WO2023163155A1 - 検出用デバイス - Google Patents

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WO2023163155A1
WO2023163155A1 PCT/JP2023/006958 JP2023006958W WO2023163155A1 WO 2023163155 A1 WO2023163155 A1 WO 2023163155A1 JP 2023006958 W JP2023006958 W JP 2023006958W WO 2023163155 A1 WO2023163155 A1 WO 2023163155A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
detection device
sample
target substance
control
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/006958
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
亮吾 東
Original Assignee
株式会社カネカ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
Publication of WO2023163155A1 publication Critical patent/WO2023163155A1/ja

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a detection device for detecting target substances in samples.
  • a substance (antibody/antigen) that specifically binds to the target substance is used to induce an antigen-antibody reaction to detect the target substance.
  • Immunoassays for detection are widely available.
  • a capture substance (antibody/antigen) that specifically binds to the target substance is immobilized at a predetermined position on a flaky carrier, and the sample is placed thereon with the labeled antibody.
  • An immunochromatographic method is known in which a target substance is developed in a mixed state, captured at the predetermined position, and visually detected (for example, Patent Document 1). This method does not require special equipment, etc., and can obtain detection results in about 5 to 30 minutes. Therefore, it is widely used mainly in clinical practice to aid diagnosis of infectious diseases.
  • a detection device used for immunochromatography is usually provided with a control section at a predetermined position on the carrier for confirming that the sample/reagent has been normally developed on the carrier.
  • a control section There are various configurations of the control section, but most of the currently used ones have a configuration in which an antibody (control antibody) that captures unreacted labeled antibody is immobilized.
  • Immunochromatography is usually performed by using a long thin strip-shaped thin piece as a solid phase carrier, and a capture portion is provided by immobilizing a capture substance in a line perpendicular to the longitudinal direction of the solid phase carrier, and the control is provided in parallel with the capture portion.
  • a portion is provided on the downstream side in the deployment direction (for example, Patent Document 1).
  • a detection device for detecting a target substance in a sample a first portion which is a solid-phase carrier comprising a target substance capturing portion and a control portion; a second portion containing a labeled antibody that specifically binds to the target substance; Capture molecules that specifically bind to the target substance are immobilized on the target substance capture portion, A control antibody that specifically binds to the labeled antibody is immobilized on the control portion, A detection device, wherein the capture molecules and the labeled antibodies are derived from different organisms, and the immobilized amount of the control antibody on the first portion is less than the immobilized amount of the capture molecules.
  • a detection device for detecting two or more target substances in a sample a first portion that is a solid-phase carrier comprising two or more target substance-capturing portions and one or more control portions; a second portion comprising two or more labeled antibodies; The two or more labeled antibodies specifically bind to different target substances, Capturing molecules that specifically bind to different target substances are immobilized on the two or more target substance capturing portions, A control antibody that specifically binds to one or more of the two or more labeled antibodies is immobilized on the one or more control regions, At least one of the capture molecules and the labeled antibody are derived from different organisms, and the immobilized amount of the control antibody in each control portion on the first portion is equal to the immobilized amount of the capture molecule in each target substance capturing portion.
  • a detection device for detection comprising detecting a target substance in a sample using the detection device according to any one of [1] to [10].
  • a kit for detecting a target substance in a sample comprising the detection device according to any one of [1] to [10] and a sample pretreatment reagent.
  • FIG. 1A and 1B are a top view (A) and an aa' cross-sectional view (B) of a detection device according to a first embodiment of the present invention
  • FIG. FIG. 2A is a top view (A) and a cross-sectional view (B) taken along the line aa' of a detection device according to a second embodiment of the present invention
  • 4 is a photograph showing the colored state of the solid phase carriers of Example 2 and Comparative Example 3.
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the color intensity of the control line of the negative samples produced in Examples 4 and 5 and Comparative Examples 5 and 6 and the elapsed time.
  • 2 is a photograph showing the colored state of solid phase carriers of Examples 4 and 5 and Comparative Examples 5 and 6.
  • FIG. 2 is a photograph showing the colored state of the solid phase carriers of Examples 6 and 7 and Comparative Example 7.
  • molar concentration refers to the molar amount per unit volume of solution (mol/dm 3 ) unless otherwise specified.
  • % concentration refers to weight concentration (wt %) unless otherwise specified.
  • antibody refers not only to intact antibodies, but also to antigen-specific binding fragments such as Fab, Fab' and F(ab') 2 .
  • the detection device of the first embodiment of the present invention is a detection device for detecting a target substance in a sample and having the following characteristics: target
  • the first part is a solid phase carrier comprising a substance capturing part and a control part
  • the second part contains a labeled antibody that specifically binds to the target substance.
  • a capture molecule that specifically binds is immobilized
  • a control antibody that specifically binds to the labeled antibody is immobilized on the control portion
  • the organisms derived from the capture molecule and the labeled antibody are different, and
  • the immobilized amount of the control antibody on the first portion is less than the immobilized amount of the capture molecule.
  • the detection device of this embodiment is capable of more accurate detection due to the features described above. More specifically, it is possible to prevent defective coloring of the control portion and suppress coloring of the background.
  • sample is not particularly limited as long as it may contain the target substance, but it can be a sample taken from a living subject, that is, a biological sample.
  • subject refers to mammals and birds. Birds refer to animals belonging to the subphylum Avians of the phylum Chordata, subphylum Vertebrates, and include, for example, chickens, ducks, quails, geese, ducks, turkeys, budgerigars, parrots, mandarin ducks, and swans. Mammals refer to animals belonging to the subphylum Mammalia, phylum Chordata, subphylum Mammalia, including humans and non-humans.
  • Examples include livestock animals such as sheep and goats, rodents such as mice and rats, and mammals kept in zoos.
  • the subject herein is preferably human.
  • biological samples include, but are not limited to, nasal swabs, pharyngeal swabs, nasal discharge, saliva, sputum, gargle, blood (e.g., whole blood, serum, plasma), urine, feces, milk, tissue or cells. It can be an extract or a mixture thereof.
  • the sample may be subjected to pretreatment such as dissolution, dilution, filtration, centrifugation, solvent extraction, etc., if necessary.
  • test sample a sample that can be directly loaded onto a detection device is referred to as a "test sample", regardless of the presence or absence of pretreatment.
  • the "target substance” is not particularly limited as long as it can bind to any of the capture molecules described below, and may be any of polypeptides, polysaccharides, low-molecular compounds, and the like. Polypeptides are preferred.
  • biomarkers that exist in a biological sample and can assist in diagnosing a subject's health condition, disease, or the like based on the presence or absence thereof are preferred.
  • target substances include polypeptides derived from infectious disease pathogens such as influenza virus, SARS-CoV-2, Zika virus, tuberculosis, and pneumococcus, disease markers such as tumor markers, sex hormones, antibodies (IgG, IgM etc.) are known, but are not limited to these.
  • the detection device of the present embodiment is particularly suitable for detection of polypeptides derived from pathogens of infectious diseases and detection of acute disease markers, for which rapid treatment policy determination is required in clinical practice.
  • FIG. 1 shows the configuration of an example of the detection device of this embodiment.
  • FIG. 1A is a top view of an example of a chromatographic apparatus
  • FIG. 1B is a cross-sectional view taken along the line aa' of FIG. 1A.
  • the detection device shown in FIG. 1 has at least a labeled antibody holding portion 12 and a solid phase carrier 13.
  • the solid phase carrier 13 has a target substance capturing portion 13a and a control portion 13b.
  • the detection device of this embodiment may include a sample receiving section.
  • the sample receiving portion 11 is, for example, a sample pad, and is a portion onto which a test sample is loaded (eg dropped).
  • a sample pad for example, a glass fiber sample pad or a cellulose fiber sample pad can be used.
  • the test sample loaded in the sample receiving portion 11 is deployed rightward.
  • the solid phase carrier 13 of the detection device 10 corresponds to the first part of this embodiment.
  • the solid-phase carrier 13 is, for example, a thin piece such as a membrane, and is a member on which a mobile phase containing labeled antibodies capable of binding to a test sample and a target substance is developed. When the target substance is present in the test sample, the mobile phase contains a complex of the target substance and the labeled antibody on the solid phase carrier 13 .
  • the shape of the solid-phase carrier 13 is not particularly limited, but it is particularly preferable to have a long and narrow strip-like shape as shown in the figure. Examples of membranes that can be used include nitrocellulose membranes, cellulose membranes, cellulose acetate membranes, polyethersulfone membranes, nylon membranes, polyester membranes, and glass fiber membranes. .
  • the target substance-capturing portion 13a on the solid-phase carrier 13 is a region where capture molecules capable of binding to the target substance are immobilized. It is a line-shaped part that has been When the test sample contains a target substance, in the target substance capturing section 13a, a complex of the target substance and a labeled antibody described later binds to the capture molecule to form a three-component complex of labeled antibody-target substance-capture molecule. A sandwich-type complex is formed.
  • any capture molecule may be used as long as it can bind to the target substance.
  • the target substance is an antigen such as a polypeptide
  • an antibody against the antigen can be used as the capture molecule.
  • the target molecule may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the target molecule is an antibody (IgG and/or IgM)
  • the antigen for that antibody can be used as the capture molecule.
  • a receptor, lectin, or the like that can bind to the target substance can be used.
  • These capturing molecules can be appropriately selected according to the type of target substance.
  • the capture molecule is an antibody, more preferably an IgG antibody, whose antigen is the target substance. That is, a preferred aspect of this embodiment is an immunoassay device, and further an immunochromatography device using the principle of chromatography.
  • the organism from which the capture molecule is derived must be different from the labeled antibody described below. It is not particularly limited as long as it is derived from a different organism from the labeled antibody. Examples include mice, rats, rabbits, goats, cows, pigs, sheep, dogs, cats, monkeys, camels, alpacas, birds, fish, and plants (lentils, etc.). may be either.
  • the capture molecule is derived from rabbits.
  • the capture molecule may contain multiple species of derived organisms, but at least one or more of the multiple species should be different from the labeled antibody.
  • the capture molecule is preferably other than a mouse antibody.
  • antibody drugs are used for immunosuppression and for the treatment and prevention of recurrence of malignant tumors.
  • Antibody drugs are mainly classified into four types: mouse antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies. be.
  • HAMA Human Anti-Mouse Antibody
  • HAMA Human Anti-Mouse Antibody
  • this HAMA may bind to mouse molecules and cause false positives and the like. Therefore, it is preferable to use a capturing molecule other than a mouse antibody to avoid problems such as false positives.
  • the solid phase carrier 13 has a control section 13b.
  • the control section 13b is a site that captures labeled antibodies, particularly free labeled antibodies that have not formed a complex between the target substance and the labeled antibodies, and is usually referred to as a control line.
  • the control section 13b is normally located downstream of the target substance capturing section 13a, as shown in the figure.
  • the control section 13b located downstream of the target substance capturing section 13a may capture surplus complexes that could not be captured by the target substance capturing section 13a.
  • the control portion 13b is a portion containing an antibody that specifically binds to the labeled antibody, and particularly a portion containing an antibody capable of capturing the antibody portion of the labeled antibody.
  • An antibody that specifically binds to the labeled antibody corresponds to the control antibody in the detection device of this embodiment.
  • the control antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody as long as it specifically binds to the labeled antibody.
  • a control antibody can be, for example, an anti-IgG antibody.
  • the origin of the control antibody is not particularly limited, and may be, for example, mouse, rat, rabbit, goat, cow, pig, sheep, dog, cat, monkey, camel, alpaca, bird, fish, or the like.
  • the organism of origin of the control antibody is preferably different from the organism of origin of the capture molecule.
  • the organism from which the control antibody is derived is preferably different from the organism from which the labeled antibody described below is derived.
  • the organisms of origin of the capture molecule, control antibody and labeled antibody are all different.
  • the control antibody is derived from goats.
  • the control antibody may contain more than one species of derived organism, but preferably at least one or more of the multiple species is different from the capture molecule. Alternatively, it is preferable that at least one or more derived organisms out of a plurality of species are different from the labeled antibody described below.
  • the immobilized amount of the control antibody on the control portion 13b of the solid phase carrier 13 needs to be less than the immobilized amount of the captured molecules on the target substance capturing portion 13a.
  • the "immobilized amount” is preferably compared using the total number of moles of molecules (capture molecule/control antibody) immobilized on the solid phase carrier as an indicator. However, when one capture molecule binds to a plurality of target molecules, it is necessary to compare the total number of moles of theoretically bindable target molecules. In the detection device 10 of the illustrated example, the areas of the target substance capturing portion 13a and the control portion 13b are the same.
  • the molar concentration of the solution coated on the solid-phase carrier can be used as an indicator for comparison. It is possible. Alternatively, if the capture molecules and the control antibody have approximately the same molecular weight, for example, both are intact antibodies, the total weight of the molecules immobilized on the solid-phase carrier can be used as an indicator for comparison. Furthermore, if the area of the coating region is the same, it is also possible to compare using the weight concentration (wt %) as an index.
  • the immobilized amount of the control antibody on the solid-phase carrier is 0.1 to 0.9 times, particularly 0.15 to 0.85 times, further 0.2 to 0.8 times the immobilized amount of the capture molecule. It is preferable to
  • the amount of capture molecules immobilized on the solid-phase carrier is not particularly limited, and can be changed as appropriate depending on the size and shape of the device, the type of target substance, and the type and condition of the sample.
  • the capture molecule is an intact antibody, it may be 0.001-10.0 ⁇ g/mm 2 , especially 0.01-1.0 ⁇ g/mm 2 , even 0.1-0.5 ⁇ g/mm 2 . can.
  • a small amount of capture molecules immobilized on the target substance capturing portion may be released and move downstream.
  • the capturing molecule and the labeled antibody are derived from the same organism, especially when the capturing molecule is an antibody, the captured molecule released and migrated downstream may have a structure similar to that of the labeled antibody.
  • a problem may arise that the binding site of the control antibody is masked by binding to the control antibody that has been detected. As a result, binding of the labeled antibody to the control portion is inhibited, resulting in insufficient coloration of the control portion, making it difficult to determine whether detection was performed normally.
  • the detection device of the present embodiment since the capture molecules and the labeled antibodies are derived from different organisms, even if the capture molecules are released from the target substance capture portion, the risk of masking the control antibody is extremely low. As described above, the detection device of the present embodiment has a configuration in which defective coloring of the control portion is less likely to occur.
  • control section is arranged further downstream in order to prevent the labeled antibody from stagnation upstream of the control section, background coloration is certainly less likely to occur.
  • placing the control section on the downstream side slows down the development speed of the test sample in the control section, further increasing the risk that the capture molecules released and moved downstream will mask the binding sites of the control antibody. Become.
  • the binding of the labeled antibody to the control portion is inhibited, resulting in insufficient coloration of the control portion, making it difficult to determine whether the detection was performed normally.
  • the amount of solid phase in the control portion by making the amount of solid phase in the control portion smaller than that in the target substance capturing portion, excessive coloring of the control portion is suppressed, while coloring of the target substance capturing portion is increased. can be made certain.
  • the first part (the solid phase carrier 13 in the detection device 10) of this embodiment preferably contains sugars and/or sugar alcohols.
  • sugars include, but are not limited to, sucrose, glucose, galactose, lactose, palatinose, maltose, isomaltose, trehalose, lactosucrose, maltotriose, maltotetraose, cyclodextrin, cyclodextran, and dextran.
  • Sugar alcohols include, but are not limited to, erythritol, sorbitol, maltitol, isomaltitol, lactitol, palatinit and the like. At least one of these sugars and sugar alcohols is preferably contained.
  • Sugars and sugar alcohols have the effect of stabilizing polypeptides such as antibodies in a dry state.
  • the sugar and/or sugar alcohol is preferably contained in at least one of the first portion and the second portion described below, particularly both.
  • the labeled antibody holding portion 12 of the detection device 10 corresponds to the second portion of this embodiment.
  • the labeled antibody holding part 12 is, for example, a conjugate pad, and is a member containing a labeled antibody that specifically binds to the target substance.
  • a labeled antibody refers to an antibody bound to any known labeling substance such as colored particles, enzymes, biotin, digoxigenin and the like.
  • the labeling substance it is preferable to use colored particles because they are particularly strongly colored and the results can be obtained quickly.
  • Colored particles include, for example, metal particles, colored latex particles, colored polystyrene particles, colored cellulose particles, fluorescent cellulose particles, and pigment-containing silica nanoparticles.
  • metal particles examples include colloidal metal particles such as colloidal gold particles, colloidal silver particles, and colloidal platinum particles.
  • conjugate pad for example, a glass fiber conjugate pad, a cellulose fiber conjugate pad, a polyester fiber conjugate pad, a polyethylene fiber conjugate pad, a polypropylene fiber conjugate pad, or the like is used. be able to.
  • the labeled antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can bind to the target substance.
  • the biological origin of the antibody used for the above-mentioned labeled antibody must be different from that of the capture molecule. If the antibody is derived from a different organism from the capturing molecule, the antibody is usually derived from an organism used in immunoassays, such as mice, rats, rabbits, goats, cows, pigs, sheep, dogs, cats, monkeys, and camels. , alpaca, birds, fish, and the like. In addition, the organism from which the labeled antibody is derived is preferably different from that of the control antibody. Preferably, the organism of origin of the labeled antibody is mouse. In addition, although the labeled antibody may contain a plurality of derived organisms, it is required that at least one of the plurality of derived organisms is different from the capture molecule.
  • the second portion (the labeled antibody holding portion 12 in the detection device 10) of the present embodiment preferably contains saccharides and/or sugar alcohols.
  • sugars include, but are not limited to, sucrose, glucose, galactose, lactose, palatinose, maltose, isomaltose, trehalose, lactosucrose, maltotriose, maltotetraose, cyclodextrin, cyclodextran, and dextran.
  • Sugar alcohols include, but are not limited to, erythritol, sorbitol, maltitol, isomaltitol, lactitol, palatinit and the like.
  • sugars and sugar alcohols are preferably contained.
  • Sugars and sugar alcohols have the effect of stabilizing polypeptides such as antibodies in a dry state.
  • colloidal metal particles are used as a labeling substance for labeled antibodies, they have the effect of suppressing aggregation of particles.
  • Sugars and/or sugar alcohols are preferably contained in at least one, especially both, of the second portion and the first portion.
  • the detection device 10 preferably has an absorbent pad 14.
  • the absorbent pad 14 holds the mobile phase so that it does not flow back after the mobile phase developed upstream, that is, from the sample receiving portion 11 on the left side of the detection device 10 toward the downstream side, that is, toward the right side, passes through the solid phase carrier 13 .
  • the absorbent pad for example, an absorbent pad made of cellulose fiber, an absorbent pad made of glass fiber, or an absorbent pad made of polystyrene fiber can be used.
  • the detection device 10 preferably has a backing sheet 15.
  • the backing sheet 15 may have an adhesive layer on a part of the upper surface or the front surface, and the solid phase carrier 3 may be fixed on the upper surface.
  • one or more of the sample receiving portion 11 , the labeled antibody holding portion 12 and the absorbent pad 14 may be fixed to the backing sheet 15 .
  • all of the sample receiving portion 11, the labeled antibody holding portion 12 and the absorbent pad 14 may be fixed to the backing sheet 15 as shown in the illustrated example.
  • the backing sheet for example, a backing sheet made of polypropylene, a backing sheet made of polystyrene, a backing sheet made of polyester, and a backing sheet made of vinyl chloride can be used.
  • the detection device 10 is not particularly limited in terms of shape and size. can be The shape and size can be changed as appropriate.
  • the detection device 10 has a labeled antibody holding portion 12, a solid phase carrier 13, and preferably a housing case (see Fig. not shown).
  • the housing case is made of a water-impermeable moldable material, such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, etc., and covers the entire test strip and encloses the sample receiver 11 and the target substance. It has a shape in which an opening or window is provided at a position corresponding to the capturing portion 13a, preferably further at a position corresponding to the control portion 13b. By providing the housing, the developed mobile phase can be prevented from leaking.
  • the detection device 10 of the illustrated example is a lateral flow type device in which the test sample develops in a substantially horizontal direction, but the detection device of the present embodiment is not limited to this format. It may be a strip-type device in which the end of the test piece is directly immersed and the test sample is spread using capillary action.
  • the first portion and the second portion are formed of separate members, but they may be formed of one member, and furthermore, if necessary, the sample receiving portion and the absorbent pad may be formed. One or more of them may be combined with the first portion and the second portion to form one member.
  • a second embodiment of the present invention is a detection device for detecting two or more target substances in a sample, which has the following characteristics: A detection device for detecting more than one type of target substance, comprising: a first portion that is a solid-phase carrier having two or more target substance-capturing portions and one or more control portions; and two or more types of labeled antibodies. and a second portion, wherein the two or more labeled antibodies specifically bind to different target substances, and the two or more target substance-capturing portions contain capture molecules that specifically bind to different target substances.
  • a control antibody that specifically binds to one or more of the two or more labeled antibodies is immobilized on the one or more control parts, and the captured molecule and the organism derived from the labeled antibody are immobilized. It is different, and the immobilized amount of control antibody in each control portion on the first portion is smaller than the immobilized amount of capturing molecules in each target substance capturing portion.
  • the detection device of this embodiment has the above-described features, so that it has the advantage of the first embodiment, that is, it can prevent coloring defects in the control section and suppress background coloring. In addition, it has the advantage of being able to detect two or more types of target substances in a sample with one detection device.
  • the two or more target substances referred to here are not particularly limited, and the above-described capture molecules (e.g., influenza virus, SARS-CoV-2, Zika virus, tuberculosis, pneumococcus, and other infectious disease pathogens-derived polypeptides, Any combination of disease markers such as tumor markers, sex hormones, antibodies (IgG, IgM, etc.) may be used, for example, by combining multiple disease markers with similar symptoms, these diseases It can be used to assist differential diagnosis.
  • disease markers such as tumor markers, sex hormones, antibodies (IgG, IgM, etc.
  • Such marker combinations include, for example, SARS-CoV-2 antigen and influenza virus antigen (type A and/or type B).
  • FIG. 2 shows the configuration of an example of the detection device of this embodiment.
  • FIG. 2A is a top view of an example of a chromatographic apparatus
  • FIG. 2B is a cross-sectional view taken along the line aa' of FIG. 1A.
  • the detection device 20 shown in FIG. 2 has a labeled antibody holding portion 22 and a solid phase carrier 23.
  • the solid phase carrier 23 has two target substance capturing portions 23a and 23a' and a control portion 23b. .
  • the configuration of the sample receiving section 21 of the detection device 20 is common to the configuration of the sample receiving section in the detection device of the first embodiment.
  • the solid phase carrier 23 of the detection device 20 corresponds to the first part of this embodiment.
  • the two target substance-capturing portions 23a and 23a' on the solid-phase carrier 23 are sites on which capture molecules capable of binding to different target substances are immobilized. According to the detection device 20, it is possible to capture two different target molecules in the sample with different target substance capture portions.
  • the detection device 20 in the illustrated example is provided with two target substance capturing portions, three or more target substance capturing portions may be provided in the present embodiment.
  • the preferred number of target substance capturing portions is 2-6, especially 2-4.
  • the solid phase carrier 23 has a control section 23b.
  • the control section 23b is normally located downstream of the target substance capturing sections 23a and 23a' as shown in the illustrated example.
  • the control unit 23b captures a free labeled antibody that does not particularly form a complex with the target substance in at least one of the two or more labeled antibodies described below.
  • the control section 23b may capture two or more types of labeled antibodies.
  • one control section is provided in the detection device 20 in the illustrated example, two or more control sections may be provided in the present embodiment.
  • the number of controls is one.
  • the source organism of the capture molecule must be different from any of the labeled antibodies described below.
  • Two or more capture molecules may be derived from the same organism as long as they are derived from different organisms than the labeled antibody. Preferably, all of the capture molecules are derived from rabbits.
  • two or more capture molecules may each contain a plurality of derived organisms, provided that at least one or more of the multiple derived organisms is different from any of the labeled antibodies.
  • the organism from which the control antibody is derived is not particularly limited, it is preferably different from any of the capture molecules.
  • the organism from which the control antibody is derived is preferably different from any of the labeled antibodies described below. If more than one control antibody is used, these control antibodies may be derived from the same organism.
  • control antibody is derived from goats.
  • control antibody (group) may contain more than one species of origin, but it is preferred that at least one of the plurality of species of origin is different from any of the two or more capture molecules.
  • at least one of the plurality of species is derived from a different organism from any of the two or more labeled antibodies.
  • the organisms of origin of the capture molecule group, the control antibody(groups) and the labeled antibody group are different from each other, but the organisms of origin within the same group are the same.
  • At least one of the capture molecules is preferably other than a mouse antibody in order to avoid the effects of HAMA. Also, it is more preferable that all of the capture molecules are other than mouse antibodies.
  • the immobilized amount of the control antibody on the control portion 23b of the solid phase carrier 23 is required to be less than the immobilized amount of any captured molecules on the target substance capturing portions 23a and 23a'.
  • the immobilized amount of the control antibody on the solid-phase carrier is 0.1 to 0.9 times, particularly 0.15 to 0.85 times, more preferably 0.15 to 0.85 times the average immobilized amount of the capturing molecules. It is preferably 2 to 0.8 times.
  • the control section As in the first embodiment, it is possible to prevent poor coloring of the control section by using different organisms for the capture molecules of the target substance capture section and the labeled antibody. Further, by making the immobilized amount of the control antibody smaller than the immobilized amount of the capturing molecule, the coloration of the target substance-capturing portion can be ensured as in the first embodiment. be.
  • the labeled antibody holding portion 22 of the detection device 20 corresponds to the second portion of this embodiment.
  • the labeled antibody holding part 22 is a member containing labeled antibodies that specifically bind to each of two or more target substances, that is, two or more labeled antibodies.
  • the organism from which the labeled antibody is derived must be a different organism from any of the two or more capture molecules.
  • two or more labeled antibodies may be derived from the same organism.
  • both of the two or more labeled antibodies are derived from mice.
  • two or more types of labeled antibodies may each contain multiple types of derived organisms, but at least one or more of the multiple types of derived organisms should be different from any of the two or more types of capture molecules.
  • the detection device 20 preferably has an absorbent pad 24.
  • the detection device 20 also preferably has a backing sheet 25 .
  • a housing case (not shown) may be provided.
  • Other configurations of the detection device of this embodiment are the same as those of the first embodiment unless there is a particular contradiction.
  • the detection method of the third embodiment of the present invention is characterized by detecting a target substance in a sample using the detection device described in the section "1. Detection device".
  • the target substance in the sample can be detected more accurately with a low risk of detection failure due to poor control coloring and false negatives due to background coloring. is.
  • the detection method of this embodiment is not particularly limited, it preferably includes the following steps.
  • Step 1) Step of preparing a test sample;
  • Step 2) A step of loading the test sample onto a predetermined position of the detection device; and
  • Step 3) A step of determining whether or not the target substance capturing portion and the control portion on the detection device are colored. Each step will be described below.
  • Step 1 Step of Preparing Test Sample
  • the detection method of the present embodiment preferably uses a sample removed from a subject.
  • subject refers to mammals and birds.
  • the “sample” referred to here is preferably a sample taken from a living subject, that is, a biological sample. Since biological samples are not necessarily suitable for development on a detection device, various methods such as dissolution, dilution, filtration, centrifugation, solvent extraction, etc., are required depending on the type and state of the biological sample and the type of target substance to be detected.
  • Pretreatment may be performed. This step includes this pretreatment step.
  • the pretreatment step is preferably a step using a sample pretreatment reagent.
  • the sample pretreatment reagent is not particularly limited, but may be a cell lysate, a sample diluent, an organic solvent, or the like.
  • a cell lysate containing SDS or the like is used to prepare the cells.
  • a step of removing the solid matter by filtration or centrifugation after diluting the sample with a sample diluent may be provided.
  • a step of extracting with an organic solvent may be provided.
  • a swab containing a nasopharyngeal swab or the like is used as a sample
  • a step of immersing the swab in a sample diluent may be provided.
  • a liquid sample such as urine or blood
  • a step of diluting the sample with a sample diluent to make the sample have a viscosity, pH, etc. suitable for development may be performed.
  • the term "test sample” refers to a sample ready for development on a detection device, with or without pretreatment.
  • Step 2 Step of Loading Test Sample into Predetermined Position of Detection Device
  • This embodiment includes a step of loading a sample into a predetermined position of the detection device.
  • a method of dropping the test sample onto the sample receiving portion 11 with a dropper, pipette, or the like can be adopted.
  • a method of immersing a portion corresponding to the sample receiving portion in a test sample such as a beaker or cup can be adopted.
  • Step 3 Step of Determining Whether or Not the Target Substance-Capturing Part and Control Part on the Detection Device Are Colored expand.
  • a developing solution can be additionally added.
  • the test sample develops from left to right.
  • the time required for deployment varies depending on the size of the device, the type and condition of the specimen, etc., but is usually about 5 to 30 minutes.
  • colored particles are used as the labeling substance, it is possible to directly confirm the coloring of the target substance capturing portion (test line) and the control portion (control line) after development.
  • a coloring component such as an enzyme substrate may be added to the additional developing solution.
  • the enzyme substrate or the like may be arranged in advance on the detection device, and the enzyme substrate or the like may be developed by loading the sample or developing solution.
  • test line and control line on the solid phase carrier are colored.
  • the determination of coloring may be performed visually, but it is also possible to determine the presence or absence of coloring using image processing software, or to quantify the strength of coloring, for example. For example, if both the test line and the control line are colored, it can be determined that the target substance has been detected. If no coloration is observed in the test line, it can be determined that there was no detectable amount of the target substance in the sample if there was coloration in the control line. If no coloration can be confirmed in the control line, it can be determined that correct detection was not possible (defective detection) due to poor development, deterioration of the reagent, or the state of the sample.
  • the detection method of the present embodiment can detect a target substance in a biological sample in a very simple manner, and thus can rapidly obtain detection results particularly in clinical practice. It is suitable for detection to assist diagnosis of desired infectious diseases, acute diseases, and the like.
  • a detection kit according to the fourth embodiment of the present invention is for detecting a target substance in a sample, comprising the detection device and the sample pretreatment reagent described in the section "1. Detection Device”. It's a kit. Further, the detection kit of the present embodiment is a kit used for the method described in the section "2. Detection method”.
  • sample pretreatment reagent is not particularly limited as long as it is a reagent used to make the sample developable on the device. It can be used as a solvent or the like.
  • sample pretreatment reagent is a sample diluent.
  • the labeled antibody used in the detection device contains colored particles such as metal particles, colored latex particles, colored polystyrene particles, colored cellulose particles, fluorescent cellulose particles, silica nanoparticles containing pigments, etc. as labeling substances. It is preferable to use a labeled antibody containing
  • the kit of this embodiment may include a filter for filtration, a tube for centrifugation, a cotton swab for sample collection, a cup/dropper, a squeeze tube, and the like. Furthermore, a color gauge or an instruction manual may be provided for assisting in determining the line after development.
  • Example 1 (1) Preparation of anti-SARS-CoV-2 NP antibody-bound colloidal gold A colloidal gold solution adjusted to pH 7.5 with 10 mM Tris-HCl buffer (particle size: 40 nm, concentration: 9.0 ⁇ 10 10 [number of particles/mL ], manufactured by BBI Solutions) was mixed with 1 mL of a 100 ⁇ g/mL mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody aqueous solution and incubated at room temperature for 10 minutes.
  • the antibody-bound colloidal gold suspension prepared in (1) above contains 5 wt% trehalose, 0.05 wt% polyethylene glycol (average molecular weight: 20,000), and bovine
  • An antibody-bound colloidal gold coating solution was prepared by adding serum albumin at 1 wt %.
  • An antibody-bound colloidal gold coating solution was uniformly applied to a glass fiber pad cut into a shape of 7 mm in height and 300 mm in length at 0.5 ⁇ L/mm 2 . Thereafter, the glass fiber pad coated with the antibody-bound colloidal gold coating solution was dried in a vacuum dryer to obtain a conjugate pad.
  • Control line coloring evaluation A cotton swab (FLOQ (registered trademark) swab 534100CS01-E, manufactured by Copan) from which a SARS-CoV-2 negative nasopharyngeal swab was collected was placed in 425 ⁇ L of the sample dilution solution, and the nasopharyngeal swab was used as the sample. A negative sample was prepared by suspending it in a diluent. 75 ⁇ L of the negative sample was dropped onto the sample pad, and the colored state of the control line was visually confirmed after 10 minutes.
  • FLOQ registered trademark
  • swab 534100CS01-E manufactured by Copan
  • Example 2 The procedure of Example 1 was repeated except that the 1.5 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody in (3) of Example 1 was changed to 1 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody.
  • Example 3 The procedure was carried out in the same manner as in Example 1, except that the 1.5 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody in (3) of Example 1 was changed to 0.5 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody. .
  • Example 1 The procedure of Example 1 was repeated except that the 1.5 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody in (3) of Example 1 was changed to 2 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody.
  • Example 3 The 2 mg/mL rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody in (3) of Example 1 was changed to 2 mg/mL mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody, and 1.5 mg/mL goat anti- The procedure was carried out in the same manner as in Example 1, except that the mouse immunoglobulin polyclonal antibody was changed to 1 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody.
  • Example 4 The 2 mg/mL rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody in (3) of Example 1 was changed to 2 mg/mL mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody, and 1.5 mg/mL goat anti- The procedure was carried out in the same manner as in Example 1, except that the mouse immunoglobulin polyclonal antibody was changed to 0.5 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody.
  • Table 1 shows the evaluation results of the control lines of the devices of Examples 1-3 and Comparative Examples 1-4.
  • photographs of Example 2 and Comparative Example 3 are shown in FIG.
  • Comparative Example 1 in which the same amount of antibody was applied to the test line and control line, the control line was the darkest, but the background was colored.
  • Comparative Examples 2 to 4 in which the same mouse-derived anti-SARS-CoV-2 antibody as the mouse antibody used for the conjugate pad was used for the test line, the control line was thin.
  • Example 4 The 2 mg / mL rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody in (3) of Example 1 was changed to 1 mg / mL rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody, and 1.5 mg / mL goat anti- An immunochromatographic device and a sample diluent were prepared in the same manner as in Example 1, except that the mouse immunoglobulin polyclonal antibody was changed to 0.5 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody, and the amount of the application liquid was doubled. .
  • a sample diluent to which no antigen was added was used as a negative sample.
  • 75 ⁇ L of the negative sample was dropped onto the sample pad, and the coloring intensity of the control line and the test line was measured every 30 seconds until 15 minutes had passed using an immunochromatographic reader (C10066, manufactured by Hamamatsu Photonics).
  • C10066 manufactured by Hamamatsu Photonics
  • Example 5 The mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody aqueous solution in (1) of Example 1 was changed to the rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody aqueous solution, and 2 mg / mL rabbit anti-SARS in (3) of Example 1 - CoV-2 NP monoclonal antibody changed to 1 mg/mL mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody and 1.5 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody to 0.5 mg/mL goat anti- An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Example 1, except that the rabbit immunoglobulin polyclonal antibody was used and the amount of the coating solution was doubled. Negative samples were developed as in Example 4.
  • Example 5 The procedure was carried out in the same manner as in Example 4, except that the 1 mg/mL rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody in Example 4 was changed to 1 mg/mL mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody.
  • Example 6 The mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody aqueous solution in (1) of Example 1 was changed to the rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody aqueous solution, and 2 mg / mL rabbit anti-SARS in (3) of Example 1 - CoV-2 NP monoclonal antibody changed to 1 mg/mL rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody and 1.5 mg/mL goat anti-mouse immunoglobulin polyclonal antibody to 0.5 mg/mL goat anti- An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Example 1, except that the rabbit immunoglobulin polyclonal antibody was used and the amount of the coating liquid was doubled. Negative samples were developed as in Example 4.
  • Table 2 shows the evaluation results of control lines and test lines of the devices of Examples 4 and 5 and Comparative Examples 5 and 6. Further, FIG. 4 shows the relationship between the coloring intensity of the control line of the negative samples prepared in Examples 4 and 5 and Comparative Examples 5 and 6 and the elapsed time. In addition, none of the test lines had a coloring intensity detected. FIG. 5 shows a photograph of each device after the negative sample was developed. In Comparative Examples 5 and 6, although the derived antibody used for the conjugate pad and the derived antibody used for the test line were the same type, it was confirmed that the coloration of the control line was low.
  • Example 6 An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Example 4. A sample dilution solution to which HAMA serum (HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche) was added as an interfering factor to a 20-fold dilution was used as a negative sample. 75 ⁇ L of the negative sample was dropped onto the sample pad, and the colored state of the control line and the test line after 15 minutes was visually confirmed.
  • HAMA serum HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche
  • Example 7 An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Example 5. A sample dilution solution to which HAMA serum (HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche) was added as an interfering factor to a 20-fold dilution was used as a negative sample. 75 ⁇ L of the negative sample was dropped onto the sample pad, and the colored state of the control line and the test line after 15 minutes was visually confirmed.
  • HAMA serum HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche
  • Comparative Example 7 An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Comparative Example 5. A sample dilution solution to which HAMA serum (HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche) was added as an interfering factor to a 20-fold dilution was used as a negative sample. 75 ⁇ L of the negative sample was dropped onto the sample pad, and the colored state of the control line and the test line after 15 minutes was visually confirmed.
  • HAMA serum HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche
  • Table 3 shows the control line and test line evaluation results of the devices of Examples 6 and 7 and Comparative Example 7.
  • 6 shows photographs of the negative samples of the devices of Examples 6 and 7 and Comparative Example 7 after development.
  • Comparative Example 7 the antibody-derived organism used for the conjugate pad and the antibody-derived organism used for the test line were both mice, but the control line was faint and the test line showed non-specific HAMA-derived coloration was confirmed.
  • the antibody-derived organism used for the conjugate pad and the antibody-derived organism used for the test line were different, but in both cases, the control line was darkly colored, and the test line No non-specific staining was seen. In the examples, it was shown that more accurate detection is possible without being affected by HAMA interference.
  • Example 8 Preparation of antibody-bound colloidal gold In the same manner as in Example 1 (1), a suspension of anti-SARS-CoV-2 NP antibody-bound colloidal gold (antibody-bound colloidal gold suspension) was obtained.
  • Example 1 (1) In the same manner as in Example 1 (1), except that the mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody in Example 1 (1) was changed to a mouse anti-influenza A virus NP monoclonal antibody, anti-A A suspension of type influenza virus NP antibody-bound colloidal gold (antibody-bound colloidal gold suspension) was obtained.
  • Example 8 In the same manner as in Example 1 (1), except that the mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody in Example 1 (1) was changed to a mouse anti-influenza B virus NP monoclonal antibody, anti-B A suspension of type influenza virus NP antibody-bound colloidal gold (antibody-bound colloidal gold suspension) was obtained. That is, in Example 8, three types of antibody-bound colloidal gold suspensions were prepared.
  • a control line was prepared by applying 1 ⁇ L/cm in a line shape with a width of 1 mm perpendicular to the developing direction.
  • the nitrocellulose membrane on which the test line and control line were prepared by coating was dried at 50°C for 30 minutes to obtain an antibody-coated membrane.
  • Example 9 1 mg/mL mouse anti-influenza A NP monoclonal antibody in (3) of Example 8 was changed to 1 mg/mL rabbit anti-influenza A NP polyclonal antibody, and 1 mg/mL mouse anti-influenza B NP monoclonal antibody was changed to 1 mg/mL rabbit anti-influenza B NP polyclonal antibody, but the procedure was performed in the same manner as in Example 8.
  • Example 8 In the same manner as in Example 8, except that the 1 mg / mL rabbit anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody in (3) of Example 8 was changed to 1 mg / mL mouse anti-SARS-CoV-2 NP monoclonal antibody. went.
  • Table 4 shows the control line and test line evaluation results of the devices of Examples 8 and 9 and Comparative Example 8.
  • the antibody-derived organism used for the conjugate pad and the antibody-derived organism used for all the test lines were mice, but it was confirmed that the coloration of the control line was low.
  • the control line was strongly colored, and no conspicuous coloration was observed in the background.
  • Example 9 Although the organism of origin of the antibody used in the conjugate pad was different from the organism of origin of the antibody used in all the test lines, the control line showed the strongest staining, and no conspicuous staining was observed in the background. I could't.
  • Example 10 An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Example 8. As an interfering factor, HAMA serum (HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche) was added to the sample diluent at a 20-fold dilution to obtain a negative sample. Thereafter, development was carried out in the same manner as in Example 8.
  • HAMA serum HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche
  • Example 11 An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Example 8. Mouse IgG was added to 100 ⁇ g/mL, and HAMA serum (HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterile distilled water) manufactured by Roche) as an interfering factor was added to the sample dilution solution at a 20-fold dilution, It was taken as a negative sample. Thereafter, development was carried out in the same manner as in Example 8.
  • HAMA serum HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterile distilled water) manufactured by Roche
  • Example 12 An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Example 9. As an interfering factor, HAMA serum (HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche) was added to the sample diluent at a 20-fold dilution to obtain a negative sample. Thereafter, development was carried out in the same manner as in Example 9.
  • HAMA serum HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche
  • Comparative Example 9 An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Comparative Example 8. As an interfering factor, HAMA serum (HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche) was added to the sample diluent at a 20-fold dilution to obtain a negative sample. Thereafter, development was carried out in the same manner as in Comparative Example 8.
  • HAMA serum HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterilized distilled water) manufactured by Roche
  • Comparative Example 10 An immunochromatographic device was prepared in the same manner as in Comparative Example 8. Mouse IgG was added to 100 ⁇ g/mL, and HAMA serum (HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterile distilled water) manufactured by Roche) as an interfering factor was added to the sample dilution solution at a 20-fold dilution, It was taken as a negative sample. Thereafter, development was carried out in the same manner as in Comparative Example 8.
  • HAMA serum HAMA Serum Type II (dissolved in 1 mL of sterile distilled water) manufactured by Roche
  • Table 5 shows the evaluation results of the control line and test line of the devices of Examples 10-12 and Comparative Examples 9 and 10.
  • Comparative Example 9 the antibody used in the conjugate pad and the antibody used in all test lines were both derived from mice, but non-specific coloring was confirmed in all test lines.
  • Comparative Example 10 is an example in which mouse IgG was added to the negative sample of Comparative Example 9. Since non-specific coloring of the test line was suppressed, the coloring of the test line in Comparative Example 9 was due to the influence of HAMA. It was speculated that there was In Comparative Example 10, the coloration of the added control line was significantly reduced.
  • Example 10 the antibody used for the conjugate pad was a mouse-derived antibody, whereas the antibody used for the A line and B line was derived from a mouse, and the antibody used for the S line was derived from a mouse.
  • Example 11 is an example in which mouse IgG was added to the negative sample of Example 10, but non-specific coloring of the test line was not detected. In addition, although a decrease in coloring of the control line was observed, it was at a sufficiently visible level.
  • Example 12 the antibody used for the conjugate pad was derived from a mouse, and the antibody used for the A line, B line and S line was derived from a rabbit. No non-specific staining was observed in the test line of either.

Abstract

より正確な検出が可能な検出用デバイスを提供する。　以下の特徴を有する、試料中の標的物質を検出するための検出用デバイスを提供する：標的物質捕捉部とコントロール部とを備える固相担体である第１部分と前記標的物質と特異的に結合する標識抗体を含む第２部分を備え、前記標的物質捕捉部には標的物質に特異的に結合する捕捉分子が固相化され、前記コントロール部には前記標識抗体に特異的に結合するコントロール抗体が固相化され、前記捕捉分子と前記標識抗体の由来生物が異なり、かつ、前記第１部分上のコントロール抗体の固相化量が、捕捉分子の固相化量よりも少ない。

Description

検出用デバイス
　本発明は、試料中の標的物質を検出するための検出用デバイスに関する。
　生体試料中の標的物質を検出する方法として、特に標的物質がタンパク質である場合は、標的物質に特異的に結合する物質（抗体／抗原）を用いて抗原抗体反応を生じさせることで標的物質を検出するイムノアッセイが広く利用されている。特に、迅速かつ簡便に標的物質を検出する方法として、薄片状の担体の所定の位置に標的物質に特異的に結合する捕捉物質（抗体／抗原）を固相化し、ここに試料を標識抗体と混合した状態で展開して標的物質を前記所定の位置に捕捉し、目視等で検出するイムノクロマト法が知られる（例えば、特許文献１）。この方法によれば、特殊な機器等を必要とせず、５～３０分程度で検出結果を得ることが可能であることから、主に臨床現場において感染症の診断補助等に多用されている。
　イムノクロマト法に用いられる検出用デバイスは、通常、担体上の所定の位置に、その試料・試薬の担体上の展開が正常に行われたことを確認するためのコントロール部が設けられる。コントロール部の構成は多様であるが、現在使用されているものの多くは、未反応の標識抗体を捕捉する抗体（コントロール抗体）が固相化された構成を有する。イムノクロマト法は、通常は、長細いストリップ状の薄片を固相担体として、その長手方向に垂直にライン状に捕捉物質が固相化されて捕捉部が設けられ、前記捕捉部と平行に前記コントロール部が展開方向下流側に設けられる（例えば、特許文献１）。
特開２０２１－１８８９６０号公報
　イムノクロマト法の検出用デバイスを作製するにあたり、条件によっては、コントロール部の着色不良、バックグラウンドの着色等により、正確な検出が行えないという問題が生じる。本発明の目的は、より正確な検出が可能な検出用デバイスを提供することである。
　本発明は以下を提供する。
［１］試料中の標的物質を検出するための検出用デバイスであって、
　標的物質捕捉部とコントロール部とを備える固相担体である第１部分と、
　前記標的物質と特異的に結合する標識抗体を含む第２部分とを備え、
　前記標的物質捕捉部には標的物質に特異的に結合する捕捉分子が固相化され、
　前記コントロール部には前記標識抗体に特異的に結合するコントロール抗体が固相化され、
　前記捕捉分子と前記標識抗体の由来生物が異なり、かつ、前記第１部分上のコントロール抗体の固相化量が捕捉分子の固相化量よりも少ない、検出用デバイス。
［２］前記捕捉分子が標的物質を抗原とする抗体である、［１］に記載の検出用デバイス。
［３］前記捕捉分子と前記コントロール抗体の由来生物が異なる、［１］又は［２］に記載の検出用デバイス。
［４］前記標識抗体と前記コントロール抗体の由来生物が異なる、［１］～［３］のいずれかに記載の検出用デバイス。
［５］前記第１部分上の前記コントロール抗体の固相化量が、前記捕捉分子の固相化量の０．１～０．９倍である、［１］～［４］のいずれかに記載の検出用デバイス。
［６］前記第１部分及び／又は第２部分が糖類及び／又は糖アルコールを含む、［１］～［５］のいずれかに記載の検出用デバイス。
［７］試料中の２種以上の標的物質を検出するための検出用デバイスであって、
　２以上の標的物質捕捉部と１以上のコントロール部を備える固相担体である第１部分と、
　２種以上の標識抗体を含む第２部分とを備え、
　前記２種以上の標識抗体はそれぞれ異なる標的物質と特異的に結合し、
　前記２以上の標的物質捕捉部には、それぞれ異なる標的物質と特異的に結合する捕捉分子が固相化され、
　前記１以上のコントロール部には前記２種以上の標識抗体のうち１種以上と特異的に結合するコントロール抗体が固相化され、
　前記捕捉分子の少なくとも１つと前記標識抗体の由来生物が異なり、かつ、前記第１部分上の各コントロール部のコントロール抗体の固相化量が、各標的物質捕捉部の捕捉分子の固相化量よりも少ない、検出用デバイス。
［８］イムノクロマト用デバイスである、［１］～［７］のいずれかに記載の検出用デバイス。
［９］前記標識抗体がマウス由来の抗体を含み、前記捕捉分子がウサギ由来の分子を含む、［１］～［８］のいずれかに記載の検出用デバイス。
［１０］前記コントロール抗体がヤギ由来の抗体を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の検出用デバイス。
［１１］試料中の標的物質を、［１］～［１０］のいずれかに記載の検出用デバイスを用いて検出する、検出方法。
［１２］［１］～［１０］のいずれかに記載の検出用デバイス及び試料前処理試薬を含む、試料中の標的物質を検出するためのキット。
［１３］前記試料前処理試薬が試料希釈液である、［１２］に記載のキット。
［１４］前記標識抗体が着色粒子を含む、［１２］又は［１３］に記載のキット。
［１５］前記捕捉分子が、マウス抗体以外の捕捉分子である、［１］～［６］のいずれかに記載の検出用デバイス。
［１６］前記捕捉分子の少なくとも１つが、マウス抗体以外の捕捉分子である、［７］～［１０］の何れかに記載の検出用デバイス。
［１７]前記捕捉分子が、すべてマウス抗体以外の捕捉分子である、［１６］に記載の検出用デバイス。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-029331号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、より正確な検出が可能な検出用デバイスを提供することが可能である。
本発明の第１の実施形態の検出用デバイスの上面図（Ａ）及びａ－ａ’断面図（Ｂ）である。 本発明の第２の実施形態の検出用デバイスの上面図（Ａ）及びａ－ａ’断面図（Ｂ）である。 実施例２及び比較例３の固相担体の着色状態を示す写真である。 実施例４、５及び比較例５、６で作製した陰性サンプルのコントロールラインの着色強度と経過時間との関係を示すグラフである。 実施例４、５及び比較例５、６の固相担体の着色状態を示す写真である。 実施例６、７及び比較例７の固相担体の着色状態を示す写真である。
　本明細書において「含有量」又は「量」とは、特に記載のない限り、モル量を指すものとする。また「モル濃度（Ｍ）」は、特に記載のない限り、溶液単位体積当たりのモル量（モル／ｄｍ３）を指すものとする。本明細書において％濃度は、特に記載のない限り、重量濃度（ｗｔ％）を指すものとする。本明細書において「抗体」とは、インタクトな抗体のみを示すものではなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗原に特異的に結合する結合性断片も包含するものとする。
１．検出用デバイス
１－１　第１の実施形態の概要
　本発明の第１の実施形態の検出用デバイスは、試料中の標的物質を検出するための、以下の特徴を有する検出用デバイスである：標的物質捕捉部とコントロール部とを備える固相担体である第１部分と、前記標的物質と特異的に結合する標識抗体を含む第２部分とを備え、前記標的物質捕捉部には標的物質に特異的に結合する捕捉分子が固相化され、前記コントロール部には前記標識抗体に特異的に結合するコントロール抗体が固相化され、前記捕捉分子と前記標識抗体の由来生物が異なり、かつ、前記第１部分上のコントロール抗体の固相化量が、捕捉分子の固相化量よりも少ない。
　本実施形態の検出用デバイスは、上記の特徴を備えることにより、より正確な検出が可能である。より具体的には、コントロール部の着色不良を防ぎ、かつ、バックグラウンドの着色を抑えることが可能である。
　本明細書において「試料」は、標的物質を含む可能性のあるものであれば特に限定されないが、生体である対象から取り出された試料、すなわち生体試料とすることができる。ここでいう「対象」は、哺乳類及び鳥類を指す。鳥類は、脊索動物門脊椎動物亜門鳥綱に属する動物を指し、例えば、ニワトリ、アヒル、ウズラ、ガチョウ、カモ、シチメンチョウ、セキセイインコ、オウム、オシドリ、ハクチョウ等が挙げられる。哺乳類は、ヒト及びヒト以外を包含する、脊索動物門脊椎動物亜門哺乳網に属する動物を指し、例えば、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類、動物園で飼育される哺乳類動物などが含まれる。本明細書における対象は、好ましくは、ヒトである。生体試料としては、特に限定されないが、例えば、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、鼻汁、唾液、喀痰、うがい液、血液（例、全血、血清、血漿）、尿、糞便、乳汁、組織又は細胞抽出液、あるいはこれらの混合物とすることができる。試料は、必要に応じて、溶解、希釈、ろ過、遠心分離、溶媒抽出等の前処理が行われていてもよい。特に、本実施形態の検出用デバイス上にロードして、後述の固相部材上に展開させる必要があることから、粘性が低く、かつ固形物の少ない液体状であることが好ましい。以下、本明細書において、前処理の有無にかかわらず、検出用デバイスに直接ロード可能な状態の試料を「被験試料」と称する。
　本明細書において「標的物質」は、後述の捕捉分子のいずれかと結合可能な物質であれば、特に限定されず、ポリペプチド、多糖、低分子化合物等のいずれであってもよい。好ましくはポリペプチドである。特に、生体試料中に存在し、その存在の有無により、対象の健康状態、疾患の有無等の診断を補助できる生体マーカーであることが好ましい。このような標的物質としては、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ジカウイルス、結核菌、肺炎球菌等の感染症病原由来のポリペプチド、腫瘍マーカー等の疾患マーカー、性ホルモン、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ等）などが知られるが、これらに限定されない。本実施形態の検出用デバイスは、特に、臨床現場で短時間での治療方針決定が必要とされる感染症の病原由来のポリペプチドの検出や、急性疾患マーカーの検出に好適に使用される。
１－２　第１の実施形態の構成
　本実施形態の検出用デバイスの例を図面を参照して以下に説明するが、本発明の範囲を図示例に限定することを意図するものではない。
　図１に、本実施形態の検出用デバイスの一例の構成を示す。図１Ａは、クロマトグラフ装置の一例の上面図であり、図１Ｂは、図１Ａのａ－ａ’断面図である。図１で表される検出用デバイスは、標識抗体保持部１２、固相担体１３を少なくとも有しており、固相担体１３は、標的物質捕捉部１３ａ及びコントロール部１３ｂを備える。
　本実施形態の検出用デバイスは、試料受容部を備えていてもよい。図示例の検出用デバイス１０において、試料受容部１１は、例えばサンプルパッドであり、被験試料がロード（例えば滴下）される部位である。サンプルパッドとしては、例えば、グラスファイバー製のサンプルパッド、セルロースファイバー製のサンプルパッドを用いることができる。検出用デバイス１０において、試料受容部１１にロードされた被験試料は、右方向に向かって展開する。
　検出用デバイス１０の固相担体１３は、本実施形態の第１部分に相当する。固相担体１３は、例えばメンブレン等の薄片であり、被験試料及び標的物質と結合可能な標識抗体を含む移動相が展開する部材である。被験試料中に標的物質が存在する場合には、固相担体１３上において、標的物質と標識抗体との複合体が移動相に含まれる。固相担体１３の形状は、特に限定されないが、特に図示例のような長細いストリップ状の形状とすることが好ましい。メンブレンとしては、例えば、ニトロセルロース製のメンブレン、セルロース製のメンブレン、酢酸セルロース製のメンブレン、ポリエーテルスルフォン製のメンブレン、ナイロン製のメンブレン、ポリエステル製のメンブレン、グラスファイバー製のメンブレンを用いることができる。
　固相担体１３上の標的物質捕捉部１３ａは、標的物質と結合可能な捕捉分子が固相化された部位であり、例えば、通常、テストラインと称される、メンブレンの長手方向に垂直に配されたライン状の部位である。被験試料に標的物質が含まれる場合には、標的物質捕捉部１３ａでは、標的物質と後述の標識抗体との複合体が捕捉分子と結合し、標識抗体－標的物質－捕捉分子の三成分から形成されるサンドイッチ型複合体が形成される。
　捕捉分子としては、標的物質と結合可能な物であればよく、標的物質がポリペプチド等の抗原である場合には、例えば該抗原に対する抗体を捕捉分子として使用することができる。抗体を使用する場合、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。あるいは、標的分子が抗体（ＩｇＧ及び／又はＩｇＭ）の場合、該抗体に対する抗原を捕捉分子として使用することができる。あるいは、標的物質と結合可能なレセプター、レクチン等を使用することができる。これらの捕捉分子は標的物質の種類に応じて、適宜選択することができる。好適には、前記捕捉分子は前記標的物質を抗原とする抗体、さらに好適にはＩｇＧ抗体である。すなわち、本実施形態の好適な態様は、イムノアッセイ用のデバイスであり、さらに、クロマトグラフィーの原理を用いるイムノクロマト用のデバイスである。
　捕捉分子の由来生物は、後述の標識抗体とは異なることを要する。標識抗体と異なる由来生物であれば特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、ラクダ、アルパカ、鳥類、魚類等及び植物（レンズマメ等）のいずれであってもよい。好ましくは、捕捉分子の由来生物はウサギである。また、捕捉分子は複数種の由来生物を含んでもよいが、複数種のうち少なくとも１種以上の由来生物が、標識抗体と異なることを要する。
　捕捉分子は、マウス抗体以外とすることが好ましい。現在、免疫抑制や、悪性腫瘍の治療・再発予防のために抗体医薬品が使用されているが、抗体医薬品は、主に、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の４種に分類される。特にマウス抗体で構成される抗体医薬品を投与された患者の血清にＨＡＭＡ（Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）が存在することが知られる。捕捉分子としてマウス抗体を使用するイムノアッセイにおいては、このＨＡＭＡがマウス分子に結合して、偽陽性等を生じる可能性がある。そのため、捕捉分子をマウス抗体以外として、偽陽性等の問題を回避することが好ましい。
　固相担体１３は、コントロール部１３ｂを備える。コントロール部１３ｂは、標識抗体、特に標的物質と標識抗体との複合体を形成していない遊離の標識抗体を捕捉する部位であり、通常、コントロールラインと称される。コントロール部１３ｂは、通常は、図示例の通り、標的物質捕捉部１３ａよりも下流側に位置する。標的物質捕捉部１３ａよりも下流側に位置するコントロール部１３ｂは、標的物質捕捉部１３ａで捕捉できなかった余剰の複合体を捕捉する場合もある。コントロール部１３ｂは、標識抗体に特異的に結合する抗体を含む部位であり、特に標識抗体の抗体部分を捕捉可能な抗体を含む部位である。標識抗体に特異的に結合する抗体は、本実施形態の検出用デバイスにおけるコントロール抗体に相当する。コントロール抗体は、標識抗体に特異的に結合する抗体であれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。コントロール抗体は、例えば、抗ＩｇＧ抗体とすることができる。
　コントロール抗体の由来生物は、特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、ラクダ、アルパカ、鳥類、魚類等のいずれであってもよい。コントロール抗体の由来生物は、捕捉分子の由来生物と異なることが好ましい。あるいは、コントロール抗体の由来生物は、後述の標識抗体の由来生物と異なることが好ましい。最も好ましい態様においては、捕捉分子、コントロール抗体及び標識抗体の由来生物は全て異なる。好ましくは、コントロール抗体の由来生物はヤギである。また、コントロール抗体は複数種の由来生物を含んでもよいが、複数種のうち少なくとも１種以上の由来生物が捕捉分子と異なることが好ましい。あるいは、複数種のうち少なくとも１種以上の由来生物が後述の標識抗体と異なることが好ましい。
　固相担体１３のコントロール部１３ｂ上のコントロール抗体の固相化量は、標的物質捕捉部１３ａ上の捕捉分子の固相化量よりも少ないことを要する。ここでいう「固相化量」は、固相担体上に固定された分子（捕捉分子／コントロール抗体）の総モル数を指標として比較することが好ましい。ただし、捕捉分子が１分子で複数の標的分子と結合する場合は、理論上結合可能な標的分子の総モル数を比較することを要する。図示例の検出用デバイス１０では、標的物質捕捉部１３ａとコントロール部１３ｂの面積が同じであるから、このような場合は、固相担体上に塗布した溶液のモル濃度を指標として比較することも可能である。あるいは、捕捉分子及びコントロール抗体が、例えば、いずれもインタクトな抗体であるなど、その分子量がほぼ同等である場合は、固相担体上に固定された分子の総重量を指標として比較することも可能であり、さらに塗布領域の面積が同じであれば、重量濃度（ｗｔ％）を指標として比較することも可能である。固相担体上のコントロール抗体の固相化量は、捕捉分子の固相化量の０．１～０．９倍、特に０．１５～０．８５倍、さらに０．２～０．８倍とすることが好ましい。
　固相担体上に固相化する捕捉分子の量は、特に限定されず、デバイスの大きさ、形状、標的物質の種類、試料の種類や状態によって適宜変更することができる。例えば、捕捉分子がインタクトな抗体である場合、０．００１～１０．０μｇ／ｍｍ２、特に０．０１～１．０μｇ／ｍｍ２、さらに０．１～０．５μｇ／ｍｍ２とすることができる。
　検出用デバイス上に被験試料を展開させた際に、標的物質捕捉部に固相化された捕捉分子が少量遊離して下流に移動することがある。捕捉分子と標識抗体が同じ生物に由来する場合、特に捕捉分子が抗体の場合、遊離して下流に移動した捕捉分子が標識抗体と類似の構造を有し得ることから、コントロール部に固相化されたコントロール抗体に結合して、コントロール抗体の結合サイトをマスキングしてしまう、という問題が生じうる。これにより、標識抗体のコントロール部への結合が阻害されてコントロール部の着色が不十分となり、検出が正常に実施されたか判断することが困難となる。本実施形態の検出用デバイスは、捕捉分子と標識抗体の由来生物が異なることから、捕捉分子が標的物質捕捉部から遊離したとしても、コントロール抗体をマスキングするリスクは非常に低い。本実施形態の検出用デバイスは、上記の通り、コントロール部の着色不良が生じにくい構成を有する。
　一方、コントロール部の着色を強くした場合、コントロール部の上流側のバックグラウンドの着色が強くなることが判明した。特に後述の標識抗体の標識物質として金属コロイド、ラテックス等の着色粒子を使用した場合、コントロール部の表面に多くの粒子が集まることにより固相担体上に微小な障壁が生じ、上流側から新たに展開する標識抗体がコントロール部の上流側で滞留することで無用な着色を生じさせる。これにより、上流側に標的物質捕捉部がある場合、標的物質捕捉部の着色がバックグラウンドにより不明瞭となり、偽陰性が生じやすい。一方、標識抗体のコントロール部上流側での滞留を生じにくくするために、コントロール部をより下流側に配置させた場合、たしかにバックグラウンドの着色は起こりにくくなる。しかしながら、この場合、コントロール部を下流側に配置することによってコントロール部での被験試料の展開速度が遅くなり、遊離して下流に移動した捕捉分子がコントロール抗体の結合サイトをマスキングするリスクが更に高くなる。これにより、標識抗体のコントロール部への結合が阻害されてコントロール部の着色が不十分となり、検出が正常に実施されたか判断することが困難となり得る。本実施形態の検出用デバイスは、コントロール部の固相量を標的物質捕捉部の固相量よりも少なくすることで、コントロール部の過剰な着色を抑え、一方で標的物質捕捉部の着色をより確実なものとすることができる。
　本実施形態の第１部分（検出用デバイス１０においては固相担体１３）は、糖類及び／又は糖アルコールを含むことが好ましい。糖類としては、特に限定されないが、例えば、スクロース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、パラチノース、マルトース、イソマルトース、トレハロース、ラクトスクロース、マルトトリオース、マルトテ卜ラオース、シクロデキストリン、シクロデキストラン、デキストラン等が挙げられ、糖アルコールとしては、特に限定されないが、エリスリ卜ール、ソルビトール、マルチ卜ール、イソマルチトール、ラクチ卜ール、パラチニット等が挙げられる。これらの糖類及び糖アルコールのうち、少なくとも１種類が含まれることが好ましい。糖類及び糖アルコールは、抗体等のポリペプチドを乾燥状態で安定化させる効果を有する。糖類及び／又は糖アルコールは第１部分と後述の第２部分の少なくとも一方、特に両方に含まれることが好ましい。
　検出用デバイス１０の標識抗体保持部１２は、本実施形態の第２部分に相当する。標識抗体保持部１２は、例えばコンジュゲートパッドであり、前記標的物質と特異的に結合する標識抗体が含まれる部材である。標識抗体は、着色粒子、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン等の既知の標識物質のいずれかが結合した抗体を指す。標識物質としては、特に着色が強く、結果が早く得られることから、着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、例えば、金属粒子、着色ラテックス粒子、着色ポリスチレン粒子、着色セルロース粒子、蛍光セルロース粒子、色素を包含するシリカナノ粒子が挙げられる。金属粒子としては、金コロイド粒子、銀コロイド粒子、白金コロイド粒子等の金属コロイド粒子が挙げられる。コンジュゲートパッドとしては、例えば、グラスファイバー製のコンジュゲートパッド、セルロースファイバー製のコンジュゲートパッド、ポリエステルファイバー製のコンジュゲートパッド、ポリエチレンファイバー製のコンジュゲートパッド、ポリプロピレンファイバー製のコンジュゲートパッド等を用いることができる。
　標識抗体は、標的物質と結合可能であれば、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。上記の標識抗体に使用される抗体の由来生物は、捕捉分子と異なる由来生物とすることを要する。抗体の由来生物は、捕捉分子と異なる由来生物であれば、通常イムノアッセイに使用される抗体の由来生物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、ラクダ、アルパカ、鳥類、魚類等のいずれであってもよい。加えて、標識抗体の由来生物は、コントロール抗体と異なる由来生物とすることが好ましい。好ましくは、標識抗体の由来生物はマウスである。また、標識抗体は複数種の由来生物を含んでもよいが、複数のうち少なくとも１種以上の由来生物を、捕捉分子と異なる由来生物とすることを要する。
　本実施形態の第２部分（検出用デバイス１０においては標識抗体保持部１２）は、糖類及び／又は糖アルコールを含むことが好ましい。糖類としては、特に限定されないが、例えば、スクロース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、パラチノース、マルトース、イソマルトース、トレハロース、ラクトスクロース、マルトトリオース、マルトテ卜ラオース、シクロデキストリン、シクロデキストラン、デキストラン等が挙げられ、糖アルコールとしては、特に限定されないが、エリスリ卜ール、ソルビトール、マルチ卜ール、イソマルチトール、ラクチ卜ール、パラチニット等が挙げられる。これらの糖類及び糖アルコールのうち、少なくとも１種類が含まれることが好ましい。糖類及び糖アルコールは、抗体等のポリペプチドを乾燥状態で安定化させる効果を有する。特に、標識抗体の標識物質として金属コロイド粒子を使用する場合、粒子の凝集を抑制する効果を有する。糖類及び／又は糖アルコールは第２部分と第１部分の少なくとも一方、特に両方に含まれることが好ましい。
　検出用デバイス１０は、吸収パッド１４を有することが好ましい。吸収パッド１４は、上流、すなわち検出用デバイス１０における左側の試料受容部１１から、下流、すなわち右側に向かって展開した移動相が固相担体１３を通過した後、移動相が逆流しないように保持できるものであることが好ましい。吸収パッドとしては、例えばセルロースファイバー製の吸収パッド、グラスファイバー製の吸収パッド、ポリスチレンファイバー製の吸収パッドを用いることができる。
　検出用デバイス１０は、バッキングシート１５を有することが好ましい。バッキングシート１５は、上面の一部又は前面に接着層を備えていてもよく、上面に固相担体３が固定されていてもよい。さらに、試料受容部１１、標識抗体保持部１２及び吸収パッド１４のうち、１つ以上がバッキングシート１５に固定されていてもよい。あるいは、図示例のように、試料受容部１１、標識抗体保持部１２及び吸収パッド１４の全てがバッキングシート１５に固定されていてもよい。バッキングシートとしては、例えばポリプロピレン製のバッキングシート、ポリスチレン製のバッキングシート、ポリエステル製のバッキングシート、塩化ビニル製のバッキングシートを用いることができる。
　検出用デバイス１０は、形状や大きさに関して特に限定は無いが、例えば長さが４０ｍｍ以上１２０ｍｍ以下であり、幅が３ｍｍ以上２０ｍｍ以下であり、厚みが１０μｍ以上５．０ｍｍ以下である、略直方体とすることができる。形状や大きさは適宜変更することができる。
　検出用デバイス１０は、標識抗体保持部１２、固相担体１３を有しており、好ましくは、試料受容部１１、吸収パッド１４及びバッキングシート１５を備える試験片を収容するためのハウジングケース（図示せず）を更に備えていてもよい。ハウジングケースは、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリ塩化ビニル等の水不透過性の成形可能な材料から構成されており、試験片全体を覆い、かつ試料受容部１１及び標的物質捕捉部１３ａに対応する位置、好ましくは更にコントロール部１３ｂに対応する位置に開口又は窓が設けられている形状を有する。ハウジングを設けることにより、展開した移動相の漏出を防止することができる。
　図示例の検出用デバイス１０は、被験試料がほぼ水平方向に展開するラテラルフロー型のデバイスであるが、本実施形態の検出用デバイスはこの形式に限定されず、例えば、容器中の被験試料に試験片の端部を直接浸漬して毛細管現象を用いて被験試料を展開させるストリップ型のデバイスであってもよい。図示例の検出用デバイス１０では、第１部分及び第２部分が別の部材で形成されているが、これらを１つの部材としてもよく、さらに、必要に応じて、試料受容部及び吸収パッドのうち１以上を、第１部分及び第２部分と合わせて１つの部材としてもよい。
１－３　第２の実施形態の概要
　本発明の第２の実施形態は、試料中の２種以上の標的物質を検出するための、以下の特徴を有する検出用デバイスである：試料中の２種以上の標的物質を検出するための検出用デバイスであって、２以上の標的物質捕捉部と１以上のコントロール部を備える固相担体である第１部分と、２種以上の標識抗体を含む第２部分とを備え、前記２種以上の標識抗体はそれぞれ異なる標的物質と特異的に結合し、前記２以上の標的物質捕捉部には、それぞれ異なる標的物質と特異的に結合する捕捉分子が固相化され、前記１以上のコントロール部には前記２種以上の標識抗体のうち１種以上と特異的に結合するコントロール抗体が固相化され、前記捕捉分子と前記標識抗体の由来生物が異なり、かつ、前記第１部分上の各コントロール部のコントロール抗体の固相化量が、各標的物質捕捉部の捕捉分子の固相化量よりも少ない。
　本実施形態の検出用デバイスは、上記の特徴を備えることにより、第１の実施形態の利点、すなわち、コントロール部の着色不良を防ぎ、かつ、バックグラウンドの着色を抑えることが可能であることに加えて、試料中の２種以上の標的物質を１つの検出用デバイスで検出することが可能である、という利点を有する。
　ここでいう２種以上の標的物質は、特に限定されず、前述の捕捉分子（例えば、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ジカウイルス、結核菌、肺炎球菌等の感染症病原由来のポリペプチド、腫瘍マーカー等の疾患マーカー、性ホルモン、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ等）など）のいずれの組み合わせであってもよいが、例えば、症状が類似する複数の疾患のマーカーを組み合わせることで、これらの疾患の鑑別診断の補助に利用することが可能となる。このようなマーカーの組み合わせとしては、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原とインフルエンザウイルス抗原（Ａ型及び／又はＢ型）が挙げられる。
　本実施形態の検出用デバイスの例を図面を参照して以下に説明するが、本発明の範囲を図示例に限定することを意図するものではない。図２に、本実施形態の検出用デバイスの一例の構成を示す。図２Ａは、クロマトグラフ装置の一例の上面図であり、図２Ｂは、図１Ａのａ－ａ’断面図である。図２で表される検出用デバイス２０は、標識抗体保持部２２、固相担体２３を有しており、固相担体２３は、２つの標的物質捕捉部２３ａ、２３ａ’及びコントロール部２３ｂを備える。
　検出用デバイス２０の試料受容部２１の構成は、第１の実施形態の検出用デバイスにおける試料受容部の構成と共通する。
　検出用デバイス２０の固相担体２３は、本実施形態の第１部分に相当する。固相担体２３上の２つの標的物質捕捉部２３ａ、２３ａ’は、それぞれが異なる標的物質と結合可能な捕捉分子が固相化された部位である。検出用デバイス２０によれば、試料中の２つの異なる標的分子をそれぞれ異なる標的物質捕捉部で捕捉することが可能である。なお、図示例の検出用デバイス２０には２つの標的物質捕捉部が設けられているが、本実施形態においては３以上の標的物質捕捉部が設けられていてもよい。標的物質捕捉部の好適な数は、２～６、特に２～４である。
　固相担体２３は、コントロール部２３ｂを備える。コントロール部２３ｂは、通常は、図示例の通り、標的物質捕捉部２３ａ、２３ａ’よりも下流側に位置する。コントロール部２３ｂは、後述の２種以上の標識抗体のうち少なくとも１種の標識抗体において、特に標的物質との複合体を形成していない遊離の標識抗体を捕捉する。コントロール部２３ｂは、２種以上の標識抗体を捕捉してもよい。なお、図示例の検出用デバイス２０には１つのコントロール部が設けられているが、本実施形態においては２以上のコントロール部が設けられていてもよい。好適には、コントロール部の数は１である。
　捕捉分子の由来生物は、後述の標識抗体のいずれとも異なることを要する。標識抗体と異なる由来生物であれば、２種以上の捕捉分子は同じ生物の由来であってもよい。好ましくは、複数の捕捉分子の由来生物は、いずれもウサギである。また、２種以上の捕捉分子は、複数種の由来生物をそれぞれ含んでもよいが、複数種のうち少なくとも１種以上の由来生物が、標識抗体のいずれとも異なることを要する。コントロール抗体の由来生物は、特に限定されないが、捕捉分子のいずれとも異なることが好ましい。あるいは、コントロール抗体の由来生物は、後述の標識抗体のいずれとも異なることが好ましい。２種以上のコントロール抗体を使用する場合、これらのコントロール抗体は同じ生物の由来であってもよい。好ましくは、コントロール抗体の由来生物は、ヤギである。また、コントロール抗体（群）は複数種の由来生物を含んでもよいが、複数種のうち少なくとも１種以上の由来生物が、２種以上の捕捉分子のいずれとも異なっていることが好ましい。あるいは、複数種のうち少なくとも１種以上の由来生物が、２種以上の標識抗体のいずれとも異なっていることが好ましい。好ましくは、捕捉分子群、コントロール抗体(群)及び標識抗体群の由来生物は互いに異なるが、同一群内の由来生物は同じである。
　捕捉分子の少なくとも１つはＨＡＭＡの影響回避のため、マウス抗体以外とすることが好ましい。また、捕捉分子の全てをマウス抗体以外とすることがより好ましい。
　固相担体２３のコントロール部２３ｂ上のコントロール抗体の固相化量は、標的物質捕捉部２３ａ、２３ａ’上の捕捉分子のいずれの固相化量よりも少ないことを要する。固相担体上のコントロール抗体の固相化量は、それぞれが捕捉分子の平均固相化量に対して、０．１～０．９倍、特に０．１５～０．８５倍、さらに０．２～０．８倍であることが好ましい。
　標的物質捕捉部の捕捉分子と標識抗体の由来生物を異なるものとすることにより、コントロール部の着色不良を防ぐことができる点は、第１の実施形態と同様である。また、コントロール抗体の固相化量を捕捉分子の固相化量より少なくすることにより、標的物質捕捉部の着色をより確実なものとすることができる点も、第１の実施形態と同様である。
　検出用デバイス２０の標識抗体保持部２２は、本実施形態の第２部分に相当する。標識抗体保持部２２は、２種以上の標的物質のそれぞれに特異的に結合する標識抗体、すなわち、２種以上の標識抗体が含まれる部材である。標識抗体の由来生物は、前記２種以上の捕捉分子のいずれとも異なる由来生物であることを要する。一方で、２種以上の標識抗体は、同じ生物の由来であってもよい。好ましくは、２種以上の標識抗体の由来生物は、いずれもマウスである。また、２種以上の標識抗体は、それぞれ複数種の由来生物を含んでよいが、複数種のうち少なくとも１種以上の由来生物が、２種以上の捕捉分子のいずれとも異なることを要する。
　検出用デバイス２０は、吸収パッド２４を有することが好ましい。また、検出用デバイス２０は、バッキングシート２５を有することが好ましい。さらに、ハウジングケース（図示せず）を備えていてもよい。本実施形態の検出用デバイスのその他の構成は、特に矛盾のない限り、第１の実施形態と同様である。
２．検出方法
　本発明の第３の実施形態の検出方法は、試料中の標的物質を、「１．検出用デバイス」の項に記載した検出用デバイスを用いて検出することを特徴とする。本実施形態の検出方法においては、試料中の標的物質を、コントロール着色不良による検出不良や、バックグラウンドの着色による偽陰性等をリスクの低い状態で、より正確に標的物質を検出することが可能である。
　本実施形態において、「対象」、「試料」及び「標的物質」の定義は、「１．検出用デバイス」の項に記載の定義と同様である。
　本実施形態の検出方法は、特に限定されないが、以下の工程を備えることが好ましい。
（工程１）被験試料を準備する工程；
（工程２）被験試料を検出用デバイスの所定の位置にロードする工程；及び
（工程３）検出用デバイス上の標的物質捕捉部及びコントロール部の着色の有無を判定する工程。
　以下各工程について説明する。
２－１　（工程１）被験試料を準備する工程
　本実施形態の検出方法は、対象から取り出した試料を使用することが好ましい。ここでいう「対象」は、哺乳類及び鳥類を指す。ここでいう「試料」は、生体である対象から取り出された試料、すなわち生体試料とすることが好ましい。生体試料は、必ずしも検出用デバイス上での展開に適した性状ではないことから、その種類や状態、検出対象たる標的物質の種類に応じて、溶解、希釈、ろ過、遠心分離、溶媒抽出等の前処理が行われていてもよい。本工程は、この前処理工程を包含する。
　前記前処理工程は、試料前処理試薬を使用する工程とすることが好ましい。試料前処理試薬は、特に限定されないが、細胞溶解液、試料希釈液、有機溶媒等とすることができる。前処理工程は、例えば、生体試料が、組織検体や、多くの細胞を含有する液状の検体であって、細胞質の成分を標的物質とする場合は、ＳＤＳ等を含む細胞溶解液を用いて細胞を溶解する工程とすることができる。また、糞便試料等の固形物を多く含む試料においては、試料希釈液で希釈した後、ろ過や遠心分離によって固形物を除去する工程を備えてもよい。標的物質が疎水性物質である場合は、有機溶媒で抽出する工程を備えてもよい。鼻咽頭ぬぐい液等を含むスワブを試料とする場合は、スワブを試料希釈液に浸漬する工程を備えてもよい。尿、血液等の液体試料の場合は、試料希釈液で希釈して、試料を展開に適した粘度、ｐＨ等とする工程としてもよい。上記した通り、「被験試料」の用語は、前処理の有無にかかわらず、検出用デバイス上での展開が可能になった状態の試料を指す。
２－２　（工程２）被験試料を検出用デバイスの所定の位置にロードする工程
　本実施形態は、試料を検出用デバイスの所定の位置にロードする工程を含む。例えば、図１に示す検出用デバイス１０を使用する場合は、試料受容部１１に被験試料をスポイト、ピペット等で滴下する手法をとり得る。あるいは、検出用デバイスがストリップ型の場合は、ビーカー、カップ等の被験試料に、試料受容部に相当する部分を浸漬する手法をとり得る。
２－３　（工程３）検出用デバイス上の標的物質捕捉部及びコントロール部の着色の有無を判定する工程
　検出用デバイス上に被験試料をロードすると、被験試料は固相担体上で所定の方向に展開する。このとき、被験試料のロードに加えて、追加で展開液を添加することもできる。図１に示す検出用デバイス１０を使用する場合は、被験試料は、左から右へ展開する。展開に要する時間は、デバイスの大きさ、検体の種類・状態等により異なるが、通常は５～３０分程度である。標識物質として着色粒子を使用する場合、展開後に標的物質捕捉部（テストライン）及びコントロール部（コントロールライン）の着色を直接確認することが可能である。例えば、標識物質として酵素等のそのままでは着色しない物質を使用する場合、追加の展開液中に酵素基質等の着色成分を含有させてもよい。または、酵素基質等を検出用デバイス上に予め配置しておき、試料又は展開液のロードにより、酵素基質等が展開する態様とすることもできる。
　被験試料のロードより所定時間が経過した後に、固相担体上の着色を観察して、着色の有無を判定することを要する。具体的には、固相担体上のテストライン及びコントロールラインの着色の有無を判定する。着色の判定は、目視で行ってもよいが、例えば、画像処理ソフトを用いて着色の有無を判定したり、着色の強さを定量化したりすることもできる。例えば、テストラインとコントロールラインの両方に着色があれば、標的物質が検出されたと判定できる。テストラインに着色が確認できない場合、コントロールラインに着色があれば、試料中に検出可能な量の標的物質は存在しなかったと判定できる。コントロールラインに着色が確認できない場合は、展開不良、試薬の劣化、検体の状態により、正しく検出ができなかった（検出不良）と判定できる。
　本実施形態の検出方法は、上記の通り、非常に簡便な手法で、生体試料中の標的物質の検出を行うことが可能であることから、特に、臨床現場において迅速に検出結果を得ることが望まれる感染症、急性疾患等の診断を補助するための検出に適している。
３．検出用キット
　本発明の第４の実施形態の検出用キットは、「１．検出用デバイス」の項に記載の検出用デバイス及び試料前処理試薬を備える、試料中の標的物質を検出するためのキットである。また、本実施形態の検出用キットは、「２．検出方法」の項に記載の方法のために使用されるキットである。
　本実施形態において、「試料前処理試薬」は、試料をデバイス上で展開可能な状態にするために使用される試薬であれば、特に限定されず、例えば、試料希釈液、細胞溶解液、有機溶媒等とすることができる。好ましくは、試料前処理試薬は、試料希釈液である。
　本実施形態において、検出用デバイスに使用される標識抗体は、標識物質として、金属粒子、着色ラテックス粒子、着色ポリスチレン粒子、着色セルロース粒子、蛍光セルロース粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等の着色粒子を含む標識抗体とすることが好ましい。
　本実施形態のキットは、測定対象となる試料の種類によっては、ろ過用フィルター、遠心分離用チューブ、試料採取用の綿棒、カップ・スポイト、スクイズチューブ等を備えてもよい。さらに、展開後のラインの判定を補助するためのカラーゲージや、使用説明書を備えていてもよい。
　以下、本発明をより詳細に説明するために実施例を示すが、本発明の範囲を実施例の範囲に限定することを意図するものではない。
［実施例１］
　（１）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰ抗体結合金コロイドの作製
　１０ｍＭトリス塩酸緩衝液でｐＨ７．５に調整した金コロイド溶液（粒径：４０ｎｍ、濃度：９．０×１０１０［粒子数／ｍＬ］、ＢＢＩ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ製）９ｍＬに対し、１００μｇ／ｍＬのマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体水溶液１ｍＬを混合して、室温で１０分間インキュベートした。さらに、１ｗｔ％のポリエチレングリコール（平均分子量２０，０００）水溶液０．５ｍＬ、１０ｗｔ％のウシ血清アルブミン水溶液１ｍＬを混合した後、再度室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後の混合物を、室温にて１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した後、得られた沈殿物に１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５を添加して再懸濁した。トリス塩酸緩衝液を用いた緩衝液置換を再度実施し、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰ抗体結合金コロイドの懸濁液（抗体結合金コロイド懸濁液）を得た。
　（２）抗体結合金コロイド塗布コンジュゲートパッドの作製
　上記（１）で作製した抗体結合金コロイド懸濁液に、トレハロースが５ｗｔ％、ポリエチレングリコール（平均分子量２０，０００）が０．０５ｗｔ％、ウシ血清アルブミンが１ｗｔ％となるようにそれぞれ添加して、抗体結合金コロイド塗布液を調製した。高さ７ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットしたグラスファイバーパッドに均一になるように、抗体結合金コロイド塗布液を０．５μＬ／ｍｍ２で塗布した。その後、抗体結合金コロイド塗布液が塗布されたグラスファイバーパッドを、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドを得た。
　（３）抗体塗布メンブレンの作製
　１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）に２ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体と３ｗｔ％のスクロースとを含む溶液を、高さ２５ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットしたニトロセルロースメンブレン（ＨＦ１３５、メルクミリポア製）に対して、ディスペンサーを用いて、高さ１０ｍｍの位置に、１μＬ／ｃｍで展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布してテストラインを作製した。
　１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体と３ｗｔ％のスクロースとを含む溶液を、前記ニトロセルロースメンブレンに対して、ディスペンサーを用いて、高さ１６ｍｍの位置に、１μＬ／ｃｍで展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布してコントロールラインを作製した。その後、テストライン及びコントロールラインが塗布により作製されたニトロセルロースメンブレンを、５０℃、３０分間乾燥させ、抗体塗布メンブレンを得た。
　（４）イムノクロマトデバイスの作製
　基材としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ製）に、前記（２）で作製したコンジュゲートパッド、前記（３）で作製した抗体塗布メンブレン、グラスファイバー製のサンプルパッド、セルロース製の吸収パッドを、上流側からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体塗布メンブレン、吸収パッドの順になるように、互いに重なり合わさるように貼り合わせた。裁断機にて４ｍｍの幅にカットし、幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマトデバイスを作製した。
　（５）試料希釈液の調製
　１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を１ｗｔ％、塩化ナトリウムを２００ｍＭとなるように加え、さらにウシ血清アルブミンを１ｗｔ％となるように添加して、試料希釈液を調製した。
　（６）コントロールライン着色評価
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性の鼻咽頭拭い液を採取した綿棒（ＦＬＯＱ（登録商標）スワブ５３４１００ＣＳ０１－Ｅ、コパン製）を試料希釈液４２５μＬに入れ、鼻咽頭ぬぐい液を試料希釈液に懸濁させ、陰性サンプルを調製した。サンプルパッドに陰性サンプル７５μＬを滴下し、１０分経過後のコントロールラインの着色状態を目視にて確認した。
［実施例２］
実施例１の（３）における１．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体を、１ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体に変更した以外は、実施例１と同様に行った。
［実施例３］
実施例１の（３）における１．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体を、０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体に変更した以外は、実施例１と同様に行った。
［比較例１］
実施例１の（３）における１．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体を、２ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体に変更した以外は、実施例１と同様に行った。
［比較例２］
　実施例１の（３）における２ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、２ｍｇ／ｍＬのマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体に変更した以外は、実施例１と同様に行った。
［比較例３］
　実施例１の（３）における２ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、２ｍｇ／ｍＬのマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体に変更し、１．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体を、１ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体に変更した以外は、実施例１と同様に行った。
［比較例４］
　実施例１の（３）における２ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、２ｍｇ／ｍＬのマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体に変更し、１．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体を、０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体に変更した以外は、実施例１と同様に行った。
［実施例１～３及び比較例１～４の結果］
　表１に実施例１～３及び比較例１～４のデバイスのコントロールラインの評価結果を示す。また、図３に実施例２及び比較例３の写真を示す。テストラインとコントロールラインとで同じ量の抗体を塗布した比較例１においては、コントロールラインは最も濃くなったが、バックグラウンドに着色が見られた。コンジュゲートパッドに使用したマウス抗体と同じマウス由来の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をテストラインに使用した比較例２～４では、コントロールラインが薄くなった。一方、コントロールラインの抗体量を減じ、ウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をテストラインに使用した実施例１～３は、いずれもコントロールラインに濃い着色が見られ、かつバックグラウンドに目立つ着色は見られず、より正確な検出が可能であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例４］
　実施例１の（３）における２ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、１ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体に変更し、１．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体を、０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体に変更し、塗布液量を２倍とした以外は、実施例１と同様にイムノクロマトデバイスと試料希釈液を作製した。
　抗原を添加していない試料希釈液を陰性サンプルとして使用した。サンプルパッドに陰性サンプル７５μＬを滴下し、イムノクロマトリーダー（Ｃ１００６６、浜松ホトニクス製）を用いて、１５分経過するまで３０秒毎にコントロールライン及びテストラインの着色強度を測定した。また、１５分経過後のコントロールライン及びテストラインの着色状態を目視にて確認した。
［実施例５］
　実施例１の（１）におけるマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体水溶液をウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体水溶液に変更し、実施例１の（３）における２ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、１ｍｇ／ｍＬのマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体に変更し、１．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体を、０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ウサギ免疫グロブリンポリクローナル抗体に変更し、塗布液量を２倍とした以外は、実施例１と同様にイムノクロマトデバイスを作製した。陰性サンプルについて、実施例４と同様に展開した。
［比較例５］
　実施例４における１ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、１ｍｇ／ｍＬのマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体に変更した以外は、実施例４と同様に実施した。
［比較例６］
　実施例１の（１）におけるマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体水溶液をウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体水溶液に変更し、実施例１の（３）における２ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、１ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体に変更し、１．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体を、０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ウサギ免疫グロブリンポリクローナル抗体に変更し、塗布液量を２倍とした以外は、実施例１と同様にイムノクロマトデバイスを作製した。陰性サンプルについて、実施例４と同様に展開した。
［実施例４、５及び比較例５、６の結果］
　表２に実施例４、５及び比較例５、６のデバイスのコントロールライン及びテストラインの評価結果を示す。また、図４に、実施例４、５及び比較例５、６で作製した陰性サンプルのコントロールラインの着色強度と経過時間との関係を示す。なお、テストラインの着色強度はいずれも検出されなかった。図５に、各デバイスの陰性サンプルを展開した後の写真を示す。比較例５及び６では、コンジュゲートパッドに使用した抗体の由来抗体とテストラインに使用した由来抗体の種類が同じであるが、コントロールラインの着色が低くなることが確認された。一方、実施例４及び５では、コンジュゲートパッドに使用した抗体の由来生物とテストラインに使用した由来生物が異なるが、いずれもコントロールラインに濃い着色が見られ、かつ、バックグラウンドに目立つ着色は見られなかった。コントロールラインとテストラインで使用する抗体の由来生物を異なるものとすることで、より短い時間でより正確な検出が可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例６］
　実施例４と同様にイムノクロマトデバイスを調製した。干渉因子としてＨＡＭＡ血清（ＨＡＭＡ　Ｓｅｒｕｍ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ（滅菌蒸留水１ｍＬに溶解）、ロシュ製）を２０倍希釈になるように添加した試料希釈液を陰性サンプルとして使用した。サンプルパッドに陰性サンプル７５μＬを滴下し、１５分経過後のコントロールライン及びテストラインの着色状態を目視にて確認した。
［実施例７］
　実施例５と同様にイムノクロマトデバイスを調製した。干渉因子としてＨＡＭＡ血清（ＨＡＭＡ　Ｓｅｒｕｍ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ（滅菌蒸留水１ｍＬに溶解）、ロシュ製）を２０倍希釈になるように添加した試料希釈液を陰性サンプルとして使用した。サンプルパッドに陰性サンプル７５μＬを滴下し、１５分経過後のコントロールライン及びテストラインの着色状態を目視にて確認した。
［比較例７］
　比較例５と同様にイムノクロマトデバイスを調製した。干渉因子としてＨＡＭＡ血清（ＨＡＭＡ　Ｓｅｒｕｍ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ（滅菌蒸留水１ｍＬに溶解）、ロシュ製）を２０倍希釈になるように添加した試料希釈液を陰性サンプルとして使用した。サンプルパッドに陰性サンプル７５μＬを滴下し、１５分経過後のコントロールライン及びテストラインの着色状態を目視にて確認した。
［実施例６、７及び比較例７の結果］
　表３に実施例６、７及び比較例７のデバイスのコントロールライン及びテストラインの評価結果を示す。また、図６に実施例６、７及び比較例７のデバイスの陰性サンプルを展開した後の写真を示す。比較例７では、コンジュゲートパッドに使用した抗体の由来生物とテストラインに使用した抗体の由来生物がいずれもマウスであるが、コントロールラインが薄くなり、かつテストラインにＨＡＭＡ由来とみられる非特異的な着色が確認された。一方、実施例６及び７では、コンジュゲートパッドに使用された抗体の由来生物とテストラインに使用された抗体の由来生物が異なるが、いずれもコントロールラインに濃い着色が見られ、かつテストラインに非特異的な着色は見られなかった。実施例においては、ＨＡＭＡ干渉の影響を受けずにより正確な検出が可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例８］
（１）抗体結合金コロイドの作製
　実施例１の（１）と同様に、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰ抗体結合金コロイドの懸濁液（抗体結合金コロイド懸濁液）を得た。
　実施例１の（１）におけるマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス　ＮＰモノクローナル抗体に変更した以外は、実施例１の（１）と同様の手法により、抗Ａ型インフルエンザウイルス　ＮＰ抗体結合金コロイドの懸濁液（抗体結合金コロイド懸濁液）を得た。
　実施例１の（１）におけるマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、マウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス　ＮＰモノクローナル抗体に変更した以外は、実施例１の（１）と同様の手法により、抗Ｂ型インフルエンザウイルス　ＮＰ抗体結合金コロイドの懸濁液（抗体結合金コロイド懸濁液）を得た。すなわち、実施例８では、３種類の抗体結合金コロイド懸濁液を調製した。
（２）抗体結合金コロイド塗布コンジュゲートパッドの作製
　（１）で作製した３種類の抗体結合金コロイド懸濁液の各液に、トレハロース、ポリエチレングリコール（平均分子量２０，０００）、ウシ血清アルブミンを、それぞれ５ｗｔ％、０．０５ｗｔ％、１ｗｔ％となるように添加して、３種類の抗体結合金コロイド塗布液を調製した。幅７ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットしたグラスファイバーパッドに均一になるように、抗体結合金コロイド塗布液を０．５μＬ／ｍｍ２で３種全てを塗布した。その後、抗体結合金コロイド塗布液が塗布されたグラスファイバーパッドを、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドを得た。
（３）抗体塗布メンブレンの作製
　１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１ｍｇ／ｍＬのマウス抗Ａ型インフルエンザ　ＮＰモノクローナル抗体と３ｗｔ％のスクロースとを含む溶液を、幅２５ｍｍ、長さ３５０ｍｍの形状にカットしたニトロセルロースメンブレン（ＨＦ１２０、メルクミリポア製）に対して、ディスペンサーを用いて、高さ１７ｍｍの位置に、１μＬ／ｃｍで展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布してＡ型インフルエンザテストライン（Ａライン）を作製した。
　１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１ｍｇ／ｍＬのマウス抗Ｂ型インフルエンザ　ＮＰモノクローナル抗体と３ｗｔ％のスクロースとを含む溶液を、前記ニトロセルロースメンブレンに対して、ディスペンサーを用いて、高さ２０ｍｍの位置に、１μＬ／ｃｍで展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布してＢ型インフルエンザテストライン（Ｂライン）を作製した。
　１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体と３ｗｔ％のスクロースとを含む溶液を、前記ニトロセルロースメンブレンに対して、ディスペンサーを用いて、高さ２３ｍｍの位置に、１μＬ／ｃｍで展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２テストライン（Ｓライン）を作製した。
　１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）に０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体と３ｗｔ％のスクロースとを含む溶液を、前記ニトロセルロースメンブレンに対して、ディスペンサーを用いて、高さ２６ｍｍの位置に、１μＬ／ｃｍで展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布してコントロールライン（Ｃライン）を作製した。
　その後、テストライン及びコントロールラインが塗布により作製されたニトロセルロースメンブレンを、５０℃、３０分間乾燥させ、抗体塗布メンブレンを得た。
（４）イムノクロマトデバイスの作製
　基材としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ製）に、前記（２）で作製したコンジュゲートパッド、前記（３）で作製した抗体塗布メンブレン、グラスファイバー製のサンプルパッド、セルロース製の吸収パッドを、上流側からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体塗布メンブレン、吸収パッドの順になるように、互いに重なり合わさるように貼り合わせた。裁断機にて４ｍｍの幅にカットし、幅４ｍｍ、長さ７０ｍｍのイムノクロマトデバイスを作製した。
（５）試料希釈液の調製
　１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を１ｗｔ％、塩化ナトリウムを２００ｍＭとなるように加え、さらにウシ血清アルブミンを１ｗｔ％となるように添加して、試料希釈液を調製した。
（６）ライン着色評価
　抗原を添加していない試料希釈液を陰性サンプルとして使用した。サンプルパッドに陰性サンプル７５μＬを滴下し、イムノクロマトリーダー（Ｃ１００６６、浜松ホトニクス製）を用いて、１５分経過後のコントロールライン及びテストラインの着色強度を測定した。また、１５分経過後のコントロールライン及びテストラインの着色状態を目視にて確認した。
［実施例９］
　実施例８の（３）における１ｍｇ／ｍＬのマウス抗Ａ型インフルエンザ　ＮＰモノクローナル抗体を、１ｍｇ／ｍＬのウサギ抗Ａ型インフルエンザ　ＮＰポリクローナル抗体に変更し、１ｍｇ／ｍＬのマウス抗Ｂ型インフルエンザ　ＮＰモノクローナル抗体を、１ｍｇ／ｍＬのウサギ抗Ｂ型インフルエンザ　ＮＰポリクローナル抗体に変更した以外は、実施例８と同様に行った。
［比較例８］
　実施例８の（３）における１ｍｇ／ｍＬのウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体を、１ｍｇ／ｍＬのマウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＮＰモノクローナル抗体に変更した以外は、実施例８と同様に行った。
［実施例８、９及び比較例８の結果］
　表４に実施例８、９及び比較例８のデバイスのコントロールライン及びテストラインの評価結果を示す。比較例８では、コンジュゲートパッドに使用した抗体の由来生物と全てのテストラインに使用した抗体の由来生物がマウスであるが、コントロールラインの着色が低くなることが確認された。一方、実施例８では、コンジュゲートパッドに使用した抗体の由来生物とＳラインに使用した抗体の由来生物が異なるが、コントロールラインの着色が強く、かつバックグラウンドに目立つ着色は見られなかった。さらに、実施例９では、コンジュゲートパッドに使用した抗体の由来生物が、全てのテストラインに使用した抗体の由来生物と異なるが、コントロールラインの着色が最も強く、かつバックグラウンドに目立つ着色は見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例１０］
　実施例８と同様にイムノクロマトデバイスを調製した。干渉因子としてＨＡＭＡ血清（ＨＡＭＡ　Ｓｅｒｕｍ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ（滅菌蒸留水１ｍＬに溶解）、ロシュ製）を２０倍希釈になるように試料希釈液に添加し、陰性サンプルとした。以下、実施例８と同様に展開を行った。
［実施例１１］
　実施例８と同様にイムノクロマトデバイスを調製した。マウスＩｇＧを１００μｇ／ｍＬとなるように、かつ、干渉因子としてＨＡＭＡ血清（ＨＡＭＡ　Ｓｅｒｕｍ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ（滅菌蒸留水１ｍＬに溶解）、ロシュ製）を２０倍希釈になるように試料希釈液に添加し、陰性サンプルとした。以下、実施例８と同様に展開を行った。
［実施例１２］
　実施例９と同様にイムノクロマトデバイスを調製した。干渉因子としてＨＡＭＡ血清（ＨＡＭＡ　Ｓｅｒｕｍ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ（滅菌蒸留水１ｍＬに溶解）、ロシュ製）を２０倍希釈になるように試料希釈液に添加し、陰性サンプルとした。以下、実施例９と同様に展開を行った。
［比較例９］
　比較例８と同様にイムノクロマトデバイスを調製した。干渉因子としてＨＡＭＡ血清（ＨＡＭＡ　Ｓｅｒｕｍ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ（滅菌蒸留水１ｍＬに溶解）、ロシュ製）を２０倍希釈になるように試料希釈液に添加し、陰性サンプルとした。以下、比較例８と同様に展開を行った。
［比較例１０］
　比較例８と同様にイムノクロマトデバイスを調製した。マウスＩｇＧを１００μｇ／ｍＬとなるように、かつ、干渉因子としてＨＡＭＡ血清（ＨＡＭＡ　Ｓｅｒｕｍ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ（滅菌蒸留水１ｍＬに溶解）、ロシュ製）を２０倍希釈になるように試料希釈液に添加し、陰性サンプルとした。以下、比較例８と同様に展開を行った。
［実施例１０～１２及び比較例９、１０の結果］
　表５に実施例１０～１２及び比較例９、１０のデバイスのコントロールライン及びテストラインの評価結果を示す。比較例９は、コンジュゲートパッドに使用した抗体と全てのテストラインに使用した抗体の由来生物がいずれもマウスであるが、すべてのテストラインで非特異的な着色が確認された。比較例１０は、比較例９の陰性サンプルにマウスＩｇＧを添加した例であるが、テストラインの非特異的な着色が抑制されたことから、比較例９におけるテストラインの着色はＨＡＭＡの影響であることが推測された。比較例１０では、添加したコントロールラインの着色が著しく低下した。一方、実施例１０は、コンジュゲートパッドに使用した抗体がマウス由来の抗体であるのに対し、ＡラインとＢラインに使用した抗体の由来生物がマウス、Ｓラインに使用した抗体の由来生物がウサギであるが、Ａライン及びＢラインにおいて非特異的な着色が見られ、ＨＡＭＡ干渉による偽陽性が確認されたものの、Ｓラインでは非特異的な着色が検出されなかった。実施例１１では、実施例１０の陰性サンプルにマウスＩｇＧを添加した例であるが、テストラインの非特異的な着色は検出されなかった。また、コントロールラインの着色低下は見られたものの十分に視認できるレベルであった。実施例１２では、コンジュゲートパッドに使用した抗体の由来生物がマウス、Ａライン、Ｂライン及びＳラインに使用した抗体の由来生物がウサギであるが、コントロールラインに強い着色が見られ、かついずれのテストラインにも非特異的な着色は見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (14)

  1. 　試料中の標的物質を検出するための検出用デバイスであって、
    　標的物質捕捉部とコントロール部とを備える固相担体である第１部分と、
    　前記標的物質と特異的に結合する標識抗体を含む第２部分とを備え、
    　前記標的物質捕捉部には標的物質に特異的に結合する捕捉分子が固相化され、
    　前記コントロール部には前記標識抗体に特異的に結合するコントロール抗体が固相化され、
    　前記捕捉分子と前記標識抗体の由来生物が異なり、かつ、前記第１部分上のコントロール抗体の固相化量が捕捉分子の固相化量よりも少ない、検出用デバイス。
  2. 　前記捕捉分子が標的物質を抗原とする抗体である、請求項１に記載の検出用デバイス。
  3. 　前記捕捉分子と前記コントロール抗体の由来生物が異なる、請求項１に記載の検出用デバイス。
  4. 　前記標識抗体と前記コントロール抗体の由来生物が異なる、請求項１に記載の検出用デバイス。
  5. 　前記第１部分上の前記コントロール抗体の固相化量が、前記捕捉分子の固相化量の０．１～０．９倍である、請求項１に記載の検出用デバイス。
  6. 　前記第１部分及び／又は第２部分が糖類及び／又は糖アルコールを含む、請求項１に記載の検出用デバイス。
  7. 　試料中の２種以上の標的物質を検出するための検出用デバイスであって、
    　２以上の標的物質捕捉部と１以上のコントロール部を備える固相担体である第１部分と、
    　２種以上の標識抗体を含む第２部分とを備え、
    　前記２種以上の標識抗体はそれぞれ異なる標的物質と特異的に結合し、
    　前記２以上の標的物質捕捉部には、それぞれ異なる標的物質と特異的に結合する捕捉分子が固相化され、
    　前記１以上のコントロール部には前記２種以上の標識抗体のうち１種以上と特異的に結合するコントロール抗体が固相化され、
    　前記捕捉分子の少なくとも１つと前記標識抗体の由来生物が異なり、かつ、前記第１部分上の各コントロール部のコントロール抗体の固相化量が、各標的物質捕捉部の捕捉分子の固相化量よりも少ない、検出用デバイス。
  8. 　イムノクロマト用デバイスである、請求項１又は７に記載の検出用デバイス。
  9. 　前記標識抗体がマウス由来の抗体を含み、前記捕捉分子がウサギ由来の分子を含む、請求項１又は７に記載の検出用デバイス。
  10. 　前記コントロール抗体がヤギ由来の抗体を含む、請求項１又は７に記載の検出用デバイス。
  11. 　試料中の標的物質を、請求項１又は７に記載の検出用デバイスを用いて検出する、検出方法。
  12. 　請求項１又は７に記載の検出用デバイス及び試料前処理試薬を含む、試料中の標的物質を検出するためのキット。
  13. 　前記試料前処理試薬が試料希釈液である、請求項１２に記載のキット。
  14. 　前記標識抗体が着色粒子を含む、請求項１２に記載のキット。
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