ES2926662T3 - Anticuerpos contra haptenos de risperidona y uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos contra haptenos de risperidona y uso de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2926662T3
ES2926662T3 ES13830253T ES13830253T ES2926662T3 ES 2926662 T3 ES2926662 T3 ES 2926662T3 ES 13830253 T ES13830253 T ES 13830253T ES 13830253 T ES13830253 T ES 13830253T ES 2926662 T3 ES2926662 T3 ES 2926662T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
risperidone
labeled
sample
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13830253T
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Hryhorenko
Banumathi Sankaran
Thomas Decory
Theresa Tubbs
Linda Colt
Maarten Vliegen
Pieter Haspeslagh
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Pharmaceutica NV
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Pharmaceutica NV filed Critical Janssen Pharmaceutica NV
Application granted granted Critical
Publication of ES2926662T3 publication Critical patent/ES2926662T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/302—Schizophrenia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Se divulga un anticuerpo que se une a la risperidona, que puede usarse para detectar la risperidona en una muestra tal como en un método de inmunoensayo competitivo. El anticuerpo se puede utilizar en un dispositivo de ensayo de flujo lateral para la detección de risperidona en el punto de atención, incluida la detección múltiple de aripiprazol, olanzapina, quetiapina y risperidona en un solo dispositivo de ensayo de flujo lateral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra haptenos de risperidona y uso de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los inmunoensayos y, en particular, a anticuerpos que se unen a la risperidona que pueden usarse en inmunoensayos para la detección de la risperidona.
Antecedentes
La esquizofrenia es un trastorno psiquiátrico crónico y debilitante que afecta aproximadamente al 0,45-1 % de la población mundial (van Os, J.; Kapur, S. "Schizophrenia" Lancet 2009, 374, 635-645). Los objetivos principales del tratamiento son lograr una remisión sostenida de los síntomas psicóticos, reducir el riesgo y las consecuencias de la recaída y mejorar el funcionamiento del paciente y la calidad de vida en general. Aunque muchos pacientes con esquizofrenia pueden lograr la estabilidad de los síntomas con los medicamentos antipsicóticos disponibles, el cumplimiento deficiente con la medicación es una razón común de recaída con medicamentos orales administrados diariamente. Varios estudios (Abdel-Baki, A.; Ouellet-Plamondon, C.; Malla, A. "Pharmacotherapy Challenges inpatients with First-Episode Psychosis" Journal of Affective Disorders 2012, 138, S3-S14) que investigan los resultados del incumplimiento han demostrado que los pacientes con esquizofrenia que no toman su medicación según lo prescrito tienen tasas más altas de recaída, ingreso hospitalario y suicidio, así como una mayor mortalidad. Se estima que del 40 al 75 % de los pacientes con esquizofrenia tienen dificultades para cumplir con un régimen de tratamiento oral diario (Lieberman, J. A.; Stroup, T. S.; McEvoy, J. P.; Swartz, M. S.; Rosenheck, R. A.; Perkins, D. O.; Keefe, R. S. E.; Davis, S. M.; Davis, C. E.; Lebowitz, B. D.; Severe, J.; Hsiao, J. K. "Effectiveness of Antipyschotic Drugs in Patients with Chronic Schizophrenia" New England Journal of Medicine 2005, 353(12), 1209-1223).
La monitorización terapéutica de fármacos (TDM) es la cuantificación de las concentraciones en suero o plasma de fármacos, incluyendo los fármacos antipsicóticos, para la monitorización y optimización del tratamiento. Dicha monitorización permite, por ejemplo, la identificación de pacientes que no cumplen su régimen de medicación, que no alcanzan las dosis terapéuticas, que no responden a las dosis terapéuticas, que tienen una tolerabilidad subóptima, que tienen interacciones farmacocinéticas fármaco-fármaco, o que tienen un metabolismo anormal que da como resultado concentraciones en plasma inapropiadas. Hay una variabilidad individual considerable en la capacidad del paciente para absorber, distribuir, metabolizar y excretar fármacos antipsicóticos. Tales diferencias pueden estar provocadas por enfermedades concurrentes, edad, medicación concomitante o peculiaridades genéticas. Diferentes formulaciones de fármacos también pueden influir en el metabolismo de los fármacos antipsicóticos. La TDM permite la optimización de la dosis para pacientes individuales, mejorando los resultados terapéuticos y funcionales. La TDM permite además que un practicante clínico que prescribe garantice el cumplimiento de las dosificaciones prescritas y el logro de concentraciones en suero eficaces.
Hasta la fecha, los métodos para determinar los niveles de concentraciones en suero o plasma de fármacos antipsicóticos implican el uso de cromatografía líquida (LC) con detección de espectrometría de masas o UV, y radioinmunoensayos (ver, por ejemplo, Woestenborghs et al., 1990 "On the selectivity of some recently developed RIA’s" in Methodological Surveys in Biochemistry and Analysis 20:241-246. Analysis of Drugs and Metabolites, Including Anti-infective Agents; Heykants et al., 1994 "The Pharmacokinetics of Risperidone in Humans: A Summary", J Clin Psychiatry 55/5, suppl:13-17; Huang et al., 1993 "Pharmacokinetics of the novel anti-psychotic agent risperidone and the prolactin response in healthy subjects", Clin Pharmacol Ther 54:257-268). Los radioinmunoensayos detectan uno o ambos de risperidona y paliperidona. Salamone et al. en la Patente de Estados Unidos N° 8.088.594 divulgan un inmunoensayo competitivo para la risperidona usando anticuerpos que detectan tanto la risperidona como la paliperidona pero no metabolitos farmacológicamente inactivos. Los anticuerpos usados en el inmunoensayo competitivo se desarrollan contra un inmunógeno particular. ID Labs Inc. (Londres, Ontario, Canadá) comercializa un ELISA para la olanzapina, otro fármaco antipsicótico, que también utiliza un formato competitivo. Las Instrucciones de uso indican que el ensayo está diseñado para propósitos de selección y destinado a uso forense o de investigación y no destinado específicamente para uso terapéutico. Las Instrucciones recomiendan que todas las muestras positivas se confirmen con cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC-MS) e indican que el anticuerpo usado detecta olanzapina y clozapina (ver "Instructions For Use Data Sheet IDEL-F083", Fecha de revisión 8 de agosto de 2011). Algunos de estos métodos, concretamente, HPLC y GC/MS, pueden ser costosos y laboriosos, y generalmente solo se realizan en laboratorios grandes o especializados que cuentan con el equipo adecuado.
Hay una necesidad de otros métodos para determinar los niveles de fármacos antipsicóticos, en particular métodos que puedan realizarse en el consultorio de un médico que prescribe (donde el tratamiento para un paciente individual puede ajustarse en consecuencia de una manera mucho más oportuna) y en otros entornos médicos que carezcan de equipo de LC o GC/MS o que requieren resultados de prueba rápidos.
La risperidona es:
Figure imgf000003_0001
La WO 2011/115733 y solicitudes relacionadas divulgan conjugados e inmunógenos derivados de la risperidona y anticuerpos generados por estos inmunógenos e inmunoensayos para la cuantificación y monitorización de la risperidona y la paliperidona en fluidos biológicos.
Sumario de la invención
La presente invención se dirige a un método para producir un anticuerpo que se una a la risperidona, el método comprendiendo:
(i) seleccionar un huésped no humano para la producción de anticuerpos; y
(ii) inocular al huésped con un conjugado de un compuesto de Fórmula III y un portador inmunogénico, en donde el huésped produce un anticuerpo que se une a la risperidona, y
la Fórmula III es:
Figure imgf000003_0002
compuesto que tiene la Fórmula III. También se divulga en la presente el anticuerpo designado 5-5 generado contra el compuesto que tiene la Fórmula II, y el anticuerpo designado 2A-5 generado contra el compuesto que tiene la Fórmula IV. Otros inmunógenos divulgados en la presente son los compuestos que tienen las Fórmulas V y VI.
Figure imgf000003_0003
Figure imgf000004_0001
Los anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invención pueden proporcionarse en kits de ensayo y dispositivos de ensayo, siendo un dispositivo actualmente preferido un dispositivo de ensayo de flujo lateral que proporciona un análisis en el punto de atención.
La invención proporciona además un método para producir una línea celular de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se une a la risperidona. El método comprende: (i) seleccionar un huésped no humano para la producción de anticuerpos; (ii) inocular al huésped un conjugado de un compuesto de Fórmula III y un portador inmunogénico; (iii) fusionar una línea celular del huésped inoculado con una célula que se divide continuamente para crear una célula fusionada capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se une a la risperidona; y (iv) clonar la célula fusionada para obtener una línea celular de hibridoma, y la
Fórmula III es:
Figure imgf000005_0001
Objetos, características y ventajas adicionales de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración detallada de las realizaciones preferidas que siguen.
Breve descripción de los dibujos
Las Figs. 1 y 2 muestran resultados de ELISA competitivos generados con el hibridoma 5-9;
La Fig. 3 muestra los resultados de ELISA competitivo generados con el clon 2A5 de risperidona/paliperidona; La Fig. 4 muestra el formato de inmunoensayo competitivo usado en un dispositivo de ensayo de flujo lateral; La Fig. 5 muestra una curva típica de respuesta a la dosis generada con el clon 5-9 de risperidona/paliperidona; La Fig. 6 muestra el diseño de chip de un dispositivo de ensayo de flujo lateral;
La Fig. 7 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para un control positivo de aripiprazol generado con el anticuerpo 5C7 y un compañero de unión competitivo de aripiprazol marcado;
La Fig. 8 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para un control positivo de olanzapina generado con el anticuerpo 4G9-1 y un compañero de unión competitivo de olanzapina marcado;
La Fig. 9 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para un control positivo de quetiapina generado con el anticuerpo 11 y un compañero de unión competitivo de quetiapina marcado;
La Fig. 10 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para un control positivo de risperidona generado con el anticuerpo 5-9 y un compañero de unión competitivo de risperidona marcado;
La Fig. 11 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene aripiprazol generada con el anticuerpo 5C7 de aripiprazol en presencia de un compañero de unión competitivo de aripiprazol marcado, sin curva de respuesta a la dosis para olanzapina, quetiapina o risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo marcado para cada uno;
La Fig. 12 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene olanzapina generada con el anticuerpo 4G9-1 de olanzapina en presencia de un compañero de unión competitivo de olanzapina marcado, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, quetiapina o risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo marcado para cada uno;
La Fig. 13 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene quetiapina generada con el anticuerpo 11 de quetiapina en presencia de un compañero de unión competitivo de quetiapina marcado, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, olanzapina o risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo marcado para cada uno;
La Fig. 14 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene risperidona generada con el anticuerpo 5-9 de risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo de risperidona marcado, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, olanzapina o quetiapina en presencia de un compañero de unión competitivo marcado para cada uno;
La Fig. 15 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene aripiprazol generada con el anticuerpo 5C7 de aripiprazol en presencia de un compañero de unión competitivo de aripiprazol marcado, sin curva de respuesta a la dosis para olanzapina, quetiapina o risperidona en presencia de anticuerpo y compañero de unión competitivo marcado para cada uno;
La Fig. 16 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene olanzapina generada con el anticuerpo 4G9-1 de olanzapina en presencia de un compañero de unión competitivo de olanzapina marcado, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, quetiapina o risperidona en presencia de anticuerpo y compañero de unión competitivo marcado para cada uno;
La Fig. 17 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene quetiapina generada con el anticuerpo 11 de quetiapina en presencia del compañero de unión competitiva de quetiapina marcado, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, olanzapina o risperidona en presencia de anticuerpo y compañero de unión competitivo marcado para cada uno;
La Fig. 18 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene risperidona generada con el anticuerpo 5-9 de risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo de risperidona marcado, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, olanzapina o quetiapina en presencia de anticuerpo y compañero de unión competitivo marcado para cada uno;
La Fig. 19 muestra una comparación de la curva de respuesta a la dosis de aripiprazol generada como control positivo con la curva de respuesta a la dosis de aripiprazol generada en el formato multiplex;
La Fig. 20 muestra una comparación de la curva de respuesta a la dosis de olanzapina generada como control positivo con la curva de respuesta a la dosis de olanzapina generada en el formato multiplex;
La Fig. 21 muestra una comparación de la curva de respuesta a la dosis de quetiapina generada como control positivo con la curva de respuesta a la dosis de quetiapina generada en el formato multiplex; y
La Fig. 22 muestra una comparación de la curva de respuesta a la dosis de risperidona generada como control positivo con la curva de respuesta a la dosis de risperidona generada en el formato multiplex.
Descripción detallada
La invención proporciona métodos para producir un anticuerpo aislado que se une a la risperidona como se define en las reivindicaciones. También se divulga en la presente un kit de ensayo y un dispositivo de ensayo que comprende el anticuerpo. También se proporcionan métodos para producir el anticuerpo y para producir una línea celular de hibridoma capaz de producir el anticuerpo como se define en las reivindicaciones. También se divulga en la presente un método para detectar risperidona en una muestra, incluyendo un método de inmunoensayo competitivo.
Detalles adicionales de los compuestos descritos por las fórmulas anteriores y los conjugados formados por los compuestos y un portador inmunogénico se proporcionan en la siguiente sección titulada "Compuestos, Conjugados e Inmunógenos".
Detalles adicionales de los anticuerpos producidos de acuerdo con la materia de la invención se proporcionan en la siguiente sección titulada "Anticuerpos".
También se divulga en la presente un kit de ensayo que comprende el anticuerpo, así como un dispositivo de ensayo que comprende el anticuerpo. Preferiblemente, el dispositivo de ensayo es un dispositivo de ensayo de flujo lateral. Detalles adicionales de los kits de ensayo y los dispositivos de ensayo se proporciona a continuación en la sección titulada "Dispositivos y kits de ensayo".
También se describe en la presente un método para detectar risperidona en una muestra. El método comprende: (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo producido de acuerdo con la presente invención que está marcado con un marcador detectable, en donde el anticuerpo marcado y la risperidona presente en la muestra forman un complejo marcado; y (ii) detectar el complejo marcado para detectar risperidona en la muestra. Detalles adicionales del método de detección de risperidona producida de acuerdo con la presente invención se proporcionan en la sección siguiente titulada "Inmunoensayos".
También se describe en la presente un método de inmunoensayo competitivo para detectar risperidona en una muestra. El método comprende: (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo producido de acuerdo con la presente invención, y con risperidona o un compañero de unión competitivo de risperidona, en donde uno del anticuerpo y de la risperidona o su compañero de unión competitivo está marcado con un marcador detectable, y en el donde la risperidona de muestra compite con la risperidona o su compañero de unión competitivo para unirse al anticuerpo; y (ii) detectar el marcador para detectar la risperidona de muestra. Detalles adicionales del método de inmunoensayo competitivo para detectar risperidona se proporcionan en la sección siguiente titulada "Inmunoensayos".
La detección de risperidona puede ir acompañada de la detección de uno o más analitos además de la risperidona. Preferiblemente, uno o más analitos son fármacos antipsicóticos distintos de la risperidona y, más preferiblemente, los fármacos antipsicóticos distintos de la risperidona se seleccionan del grupo que consiste de: aripiprazol, paliperidona, quetiapina, olanzapina y metabolitos de los mismos.
Como se analizado anteriormente, los anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invención pueden usarse en ensayos para detectar la presencia y/o la cantidad del fármaco antipsicótico en muestras de pacientes. Tal detección permite la monitorización terapéutica de fármacos permitiendo todos los beneficios de los mismos. La detección de niveles de fármacos antipsicóticos puede ser útil para muchos propósitos, incluyendo: determinación de la adherencia o del cumplimiento del paciente con la terapia prescrita; uso como una herramienta de decisión para determinar si un paciente debe cambiar de un régimen antipsicótico oral a un régimen antipsicótico inyectable de acción prolongada; uso como herramienta de decisión para determinar si el nivel de dosis o el intervalo de dosificación de los antipsicóticos orales o inyectables debe aumentarse o disminuirse para garantizar el logro o el mantenimiento de niveles de fármaco eficaces o seguros; uso como ayuda en el inicio de la terapia con fármacos antipsicóticos proporcionando evidencia del logro de los niveles mínimos de pK; uso para determinar la bioequivalencia de fármacos antipsicóticos en múltiples formulaciones o de múltiples fuentes; uso para evaluar el impacto de la polifarmacia y las potenciales interacciones fármaco-fármaco; y uso como una indicación de que un paciente debe ser excluido o incluido en un ensayo clínico y como ayuda en la monitorización posterior del cumplimiento de los requisitos de medicación del ensayo clínico.
COMPUESTOS, CONJUGADOS E INMUNÓGENOS
Con respecto a los compuestos y conjugados e inmunógenos, se usan las siguientes abreviaturas: AMAS es éster de N-(a-maleimidoacetoxi)succinimida; BTG es tiroglobulina bovina; Bu3N es tributilamina; DCC es diciclohexilcarbodiimida; DCM es diclorometano; DIEA es diisopropiletilamina; DMF es N,N-dimetilformamida; EDTA es ácido etilendiaminotetraacético; KLH es hemocianina de lapa californiana; SATA es S-acetiltioacetato de N-succinimidilo; TEA es trietilamina; THF es tetrahidrofurano; TFA es ácido trifluoroacético; Et3N es trietilamina; TBDMS es t-butildimetilsililo; DIC es diisopropilcarbodiimida; DMAP es N,N-dimetil-4-aminopiridina; EDC es clorhidrato de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida; NHS es N-hidroxisuccinimida; TFP es tetrafluorofenilo; PNP es p-nitrofenilo; TBTU es tetrafluoroborato de O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio; HOBT es N-hidroxibenzotriazol; DEPBT es 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotrazi-4(3H)-ona; BOP-CI es cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfónico; DTT es ditioeritritol. El término "conjugado" se refiere a cualquier sustancia formada por la unión de partes separadas. Los conjugados representativos incluyen los formados por la unión de una molécula pequeña y una molécula grande, como un portador o un polímero de poliamina, particularmente una proteína. En el conjugado, la molécula pequeña puede unirse en uno o más sitios activos de la molécula grande.
El término "hapteno" se refiere a un antígeno parcial o incompleto. Un hapteno es una sustancia sin proteínas, que no es capaz de estimular la formación de anticuerpos, pero que reacciona con los anticuerpos. Los anticuerpos se forman acoplando un hapteno a un portador inmunogénico de alto peso molecular y luego inyectando este producto acoplado, es decir, un inmunógeno, en un sujeto humano o animal.
El término "inmunógeno" se refiere a una sustancia capaz de provocar, producir o generar una respuesta inmunitaria en un organismo.
Un "portador inmunogénico", como se usa en la presente, es una sustancia inmunogénica, comúnmente una proteína, que puede unirse en una o más posiciones con haptenos, permitiendo de este modo la producción de anticuerpos que pueden unirse a estos haptenos. Los ejemplos de sustancias portadoras inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, proteínas, glicoproteínas, poliamino-polisacáridos complejos, partículas y ácidos nucleicos que se reconocen como extraños y por lo tanto provocan una respuesta inmunológica del huésped. Los poliaminopolisacáridos pueden prepararse a partir de polisacáridos usando cualquiera de los medios convencionales conocidos para esta preparación.
Pueden emplearse varios tipos de proteínas como portadores inmunogénicos, que incluyen sin limitación, albúminas, proteínas séricas, lipoproteínas, etc. Las proteínas ilustrativas incluyen albúmina sérica bovina, hemocianina de lapa californiana, ovoalbúmina, tiroglobulina bovina, fracción V de albúmina sérica humana, albúmina de conejo, globulina de semilla de calabaza, toxoide diftérico, toxoide tetánico, toxina botulínica, proteínas succiniladas y poli(aminoácidos) sintéticos como polilisina.
Los portadores inmunogénicos también pueden incluir poliaminopolisacáridos, que son polímeros de alto peso molecular formados por condensaciones repetidas de monosacáridos. Ejemplos de polisacáridos son almidones, glucógeno, celulosa, gomas de carbohidratos como goma arábiga, agar, y demás. El polisacárido también contiene residuos de poli(aminoácido) y/o residuos de lípidos.
El portador inmunogénico también puede ser un poli(ácido nucleico) solo o conjugado con uno de los poli(aminoácidos) o polisacáridos mencionados anteriormente.
El portador inmunogénico también puede incluir partículas sólidas. Las partículas son generalmente de por lo menos aproximadamente 0,02 micras (pm) y no más de aproximadamente 100 pm, y habitualmente de aproximadamente 0,05 pm a 10 pm de diámetro. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, óptimamente con una densidad que se aproxime a la del agua, generalmente de aproximadamente 0,7 a 1,5 g/ml, y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos como células y microorganismos, incluyendo ejemplos no limitativos como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli y virus. Las partículas también pueden estar compuestas por polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, látex, vesículas de fosfolípidos o lipoproteínas. El término "derivado" se refiere a un compuesto químico o molécula elaborada a partir de un compuesto original mediante una o más reacciones químicas.
El término "análogo" de un compuesto químico se refiere a un compuesto químico que contiene una cadena de átomos de carbono y los mismos grupos funcionales particulares que un compuesto de referencia, pero la cadena de carbono del análogo es más larga o más corta que la del compuesto de referencia.
Un "marcador", "molécula detectora", "informador" o "marcador detectable" es cualquier molécula que produzca, o a la que se le puede inducir que produzca, una señal detectable. El marcador puede conjugarse con un analito, un inmunógeno, un anticuerpo o con otra molécula, como un receptor o una molécula que puede unirse a un receptor, como un ligando, particularmente un hapteno o un anticuerpo. Un marcador puede unirse directa o indirectamente por medio de una fracción de enlace o puente. Los ejemplos no limitativos de marcadores incluyen isótopos radiactivos (por ejemplo, 125I), enzimas (por ejemplo, p-gatactosidasa, peroxidasa), fragmentos de enzimas, sustratos de enzimas, inhibidores de enzimas, coenzimas, catalizadores, fluoróforos (por ejemplo, rodamina, isotiocianato de fluoresceína o FITC, o Dylight 649), colorantes, quimioluminiscentes y luminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, luciferina),
Como se usa en la presente, un "espaciador" se refiere a una parte de una estructura química que conecta dos o más subestructuras como haptenos, portadores, inmunógenos, marcadores o compañeros de unión a través de un grupo de enlace funcional. Estos grupos espaciadores están compuestos por los átomos típicamente presentes y ensamblados de maneras que se encuentran típicamente en compuestos orgánicos y, por lo tanto, pueden denominarse "grupos espaciadores orgánicos". Los bloques de construcción químicos usados para ensamblar los espaciadores se describirán posteriormente en esta solicitud. Entre los espaciadores preferidos están las cadenas de carbono lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas. Estas cadenas de carbono también pueden incluir uno o más heteroátomos dentro de la cadena, uno o más heteroátomos reemplazando a uno o más hidrógenos de cualquier átomo de carbono en la cadena, o en los extremos terminales de las cadenas. Por "heteroátomos" se entiende átomos distintos del carbono que se eligen del grupo que consiste de oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre, en donde los átomos de nitrógeno, fósforo y azufre pueden existir en cualquier estado de oxidación y pueden tener carbono u otros heteroátomos unidos a ellos. El espaciador también puede incluir grupos cíclicos o aromáticos como parte de la cadena o como sustitución de uno de los átomos de la cadena. El número de átomos en el grupo espaciador se determina contando los átomos distintos de hidrógeno. El número de átomos en una cadena dentro de un grupo espaciador se determina contando el número de átomos distintos de hidrógeno a lo largo de la ruta más corta entre las subestructuras que se están conectando. Las longitudes de cadena preferidas están entre 1 y 20 átomos.
Un "grupo de enlace funcional" se refiere a un grupo reactivo que está presente en un hapteno y que puede usarse para proporcionar un sitio reactivo disponible a través del cual la parte de hapteno puede acoplarse a otra fracción mediante la formación de un enlace químico covalente para producir un conjugado de un hapteno con otra fracción (como un marcador o un portador). El hapteno puede enlazarse de esta manera a una fracción como la biotina para formar un compañero de unión competitivo.
Pueden usarse grupos espaciadores para enlazar el hapteno con el portador. Los espaciadores de diferentes longitudes permiten unir el hapteno a diferentes distancias del portador para su presentación al sistema inmunitario del animal o humano que se está inmunizando para optimizar el proceso de formación de anticuerpos. La unión a diferentes posiciones en la molécula de hapteno permite la oportunidad de presentar sitios específicos en el hapteno al sistema inmunitario para influir en el reconocimiento de anticuerpos. El espaciador puede contener grupos solubilizantes hidrófilos para hacer que el derivado de hapteno sea más soluble en medios acuosos. Los ejemplos de grupos solubilizantes hidrófilos incluyen, pero no se limitan a, grupos polioxialquiloxi, por ejemplo, cadenas de polietilenglicol; grupos hidroxilo, carboxilato y sulfonato.
El término "grupo nucleofílico" o "nucleófilo" se refiere a una especie que dona un par de electrones para formar un enlace químico en una reacción. El término "grupo electrofílico" o "electrófilo" se refiere a una especie que acepta un par de electrones de un nucleófilo para formar un enlace químico en una reacción.
El término "sustituido" se refiere a la sustitución de un átomo o grupo de átomos en lugar de un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono en cualquier posición de la molécula original. Los ejemplos no limitativos de sustituyentes incluyen átomos de halógeno, grupos amino, hidroxi, carboxi, alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, ciano, alcoxi, nitro, aldehído y cetona.
El término "alquilo" se refiere a radicales de cadena lineal y ramificada saturados o insaturados de hasta 12 átomos de carbono, a menos que se indique lo contrario, y se pretende específicamente que incluya radicales que tengan cualquier grado o nivel de saturación. Alquilo incluye, pero no se limita a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, ferc-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, isohexilo, heptilo, octilo, 2,2,4-trimetilpentilo, nonilo, decilo, undecilo y dodecilo.
El término "cicloalquilo" se refiere a un radical de anillo de hidrocarburo monocíclico o bicíclico saturado o parcialmente insaturado compuesto de 3 a 10 átomos de carbono. Los sustituyentes alquilo pueden estar presentes opcionalmente en el anillo. Los ejemplos incluyen ciclopropilo, 1,1 -dimetilciclobutilo, 1,2,3-trimetilciclopentilo, ciclohexilo y ciclohexenilo.
El término "heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo que incluye uno o más heteroátomos dentro de la cadena, uno o más heteroátomos reemplazando a uno o más hidrógenos de cualquier átomo de carbono en la cadena, o en los extremos terminales de las cadenas.
El término "aminoalquilo" se refiere a por lo menos un grupo amino primario o secundario unido a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo.
El término "alcoxi" se refiere a radicales de cadena lineal o ramificada de hasta 12 átomos de carbono, a menos que se indique lo contrario, unidos a un átomo de oxígeno. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi y butoxi.
El término "alcoxialquilo" se refiere a por lo menos un grupo alcoxi unido a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo.
El término "tioalquilo" se refiere a por lo menos un grupo azufre unido a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo. El grupo azufre puede estar en cualquier estado de oxidación e incluye sulfóxidos, sulfonas y sulfatos.
El término "grupo carboxilato" incluye ácidos carboxílicos y ésteres de carboxilato de alquilo, cicloalquilo, arilo o aralquilo.
El término "alquilcarbonilo" se refiere a un grupo que tiene un grupo carbonilo unido a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena de alquilo.
El término "heteroarilo" se refiere a radicales de anillos aromáticos monocíclicos de 5 a 7 miembros o bicíclicos de 8 a 10 miembros, cualquiera de los cuales puede consistir de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, O o S donde los átomos de nitrógeno y de azufre pueden existir en cualquier estado de oxidación permitido. Los ejemplos incluyen bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzotienilo, benzoxazolilo, furilo, imidazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, oxazolilo, pirazinilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinolinilo, tiazolilo y tienilo.
El término "arilo" se refiere a radicales de anillos aromáticos monocíclicos o bicíclicos que contienen de 6 a 12 carbonos en el anillo. Los sustituyentes alquilo pueden estar presentes opcionalmente en el anillo. Los ejemplos incluyen fenilo, bifenilo y naftaleno.
El término "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo C1-6 que contiene un sustituyente arilo. Los ejemplos incluyen bencilo, feniletilo o 2-naftilmetilo.
El término "acilo" se refiere al grupo -C(O)Ra, donde Ra es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, arilo, aralquilo y heteroarilo. Un "agente acilante" añade el grupo -C(O)Ra a una molécula.
El término "sulfonilo" se refiere al grupo -S(O)2 Rb, donde Rb es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, haloalquilo, arilo, aralquilo y heteroarilo. Un "agente sulfonilante" añade el grupo -S(O)2 Ra a una molécula. Los espaciadores que portan grupos de enlace funcionales reactivos para la unión de haptenos a fracciones portadoras pueden prepararse mediante una amplia variedad de métodos. El espaciador puede formarse usando una molécula que se funcionaliza de manera diferencial o se activa con grupos en cualquier extremo para permitir la reacción secuencial selectiva con el hapteno y el portador, pero también puede usarse la misma fracción reactiva en ambos extremos. Los grupos seleccionados para la reacción con el hapteno y el grupo de enlace funcional que se unirá al portador están determinados por el tipo de funcionalidad en el hapteno y el portador con el que se va a unir el hapteno. Los espaciadores y los métodos de unión a haptenos y portadores incluyen, pero no se limitan a, los descritos por Brinkley, M., A., Bioconjugate Chem. 1992, 3:2-13, Hermanson, Greg T., Bioconjugate Techniques,.Academic Press, London, Ámsterdam, Burlington, MA, USA, 2008 y Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook; disponible para descargar o solicitar una copia impresa de Thermo Scientific 3747 N Meridian Rd, Rockford, IL USA 61101, tel. 800-874-3723 o en: http://www.piercenet.com/ y referencias en el mismo. Muchas moléculas diferencialmente activadas para la formación de grupos espaciadores están disponibles comercialmente de proveedores, por ejemplo, Thermo Scientific.
Para los haptenos que portan un grupo amino, los modos de unión del espaciador al hapteno incluyen la reacción de la amina sobre el hapteno con un bloque de construcción del espaciador que porta un haluro de acilo o un éster activo. Los "ésteres activos" se definen como ésteres que experimentan reacción con un grupo nucleofílico, por ejemplo, un grupo amino, en condiciones suaves para formar un enlace estable. Un enlace estable se define como uno que permanece intacto en condiciones de uso posterior, por ejemplo, pasos sintéticos posteriores, uso como inmunógeno o en un ensayo bioquímico. Un ejemplo preferido de enlace estable es un enlace amida. Los ésteres activos y los métodos de formación se describen por Benoiton, N.L., en Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Thieme Stuttgart, Nueva York, vol E22 sección 3.2:443 y Benoiton, N.L. Chemistry of Peptide Synthesis, Taylor and Francis, NY, 2006. Los ésteres activos preferidos incluyen éster de p-nitrofenilo (PNP), éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) y éster de tetrafluorofenilo (TFP). Los haluros de acilo pueden prepararse mediante muchos métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, reacción del ácido carboxílico con cloruro de tionilo o cloruro de oxalilo, ver: Fieser, L.F. y Fieser, M. Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons, NY, 1967 y referencias en el mismo. Estos pueden convertirse en otros ésteres activos como ésteres de p-nitrofenilo (PNP) que también pueden usarse en espaciadores bifuncionales activos como se describe en Wu et.al, Organic Letters, 2004, 6 (24): 4407. Los ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) pueden prepararse mediante la reacción de carbonato de N,N-disuccinimidilo (CAS 74124-79-1) con el ácido carboxílico de un compuesto en presencia de una base orgánica como trietilamina o diisopropiletilamina en un solvente aprótico. en condiciones anhidras como se describe en el Ejemplo 35 de la WO2012012595 o usando N-hidroxisuccinimida y diciclohexilcarbodiimida (DCC) u otro agente deshidratante, en condiciones anhidras. Los ésteres de tetrafluorofenilo (TFP) pueden prepararse mediante la reacción de ácidos carboxílicos con 2,3,5,6-tetrafluorofeniltrifluoroacetato en presencia de una base orgánica como trietilamina o diisopropiletilamina en un solvente aprótico en condiciones anhidras, según lo informado por Wilbur, et.al., Bioconjugate Chem., 2004, 15(1):203. Un experto en la técnica reconocerá que los espaciadores mostrados en la Tabla 1, entre otros, pueden obtenerse usando métodos conocidos y unirse a haptenos que portan amino usando optimización rutinaria de las condiciones de reacción. Estos espaciadores permiten la unión del hapteno a un grupo tiol en un portador.
Tabla 1
Figure imgf000010_0001
También puede usarse el acoplamiento directo de la amina en el hapteno y una funcionalidad de ácido carboxílico en el bloque de construcción del espaciador en presencia de un agente de acoplamiento como un modo de unión. Los reactivos preferidos son los usados tiípicamente en la síntesis de péptidos. Los reactivos de acoplamiento de péptidos incluyen, pero no se limitan a, tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU, N° CAS 125700-67-6), ver Pruhs, S., Org. Process. Res. Dev. 2006, 10:441; N-hidroxibenzotriazol (HOBT, N° CAS 2592-95-2) con un agente deshidratante de carbodiimida, por ejemplo, N-N-diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC) o clorhidrato de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), ver: Konig W., Geiger, R. Chem. Ber., 1970, 103 (3):788; 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotrazin-4(3H)-ona (DEPBT, CAS N° 165534-43-0), ver: Liu, H. et. al., Chinese Chemical Letters, 2002, 13(7):601; cloruro bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfónico; (BOP-CI, CAS N° 68641-49-6), ver: Diago-Meseguer, J et. al. Synthesis, 1980, 7:547-51 y otros descritos con detalle por Benoiton en Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, FL, 2005, Capítulo 2, y el boletín técnico proporcionado por Advanced Automated Peptide Protein Technologies (aapptec), 6309 Shepardsville Rd., Louisville KY 40228, tfno. 888 692 9111; www.aapptec.com, y referencias en el mismo. Estos métodos crean un enlace amida estable que une el hapteno al espaciador. En la Tabla 2 se muestran ejemplos de espaciadores que pueden obtenerse usando métodos conocidos y unirse a haptenos que contienen amino utilizando optimización rutinaria de las condiciones de reacción empleando los métodos descritos y citados anteriormente, pero no se limitan a los mismos. Estos espaciadores permiten la unión del hapteno a un grupo tiol en un portador.
Tabla 2
Figure imgf000011_0001
Los espaciadores también pueden construirse por pasos mediante la unión secuencial de grupos químicos apropiados al hapteno, incluyendo el paso de formar el grupo de enlace funcional que es capaz de unirse al portador. Ver ejemplos ilustrativos en los Esquemas generales de reacción.
Además, cuando el hapteno tiene un grupo nucleofílico, por ejemplo, un grupo tiol, un grupo amino o un grupo hidroxilo que se convertirá en el punto de unión del espaciador, el espaciador también puede construirse mediante la alquilación del grupo tiol, amina o hidroxilo. Para unir el espaciador puede usarse cualquier grupo alquilo que esté adecuadamente sustituido con una fracción capaz de experimentar una reacción de sustitución, por ejemplo, un haluro de alquilo o un éster de ácido sulfónico como p-toluenosulfonato. Los expertos en la técnica conocen muchos ejemplos de reacciones de alquilación y pueden encontrarse ejemplos específicos en la bibliografía química general y optimizarse a través de experimentación rutinaria. Un análisis de las reacciones de alquilación con muchas referencias puede encontrarse en el Capítulo 10 de March’s Advanced Organic Chemistry, Smith, M.B., y March, J., John Wiley & sons, Inc. NY, 2001. También pueden emplearse otros enlaces, como la reacción de la fracción nucleofílica, por ejemplo, una amina, en el hapteno con un isocianato para formar una urea o la reacción con un isotiocianato para formar un enlace tiourea, ver: Li, Z., et. al., Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, 2003, 178(2):293-297. Los espaciadores pueden unirse a haptenos que portan grupos hidroxilo a través de la reacción con grupos isocianato para formar enlaces carbamato o uretano. El espaciador puede activarse diferencialmente con el grupo funcional isocianato en un extremo y un grupo de enlace funcional capaz de reaccionar con el portador, ver: Annunziato, M.E., Patel, U.S., Ranade, M. and Palumbo, P.S., Bioconjugate Chem., 1993, 4:212-218.
Para los haptenos que portan un grupo de ácido carboxílico, los modos de unión de una porción espaciadora al hapteno incluyen la activación del grupo de ácido carboxílico como un haluro de acilo o un éster activo, ejemplos de los cuales se muestran en la Tabla 3, cuya preparación se ha descrito anteriormente, seguido de reacción con un grupo amino (-NH2-), hidrazino (-NH-NH2-), hidrazido (-C(O)-NH-NH2-) o hidroxilo (-OH) en la porción espaciadora para formar un enlace amida, hidrazida, diacilhidrazina o éster, o acoplamiento directo del grupo ácido carboxílico con un grupo amino en la porción espaciadora o directamente en el portador con un acoplamiento peptídico y/o reactivo deshidratante de carbodiimida, descrito anteriormente, ejemplos de los cuales se muestran en las Tablas 4 y 5. Los procedimientos que se encuentran en las referencias citadas anteriormente para la formación de ésteres activados y el uso de agentes de acoplamiento de péptidos pueden emplearse para la unión de haptenos que contienen ácido carboxílico a bloques de construcción de espaciadores y portadores de proteínas con grupos amino disponibles utilizando optimización rutinaria de las condiciones de reacción.
Tab la 3
Figure imgf000012_0003
Tabla 4
Figure imgf000012_0005
Tabla 5
Figure imgf000012_0004
Otros grupos electrofílicos pueden estar presentes en el hapteno para unir el espaciador, por ejemplo, un haluro de sulfonilo
Figure imgf000012_0001
o grupo fósforo electrofílico, por ejemplo:
Figure imgf000012_0002
Ver: Malachowski, William P., Coward, James K., Journal of Organic Chemistry, 1994, 59 (25):7616 o:
, O
! - P -O R c
ORc
Rc es alquilo, cicloalquilo, arilo, arilo sustituido, aralquilo.
Ver: Aliouane, L., et.al, Tetrahedron Letters, 2011,52(28):8681.
Los haptenos que llevan grupos aldehído o cetona pueden unirse a los espaciadores usando métodos que incluyen, pero no se limitan a, la reacción con un grupo hidrazida H2N-NH-C(O)- en el espaciador para formar una acilhidrazona, ver: Chamow, S.M., Kogan, T.P., Peers, D.H., Hastings, R.C., Byrn, R.A. and Askenaszi, A., J. Biol. Chem., 1992, 267(22): 15916. En la Tabla 6 se muestran ejemplos de grupos espaciadores de hidrazida bifuncionales que permiten la unión a un grupo tiol en el portador.
Figure imgf000013_0001
Los haptenos también pueden contener grupos tiol que pueden reaccionar con el portador siempre que el portador se haya modificado para proporcionar un grupo que pueda reaccionar con el tiol. Los grupos portadores pueden modificarse mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a, la unión de un grupo que contiene un grupo funcional de maleimida mediante la reacción de un grupo amino en el portador con maleimidoacetato de N-succinimidilo, (AMAS, N° CAS 55750-61 -3), yodoacetato de succinimidilo (N° CAS 151199-81 -4), o cualquiera de los grupos espaciadores bifuncionales que se muestran en la Tabla 1 para introducir un grupo que puede experimentar una reacción que dé como resultado la unión del hapteno al portador.
El grupo de enlace funcional capaz de formar un enlace con el portador puede ser cualquier grupo capaz de formar un enlace estable y puede ser reactivo para una variedad de grupos diferentes en el portador. El grupo de enlace funcional puede reaccionar preferiblemente con un grupo amino, un grupo de ácido carboxílico o un grupo tiol en el portador, o derivado del mismo. Los ejemplos no limitativos del grupo de enlace funcional son un grupo de ácido carboxílico, haluro de acilo, éster activo (como se ha definido anteriormente), isocianato, isotiocianato, haluro de alquilo, grupo amino, grupo tiol, grupo maleimida, grupo acrilato (H2C=CH -C(O)-) o grupo vinilsulfona H2C=CH-SO2-) Ver: Park, J.W., et.al., Bioconjugate Chem., 2012, 23(3): 350. El grupo de enlace funcional puede estar presente como parte de un bloque de construcción espaciador diferencialmente activado que puede hacerse reaccionar por pasos con el hapteno y luego el derivado de hapteno resultante puede hacerse reaccionar con el portador. Alternativamente, el hapteno puede derivatizarse con un espaciador que lleva un grupo precursor que puede transformarse en el grupo de enlace funcional mediante una reacción posterior. Cuando el grupo de enlace funcional en el espaciador es una amina o un grupo de ácido carboxílico, la reacción de acoplamiento con el grupo de ácido carboxílico o la amina en el portador puede llevarse a cabo directamente mediante el uso de reactivos de acoplamiento de péptidos de acuerdo con los procedimientos de las referencias citadas anteriormente para estos reactivos. Pueden usarse grupos disulfuro particulares, por ejemplo, disulfuros de piridilo, como el grupo de enlace funcional en el espaciador que puede someterse a intercambio con un grupo tiol en el portador para formar un enlace de disulfuro mixto, ver: Ghetie, V., et al., Bioconjugate Chem., 1990, 1:24-31. Estos espaciadores pueden unirse mediante la reacción del hapteno portador de amina con un éster activo que se une a un espaciador que lleva el grupo disulfuro de piridilo, ejemplos del cual incluyen, pero no se limitan a, los que se muestran en la Tabla 7.
Figure imgf000013_0002
La mayoría de las veces, el portador es una proteína y pueden usarse los grupos £-amino de los residuos de lisina para la unión, ya sea directamente por reacción con un grupo de enlace funcional reactivo con amina o después de la derivatización con un grupo que contiene tiol, incluyendo N -Succinimidilo S -Acetilotioacetato, (SATA, CAS 76931-93-6), o un análogo del mismo, seguido de la escisión del grupo actato con hidroxilamina para exponer el grupo tiol para la reacción con el grupo de enlace funcional en el hapteno. Los grupos tiol también pueden introducirse en el portador mediante la reducción de los enlaces disulfuro dentro de los portadores de proteínas con reactivos reductores suaves que incluyen, pero no se limitan a, 2-mercaptoetilamina, ver: Bilah, M., et.al., Bioelectrochemistry, 2010, 80(1):49, reactivos de fosfina, ver: Kirley, T.L., Analytical Biochemistry, 1989, 180(2) :231 o ditioeritritol (DTT, CAS 3483-12-3) Cleland, W.,Biochemistry, 1964, 3:480-482.
ESQUEMAS GENERALES DE REACCIÓN
Los compuestos útiles para producir anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos sintéticos generales que se describen a continuación. Se pretende que los siguientes esquemas representen solamente ejemplos de la invención y de ninguna manera se pretende que sean una limitación de la invención. La unión de un espaciador a la estructura del anillo original de la risperidona puede lograrse mediante el uso del compuesto de partida protegido con sililo mostrado en el Esquema 1, cuya preparación se describe en el Ejemplo 1. En el Ejemplo 1 también se describe la alquilación con un derivado de haloalquilo N-protegido. Los derivados de haloalquilo N-protegidos de longitudes de cadena variables están disponibles comercialmente o pueden elaborarse mediante reacciones orgánicas estándar conocidas por los expertos en la técnica. Los valores preferidos para r están entre 1 y 5. La desprotección como se describe en el Ejemplo 1 puede proporcionar el compuesto amino que puede elaborarse adicionalmente para unir átomos espaciadores adicionales o puede unirse directamente al portador. Los derivados del compuesto amino que carecen del grupo hidroxilo en el producto final pueden prepararse como se describe en el Ejemplo 3.
Figure imgf000014_0001
La alquilación de risperidona también puede lograrse usando un tiol, por ejemplo, 3-mercaptometilpropionato, usando el método de Wang, J., L., et. al., Bioorganic and Med. química Letters, 2010, 20:7159, usando K2CO3 en DMF seguido de hidrólisis con NaOH en THF acuoso, como se muestra en el Esquema 2, para proporcionar un análogo del hapteno que tiene un enlace tioalquilo que termina en un grupo carboxi que puede unirse directamente a un portador o elaborado adicionalmente para extender la porción espaciadora. La alquilación con una amina también puede llevarse a cabo como se muestra en el Esquema 2, de acuerdo con el método usado para elaborar el producto intermedio 535 en la US20110245224. Las versiones de los análogos de aminoalquilo o tioalquilo del Esquema 2 en las que R1 es OH o H pueden elaborarse mediante optimización rutinaria de los procedimientos químicos enseñados en las referencias mencionadas anteriormente por un químico experto.
Figure imgf000015_0001
El grupo hidroxilo fenólico del compuesto de partida que se muestra en el Esquema 3, en el que Ri es H o un alcohol protegido con sililo, puede ser el sitio de introducción de un grupo que lleva un grupo de enlace funcional para unirse a un portador. El compuesto fenólico puede hacerse reaccionar directamente con anhídrido succínico como se muestra en el Esquema 3 y se describe en la US20060251592 para proporcionar un producto intermedio que lleva carboxi, o puede hacerse reaccionar con un espaciador bifuncional de isocianato, como se muestra en el Esquema 4, de acuerdo con la referencia de Annunziato proporcionada en otra parte de esta divulgación para proporcionar un hapteno que lleva un conector funcional reactivo con tiol. Se requiere la desprotección como se describe en los ejemplos posteriores cuando R1 es un alcohol protegido con sililo.
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000016_0001
El Esquema 5 ilustra cómo los haptenos con espaciadores que terminan en un grupo alquilo amina, como los Ejemplos 1 y 2, pueden funcionalizarse adicionalmente con un grupo maleimida. La maleimida puede introducirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la reacción con alquilaminoácido sustituido con N-maleoilo en un solvente como diclorometano y reactivos de acoplamiento como diisopropiletilamina y cianofosfonato de dietilo da el espaciador funcionalizado con maleimida en el hapteno. La reacción de la amina derivada de risperidona con un grupo de funcionalización de alquil-maleimida, como 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1 -ilo, en un solvente como DMF, en presencia de una base, como tributilamina, a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora, genera haptenos con un espaciador funcionalizado con maleimida.
Figure imgf000017_0001
Los haptenos con espaciadores que terminan en un grupo alquilo amina pueden elaborarse por reacción con un compuesto de anhídrido cíclico, como anhídrido succínico o anhídrido glutárico, como se muestra en el Esquema 6. La reacción puede llevarse a cabo en un solvente como THF, a temperatura ambiente durante la noche.
Figure imgf000017_0002
Los haptenos funcionalizados con maleimida pueden conjugarse con proteínas de acuerdo con el método que se muestra en el Esquema 7. La activación de los residuos de proteína lisina por acilación del nitrógeno épsilon con S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA), seguido de la hidrólisis posterior del grupo S-acetilo con hidroxilamina produce un grupo sulfhidrilo nucleofílico. La conjugación de la proteína activada con sulfhidrilo con el hapteno derivatizado con maleimida (preparado como se describe en el esquema general 5) continúa mediante una reacción de adición de Michael. Las proteínas adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen hemocianina de lapa californiana, tiroglobulina bovina y ovoalbúmina.
Figure imgf000018_0001
Los haptenos funcionalizados con ácido carboxílico pueden conjugarse con proteínas de acuerdo con el método que se muestra en el Esquema 8. La reacción con N-hidroxisuccinimida y un agente de acoplamiento adecuado, como diciclohexilcarbodiimida (DCC), y una base, como tributilamina, en un solvente como DMF a una temperatura de aproximadamente 20° C, durante aproximadamente 18 horas, activa el ácido carboxílico con el grupo saliente N-hidroxisuccinimida. Luego, el espaciador activado y el hapteno pueden conjugarse con una proteína en un solvente como tampón de fosfato de pH 7,5, a aproximadamente 20° C durante aproximadamente 2,5 horas. Las proteínas adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen hemocianina de lapa californiana, tiroglobulina bovina y ovoalbúmina.
ANTICUERPOS
El término "anticuerpo" se refiere a una proteína específica capaz de unirse a un antígeno o una porción del mismo (de acuerdo con esta invención, capaz de unirse a un fármaco antipsicótico o metabolito del mismo). Un anticuerpo se produce en respuesta a un inmunógeno que puede haberse introducido en un huésped, por ejemplo, un animal o un humano, mediante inyección. El término genérico "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos.
"Anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo, que compite con el anticuerpo intacto por la unión. En términos generales, se dice que un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es menor o igual a 1 pM, preferiblemente menor o igual a 100 nM y lo más preferible menor o igual a 10 nM. La unión puede medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, siendo un ejemplo el uso de un instrumento BIAcore™.
Los fragmentos de anticuerpos comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los fragmentos de unión incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Se entiende que un anticuerpo distinto de un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos.
Como se usa en la presente, "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a un receptor de inmunoglobulina o de células T. Los determinantes epitópicos suelen consistir de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que dos anticuerpos "se unen al mismo epítopo" si se demuestra que un anticuerpo compite con el segundo anticuerpo en un ensayo de unión competitiva, mediante cualquiera de los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (como el método BIAcore™ mencionado anteriormente). Con referencia a un hapteno (como la risperidona u otro fármaco antipsicótico), puede generarse un anticuerpo contra la molécula de hapteno no antigénica conjugando el hapteno con un portador inmunogénico. Entonces se genera un anticuerpo que reconoce un "epítopo" definido por el hapteno.
"Aislado" cuando se usa en el contexto de un anticuerpo significa alterado "por la mano del hombre" de cualquier estado natural; es decir, que, si se produce en la naturaleza, ha sido cambiado o retirado de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un anticuerpo de origen natural presente de manera natural en un animal vivo en su estado natural no está "aislado", pero el mismo anticuerpo separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en la presente. Los anticuerpos pueden producirse en una composición, como un reactivo de inmunoensayo, que no son composiciones de origen natural, y allí permanecen anticuerpos aislados dentro del significado de ese término como se emplea en la presente.
"Reactividad cruzada" se refiere a la reacción de un anticuerpo con un antígeno que no se ha usado para inducir ese anticuerpo.
Preferiblemente, el anticuerpo producido de acuerdo con la presente invención se unirá al fármaco y a cualquier metabolito farmacológicamente activo deseado. Alterando la ubicación de la unión del portador inmunogénico a los compuestos usados en la invención, puede manipularse en los anticuerpos la selectividad y la reactividad cruzada con los metabolitos. Para la risperidona, la reactividad cruzada con los metabolitos de la risperidona como la 9-hidroxirisperidona (paliperidona, que también se administra como un fármaco antipsicótico), la 7-hidroxirisperidona y la N-desalquilrisperidona puede ser deseable o no. Puede ser deseable un anticuerpo que reaccione de manera cruzada con la risperidona y la paliperidona, que no reaccione con la 7-hidroxirisperidona o la N-dealquilrisperidona, detectando por tanto la risperidona y su principal metabolito farmacológicamente activo. Alternativamente, puede ser deseable detectar los metabolitos farmacológicamente activos, risperidona y paliperidona, por separado, sin detectar los metabolitos inactivos, 7-hidroxirisperidona y N-dealquilrisperidona. Pueden generarse anticuerpos que detecten múltiples de estos fármacos y/o metabolitos, o pueden generarse anticuerpos que detecten cada uno por separado (definiendo así las propiedades de "unión específica" del anticuerpo). Un anticuerpo se une específicamente a uno o más compuestos cuando su unión a uno o más compuestos es equimolar o sustancialmente equimolar. Los métodos para producir tales anticuerpos comprenden inocular a un huésped el conjugado descrito en la presente. Los huéspedes adecuados incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, conejos, pollos, burros, caballos, monos, chimpancés, orangutanes, gorilas, humanos, y cualquier especie capaz de montar una respuesta inmune madura. Los procedimientos de inmunización están bien establecidos en la técnica y se exponen en numerosos tratados y publicaciones que incluyen" The Immunoassay Handbook", 2a Edición, editada por David Wild (Nature Publishing Group, 2000) y las referencias citadas en el mismo. Preferiblemente, un inmunógeno usado en los métodos de la presente invención se administra a un sujeto huésped, por ejemplo, un animal o un humano, en combinación con un adyuvante. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, hidróxido de aluminio (alumbre) en polvo, hidróxido de aluminio junto con Bórdetela pertussis y monofosforil lípido A-dicorinomicolato de trehalosa sintético (MPL-TDM).
Típicamente, se inyecta un inmunógeno o una combinación de un inmunógeno y un adyuvante en un huésped mamífero mediante una o múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Preferiblemente, el programa de inmunización se lleva a cabo durante por lo menos una semana, y más preferiblemente durante dos o más semanas. Los anticuerpos policlonales producidos de esta manera pueden aislarse y purificarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante los métodos de hibridomas bien establecidos de Kohler y Milstein, por ejemplo, Nature 256:495-497 (1975). Los métodos de hibridoma típicamente implican inmunizar a un huésped o linfocitos de un huésped, recoger el anticuerpo monoclonal que secreta o tiene el potencial de secretar linfocitos, fusionar los linfocitos con células inmortalizadas y seleccionar células que secretan el anticuerpo monoclonal deseado.
Un huésped puede inmunizarse para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos específicos para un inmunógeno. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Si se desean células humanas, pueden usarse linfocitos de sangre periférica, aunque se prefieren células de bazo o linfocitos de otras fuentes de mamíferos.
Pueden fusionarse linfocitos con una línea celular inmortalizada para formar células de hibridoma, un proceso que puede facilitarse mediante el uso de un agente de fusión, por ejemplo, polietilenglicol. A modo de ilustración, pueden usarse células mutantes de mieloma de roedor, bovino o humano inmortalizadas por transformación. Se prefieren poblaciones sustancialmente puras de células de hibridoma, en oposición a células inmortalizadas no fusionadas. Por tanto, después de la fusión, las células pueden cultivarse en un medio adecuado que inhiba el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas, por ejemplo, usando células de mieloma mutantes que carezcan de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT). En tal caso, pueden añadirse hipoxantina, aminopterina y timidina al medio (medio HAT) para evitar el crecimiento de células deficientes en HGPRT a la vez que se permite el crecimiento de hibridomas.
Preferiblemente, las células inmortalizadas se fusionan de manera eficiente, pueden aislarse de poblaciones mixtas mediante selección en un medio como HAT y soportan una expresión estable y de alto nivel de anticuerpo después de la fusión. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas incluyen líneas celulares de mieloma disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Como las células de hibridoma típicamente secretan anticuerpos de manera extracelular, los medios de cultivo pueden analizarse para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales específicos para el fármaco antipsicótico. Pueden usarse la inmunoprecipitación de los ensayos de unión in vitro, por ejemplo, el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), para medir la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales.
Las células de hibridoma secretoras de anticuerpos monoclonales pueden aislarse como clones individuales mediante procedimientos de dilución limitante y subcultivarse. Los medios de cultivo adecuados incluyen, pero no se limitan a, medio de Eagle modificado de Dulbecco, RPMI-1640 y medios libres de polipéptidos, reducidos en polipéptidos o libres de suero, por ejemplo, Ultra DOMA PF o HL-1, disponible de Biowhittaker, Walkersville, MD. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis.
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y/o purificarse a partir de un medio de cultivo o fluido de ascitis mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina (Ig) convencionales que incluyen, pero no se limitan a, polipéptido A-SEFAROSA, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también pueden producirse mediante métodos recombinantes como los que se describen en la Patente de Estados Unidos N° 4.166.452. El ADN que codifica anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse usando procedimientos convencionales, por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que se unen específicamente a genes de cadenas de anticuerpos pesadas y ligeras murinos, preferiblemente para sondar ADN aislado de líneas celulares de hibridoma de anticuerpos monoclonales que secretan anticuerpos específicos para fármacos antipsicóticos.
También pueden generarse fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de unión específicos para el fármaco antipsicótico. Tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos F(ab')2 que pueden producirse mediante la digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse mediante reduciendo los puentes disulfuro de fragmentos F(ab')2. Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse et al., Science 256:1270-1281 (1989)). Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden expresarse y secretarse a partir de Escherichia coli, permitiendo la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., BioTechnology 10:163-167 (1992)). Los expertos en la técnica conocen otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. También se prevén fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) (ver Patentes de Estados Unidos N° 5.761.894 y 5.587.458). Los fragmentos Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por lo tanto, es probable que muestren una unión no específica reducida. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.642.870, por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
KITS Y DISPOSITIVOS DE ENSAYO
También se describe en la presente un kit de ensayo (también denominado kit de reactivos) que comprende un anticuerpo como se ha descrito anteriormente. Un kit de reactivos representativo puede comprender un anticuerpo que se une al fármaco antipsicótico, risperidona, un complejo que comprende un análogo de un fármaco antipsicótico o un derivado del mismo acoplado a una fracción marcadora y, opcionalmente, también puede comprender uno o más calibradores que comprenden una cantidad conocida de un fármaco antipsicótico o un estándar relacionado.
La frase "kit de ensayo" se refiere a un conjunto de materiales y reactivos que se usa para realizar un ensayo. Los reactivos pueden proporcionarse combinados y envasados en el mismo recipiente o en recipientes separados, dependiendo de sus reactividades cruzadas y estabilidades, y en forma líquida o liofilizada. Las cantidades y proporciones de los reactivos proporcionados en el kit pueden seleccionarse para proporcionar resultados óptimos para una aplicación en particular. Un kit de ensayo descrito en la presente comprende anticuerpos que se unen a la risperidona. El kit puede comprender además compañeros de unión competitivos de la risperidona y materiales de calibración y control.
La frase "material de calibración y control" se refiere a cualquier estándar o material de referencia que contenga una cantidad conocida de un analito. Una muestra sospechosa de contener un analito y el material de calibración correspondiente se analizan en condiciones similares. La concentración de analito se calcula comparando los resultados obtenidos para el espécimen desconocido con los resultados obtenidos para el estándar. Esto se hace comúnmente mediante la construcción de una curva de calibración.
Los anticuerpos producidos de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden incluirse en un kit, recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para su uso. Cuando los anticuerpos se suministran en un kit, los diferentes componentes del inmunoensayo pueden envasarse en recipientes separados y mezclarse antes de su uso. Tal envasado de los componentes por separado puede permitir el almacenamiento a largo plazo sin disminuir sustancialmente el funcionamiento de los componentes activos. Además, los reactivos pueden envasarse en entornos inertes, por ejemplo, bajo una presión positiva de gas nitrógeno, gas argón o similar, lo que se prefiere especialmente para los reactivos que son sensibles al aire y/o a la humedad.
Los reactivos incluidos en los kits pueden suministrarse en todo tipo de recipientes de tal manera que las actividades de los diferentes componentes se conserven sustancialmente mientras que los propios componentes no son adsorbidos o alterados sustancialmente por los materiales del recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, ampollas, botellas, tubos de ensayo, viales, matraces, jeringuillas, sobres, por ejemplo, forrados con papel aluminio y similares. Los recipientes pueden estar compuestos de cualquier material adecuado, incluyendo pero no limitados a, vidrio, polímeros orgánicos, por ejemplo, policarbonato, poliestireno, polietileno, etc., cerámica, metal, por ejemplo, aluminio, aleaciones metálicas, por ejemplo, acero, corcho y similares. Además, los recipientes pueden comprender uno o más puertos de acceso estériles, por ejemplo, para el acceso a través de una aguja, como el que puede proporcionar un tabique. Los materiales preferidos para el tabique incluyen caucho y politetrafluoroetileno del tipo vendido con el nombre comercial TEFLON por DuPont (Wilmington, DE). Además, los recipientes pueden comprender dos o más compartimentos separados por separaciones o membranas que pueden quitarse para permitir el mezclado de los componentes.
Los kits de reactivos también pueden suministrarse con materiales de instrucciones. Las instrucciones pueden estar impresas, por ejemplo, en papel y/o suministrarse en un medio legible electrónicamente. Alternativamente, pueden proporcionarse instrucciones dirigiendo a un usuario a un sitio web de Internet, por ejemplo, especificado por el fabricante o distribuidor del kit y/o por correo electrónico.
El anticuerpo también puede proporcionarse como parte de un dispositivo de ensayo. Tales dispositivos de ensayo incluyen dispositivos de ensayo de flujo lateral. Un tipo común de dispositivo de ensayo de flujo lateral desechable incluye una zona o área para recibir la muestra líquida, una zona de conjugado y una zona de reacción. Estos dispositivos de ensayo se conocen comúnmente como tiras reactivas de flujo lateral. Emplean un material poroso, por ejemplo, nitrocelulosa, que define una trayectoria para el flujo de fluido capaz de soportar el flujo capilar. Los ejemplos incluyen los mostrados en las Patentes de Estados Unidos N° 5.559.041, 5.714.389, 5.120.643, y 6.228.660.
Otro tipo de dispositivo de ensayo es un dispositivo de ensayo no poroso que tiene proyecciones para inducir el flujo capilar. Los ejemplos de tales dispositivos de ensayo incluyen el dispositivo de flujo lateral abierto como se divulga en las Publicaciones Internacionales de PCT N° WO 2003/103835, WO 2005/089082, WO 2005/118139, y WO 2006/137785.
En un dispositivo de ensayo no poroso, el dispositivo de ensayo generalmente tiene por lo menos una zona de adición de muestra, por lo menos una zona de conjugado, por lo menos una zona de reacción y por lo menos una zona de absorción. Las zonas forman una trayectoria de flujo por la cual la muestra fluye desde la zona de adición de muestra a la zona de absorción. También se incluyen elementos de captura, como anticuerpos, en la zona de reacción, capaces de unirse al analito, depositados opcionalmente en el dispositivo (como por recubrimiento); y un material conjugado marcado que también es capaz de participar en reacciones que permitirán la determinación de la concentración del analito, depositado en el dispositivo en la zona de conjugado, en donde el material conjugado marcado lleva un marcador para detección en la zona de reacción. El material conjugado se disuelve a medida que la muestra fluye a través de la zona de conjugado formando un penacho de conjugado de material conjugado marcado disuelto y muestra que fluye en sentido descendente hacia la zona de reacción. A medida que el penacho de conjugado fluye hacia la zona de reacción, el material conjugado será capturado por los elementos de captura, por ejemplo a través de un complejo de material conjugado y analito (como en un ensayo "sándwich") o directamente (como en un ensayo "competitivo").. El material conjugado disuelto no unido pasará más allá de la zona de reacción hacia por lo menos una zona de absorción. Tales dispositivos pueden incluir proyecciones o micropilares en la trayectoria del flujo.
Un instrumento como el divulgado en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° US20060289787A1 y US20070231883A1, y las Patentes de Estados Unidos N27.416.700 y 6.139.800, es capaz de detectar el material conjugado unido en la zona de reacción. Los marcadores comunes incluyen colorantes fluorescentes que pueden detectarse mediante instrumentos que excitan los colorantes fluorescentes e incorporan un detector capaz de detectar los colorantes fluorescentes.
INMUNOENSAYO
Los anticuerpos producidos de este modo pueden usarse en inmunoensayos para reconocer/unirse al fármaco antipsicótico, detectando de este modo la presencia y/o la cantidad del fármaco en una muestra de paciente. Preferiblemente, el formato de ensayo es un formato de inmunoensayo competitivo. Dicho formato de ensayo y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton et al. (Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN 1990) y Maddox et al. (J. Exp. Med. 158:12111, 1983).
El término "analito" se refiere a cualquier sustancia o grupo de sustancias, cuya presencia o cantidad debe determinarse. Los analitos de fármacos antipsicóticos representativos incluyen, pero no se limitan a, risperidona, paliperidona, olanzapina, aripiprazol y quetiapina.
El término "compañero de unión competitivo" se refiere a una sustancia o grupo de sustancias, como las que pueden emplearse en un inmunoensayo competitivo, que se comportan de manera similar a un analito con respecto a la afinidad de unión a un anticuerpo. Los compañeros de unión competitivos representativos incluyen, pero no se limitan a, derivados de fármacos antipsicóticos y similares.
El término "detectar" cuando se usa con un analito se refiere a cualquier método cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo, así como a todos los demás métodos para determinar un analito en general y un fármaco antipsicótico en particular. Por ejemplo, se describe un método que simplemente detecta la presencia o ausencia de un fármaco antipsicótico en una muestra, así como métodos que proporcionan datos sobre la cantidad o concentración del fármaco antipsicótico en la muestra. Los términos "detectar", "determinar", "identificar" y similares se usan en la presente como sinónimos, y todos se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
En la presente se divulga un inmunoensayo competitivo en el que los anticuerpos que se unen al fármaco antipsicótico, o al fármaco o a su compañero de unión competitivo, se unen a un soporte sólido (como la zona de reacción en un dispositivo de ensayo de flujo lateral) y el fármaco marcado o el compañero de unión competitivo del mismo, o anticuerpo marcado, respectivamente, y una muestra derivada del huésped se pasan sobre el soporte sólido y la cantidad de marca detectada unida al soporte sólido puede correlacionarse con una cantidad de fármaco en la muestra.
Puede analizarse cualquier muestra de la que se sospeche que contiene un analito, por ejemplo, un fármaco antipsicótico. La muestra puede pretratarse si se desea y puede prepararse en cualquier medio conveniente que no interfiera con el ensayo. Preferiblemente, la muestra comprende un medio acuoso como un fluido corporal de un huésped, más preferiblemente plasma o suero.
Debe entenderse que se contemplan todo tipo de inmunoensayos que emplean anticuerpos producidos de acuerdo con los métodos de la invención, incluyendo ensayos en los que los anticuerpos se unen a fases sólidas y ensayos en los que los anticuerpos están en medios líquidos. Los métodos de inmunoensayos que pueden usarse para detectar analitos usando anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, ensayos competitivos (limitados por reactivos) en los que el analito marcado (análogo del analito) y el analito en una muestra compiten por los anticuerpos y ensayos inmunométricos de sitio único en donde el anticuerpo está marcado; y similares.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la invención con referencia a realizaciones específicas. Estas ejemplificaciones, aunque ilustran ciertos aspectos específicos de la invención, no describen las limitaciones ni circunscriben el alcance de la invención divulgada.
Todos los ejemplos se llevaron a cabo usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, excepto cuando se describa lo contrario en detalle. Las técnicas de biología molecular rutinarias de los siguientes ejemplos pueden llevarse a cabo como se describe en los manuales de laboratorio estándar, como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2§ Ed., Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).).
En la presente se hace referencia a las solicitudes en tramitación tituladas "Haptens of Aripiprazole" (Expediente de apoderado N° PRD3265USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.450, presentada el 21 de agosto de 2012), "Haptens of Olanzapine" (Expediente de apoderado N° PRD3266USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.454, presentada el 21 de agosto de 2012), "Haptens of Paliperidone" (Expediente de apoderado N° PRD3267USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.459, presentada el 21 de agosto de 2012), " Haptens of Quetiapine " (Expediente de apoderado N° PRD3268USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.462, presentada el 21 de agosto de 2012), " Haptens of Risperidone and Paliperidone" (Expediente de apoderado N° PRD3269USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.469, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Aripiprazole Haptens and Use Thereof (Expediente de apoderado N° CDS5128USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.544, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Olanzapine Haptens and Use Thereof" (Expediente de apoderado N° CDS5132USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.572, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Paliperidone Haptens and Use Thereof" (Expediente de apoderado N° CDS5126USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.634, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Quetiapine Haptens and Use Thereof" (Expediente de apoderado N° CDS5134USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.598, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Aripiprazole and Use Thereof" (Expediente de apoderado N° CDS5129USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.522, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Olanzapine and Use Thereof" (Expediente de apoderado N° CDS5133USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.645, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Paliperidone and Use Thereof" (Expediente de apoderado N° CDS5127USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.692, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Quetiapine and Use Thereof" (Expediente de apoderado N° CDS5135USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.659, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Risperidone and Use Thereof" (Expediente de apoderado N° CDS5131 USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/691.675, presentada el 21 de agosto de 2012), y "Antibodies to Risperidone and Use Thereof" (Expediente de apoderado N° CDS5145USPSP, Solicitud de patente provisional de Estados Unidos N° 61/790.880, presentada el 15 de marzo de 2013).
EJEMPLO 1
Paso A
9-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-(2-cloroetil)-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
Figure imgf000023_0001
Se trató una solución de 3-(2-cloroetil)-9-hidroxi-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (1,0 g, 4,12 mmol) en DMF (5 ml) con 7H-imidazol (701,24 mg, 64,66 mmol), seguido de una solución de tbutildimetilclorosilano (683,12 mg, 4,53 mmol) en DMF (1 ml). Después de 18 h de agitación a temperatura ambiente, los solventes se eliminaron al vacío y el residuo se recogió en diclorometano/agua (10 ml/10 ml) con la adición de una espátula de carbonato de potasio. La capa acuosa se extrajo con diclorometano (tres veces 10 ml). Las fracciones orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el solvente se eliminó al vacío. La mezcla bruta se usó sin más purificación en el paso siguiente. (ESI-MS (M+1) 357).
Paso B
9-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-(2-(4-(6-hidroxibenzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-1-il)etil)-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4Hpirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
Figure imgf000024_0001
Se trató una solución de 9-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-(2-cloroetil)-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4- uno, preparado como se describe en el paso anterior, (0,5 g, 1,40 mmol) en metanol (25 ml) y diisopropiletilamina (732,83 pl, 4,20 mmol) con sal de clorhidrato de 3-(piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-ol (374,62 mg, 1,47 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 17 horas a 60° C en una atmósfera de argón. Se añadió diisopropiletilamina (732,83 pl, 4,20 mmol) y la mezcla se agitó adicionalmente durante 4 horas a 60° C. La mezcla de la reacción se evaporó al vacío y el residuo se recogió en agua (25 ml), se extrajo con cloroformo (3 x 25 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSÜ4, se filtraron y el solvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (elución con diclorometano/metanol (98/2) para dar el compuesto del título (ESI-MS (M+1) 539).
Paso C
(2-((3-(1-(2-(9-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)carbamato de terc-butilo
Figure imgf000024_0002
Se trató una solución de 9-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-(2-(4-(6-hidroxibenzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-1-il)etil)-2- metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona, preparada como se describe en el paso anterior, (50 mg, 0,093 mmol) en acetona (0,5 ml) y d Mf (0,5 ml) con carbonato de potasio (33,3 mg, 0,24 mmol) y N-Boc-2-bromoaminoetano (27 mg, 0,12 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó durante 17 h a 60° C en una atmósfera de argón. La mezcla de la reacción se evaporó a 40° C a presión reducida y se disolvió en agua (10 ml) y se extrajo con diclorometano (3 x 10 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SÜ4, se filtraron y el solvente se evaporó para proporcionar el compuesto del título bruto. (ESI-MS (M+1) 682).
Paso D
3- (2-(4-(6-(2-aminoetoxi)benzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-1-il)etil)-9-hidroxi-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
Figure imgf000025_0001
Se agitó una solución de (2-((3-(1-(2-(9-((terc-butildimetilsilil)oxi)-2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)carbamato de terc-butilo, preparado como se describe en el paso anterior, (70 mg, 0,103 mmol) en HCl/isopropanol (10 ml, 5 N) durante 1 hora a 60° C. La mezcla de la reacción se evaporó a 40° C a presión reducida y se disolvió cuidadosamente en solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (5 ml) y se extrajo con diclorometano (3 x 10 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se evaporaron a presión reducida a 40° C. La capa acuosa todavía contenía producto, que se recuperó evaporando la capa acuosa hasta la sequedad a 40° C a presión reducida. El residuo resultante de la capa acuosa se volvió a disolver en agua y se llevó a una columna Waters Oasis SPE (6 cc) acondicionada y luego se eluyó con metanol. La fracción de elución de metanol se combinó con el residuo de la extracción con diclorometano y se evaporó hasta la sequedad a 40° C a presión reducida para proporcionar el compuesto del título junto con un producto secundario (ESI-MS (M+1) 468; siendo el producto secundario 5% de 9-hidroxi-3-(2-(4-(6-hidroxibenzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-1 -il)etil)-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (M+1) 425). La mezcla se usó en el paso siguiente sin purificación adicional.
EJEMPLO 2
2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1 -(2-(9-hidroxi-2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida
Figure imgf000025_0002
A una solución de 3-(2-(4-(6-(2-aminoetoxi)benzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-1-il)etil)-9-hidroxi-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona, preparada como se describe en el Ejemplo 1, (4,0 mg, 8,5 pmoles) en 215 pl de DMF y 4,3 pl de tributilamina se le añadieron 214 pl de una solución en DMF de éster de N-(amaleimidoacetoxi) succinimida (AMAS, 10 mg/ml, 2,1 mg, 8,5 pmoles). La solución resultante se dejó agitar durante 60 minutos a 20° C, luego se usó como tal en la reacción de conjugación con proteína activada con tiol.
EJEMPLO 3
Paso A
3-(2-(4-(6-hidroxibenzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-1 -il)etil)-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1, 2-a]pirimidin-4-ona
Figure imgf000025_0003
Se agitó una solución de 3-(2-cloroetil)-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona (14,4 g, 0,05 mmol), 3-(piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-ol (14,0 g, 0,05 mmol), carbonato de sodio (16,0 g, 0,15 mmol) y yoduro de potasio (punta de espátula) en DMF (150 ml) durante 5 h a 80° C. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se añadió agua. El precipitado se eliminó por filtración y el filtrado se extrajo con cloroformo (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 , se filtraron y se concentraron. El residuo se cristalizó con alcohol isopropílico (70 ml), se filtró y se lavó con una mezcla de isopropanol/éter diisopropílico 50/50 (10 ml). El residuo se secó durante la noche a 100° C dando el compuesto del título y se usó sin purificación adicional en el paso siguiente.
Paso B
3-(2-(4-(6-(2-aminoetoxi)benzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-1 -il)etil)-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona
Figure imgf000026_0001
Se trató una solución de 3-(2-(4-(6-hidroxibenzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-1-il)etil)-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona, preparada como se describe en el paso anterior, (6,6 g, 0,015 mmol) en DMF (50 ml) y acetona (50 ml) con carbonato de potasio (3,0 g, 0,03 mmol) y (2-bromoetil)carbamato de etilo (2,4 g, 0,015 mmol). Después de agitar durante la noche a 60° C, la mezcla de la reacción se vertió en agua (150 ml), se extrajo con cloroformo (3 x 100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2 SO4, se filtraron, se concentraron y se purificaron por cromatografía en gel de sílice (elución con diclorometano/metanol (90/10). Las fracciones combinadas se trataron con HBr (150 ml, 48 %) y se calentaron a reflujo durante 30 min. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se basificó con hidróxido de amonio (28% de NH3 en H2O) y se extrajo con cloroformo (3 x 100 ml).Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 , se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía en gel de sílice (gradiente de elución con diclorometano/metanol (90/10 a 50/50) dando como resultado un sólido que se disolvió en isopropanol (50 ml) y se trató con isopropanol/HCl. El precipitado se eliminó por filtración y se lavó con /PrOH/éter diisopropílico (50/50, 3 x 20 ml). El precipitado se secó al vacío para proporcionar el compuesto del título ESI-MS (M+1) 452. 1H Nm R (360 MHz, DMSO-de) □ ppm 1.76 - 1.85 (m, 1 H) 1.87 - 1.96 (m, 1 H) 2.19 (d, J=12.81 Hz, 1 H) 2.37 - 2.48 (m, 4 H) 2.98 - 3.10 (m, 3 H) 3.10 - 3.28 (m, 5 H) 3.37 -3.46 (m, 3 H) 3.72 (d, J=11.34 Hz, 3 H) 3.79 - 3.85 (m, 2 H) 4.31 (t, J=4.94 Hz, 1 H) 7.05 (dd, J=8.78, 1.83 Hz, 1 H) 7.35 - 7.39 (m, 1 H) 8.08 (d, J=8.78 Hz, 1 H).
EJEMPLO 4
2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1 -(2-(2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida
Figure imgf000026_0002
A una solución de 3-(2-(4-(6-(2-aminoetoxi)benzo[d]isoxazol-3-il)piperidin-1-il)etil)-2-metil-6,7,8,9 -tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona, preparada como se describe en el Ejemplo 3, (3,4 mg, 7,58 pmoles) en 185 pl de DMF y 3,7 pl de tributilamina se le añadieron 190 pl de solución DMF de éster de N-(a-maleimidoacetoxi) succinimida (AMAS, 10 mg/ml, 1,9 mg, 7,58 pmoles). La solución resultante se dejó en agitación durante 90 minutos a 20° C, luego se usó como tal en la reacción de conjugación con proteína activada con tiol.
EJEMPLO 5
Conjugado de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1 -(2-(9-hidroxi-2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida - hemocianina de lapa californiana Paso A
A una solución de 4,22 ml de hemocianina de lapa californiana (KLH, 18,0 mg, 0,18 gmoles) en tampón de fosfato 100 mM, cloruro de sodio 0,46 M, a pH 7,4, se le añadieron 83,2 gl de una solución DMF de N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA, 25 mg/ml, 2,1 mg, 9,0 gmoles). La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón de fosfato 100 mM, cloruro de sodio 0,46 M, EDTA 5 mM, a pH 6,0.
Paso B
A 9,37 ml de solución KLH-SATA, preparada como se describe en el Paso A, (17,1 mg, 0,171 gmoles) se le añadieron 937 gl de hidroxilamina 2,5 M, EDTA 50 mM, a pH 7,0. La solución resultante se incubó a 20° C durante 40 minutos en un mezclador de rodillos. La reacción se usó como tal en la reacción de conjugación con hapteno activado con maleimida.
Paso C
A una alícuota de la solución de KLH-SH resultante, preparada como se describe en el Paso B, (3,4 ml, 0,058 gmoles) se le añadió una alícuota de solución de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1-(2-(9-hidroxi-2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida, preparada como se describe en el Ejemplo 2, (282,8 gl, 5,0 gmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 3 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se filtró a través de un filtro de jeringuilla de 0,2 gm y luego se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón de fosfato 100 mM, cloruro de sodio 0,46 M, a pH 7,4.
EJEMPLO 6
Conjugado de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1 -(2-(9-hidroxi-2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida - tiroglobulina bovina
Paso A
A 1,0 ml de una solución de tiroglobulina bovina (BTG, 9,3 mg, 0,014 gmoles) en tampón de fosfato 100 mM a pH 7,5 se le añadieron 132 gl de una solución DMF de N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA, 25 mg/ml, 3,3 mg, 14,1 gmoles). La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón de fosfato 100 mM, EDTA 5 mM, a pH 6,0.
Paso B
A 2,11 ml de solución BTG-SATA, preparada como se describe en el Paso A, (7,4 mg, 0,011 gmoles) se añadieron 211 gl de hidroxilamina 2,5 M, EDTA 50 mM, a pH 7,0. La solución resultante se incubó a 20° C durante 60 minutos en un mezclador de rodillos. La reacción se usó como tal en la reacción de conjugación con hapteno activado con maleimida.
Paso C
A una alícuota de la solución de BTG-SH resultante, preparada como se describe en el Paso B, (2,3 ml, 0,011 gmoles) se le añadió una alícuota de una solución de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1-(2-(9-hidroxi-2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida, preparada como se describe en el Ejemplo 2, (280,4 gl, 5,5 gmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 2,5 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se filtró a través de un filtro de jeringuilla de 0,2 gm y luego se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón de fosfato 100 mM, cloruro de sodio 0,14 M, a pH 7,4.
EJEMPLO 7
Conjugado de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1 -(2-(2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida - hemocianina de lapa californiana
A una alícuota de solución de KLH-SH, preparada como se describe en el Ejemplo 5, Paso B, (1,5 ml, 0,025 gmoles) se le añadió una alícuota de solución de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1-(2-(2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida, preparada como se describe en el Ejemplo 4, (113 pl, 2,26 pmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 2,5 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se filtró a través de un filtro de jeringuilla de 0,2 pm y luego se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón de fosfato 100 mM y cloruro de sodio 0,46 M, a pH 7,4.
EJEMPLO 8
Conjugado de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1 -(2-(2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida - tiroglobulina bovina
A una alícuota de solución de BTG-SH, preparada como se describe en el Ejemplo 6, Paso B, (0,63 ml, 0,0033 pmoles) se le añadió una alícuota de solución de 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-N-(2-((3-(1 -(2-(2-metil-4-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2-a]pirimidina-3-il)etil)piperidin-4-il)benzo[d]isoxazol-6-il)oxi)etil)acetamida, preparada como se describe en el Ejemplo 4 (80 pl, 1,6 pmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 2,5 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se filtró a través de un filtro de jeringuilla de 0,2 pm y luego se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón de fosfato 100 mM y cloruro de sodio 0,14 M, a pH 7,4. EJEMPLO 9
Inmunoensayos competitivos para risperidona/paliperidona e inmunoensayos competitivos multiplex para aripiprazol, olanzapina, quetiapina y risperidona/paliperidona
Después de una serie de inmunizaciones con inmunógenos de paliperidona/risperidona, se probó la reactividad de los sangrados de la cola del ratón usando un ELISA. También se probaron los sobrenadantes de hibridomas, y los datos de ELISA mostrados en las Tablas 8 y 9 a continuación muestran la reactividad de varios hibridomas (el compañero de fusión eran células NSO). Como se muestra en la Tabla 9, se observó reactividad de los hibridomas 2A5 y 5G11.
Figure imgf000029_0001
Tabla 9
Figure imgf000030_0001
Después de que se hubieran identificado los clones mediante la reactividad de ELISA, se realizaron ELISA de competición para aproximar la afinidad y la reactividad cruzada con compuestos similares. Las Figs. 1 y 2 muestran los resultados de reactividad cruzada de ELISA del subclon 5_9 del hibridoma. Los datos muestran reactividad a la risperidona, así como a sus metabolitos paliperidona y 7-hidroxirisperidona.
Los sobrenadantes también se analizaron mediante ELISA de competición para determinar si las señales eran específicas o para risperidona o para paliperidona. La Fig. 3 muestra los resultados del subclon de hibridoma 2A5. Los datos muestran reactividad tanto a la risperidona como a la paliperidona.
La Fig. 4 muestra el formato de inmunoensayo competitivo usado en un dispositivo de ensayo de flujo lateral en el que el anticuerpo de captura, risperidona/paliperidona clon 5-9, se depositó en un chip junto con un conjugado de detección que consistía de risperidona conjugada con un fluoróforo. En este formato competitivo como se muestra en la Fig. 4, un nivel bajo de analito (paliperidona) da como resultado una señal alta, mientras que un nivel alto de analito (paliperidona) da como resultado una señal baja. La cantidad de paliperidona en la muestra puede calcularse a partir de la pérdida de fluorescencia en comparación con una muestra de control sin fármaco presente. En la Fig. 5 se muestra una curva típica de respuesta a la dosis generada con el clon 5-9 de risperidona/paliperidona.
La Fig. 6 muestra el diseño de chip de un dispositivo de ensayo de flujo lateral. El dispositivo incluye una zona o área para recibir la muestra, una zona de conjugado (que contiene los compañeros de unión competitivos marcados deseados) y una zona de reacción (se indican ocho áreas dentro de la zona de reacción; cada área puede contener un anticuerpo deseado separado). La muestra fluye desde la zona de muestra a través de la zona de conjugado y hacia la zona de reacción.
Las Figs. 7-10 muestran las curvas típicas de respuesta a la dosis para un control positivo de aripiprazol (muestra que contiene aripiprazol) generado con el anticuerpo 5C7 depositado en la zona de reacción 2 y un compañero de unión competitivo de aripiprazol marcado en la zona de conjugado (Fig. 7), un control positivo de olanzapina (muestra que contiene olanzapina) generado con el anticuerpo 4G9-1 depositado en la zona de reacción 4 y un compañero de unión competitivo de olanzapina marcado en la zona de conjugado (Fig. 8), un control positivo de quetiapina (muestra que contiene quetiapina) generado con el anticuerpo 11 depositado en la zona de reacción 6 y un compañero de unión competitivo de quetiapina marcado en la zona de conjugado (Fig. 9), y un control positivo de risperidona (muestra que contiene risperidona) generado con el anticuerpo 5-9 depositado en la zona de reacción 8 y un compañero de unión competitivo de risperidona marcado en la zona de conjugado (Fig. 10). Los compañeros de unión competitivos marcados en la zona de conjugado compiten con los fármacos presentes en las muestras para unirse a los anticuerpos. Se detecta la cantidad de marcador y es una indicación de la cantidad de fármaco presente en la muestra (la cantidad de señal es inversamente proporcional a la cantidad de fármaco en la muestra - ver la Fig. 4).
Para confirmar que los conjugados de compañeros de unión competitiva marcados no se unen a los anticuerpos depositados en las zonas de reacción, se realizaron controles negativos usando muestras que no contenían fármacos. Con referencia a la Tabla 10, se deposita una muestra que no contiene aripiprazol en la zona de muestra y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada, pero no aripiprazol marcado) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2. La Tabla 10 a continuación muestra los resultados, lo que confirma que no hay respuesta a la dosis y que los conjugados de olanzapina, quetiapina y risperidona que se mueven por acción capilar a través de la zona de reacción no se unen al anticuerpo de aripiprazol.
Tabla 10
Figure imgf000031_0002
Con referencia a la Tabla 11, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene olanzapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, quetiapina marcada y risperidona marcada, pero no olanzapina marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4. La Tabla 11 a continuación muestra los resultados, lo que confirma que no hay respuesta a la dosis y que los conjugados de aripiprazol, quetiapina y risperidona que se mueven por acción capilar a través de la zona de reacción no se unen al anticuerpo de olanzapina.
Tabla 11
Figure imgf000031_0001
Con referencia a la Tabla 12, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene quetiapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, olanzapina marcada y risperidona marcada, pero no quetiapina marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6. La Tabla 12 a continuación muestra los resultados, lo que confirma que no hay respuesta a la dosis y que los conjugados de aripiprazol, olanzapina y risperidona que se mueven por acción capilar a través de la zona de reacción no se unen al anticuerpo de quetiapina.
Tabla 12
Figure imgf000032_0001
Con referencia a la Tabla 13, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene risperidona y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, olanzapina marcada y quetiapina marcada, pero no risperidona marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La Tabla 13 a continuación muestra los resultados, lo que confirma que no hay respuesta a la dosis y que los conjugados de aripiprazol, olanzapina y quetiapina que se mueven por acción capilar a través de la zona de reacción no se unen al anticuerpo de risperidona.
Tabla 13
Figure imgf000032_0002
Para confirmar que los conjugados de compañeros de unión competitiva marcados se unen solo a sus anticuerpos respectivos depositados en las zonas de reacción, se realizaron controles negativos adicionales usando de nuevo muestras que no contenían fármacos. Con referencia a la Tabla 14, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene aripiprazol y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6 y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La Tabla 14 a continuación muestra los resultados, confirmando que no hay respuesta a la dosis excepto para el anticuerpo 5C7 de aripiprazol (en la zona de reacción 2).
Tabla 14
Figure imgf000033_0003
Con referencia a la Tabla 15, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene olanzapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo olanzapina marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6 y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La Tabla 15 a continuación muestra los resultados, lo que confirma que no hay respuesta a la dosis excepto para el anticuerpo de olanzapina 4G9-1 (en la zona de reacción 4).
Tabla 15
Figure imgf000033_0001
Con referencia a la Tabla 16, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene quetiapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo quetiapina marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6 y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La Tabla 16 a continuación muestra los resultados, lo que confirma que no hay respuesta a la dosis excepto para el anticuerpo 11 de quetiapina (en la zona de reacción 6).
Tabla 16
Figure imgf000033_0002
Con referencia a la Tabla 17, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene risperidona y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo risperidona marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6 y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La Tabla 17 a continuación muestra los resultados, lo que confirma que no hay respuesta a la dosis excepto para el anticuerpo de risperidona 5-9 (en la zona de reacción 8).
Tabla 17
Figure imgf000034_0001
Los resultados que se muestran arriba confirman que los conjugados de compañeros de unión competitiva marcados se unen solamente a sus anticuerpos respectivos en la zona de reacción.
Las Figs. 11-14 muestran curvas típicas de respuesta a la dosis en zonas de reacción de anticuerpos específicas, y pruebas de la respuesta a la dosis en concentraciones bajas/altas para cada ensayo específico en presencia de otros conjugados. En la Fig. 11, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene aripiprazol y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis como se muestra en la Fig. 11 solo para el aripiprazol, y no para la olanzapina, la quetiapina o la risperidona.
En la Fig. 12, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene olanzapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis como se muestra en la Fig. 12 solo para la olanzapina, y no para el aripiprazol, la quetiapina o la risperidona.
En la Fig. 13, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene quetiapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis como se muestra en la Fig. 13 solo para la quetiapina, y no para el aripiprazol, la olanzapina o la risperidona.
En la Fig. 14, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene risperidona y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis como se muestra en la Fig. 14 solo para la risperidona, y no para el aripiprazol, la olanzapina o la quetiapina.
Las Figs. 15-18 muestran las curvas típicas de respuesta a la dosis para cada ensayo en presencia de otros conjugados y anticuerpos. En la Fig. 15, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene aripiprazol y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (que contiene de nuevo aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6 y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis para el aripiprazol, como se muestra en la Fig. 15. Cuando se depositó una muestra que contenía olanzapina en la zona de muestra de este chip, se generó una curva típica de respuesta a la dosis para la olanzapina como se muestra en la Fig. 16. Cuando se depositó una muestra que contenía quetiapina en la zona de muestra de este chip, se generó una curva típica de respuesta a la dosis para quetiapina como se muestra en la Fig. 17. Cuando se depositó una muestra que contenía risperidona en la zona de muestra de este chip, se generó una curva típica de respuesta a la dosis para risperidona como se muestra en la Fig. 18.
Las Figs. 19-22 muestran comparaciones de curvas de respuesta a la dosis generadas como controles positivos (Figs. 7-10) para las curvas de respuesta a la dosis generadas en formato multiplex (Figs. 15-18). La comparación para el aripiprazol se muestra en la Fig. 19; para la olanzapina en la Fig. 20; para la quetiapina en la Fig. 21; y para la risperidona en la Fig. 22. Estas figuras muestran que las curvas de control positivo son similares a las curvas multiplex.
Estos datos muestran que puede usarse un dispositivo de ensayo de flujo lateral para detectar múltiples fármacos antipsicóticos usando una única muestra de un paciente en un dispositivo portátil en el punto de atención.

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un anticuerpo que se una a la risperidona, el método comprendiendo:
(i) seleccionar un huésped no humano para la producción de anticuerpos; y
(ii) inocular al huésped con un conjugado de un compuesto de Fórmula III y un portador inmunogénico, en donde el huésped produce un anticuerpo que se une a la risperidona, y
la Fórmula III es:
Figure imgf000036_0001
2. Un método para producir una línea celular de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se une a la risperidona, el método comprendiendo:
(i) seleccionar un huésped no humano para la producción de anticuerpos;
(ii) inocular al huésped con un conjugado de un compuesto de Fórmula III y un portador inmunogénico;
(iii) fusionar una línea celular de dicho huésped inoculado con una célula que se divide continuamente para crear una célula fusionada capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se une a la risperidona; y
(iv) clonar la célula fusionada para obtener una línea celular de hibridoma, y
la Fórmula III es:
Figure imgf000036_0002
ES13830253T 2012-08-21 2013-08-20 Anticuerpos contra haptenos de risperidona y uso de los mismos Active ES2926662T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261691615P 2012-08-21 2012-08-21
PCT/US2013/055794 WO2014031645A1 (en) 2012-08-21 2013-08-20 Antibodies to risperidone haptens and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2926662T3 true ES2926662T3 (es) 2022-10-27

Family

ID=50148308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13830253T Active ES2926662T3 (es) 2012-08-21 2013-08-20 Anticuerpos contra haptenos de risperidona y uso de los mismos

Country Status (11)

Country Link
US (3) US9751953B2 (es)
EP (1) EP2888284B1 (es)
JP (3) JP6374387B2 (es)
CN (2) CN104736565B (es)
AU (3) AU2013305884B2 (es)
CA (1) CA2882563C (es)
ES (1) ES2926662T3 (es)
HK (1) HK1211957A1 (es)
PL (1) PL2888284T3 (es)
PT (1) PT2888284T (es)
WO (1) WO2014031645A1 (es)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2888286T3 (pl) 2012-08-21 2018-07-31 Janssen Pharmaceutica Nv Przeciwciała skierowane przeciwko haptenom kwetiapinowym i ich zastosowanie
CN104736565B (zh) * 2012-08-21 2019-03-12 詹森药业有限公司 利培酮半抗原的抗体及其用途
AU2013305938B2 (en) 2012-08-21 2017-08-17 Saladax Biomedical Inc. Antibodies to paliperidone haptens and use thereof
JP6389176B2 (ja) 2012-08-21 2018-09-12 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． アリピプラゾールハプテンに対する抗体及びその使用
CN107043424B (zh) * 2012-08-21 2021-03-16 詹森药业有限公司 利培酮的抗体及其用途
ES2666000T3 (es) 2012-08-21 2018-04-30 Janssen Pharmaceutica, N.V. Anticuerpos para aripiprazol y uso de los mismos
JP6389177B2 (ja) 2012-08-21 2018-09-12 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． オランザピンハプテンに対する抗体及びその使用
CA2882615C (en) 2012-08-21 2019-07-09 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Antibodies to quetiapine and use thereof
US9504682B2 (en) 2012-08-21 2016-11-29 Janssen Pharmaceutica Nv Haptens of aripiprazole
EP2888590B1 (en) 2012-08-21 2020-07-08 Janssen Pharmaceutica NV Antibodies to olanzapine and use thereof
CN104736561B (zh) 2012-08-21 2018-06-12 詹森药业有限公司 帕潘立酮的抗体及其用途
PL2888258T3 (pl) 2012-08-21 2019-10-31 Janssen Pharmaceutica Nv Hapteny paliperydonu
JP6523020B2 (ja) * 2015-03-31 2019-05-29 古河電気工業株式会社 生体分子の検出又は定量方法、及び生体分子の検出又は定量用標識試薬粒子
JP6949025B2 (ja) 2015-12-17 2021-10-13 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． リスペリドンに対する抗体及びその使用
US10435478B2 (en) 2015-12-17 2019-10-08 Janssen Pharmaceutica Nv Antibodies to quetiapine and use thereof
CN113424060A (zh) * 2019-01-31 2021-09-21 美国西门子医学诊断股份有限公司 抗纳洛酮和抗纳曲酮单克隆抗体及其生产和使用方法
CN110938072A (zh) * 2019-10-30 2020-03-31 杭州博拓生物科技股份有限公司 一种利培酮人工抗原及其制备方法
CN111808046B (zh) * 2020-06-30 2022-11-11 杭州同舟生物技术有限公司 一种喹硫平人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
CN112608310B (zh) * 2020-12-17 2022-03-29 北京丹大生物技术有限公司 一种利培酮和9-羟基利培酮半抗原、抗原和抗体以及其应用
CN114685470B (zh) * 2020-12-25 2023-08-18 长沙博源医疗科技有限公司 一种利培酮关键基团衍生物、免疫原、抗利培酮特异性抗体及其制备方法与应用
CN116003404B (zh) * 2022-12-14 2024-10-01 杭州同舟生物技术有限公司 一种利培酮人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
US11977085B1 (en) 2023-09-05 2024-05-07 Elan Ehrlich Date rape drug detection device and method of using same

Family Cites Families (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4022780A (en) 1973-03-06 1977-05-10 Imperial Chemical Industries Limited Process for the manufacture of indole derivatives
US4166452A (en) 1976-05-03 1979-09-04 Generales Constantine D J Jr Apparatus for testing human responses to stimuli
US4804663A (en) * 1985-03-27 1989-02-14 Janssen Pharmaceutica N.V. 3-piperidinyl-substituted 1,2-benzisoxazoles and 1,2-benzisothiazoles
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
DE291194T1 (de) 1987-04-27 1992-03-19 Unilever N.V., Rotterdam Immunoassays und vorrichtungen dafuer.
US5120643A (en) 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
AU2684488A (en) 1988-06-27 1990-01-04 Carter-Wallace, Inc. Test device and method for colored particle immunoassay
CA2064194A1 (en) * 1989-07-27 1991-01-28 Nelson Teng Lipid a analog/immunogenic carrier conjugates and the use thereof as vaccines
US5252496A (en) 1989-12-18 1993-10-12 Princeton Biomeditech Corporation Carbon black immunochemical label
DE69232002T2 (de) 1991-06-07 2002-06-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Immunoassays unter Verwendung von markierten Hapten-Analogen
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US5616505A (en) 1992-03-27 1997-04-01 Abbott Laboratories Haptens tracers, immunogens and antibodies for 3-phenyl-1-adamantaneacetic acids
NZ247703A (en) 1992-05-29 1995-07-26 Lilly Industries Ltd Thienobenzdiazepine derivatives and medicaments thereof
US6034078A (en) 1992-05-29 2000-03-07 Eli Lilly And Company Limited Thienobenzodiazepine compounds
US5527709A (en) 1992-06-26 1996-06-18 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Immunoassays with labeled thyronine hapten analogues
US5642870A (en) 1992-08-05 1997-07-01 Sargis; Ike Switch stand
US5395933A (en) 1992-08-07 1995-03-07 Eastman Kodak Company Carbamazepine hapten analogues
ES2236700T3 (es) 1993-11-19 2005-07-16 Janssen Pharmaceutica N.V. 1,2-benzazoles microencapsulados.
AU710106B2 (en) 1994-06-10 1999-09-16 Oklahoma Medical Research Foundation Calcium binding recombinant antibody against protein c
EG23659A (en) 1995-03-24 2007-03-26 Lilly Co Eli Process and crystal forms of methyl-thieno-benzodiazepine
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5643933A (en) 1995-06-02 1997-07-01 G. D. Searle & Co. Substituted sulfonylphenylheterocycles as cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase inhibitors
US5761894A (en) 1996-09-25 1998-06-09 Magic Circle Corporation Grass striping attachment for lawn mowers
AU8148898A (en) 1997-06-23 1999-01-04 Luminex Corporation Interlaced lasers for multiple fluorescence measurement
US6830731B1 (en) 1998-01-05 2004-12-14 Biosite, Inc. Immunoassay fluorometer
ID26669A (id) * 1998-02-12 2001-01-25 Immune Complex Corp Inti protein-protein hepatitis b yang dimodifikasi secara strategi dan turunan-turunannya
US6541669B1 (en) 1998-06-08 2003-04-01 Theravance, Inc. β2-adrenergic receptor agonists
US20030143233A1 (en) 1999-06-07 2003-07-31 Neorx Corporation Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
RU2181297C2 (ru) 2000-06-20 2002-04-20 Эпштейн Олег Ильич Способ лечения патологического синдрома и лекарственное средство
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US6958156B2 (en) 2000-12-15 2005-10-25 Vyrex Corporation Isoflavone derivatives
ATE492565T1 (de) 2002-01-31 2011-01-15 Randox Lab Ltd Immunogene, antikörper und konjugate für ketamin und dessen metaboliten
WO2003072036A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Duke University Treatment methods using anti-cd22 antibodies
IL163666A0 (en) 2002-02-22 2005-12-18 New River Pharmaceuticals Inc Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents
AU2003209447B8 (en) 2002-03-01 2008-10-23 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
WO2003082877A1 (en) 2002-03-28 2003-10-09 Eli Lilly And Company Piperazine substituted aryl benzodiazepines and their use as dopamine receptor antagonists for the treatment of psychotic disorders
SE0201738D0 (sv) 2002-06-07 2002-06-07 Aamic Ab Micro-fluid structures
US20040127489A1 (en) 2002-07-29 2004-07-01 David Pickar Novel antipsychotic combination therapies and compositions useful therein
WO2004014895A1 (en) 2002-08-05 2004-02-19 Eli Lilly And Company Piperazine substituted aryl benzodiazepines
ATE335763T1 (de) * 2002-11-20 2006-09-15 Brahms Ag Sandwich-immunoassay zur bestimmung von proanp- teilpeptiden
US20040193446A1 (en) 2003-03-27 2004-09-30 Mayer Steven Lloyd System and method for managing a patient treatment program including a prescribed drug regimen
US7271252B2 (en) 2003-04-22 2007-09-18 Roche Diagnostics Operations, Inc. Reagents for detecting efavirenz
AU2004252067B2 (en) 2003-05-09 2012-04-12 Duke University CD20-specific antibodies and methods of employing same
US7772240B2 (en) 2003-08-18 2010-08-10 H. Lundbeck A/S Trans-1(6-chloro-3-phenylindan-1-yl)-3,3-dimethylpiperazine
EP1664007B1 (en) 2003-09-23 2009-12-23 Fermion Oy Preparation of quetiapine
KR101255074B1 (ko) 2003-10-01 2013-04-16 아돌로 코포레이션 스피로시클릭 헤테로시클릭 유도체 및 이의 사용 방법
CN1870980B (zh) 2003-10-23 2010-06-23 大冢制药株式会社 控释无菌阿立哌唑注射剂和方法
JP4624364B2 (ja) * 2003-12-12 2011-02-02 アレル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング アッセイ
SE0400662D0 (sv) 2004-03-24 2004-03-24 Aamic Ab Assay device and method
US20080260812A1 (en) 2004-04-26 2008-10-23 Takami Matsuyama C/O Kagoshima University Therapeutic Medicine Containing Monoclonal Antibody Against Folate Receptor Beta (Fr-Beta)
US7087699B2 (en) 2004-05-17 2006-08-08 Acushnet Company Sulfur-containing composition for golf equipment, and method of using same
SE527036C2 (sv) 2004-06-02 2005-12-13 Aamic Ab Analysanordning med reglerat flöde och motsvarande förfarande
TW200616604A (en) 2004-08-26 2006-06-01 Nicholas Piramal India Ltd Nitric oxide releasing prodrugs containing bio-cleavable linker
US20060177883A1 (en) * 2005-02-08 2006-08-10 Saladax Biomedical Inc. 5-Fluoro-uracil immunoassay
US20060235005A1 (en) 2005-04-14 2006-10-19 Oak Labs, Corp. Use of phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitors in the treatment of schizophrenia
US20080214808A1 (en) 2005-04-25 2008-09-04 Thomas Frederik Ernestine Spittaels Preparation of Aseptic 3-[2-[4-((6-Fluoro-1,2-Benzisoxazol-3-Yl)-1-Piperidinyl]-6,7,8,9-Tetrahydro-9-Hydroxy-2-Methyl-4H-Pyrido[1,2-a]Pyrimidin-4-One Palmitate Ester
SE529254C2 (sv) 2005-06-17 2007-06-12 Aamic Ab Optiskt testsystem
SE0501418L (sv) 2005-06-20 2006-09-26 Aamic Ab Metod och medel för att åstadkomma vätsketransport
SE529711C2 (sv) 2006-03-22 2007-11-06 Aamic Ab Fluorescensläsare
JP5026761B2 (ja) * 2006-10-06 2012-09-19 公立大学法人大阪府立大学 ハプテン化合物および抗体
CA2666559A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
US8975374B2 (en) 2006-10-20 2015-03-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
JP2010507648A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 ラモット アット テル−アビブ ユニバーシティー リミテッド グルタミン酸ｎｍｄａ活性を有する新規向精神薬
US20080138842A1 (en) 2006-12-11 2008-06-12 Hans Boehringer Indirect lateral flow sandwich assay
EP2118654B1 (en) 2006-12-29 2013-03-27 Abbott Laboratories Diagnostic test for the detection of a molecule or drug in whole blood
WO2008087557A2 (en) 2007-01-08 2008-07-24 Actavis Group Ptc Ehf An improved process for preparation of 9-hydroxy-3-(2-chloroethyl)- 2-methyl-4h-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-one hydrochloride
CN101245065B (zh) 2007-02-14 2010-05-19 江苏恩华药业股份有限公司 制备苯并异噁唑衍生物的方法及其中间体
MX2010003259A (es) 2007-09-27 2010-04-12 Novartis Ag Ensayo de monitoreo de farmacos.
EA028427B1 (ru) 2008-07-21 2017-11-30 Пробиодруг Аг АНТИТЕЛО, СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С Aβ-ПЕПТИДАМИ ИЛИ ИХ ВАРИАНТАМИ, КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЭТО АНТИТЕЛО, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
US20110207718A1 (en) 2008-08-06 2011-08-25 Gosforth Centre (Holdings) Pty Ltd. Compositions and methods for treating psychiatric disorders
US20100069356A1 (en) 2008-09-17 2010-03-18 Auspex Pharmaceuticals, Inc. Dibenzothiazepine modulators of dopamine, alpha adrenergic, and serotonin receptors
JP5749169B2 (ja) 2008-10-14 2015-07-15 アストラゼネカ アクチボラグ 細菌感染の処置用の縮合スピロ環式ヘテロ芳香族化合物
US20100144781A1 (en) 2008-10-29 2010-06-10 Dong-Jing Fu Methods of treating psychosis and schizophrenia based on polymorphisms in the erbb4 gene
EP2194048A1 (en) 2008-12-02 2010-06-09 Dirk Sartor Nitrate esters for the treatment of vascular and metabolic diseases
US8480333B2 (en) 2008-12-26 2013-07-09 Steven Edward DeMay Frame rail assemblies and interlocking frame rail systems
CA2750400A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Egalet A/S Controlled release formulations with continuous efficacy
CN103415534A (zh) 2009-03-10 2013-11-27 贝勒研究院 靶向抗原呈递细胞的癌症疫苗
EP2445343B1 (en) 2009-06-25 2021-08-04 Alkermes Pharma Ireland Limited Prodrugs of nh-acidic compounds
SG177761A1 (en) 2009-07-31 2012-03-29 Ascendis Pharma As Biodegradable polyethylene glycol based water-insoluble hydrogels
CN102574917A (zh) 2009-08-17 2012-07-11 株式会社未来创药研究所 含有抗hb-egf抗体作为有效成分的药物组合物
US8076097B2 (en) 2009-08-19 2011-12-13 Saladax Biomedical Inc. Imatinib immunoassay
EP2485767A1 (en) 2009-10-06 2012-08-15 Ascendis Pharma A/S Carrier linked paliperidone prodrugs
EP2343296A1 (en) 2009-12-01 2011-07-13 Chemo Ibérica, S.A. A process for the purification of paliperidone
CA2889457C (en) 2009-12-31 2016-06-28 Kempharm, Inc. Amino acid conjugates of quetiapine, process for making and using the same
HUE042945T2 (hu) 2010-03-11 2019-07-29 Kempharm Inc Kvetiapin zsírsav-konjugátumai, eljárás ugyanannak elkészítésére és felhasználására
US8114621B2 (en) 2010-03-12 2012-02-14 Saladax Biomedical Inc. Lenalidomide and thalidomide immunoassays
US8088594B2 (en) 2010-03-16 2012-01-03 Saladax Biomedical Inc. Risperidone immunoassay
WO2011159537A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 The Regents Of The University Of California Method and device for analyte detection
US8530413B2 (en) 2010-06-21 2013-09-10 Sanofi Heterocyclically substituted methoxyphenyl derivatives with an oxo group, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
NZ604423A (en) 2010-06-24 2015-01-30 Alkermes Pharma Ireland Ltd Prodrugs of nh-acidic compounds: ester, carbonate, carbamate and phosphonate derivatives
US9156822B2 (en) 2010-07-02 2015-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Functionally selective ligands of dopamine D2 receptors
US8623324B2 (en) 2010-07-21 2014-01-07 Aat Bioquest Inc. Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates
CN101987836B (zh) * 2010-08-31 2012-11-07 华南农业大学 氯丙嗪半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
AU2012296949B2 (en) 2011-08-12 2016-09-15 Ascendis Pharma A/S High-loading water-soluble carrier-linked prodrugs
US20140243254A1 (en) 2011-08-12 2014-08-28 Ascendis Pharma A/S Polymeric Hyperbranched Carrier-Linked Prodrugs
US8969337B2 (en) 2011-12-15 2015-03-03 Alkermes Pharma Ireland Limited Prodrugs of secondary amine compounds
SG11201501130PA (en) 2012-08-16 2015-04-29 Janssen Pharmaceutica Nv Substituted pyrazoles as n-type calcium channel blockers
PL2888286T3 (pl) 2012-08-21 2018-07-31 Janssen Pharmaceutica Nv Przeciwciała skierowane przeciwko haptenom kwetiapinowym i ich zastosowanie
CN104736561B (zh) 2012-08-21 2018-06-12 詹森药业有限公司 帕潘立酮的抗体及其用途
JP6389176B2 (ja) 2012-08-21 2018-09-12 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． アリピプラゾールハプテンに対する抗体及びその使用
AU2013305935B2 (en) 2012-08-21 2017-08-24 Saladax Biomedical Inc. Haptens of quetiapine for use in immunoassays
CA2882615C (en) 2012-08-21 2019-07-09 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Antibodies to quetiapine and use thereof
AU2013305938B2 (en) 2012-08-21 2017-08-17 Saladax Biomedical Inc. Antibodies to paliperidone haptens and use thereof
US9504682B2 (en) 2012-08-21 2016-11-29 Janssen Pharmaceutica Nv Haptens of aripiprazole
EP2888590B1 (en) 2012-08-21 2020-07-08 Janssen Pharmaceutica NV Antibodies to olanzapine and use thereof
CN104736565B (zh) 2012-08-21 2019-03-12 詹森药业有限公司 利培酮半抗原的抗体及其用途
US9303041B2 (en) 2012-08-21 2016-04-05 Janssen Pharmaceutica Nv Haptens of olanzapine
PL2888258T3 (pl) 2012-08-21 2019-10-31 Janssen Pharmaceutica Nv Hapteny paliperydonu
JP6389177B2 (ja) 2012-08-21 2018-09-12 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． オランザピンハプテンに対する抗体及びその使用
CN107043424B (zh) 2012-08-21 2021-03-16 詹森药业有限公司 利培酮的抗体及其用途
ES2669565T3 (es) * 2012-08-21 2018-05-28 Janssen Pharmaceutica Nv Haptenos de risperidona y paliperidona
ES2666000T3 (es) 2012-08-21 2018-04-30 Janssen Pharmaceutica, N.V. Anticuerpos para aripiprazol y uso de los mismos
US9453002B2 (en) 2013-08-16 2016-09-27 Janssen Pharmaceutica Nv Substituted imidazoles as N-type calcium channel blockers
JP6949025B2 (ja) * 2015-12-17 2021-10-13 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． リスペリドンに対する抗体及びその使用
US10435478B2 (en) 2015-12-17 2019-10-08 Janssen Pharmaceutica Nv Antibodies to quetiapine and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US10793644B2 (en) 2020-10-06
AU2018200107A1 (en) 2018-01-25
PL2888284T3 (pl) 2023-02-27
JP6971927B2 (ja) 2021-11-24
US9751953B2 (en) 2017-09-05
US20200399400A1 (en) 2020-12-24
EP2888284B1 (en) 2022-07-06
JP6374387B2 (ja) 2018-08-15
AU2019284059B2 (en) 2022-03-10
JP2021003118A (ja) 2021-01-14
AU2013305884A1 (en) 2015-03-05
JP2019001788A (ja) 2019-01-10
US20140057301A1 (en) 2014-02-27
WO2014031645A1 (en) 2014-02-27
CN104736565A (zh) 2015-06-24
CA2882563A1 (en) 2014-02-27
AU2019284059A1 (en) 2020-01-23
PT2888284T (pt) 2022-11-18
EP2888284A1 (en) 2015-07-01
AU2018200107B2 (en) 2019-10-03
AU2013305884B2 (en) 2017-10-05
HK1211957A1 (en) 2016-06-03
CA2882563C (en) 2022-11-29
JP2015532646A (ja) 2015-11-12
CN108517014A (zh) 2018-09-11
CN104736565B (zh) 2019-03-12
US20180022827A1 (en) 2018-01-25
EP2888284A4 (en) 2016-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2926662T3 (es) Anticuerpos contra haptenos de risperidona y uso de los mismos
AU2017261585B2 (en) Antibodies to paliperidone haptens and use thereof
AU2018200435B2 (en) Antibodies to olanzapine haptens and use thereof
ES2935460T3 (es) Anticuerpos para haptenos de quetiapina y uso de los mismos
ES2978909T3 (es) Anticuerpos contra haptenos de aripiprazol y uso de los mismos
ES2971506T3 (es) Haptenos de paliperidona
ES2904838T3 (es) Haptenos de risperidona y paliperidona