieron lugar a la presencia de una mancha roja en la tercera zona. Las tiras estudiadas con sueros negativos no produjeron una señal en la tercera zona.
Ejemplo 4
En este ejemplo, se construyó y utilizó un dispositivo de inmunoensayo de tipo emparedado de mezcla y operación para la detección de gonadotropina coriónica humana (HCG). El dispositivo, que está modelado con el mismo diseño general que el dispositivo de la Fig. 2, produce una señal que confirma la presencia de un primer reactivo especifico marcado en la muestra como control negativo y produce una señal adicional que indica la presencia del analito HCG. Se laminó material microporoso de nitrocelulosa con un espesor de aproximadamente 0,1 mm y un tamaño medio de poro de 5 \mum con mylar y cemento (Monokote®) según los métodos del Ejemplo 3.
En una primera zona, se impregnaron las tiras con un segundo reactivo consistente en 0,35 \mul de 2 mg/ml de anticuerpo policlonal anti-HCG en solución salina tamponada que contenía sacarosa 1%. En una segunda zona, las tiras fueron impregnadas con un tercer reactivo consistente en 0,45 \mul de 100 \mug/ml de IgG de cabra anti-ratón en solución salina tamponada con Trié que contenía sacarosa 1%. Las dos zonas estaban localizadas a aproximadamente 10 mm del primer extremo de la tira y estaban dispuestas de tal manera que la segunda zona tenia la forma de un signo menos (-) y la primera zona estaba localizada en dos lados de la segunda zona, de tal manera que las dos zonas juntas forman un signo más (+).
Se incubaron anticuerpos anti-HCG (Abbott Laboratories, North Chicago, IL.) con 1 ml de suspensión de oro coloidal ajustada a pH 6,6 con carbonato de potasio según el método del Ejemplo 2, de tal manera que se añadieron aproximadamente 10 \muq de IgG por ml de suspensión de oro. Se preparó entonces una solución indicadora consistente en 10 \mul de anticuerpo anti-HCG marcado con oro coloidal. Se añadieron los anticuerpos marcados con partículas de oro a 10 \mul de solución salina tamponada con Tris que contenía caseína tratada alcalina 10% según el Ejemplo 1 y PEG 1% (P.M. 20.000). Se mezcló entonces la solución indicadora con 100 \mul de una muestra de orina a la que se habían añadido cantidades variables de HCG.
Se puso entonces en contacto la tira de ensayo en su primer extremo en la mezcla de muestra y solución indicadora y se dejó que el frente líquido se elevase a través de las zonas hasta el segundo extremo de la tira. Cuando la solución de la muestra no contenía nada de antígeno HCG, la mezcla de muestra y solución indicadora progresó a través de. la tira. Al contactar con la segunda zona en la que se habla inmovilizado IgG de cabra anti-ratón, los anticuerpos anti-HCG marcados fueron inmovilizados por la reacción inmunológica selectiva. Como no habla presencia de HCG en la solución de la muestra, no hubo unión específica con el segundo reactivo inmovilizado en la primera zona. Los reactivos marcados con oro coloidal produjeron de este modo una señal visualmente detectable en forma de un signo menos (-), lo que indica operabilidad de los reactivos, pero ausencia de HCG en la muestra.
Cuando la solución de la muestra contenía HCG, los anticuerpos anti-HCG marcados se unieron selectivamente al analito para formar un conjugado marcado. La mezcla de la solución de la muestra y de la solución indicadora fue transportada por transporte por solvente cromatográfico a través de la primera y de la segunda zona al segundo extremo. Al contactar con la primera zona en la que se hablan inmovilizado anticuerpos anti-HCG policlonales, el conjugado anticuerpo/HCG marcado con oro quedó inmovilizado por una reacción de unión específica del antígeno HCG con los anticuerpos anti-HCG. Al mismo tiempo, los conjugados HCG/anticuerpo y cualquier anticuerpo anti-HCG marcado no conjugado que contactaran con la segunda zona fueron inmovilizados por contacto con los anticuerpos IgG de cabra anti-ratón inmovilizados en esa zona. Los reactivos marcados con oro coloidal así inmovilizados tanto en la primera zona como en la segunda produjeron una señal visualmente detectable en forma de un signo más (+), lo cual indica la presencia de HCG en la muestra. La sensibilidad para HCG en este formato fue determinada como de tan sólo 25 mili-UI/ml.
Ejemplo 5
En este ejemplo, se preparó un inmunoensayo de tipo emparedado mezcla y operación para la detección de polisacárido A (APS) y se utilizó según los métodos del Ejemplo 4. Según este ejemplo, se prepararon tiras e nitrocelulosa según el Ejemplo 4 y se trataron con anticuerpos policlonales anti-APS, que fueron inmovilizados en la primera zona.
Se incubaron anticuerpos policlonales anti-APS de conejo (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) con 1 ml de suspensión de oro coloidal ajustada a pH 7,2 con carbonato de potasio según el método del Ejemplo 2, de tal manera que se añadieron aproximadamente 10 \mug de anticuerpo anti-APS por ml de suspensión de oro. Se preparó entonces una solución indicadora consistente en 10 \mul de anticuerpos anti-APS marcados con oro coloidal. Se añadieron los anticuerpos marcados con partículas de oro a 10 \mul de solución salina tamponada con Tris que contenía caseína tratada de forma alcalina al 10% según el Ejemplo 1 y PEG 1%. Se mezcló entonces la solución indicadora con 100 \mul de un tampón de extracción por torunda para strep al que se hablan añadido cantidades variables de APS (Abbott Laboratories, North Chicago, IL).
Se sumergió entonces la tira de ensayo en su primer extremo en la mezcla de una muestra y solución indicadora y se dejó que el frente liquido se elevara a través de la primera zona hasta el segundo extremo de la tira. El APS presente en las muestras reaccionó con los anticuerpos anti-APS y se unió a ellos en la solución indicadora para formar un conjugado. Estos conjugados fueron entonces inmovilizados en la primera zona por reacción entre el APS y los anticuerpos policlonales anti-APS inmovilizados en la zona. La presencia de APS en la muestra extraída con torunda quedó indicada por el desarrollo de un color púrpura como consecuencia de la concentración de las partículas de oro coloidal en la zona. Se determinó que la sensibilidad para el APS de los dispositivos según este formato era de tan sólo 0,5 ng/ml de APS.
Ejemplo 6
En este ejemplo, se produjeron dispositivos de inmunoensayo de tipo emparedado para la detección de anticuerpos de cerdo anti-trichina según los procedimientos generales del Ejemplo 3. Se prepararon tiras de ensayo de nitrocelulosa y se trataron con antígeno de trichina parcialmente purificado (Ministerio de Agricultura de los Estados Unidos) inmovilizado en la zona de detección.
Se produjeron partículas de selenio coloidal de diversos tamaños. Se pipetearon diversos volúmenes (alícuotas de 40, 80 y 150 \mul) de sol concentrado de selenio en viales individuales que contenían 4 ml de agua cada uno y se ajustó el pH de cada solución a 7,2-mediante la adición de carbonato de potasio 0,01 M. Se añadieron entonces a cada uno de los viales 150 \mul de anticuerpo de cabra anti-cerdo (concentración de 1 mg/mi) (Kirkegaard-Perry). Se mezclaron las soluciones y se dejaron incubar durante 10 minutos. Se añadió a cada solución una alícuota de 0,5 ml de una solución al 0,5% de caseína tratada de forma alcalina y se mezcló bien. Se centrifugaron alícuotas de 3 ml de cada solución de conjugado de selenio en porciones de 1 ml en una centrífuga de mesa TDx y se combinaron los gránulos para cada conjugado después de decantar el sobrenadante. Se resuspendieron los gránulos combinados de cada conjugado con una solución de caseína al 4% en 20 \mul de TBS. Se aplicaron entonces alícuotas de 0,5 \mul de las soluciones indicadoras de anticuerpos marcados con partículas de selenio a una primera zona de cada tira (adyacente a la caja retardadora) y se secaron.
Se aplicaron entonces muestras de suero positivas y negativas que contenían anticuerpos Trichina a las segundas zonas de los dispositivos entre la primera y la tercera zona y se sumergió el primer extremo de las tiras en un solvente de transporte cromatográfico consistente en TBS y Triton® X 100 1%. Se dejó que el frente líquido progresara a los segundos extremos de los dispositivos a lo largo de un período de aproximadamente 2,5 minutos, transportando el material de la muestra y los anticuerpos anti-cerdo marcados con selenio a la tercera zona. Todos los conjugados dieron señales positivas visibles con el conjugado utilizando partículas de selenio de 80 nm, que dieron los mejores resultados. Todas las soluciones de conjugado fueron estudiadas frente a un control negativo que indicaba que no habla unión especifica.
Ejemplo 7
En este ejemplo, se construyó un dispositivo de inmunoensayo de tipo emparedado mezcla y operación y se utilizó según los procedimientos generales del Ejemplo 4. En lugar de incubar los anticuerpos anti-HCG con partículas de oro, los anticuerpos fueron incubados con partículas de selenio coloidal. Se estudiaron partículas de selenio de tamaños variables frente a concentraciones variables de HCG. El conjugado que utilizaba partículas de 80 nm dio los mejores resultados, con un limite de detección de 20 mUI/ml. Los anticuerpos marcados con partículas mayores o menores dieron resultados menos sensibles, según se muestra en la siguiente Tabla 1. Todas las soluciones de conjugado fueron estudiadas frente a un control negativo que indicaba que no había unión específica.
TABLA 1
Tamaño de partícula (nm) Límite de detección (mUI/ml)
11 500
80 20
140 50
193 50
301 4000
El uso de reactivos marcados con partículas coloidales en técnicas de ensayo cromatográficas es de amplia aplicabilidad y no se limita a los ejemplos específicos descritos. Entra, por lo tanto, dentro de los conocimientos de la técnica practicar la presente invención según una amplia variedad de métodos y formatos. En consecuencia, sólo se deben poner sobre la invención aquellas limitaciones que aparecen en las siguientes reivindicaciones.

Claims (6)

1. Un método para determinar la presencia o la cantidad de una substancia en una muestra, cuyo método consiste en:
(a) poner en contacto dicha muestra con un medio cromatográfico, teniendo dicho medio al menos un sitio de reacción que incluye un reactivo inmovilizado capaz de unirse a un miembro seleccionado entre el grupo consistente en la substancia y un material marcado con partículas coloidales capaz de producir una respuesta detectable;
(b) transportar cromatográficamente en dicho medio cromatográfico dicho material marcado con partículas coloidales en presencia de un agente facilitador, del transporte cromatográfico, que comprende una proteína meta-soluble tratada químicamente para hacerla más hidrofílica que en su forma natural, evitando dicho agente la agregación y la inactivación de materiales y reactivos de unión específica en solución y promoviendo su transporte cromatográfico, mediante lo cual al menos una porción de dicho material marcado con partículas coloidales es cromatográficamente transportado al sitio de reacción para unirse al mismo, y
(c) determinar la respuesta detectable producida por dicho material marcado con partículas coloidales en el sitio de reacción como indicación de la presencia o cantidad de la substancia en la muestra,
siempre que se excluya un inmunoensayo de hipo emparedado, en el que se mezcla una muestra de suelo de un anticuerpo anti-trichina con una solución tamponada de anticuerpo de cabra anti-cerdo marcado con selenio coloidal y se pone en contacto con una tira de nitrocelulosa que tiene un solo sitio de reacción en el que está inmovilizado el antígeno de la trichina.
2. El método según la Reivindicación 1, donde dicho medio cromatográfico consiste en un segundo sitio de reacción que incluye un segundo reactivo inmovilizado que puede ser el mismo o diferente de dicho primer reactivo inmovilizado y que es capaz de unirse a dicho material marcado con partículas coloidales y que incluye la etapa de
(d) determinar la respuesta detectable producida por dicho material marcado con partículas coloidales en el segundo sitio de reacción como indicación de la presencia o de la cantidad de la substancia en la muestra.
3. Un método para determinar la presencia o la cantidad de una substancia en una muestra, cuyo método consiste en:
(a) poner en contacto la muestra con un medio cromatográfico, teniendo dicho medio al menos dos sitios de reacción, incluyendo el primer sitio de reacción una solución desecada de un material marcado con partículas coloidales en presencia de una proteína metasoluble, evitando dicha proteína metasoluble la agregación y la inactivación de los materiales y reactivos de unión específica en solución y promoviendo su transporte cromatográfico e incluyendo el segundo sitio de reacción un reactivo inmovilizado capaz de unirse a un miembro seleccionado entre el grupo consistente en la substancia y dicho material marcado con partículas coloidales;
(b) solubilizar dicho material marcado con partículas coloidales y transportar cromatográficamente al menos una porción de dicho material marcado con partículas coloidales al segundo sitio de reacción para unirse al mismo, y
(c) determinar la respuesta detectable producida por dicho material marcado con partículas coloidales en el segundo sitio de reacción como indicación de la presencia o de la cantidad de la substancia en la muestra.
4. El método según la Reivindicación 3, donde dicho medio cromatográfico consiste en un tercer sitio de reacción,que incluye un segundo reactivo inmovilizado que puede ser el mismo o diferente de dicho primer reactivo inmovilizado y que es capaz de unirse a dicho material marcado con partículas coloidales y que incluye la etapa
de
(d) determinar la respuesta detectable producida por dicho material marcado con partículas coloidales en dicho tercer sitio de reacción como indicación de la presencia o cantidad de la substancia en la muestra.
5. Un dispositivo de ensayo para determinar la presencia o cantidad de una substancia en una muestra, por medio de una o más reacciones de unión especifica, que consiste en:
un medio cromatográfico que tiene capilaridad y capacidad para un rápido transporte por solvente cromatográfico de uno o más reactivos y componentes reactivos de la muestra no inmovilizados, por medio de un solvente cromatográfico seleccionado, que incluye
un primer sitio de reacción que incluye una solución desecada de un material marcado con partículas coloidales en presencia de una proteína metasoluble, donde dicho material marcado con partículas coloidales es capaz de sufrir una rápida solubilización y donde dicha proteína metasoluble evita la agregación e inactivación de los materiales y reactivos de unión especifica en solución y promueve su transporte cromatográfico en dicho solvente, y
un segundo sitio de reacción que incluye un reactivo inmovilizado capaz de unirse a un miembro seleccionado entre el grupo consistente en dicha substancia y dicho material marcado con partículas coloidales.
6. Un kit para uso en ensayos de unión especifica para determinar la presencia o cantidad de una substancia en una muestra, que consiste en:
(1) una solución consistente en un material marcado con partículas coloidales en presencia de un agente facilitador del transporte cromatográfico, cuyo agente evita la agregación e inactivación de materiales y reactivos de unión especifica en solución y promueve su transporte cromatográfico, y
(2) un medio cromatográfico que tiene capilaridad y capacidad de transporte por solvente cromatográfico de reactivos y componentes reactivos de la muestra no inmovilizados por medio de un solvente cromatográfico seleccionado que incluye al menos un sitio de reacción que incluye un reactivo inmovilizado capaz de unirse a un miembro seleccionado entre el grupo consistente en dicha substancia y dicho material marcado con partículas coloidales.
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