JP2008139297A - イムノクロマトグラフキット - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、簡便迅速で高感度のイムノクロマトグラフキットを提供することである。
【解決手段】分析対象物及びそれと特異的に結合する抗体又は抗原による免疫反応を利用し、固定化された免疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマトグラフキットであって、有機銀塩粒子、銀イオンの為の還元剤、および金属コロイド標識または金属硫化物標識を含有することを特徴とする。
【選択図】なし
【解決手段】分析対象物及びそれと特異的に結合する抗体又は抗原による免疫反応を利用し、固定化された免疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマトグラフキットであって、有機銀塩粒子、銀イオンの為の還元剤、および金属コロイド標識または金属硫化物標識を含有することを特徴とする。
【選択図】なし
Description
本発明は、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、正確に定性及び定量を行うことができる免疫化学的分析材料に関する。
天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質の中には、極微量で作用するものが非常に多い。従って、これらの物質の定性的及び定量的測定には、従来、高感度分析が可能な機器分析法が広く用いられてきた。しかし、機器分析法は、特異性が低く、試料の前処理工程を含め、分析に時間を要する上、操作が煩雑なため、近年要求されている迅速簡便測定目的には不都合である。一方、免疫学的測定法は、特異性も高く、操作も機器分析よりはるかに簡便であることから、生理活性物質又は環境汚染物質の測定分野に徐々に普及してきた。しかし、96穴プレ−トを用いた酵素免疫測定法やラテックス凝集法のような従来の免疫学的測定法は、必ずしも測定の迅速簡便性又は検出感度を満たすものではなかった。
また他のニ−ズとしては、現在スワブ液や血液と言った比較的侵襲的な検体を用いている検査においても、高感度化が達成されることで、鼻水やうがい液、尿、といった比較的低侵襲的な検体中にごく少量含まれる被検試料を検出することが出来るようになることで、患者の負担の少ない検査方法が可能となることも期待できる。
近年、特に迅速な診断が求められる感染症の検査に、イムノクロマトグラフ法を用いた検査キット(以後の説明において、イムノクロマトグラフキットと記す。)が多く使用されるようになってきている。これらキットの普及により、患者の感染を迅速・簡便な方法で特定することができ、その後の診断、治療を素早く的確に行うことが可能となってきている。例えば、サンドイッチ法を利用したイムノクロマトグラフ法では、分析対象物(例えば、抗原)に特異的に結合する第1抗体を特定の領域に固定した不溶性薄膜状支持体(例えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜など)中に、分析対象物と特異的に結合する標識化第2抗体と、分析対象物を含む可能性のある検体溶液とを展開し、不溶性薄膜状支持体の第1抗体を固定した領域上で、分析対象物との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色などの信号を検出し、分析対象物を測定することができる。なお、前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。
イムノクロマトグラフ法は、その判定・測定に重厚な設備・機器を必要とせず、操作が簡便であり、例えば、分析対象物を含む可能性のある検体溶液を滴下した後、約5分〜10分間静置するだけで測定結果が得られるほど迅速であるので、簡便・迅速・特異性の高い判定・測定手法として、多くの場面、例えば病院における臨床検査、研究室における検定試験等に広く使われている。
また、天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質は、従来の一般的イムノクロマトグラフ法では検出できない極微量で作用する物質が多く、それらを迅速、簡便、且つ高感度に検出できるイムノクロマトグラフ法の開発が求められている。
従来、展開の手段を工夫した技術(例えば、特許文献1,2参照。)、着色粒子を工夫した技術(例えば、特許文献3,4参照。)、展開部材を工夫した技術(例えば、特許文献5参照。)、アビジン−ビオチン結合を利用した技術(例えば、特許文献6参照。)、及び酵素免疫法を利用した技術(例えば、特許文献7参照。)、触媒作用のある金属コロイドを用いた技術(例えば、特許文献8参照。)、金属イオンを沈着させる技術(例えば、特許文献9参照。)等、高感度化を目指した数多くの技術が開示されている。
しかしながら、これらの技術の進歩によりイムノクロマトグラフ法は、分析対象物の検出感度が高くなり酵素免疫測定法に近づいたとは言え、さらなる高感度化が要望されている。
特開平1−32169号公報
特開平4−299262号公報
特開平5−10950号公報
特開平5−133956号公報
特開平7−318560号公報
特開平10−68730号公報
特開平11−69996号公報
特開2002−262638号公報
特開2002−202307号公報
本発明の課題は、イムノクロマトグラフ法の簡便迅速というメリットを保ちつつ、その高感度化をはかることである。
一般に、従来のイムノクロマトグラフ法の検出感度は細菌の場合、105CFU/mL〜107CFU/mLである。最近の高感度な検出法として遺伝子増幅法(PCR法)が挙げられ、その検出感度は103CFU/mL〜104CFU/mLまで達成されている。しかしながら、PCR法は、重厚な設備、機器および煩雑な操作が必要であり、しかも検出までに数時間という長時間を要すため、簡便・迅速な測定方法とは言えない。従来のイムノクロマトグラフ法を1桁〜4桁程度高感度化することは、つまりこれまでPCR法により行っていたような簡便・迅速とは言えなかった検査を、簡便・迅速に行うことを可能にすると考えられる。
一般に、従来のイムノクロマトグラフ法の検出感度は細菌の場合、105CFU/mL〜107CFU/mLである。最近の高感度な検出法として遺伝子増幅法(PCR法)が挙げられ、その検出感度は103CFU/mL〜104CFU/mLまで達成されている。しかしながら、PCR法は、重厚な設備、機器および煩雑な操作が必要であり、しかも検出までに数時間という長時間を要すため、簡便・迅速な測定方法とは言えない。従来のイムノクロマトグラフ法を1桁〜4桁程度高感度化することは、つまりこれまでPCR法により行っていたような簡便・迅速とは言えなかった検査を、簡便・迅速に行うことを可能にすると考えられる。
また、既にイムノクロマトグラフ法による測定法が確立されている感染症の検査においても高感度化が求められている。例えば、イムノクロマトグラフ法によるインフルエンザ検査は近年その簡便・迅速な検査方法として普及しているが、この検査において、感染初期のウイルス量が比較的少ない際には、その検出感度不足から偽陰性が出てしまい再検査が必要となることがある。一般にインフルエンザウイルスは4時間で10倍に増殖するとされることから、例えば1桁の感度アップにより、従来よりも4時間前の時点で感染を判定できるようになる。何度も通院するという患者の負担を低減するという観点から、イムノクロマトグラフ法のような簡便迅速でさらに高感度な検査法の開発が求められている。
従って、本発明の課題は、迅速且つ簡便であって、しかも、従来公知のイムノクロマトグラフ法による検査キットよりも更に高感度なイムノクロマトグラフキットを提供することにある。
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
<1> 分析対象物及びそれと特異的に結合する抗体又は抗原による免疫反応を利用し、固定化された免疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマトグラフキットであって、有機銀塩粒子、銀イオンの為の還元剤、および金属コロイド標識または金属硫化物標識を含有することを特徴とするイムノクロマトグラフキット。
<2> 前記有機銀塩粒子の溶剤を含むことを特徴とする<1>に記載のイムノクロマトグラフキット。
<3> 前記有機銀塩粒子が、カルボン酸銀もしくは含窒素複素環銀塩を含有することを特徴とする<1>又は<2>に記載のイムノクロマトグラフキット。
<4> 前記有機銀塩の相転位温度が40℃以上100℃以下である事を特徴とする<1>〜<3>記載のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
<5> 前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を同一のキット内に含有する事を特徴とする<1>〜<4>のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
<6> 前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤を含有する層、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を含有する層を、同一のキット内に含む事を特徴とする<5>に記載のイムノクロマトグラフキット。
<7> 前記金属コロイドが金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、もしくはこれらの複合コロイドである事を特徴とする<1>〜<6>のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
<8> 前記金属コロイドの平均粒径が5nm以上100nm以下である事を特徴とする<1>〜<7>のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
<2> 前記有機銀塩粒子の溶剤を含むことを特徴とする<1>に記載のイムノクロマトグラフキット。
<3> 前記有機銀塩粒子が、カルボン酸銀もしくは含窒素複素環銀塩を含有することを特徴とする<1>又は<2>に記載のイムノクロマトグラフキット。
<4> 前記有機銀塩の相転位温度が40℃以上100℃以下である事を特徴とする<1>〜<3>記載のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
<5> 前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を同一のキット内に含有する事を特徴とする<1>〜<4>のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
<6> 前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤を含有する層、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を含有する層を、同一のキット内に含む事を特徴とする<5>に記載のイムノクロマトグラフキット。
<7> 前記金属コロイドが金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、もしくはこれらの複合コロイドである事を特徴とする<1>〜<6>のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
<8> 前記金属コロイドの平均粒径が5nm以上100nm以下である事を特徴とする<1>〜<7>のいずれかに記載のイムノクロマトグラフキット。
本発明により、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、正確に定性及び定量を行うことができる高感度のイムノクロマトグラフキットが提供される。
1.イムノクロマト
一般に、イムノクロマトグラフ法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬(抗体、抗原等)を含む少なくとも1つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された検出用標識物が分散されてなる分散液を移動相として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させる際に、前記分析対象物と検出用標識物とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と検出用標識物の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に検出用標識物が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて検出することで被分析液中に被検出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
一般に、イムノクロマトグラフ法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬(抗体、抗原等)を含む少なくとも1つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された検出用標識物が分散されてなる分散液を移動相として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させる際に、前記分析対象物と検出用標識物とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と検出用標識物の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に検出用標識物が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて検出することで被分析液中に被検出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
本発明におけるイムノクロマトグラフキットは、有機銀塩および銀イオンのために還元剤を内蔵し、前記固定化試薬に結合した前記分析対象物と検出用標識物の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することを特徴とする。本発明によれば、従来のイムノクロマトグラフキットで必要とされた外部からの増幅のための金属イオンや還元剤溶液の供給を必要とせず、一段と簡便で、迅速な高感度イムノクロマトグラフキットが提供される。
2.被検試料
本発明のイムノクロマトグラフキットで分析することのできる被検試料としては、分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(特にヒト)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体(スワブ)、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
本発明のイムノクロマトグラフキットで分析することのできる被検試料としては、分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(特にヒト)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体(スワブ)、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
3.被検試料の前処理
本発明のイムノクロマトグラフキットでは、前記被検試料をそのままで、あるいは、前記被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒(例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等)、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
本発明のイムノクロマトグラフキットでは、前記被検試料をそのままで、あるいは、前記被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒(例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等)、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
4.構成
本発明のイムノクロマトグラフキットに使用することのできるイムノクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるイムノクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。例えば、図1に模式的に従来のイムノクロマトグラフ用ストリップの平面図を模式的に示す。図2に図1で示されたイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。図3は本発明のイムノクロマトグラフ用ストリップの縦断面図を模式的に示す。
本発明のムノクロマトグラフ用ストリップ10は、展開方向(図1において矢印Aで示す方向)の上流から下流に向かって、試料添加パッド5、標識化物質保持パッド(例えば金コロイド抗体保持パッド)2、クロマトグラフ担体(例えば抗体固定化メンブレン)3、及び吸収パッド4がこの順に、粘着シ−ト1上に配置されている。
本発明のイムノクロマトグラフキットに使用することのできるイムノクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができるイムノクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。例えば、図1に模式的に従来のイムノクロマトグラフ用ストリップの平面図を模式的に示す。図2に図1で示されたイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。図3は本発明のイムノクロマトグラフ用ストリップの縦断面図を模式的に示す。
本発明のムノクロマトグラフ用ストリップ10は、展開方向(図1において矢印Aで示す方向)の上流から下流に向かって、試料添加パッド5、標識化物質保持パッド(例えば金コロイド抗体保持パッド)2、クロマトグラフ担体(例えば抗体固定化メンブレン)3、及び吸収パッド4がこの順に、粘着シ−ト1上に配置されている。
前記クロマトグラフ担体3は、捕捉部位3aを有し、分析対象物と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域である検出ゾ−ン(検出部と記載することもある)31を有し、所望により、コントロ−ル用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロ−ルゾ−ン(コントロ−ル部と記載することもある)32を更に有する。さらに、検出ゾ−ン31およびコントロ−ルゾ−ン32は、増幅のための有機銀塩と銀イオンのための還元剤を含有する。
前記標識化物質保持パッド2は、標識化物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド(例えば、グラスファイバ−パット)に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。
前記試料添加パッド5としては、例えばグラスファイバ−パットを用いることができる。
4−1.検出用標識物
検出用標識物は、免疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することができる。例えば、金属コロイドのような金属等を用いることができる。担体粒子(又はコロイド)の平均粒径は、0.02〜10μmの範囲が好ましい。色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も着色粒子として使用することができる。従来公知の着色金属コロイドはいずれも標識用着色粒子として使用することができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約1nm〜500nmが好ましく、特に強い色調が得られる5nm〜100nmがさらに好ましい。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法(例えばThe Journal of Histochemistry and Cytochemistry,Vol.30,No.7,pp691−696,(1982))に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイドと特異結合物質(例えば抗体)を適当な緩衝液中で室温下5分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識特異結合物質を得ることができる。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法(Nature Phys. Sci.,vol.241,20,(1973)等)により金コロイド粒子を調製することができる。
検出用標識物は、免疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することができる。例えば、金属コロイドのような金属等を用いることができる。担体粒子(又はコロイド)の平均粒径は、0.02〜10μmの範囲が好ましい。色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も着色粒子として使用することができる。従来公知の着色金属コロイドはいずれも標識用着色粒子として使用することができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約1nm〜500nmが好ましく、特に強い色調が得られる5nm〜100nmがさらに好ましい。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法(例えばThe Journal of Histochemistry and Cytochemistry,Vol.30,No.7,pp691−696,(1982))に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイドと特異結合物質(例えば抗体)を適当な緩衝液中で室温下5分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識特異結合物質を得ることができる。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法(Nature Phys. Sci.,vol.241,20,(1973)等)により金コロイド粒子を調製することができる。
本発明によれば、検出用標識物として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識(以下、金属系標識と称することがある)、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるイムノクロマトグラフキットにおいて、前記金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、前記分析対象物と検出用標識物の複合体の形成後に、有機銀塩から供給される銀イオンおよび銀イオンのために還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が前記金属系標識を核として前記金属系標識上に沈着するので、前記金属系標識が増幅され、分析対象物の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のイムノクロマトグラフキットは、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を免疫複合体の標識上に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のイムノクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。
本発明のイムノクロマトグラフキットでは、分析対象物(抗原又は抗体)と特異的に結合する抗体若しくは抗原、又は標準化合物を標識するのに用いる標識として、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いる。前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識としては、通常のイムノクロマトグラフ法に用いることができる標識である限り、特に限定されるものではなく、金属コロイド標識としては、例えば、白金コロイド、金コロイド、パラジウムコロイド、又は銀コロイドそして、それらの混合物を挙げることができ、金属硫化物標識としては、例えば、鉄、銀、パラジウム、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を挙げることができる。本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、これらの金属コロイド標識及び/又は金属硫化物標識の1又はそれ以上を標識として用いることができる。
4−2.抗体
本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、分析対象物に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクロ−ナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、又はFv]を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。
本発明のイムノクロマトグラフキットにおいては、分析対象物に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクロ−ナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、又はFv]を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。
4−3.クロマトグラフ担体
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロ−ス膜、セルロ−ス膜、アセチルセルロ−ス膜、ポリスルホン膜、ポリエ−テルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
通常クロマトグラフ担体の一部に検出用物質を固定化させて検出ゾ−ンを作製する。検出用物質の固定は、検出用物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、検出用物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロ−ス膜、セルロ−ス膜、アセチルセルロ−ス膜、ポリスルホン膜、ポリエ−テルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
通常クロマトグラフ担体の一部に検出用物質を固定化させて検出ゾ−ンを作製する。検出用物質の固定は、検出用物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、検出用物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。
4−4.試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロ−ス濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテ−ト、酢酸セルロ−ス、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
試料添加パッドの材質は、セルロ−ス濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテ−ト、酢酸セルロ−ス、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
4−5.標識化物質保持パッド
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロ−ス濾紙、グラスファイバ−、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した検出用標識物を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロ−ス濾紙、グラスファイバ−、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した検出用標識物を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
4−6.吸収パッド
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロ−スアセテ−ト等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により分析対象物の測定に合った速度を設定することができる。
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロ−スアセテ−ト等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により分析対象物の測定に合った速度を設定することができる。
5.免疫検査の方法
以下、本発明に用いられるイムノクロマトグラフ法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法、抗体固定化競合法、抗原固定化競合法、及び固定抗原法にそれぞれ適用した各態様に基づいて、順に説明する。
以下、本発明に用いられるイムノクロマトグラフ法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法、抗体固定化競合法、抗原固定化競合法、及び固定抗原法にそれぞれ適用した各態様に基づいて、順に説明する。
5−1.サンドイッチ法
本発明のイムノクロマトグラフキットにサンドイッチ法を適用した態様(以下、単に、サンドイッチ法と称する)では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物(抗原)に対して特異性を有する第1抗体及び第2抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第2抗体を、予め標識化しておく。第1抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定し、分析対象物(抗原)を含む可能性のある被検試料(又はその抽出液)と接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第2抗体を更に接触させると、被検試料中に分析対象物が存在する場合には、固定化第1抗体と分析対象物(抗原)と標識化第2抗体とからなる免疫複合体が形成される。
本発明のイムノクロマトグラフキットにサンドイッチ法を適用した態様(以下、単に、サンドイッチ法と称する)では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物(抗原)に対して特異性を有する第1抗体及び第2抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第2抗体を、予め標識化しておく。第1抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定し、分析対象物(抗原)を含む可能性のある被検試料(又はその抽出液)と接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第2抗体を更に接触させると、被検試料中に分析対象物が存在する場合には、固定化第1抗体と分析対象物(抗原)と標識化第2抗体とからなる免疫複合体が形成される。
サンドイッチ法では、固定化第1抗体と分析対象物(抗原)と第2抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第2抗体を除去し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化第1抗体を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第2抗体の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化第2抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時にこれらを薄膜状支持体に添加することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第2抗体の標識からの信号を増幅する。
5−2.抗体固定化競合法
本発明のイムノクロマトグラフキットに抗体固定化競合法を適用した態様(以下、単に、抗体固定化競合法と称する)では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物(抗原)に対して特異性を有する抗体を、先に述べた方法により予め調製しておき、その抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定しておく。また、標準化合物を、予め標識化しておく。分析対象物(抗原)を含む可能性のある被検試料(又はその抽出液)と、前記標識化標準化合物とを展開させながら接触させ、それと同時に、あるいは、その終了後に、前記固定化抗体に、前記標識化標準化合物を展開させながら接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。
本発明のイムノクロマトグラフキットに抗体固定化競合法を適用した態様(以下、単に、抗体固定化競合法と称する)では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物(抗原)に対して特異性を有する抗体を、先に述べた方法により予め調製しておき、その抗体を、適当な不溶性薄膜状支持体(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定しておく。また、標準化合物を、予め標識化しておく。分析対象物(抗原)を含む可能性のある被検試料(又はその抽出液)と、前記標識化標準化合物とを展開させながら接触させ、それと同時に、あるいは、その終了後に、前記固定化抗体に、前記標識化標準化合物を展開させながら接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。
抗体固定化競合法では、前記不溶性薄膜状支持体上の固定化抗体と、標識化標準化合物(すなわち、標識化抗原)との反応が終了した後、固定化抗体と結合した標識化標準化合物と、固定化抗体と結合しなかった標識化標準化合物とを分離し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化抗体を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、固定化抗体と結合した標識化抗原の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化標準化合物に金属イオン及び還元剤を添加し、同時にこれらを薄膜状支持体に添加することにより、固定化抗体と結合した標識化標準化合物の標識からの信号を増幅する。前記分離は、例えば、緩衝液による洗浄によって行なうことができる。
5−3.抗原固定化競合法
本発明のイムノクロマトグラフキットに抗原固定化競合法を適用した態様(以下、単に抗原固定化競合法と称する)では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物(抗原)に対して特異性を有する抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、前記抗体を、予め標識化しておく。更に、既知量の標準化合物(抗原)を、適当な不溶性薄膜状支持体(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定しておく。
本発明のイムノクロマトグラフキットに抗原固定化競合法を適用した態様(以下、単に抗原固定化競合法と称する)では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物(抗原)に対して特異性を有する抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、前記抗体を、予め標識化しておく。更に、既知量の標準化合物(抗原)を、適当な不溶性薄膜状支持体(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定しておく。
抗原固定化競合法では、前記不溶性薄膜状支持体上の固定化標準化合物(すなわち、固定化抗原)と、標識化抗体との反応が終了した後、固定化標準化合物と結合した標識化抗体と、固定化標準化合物と結合しなかった標識化抗体とを分離し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化標準化合物を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、固定化標準化合物と結合した標識化抗体の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時にこれらを薄膜状支持体に添加することにより、固定化標準化合物と結合した標識化抗体の標識からの信号を増幅する。前記分離は、例えば、緩衝液による洗浄によって行なうことができる。
5−4.固定抗原法
本発明のイムノクロマトグラフキットに固定抗原法を適用した態様(以下、単に、固定抗原法と称する)では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物(抗体)に対して特異性を有する第2抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、前記第2抗体を、予め標識化しておく。分析対象物(抗体)が特異的に結合する抗原を、適当な不溶性薄膜状支持体(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定し、分析対象物(抗体)を含む可能性のある被検試料(又はその抽出液)と接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第2抗体を更に接触させると、被検試料中に分析対象物が存在する場合には、固定化抗原と分析対象物(抗体)と標識化第2抗体とからなる免疫複合体が形成される。
本発明のイムノクロマトグラフキットに固定抗原法を適用した態様(以下、単に、固定抗原法と称する)では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により分析対象物の分析を実施することができる。まず、分析対象物(抗体)に対して特異性を有する第2抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、前記第2抗体を、予め標識化しておく。分析対象物(抗体)が特異的に結合する抗原を、適当な不溶性薄膜状支持体(例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等)上に固定し、分析対象物(抗体)を含む可能性のある被検試料(又はその抽出液)と接触させると、その被検試料中に分析対象物が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第2抗体を更に接触させると、被検試料中に分析対象物が存在する場合には、固定化抗原と分析対象物(抗体)と標識化第2抗体とからなる免疫複合体が形成される。
固定抗原法では、固定化抗原と分析対象物(抗体)と第2抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第2抗体を除去し、続いて、例えば、不溶性薄膜状支持体における固定化抗原を固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第2抗体の標識からの信号を増幅する。あるいは、標識化第2抗体に金属イオン及び還元剤を添加し、同時にこれらを薄膜状支持体に添加することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第2抗体の標識からの信号を増幅する。
6.有機銀塩
本発明に用いられる有機銀塩は、還元可能な銀イオンを含む有機化合物である。好ましくは、還元剤の存在下で50℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する銀塩または配位化合物である。
本発明に用いられる有機銀塩は、アゾ−ル化合物の銀塩およびメルカプト化合物の銀塩より選ばれる化合物が好ましい。好ましくは、アゾ−ル化合物としては含窒素ヘテロ環化合物であり、より好ましくはトリアゾ−ル化合物およびテトラゾ−ル化合物である。メルカプト化合物は、メルカプト基またはチオン基を分子内に少なくとも1つ有する化合物
である。
本発明に用いられる有機銀塩は、還元可能な銀イオンを含む有機化合物である。好ましくは、還元剤の存在下で50℃以上まで加熱されると、光に比較的に安定な金属銀を形成する銀塩または配位化合物である。
本発明に用いられる有機銀塩は、アゾ−ル化合物の銀塩およびメルカプト化合物の銀塩より選ばれる化合物が好ましい。好ましくは、アゾ−ル化合物としては含窒素ヘテロ環化合物であり、より好ましくはトリアゾ−ル化合物およびテトラゾ−ル化合物である。メルカプト化合物は、メルカプト基またはチオン基を分子内に少なくとも1つ有する化合物
である。
本発明における窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩は、好ましくはイミノ基を有する化合物の銀塩である。代表的な化合物としては次にあげるものであるが、これらの化合物に限定されることはない。1,2,4−トリアゾ−ルの銀塩、又はベンゾトリアゾ−ルおよびその誘導体の銀塩(例えば、メチルベンゾトリアゾ−ル銀塩又は5−クロロベンゾトリアゾ−ル銀塩)、米国特許第4,220,709に記載されているフェニルメルカプトテトラゾ−ルのような1H−テトラゾ−ル化合物、米国特許第4,260,677に記載のイミダゾ−ルおよびイミダゾ−ル誘導体。この種の銀塩のうち、特に好ましい化合物はベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩、又はこれらの2つ以上の混合物である。
本発明に用いられる窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩として最も好ましくは、ベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩である。
本発明に用いられる窒素含有ヘテロ環化合物の銀塩として最も好ましくは、ベンゾトリアゾ−ル誘導体の銀塩である。
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物は、好ましくは5つまたは6つの原子を含むヘテロ環化合物である。この場合に環中の原子の少なくとも1つは窒素原子であり、その他の原子は炭素、酸素、硫黄原子である。このようなヘテロ環化合物としてはトリアゾ−ル類オキサゾ−ル類、チアゾ−ル類、チアゾリン類、イミダゾ−ル類、ジアゾ−ル類、ピリジン類、およびトリアジン類が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
メルカプト基またはチオン基を持つ化合物の銀塩のうち代表的な化合物を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない。
3−メルカプト−4−フェニル−1,2,4−トリアゾ−ルの銀塩、2−メルカプト−ベンズイミダゾ−ルの銀塩、2−メルカプト−5−アミノチアゾ−ルの銀塩、2−(2−エチルグリコ−ルアミド)ベンゾチアゾ−ルの銀塩、5−カルボキシ−1−メチル−2−フェニル−4−チオピリジンの銀塩、メルカプトトリアジンの銀塩、2−メルカプトベンゾオキサゾ−ルの銀塩、米国特許第4,123,274記載の化合物の銀塩(例えば1,2,4−メルカプトチアゾ−ル誘導体の銀塩、3−アミノ−5−ベンジルチオ−1,2,4−チアゾ−ルの銀塩)、およびチオン化合物の銀塩[例えば米国特許No.3,785,830に記載の3−(2−カルボキシエチル)−4−メチル−4−チアゾリン−2−チオンの銀塩]。
3−メルカプト−4−フェニル−1,2,4−トリアゾ−ルの銀塩、2−メルカプト−ベンズイミダゾ−ルの銀塩、2−メルカプト−5−アミノチアゾ−ルの銀塩、2−(2−エチルグリコ−ルアミド)ベンゾチアゾ−ルの銀塩、5−カルボキシ−1−メチル−2−フェニル−4−チオピリジンの銀塩、メルカプトトリアジンの銀塩、2−メルカプトベンゾオキサゾ−ルの銀塩、米国特許第4,123,274記載の化合物の銀塩(例えば1,2,4−メルカプトチアゾ−ル誘導体の銀塩、3−アミノ−5−ベンジルチオ−1,2,4−チアゾ−ルの銀塩)、およびチオン化合物の銀塩[例えば米国特許No.3,785,830に記載の3−(2−カルボキシエチル)−4−メチル−4−チアゾリン−2−チオンの銀塩]。
本発明におけるメルカプト基またはチオン基を持つ化合物としては、ヘテロ環を含まない化合物を用いることも出来る。ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体としては、総炭素数が10以上の脂肪族または芳香族炭化水素化合物が好ましい。
ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体のうち有用な化合物としては以下に挙げるものがあるが、これらに制限されるわけではない。
チオグリコ−ル酸銀塩(例えば炭素原子数12から22までのアルキル基を持つS−アルキルチオグリコ−ル酸の銀塩)、ジチオカルボン酸の銀塩(たとえばジチオ酢酸の銀塩又はチオアミドの銀塩)
ヘテロ環を含まないメルカプトまたはチオン誘導体のうち有用な化合物としては以下に挙げるものがあるが、これらに制限されるわけではない。
チオグリコ−ル酸銀塩(例えば炭素原子数12から22までのアルキル基を持つS−アルキルチオグリコ−ル酸の銀塩)、ジチオカルボン酸の銀塩(たとえばジチオ酢酸の銀塩又はチオアミドの銀塩)
カルボン酸の銀塩を持つ有機化合物もまた好ましく用いられる。例えば、直鎖のカルボン酸である。具体的には、C数6〜22のカルボン酸が好ましく用いられる。加えて芳香族カルボン酸の銀塩である。芳香族カルボン酸とその他のカルボン酸の例として、以下の化合物が挙げられるが、これらに限定されることはない。
置換または無置換の安息香酸銀(例えば3,5−ジヒドロキシ安息香酸銀、o−メチル安息香酸銀、m−メチル安息香酸銀、p−メチル安息香酸銀、2,4−ジクロロ安息香酸銀、アセタミド安息香酸銀、およびp−フェニル安息香酸銀)、タンニン酸銀、フタル酸銀、テレフタル酸銀、サリチル酸銀、フェニル酢酸銀、又はピロメリット酸銀。
置換または無置換の安息香酸銀(例えば3,5−ジヒドロキシ安息香酸銀、o−メチル安息香酸銀、m−メチル安息香酸銀、p−メチル安息香酸銀、2,4−ジクロロ安息香酸銀、アセタミド安息香酸銀、およびp−フェニル安息香酸銀)、タンニン酸銀、フタル酸銀、テレフタル酸銀、サリチル酸銀、フェニル酢酸銀、又はピロメリット酸銀。
本発明においては米国特許第3,330,663に記載されたようなチオエ−テル基を含む脂肪酸銀もまた好ましく用いられる。エ−テルまたはチオエ−テル結合を含む炭化水素鎖を有するか、α−位(炭化水素基の上)またはオルト位(芳香族基の上)に立体的に遮蔽された置換基を有する可溶性のカルボン酸銀も用いることができる。これらは、塗布溶媒中で溶解性が向上し、光散乱が少ない塗布物になる。
そのような銀のカルボン酸塩は、米国特許第5,491,059に記載されている。ここで記載されている銀塩の混合物はどれでも、本発明においては必要に応じて使うことができる。
米国特許第4,504,575に記載のスルホン酸塩の銀塩もまた、本発明の態様においては使用することが出来る。EP−A−0227141に記載のsulfosuccinatesの銀塩もまた、本発明において有用である。
さらに、本発明においては例えば米国特許第4,761,361と米国特許第4,775,613に記載のアセチレンの銀塩も使用することが出来る。米国特許第6,355,408に記載のコア−シェル型銀塩として提供されることもできる。これらの銀塩は、一つ以上の銀塩から成るコアと一つ以上の異なる銀塩からなるシェルで構成される。
本発明中において、非感光性銀源としてもう一つ有用なものは米国特許6472131に記載の2つの異なった銀塩から構成される銀の二量体合成物である。そのような非感光性の銀の二量体合成物は2つの異なる銀塩から成る。前記二種の銀塩が直鎖の飽和炭化水素基を銀の配位子として含む場合にはそれら配位子の炭素原子数の差が6以上である。
有機銀塩は、銀として一般に0.001モル/m2〜0.2モル/m2、好ましくは0.001モル/m2〜0.05モル/m2含有される。
7.還元剤
銀イオンのための還元剤は、銀(I)イオンを銀に還元することができるいかなる材料でも用いることができる。
湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬(例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、3−ピラゾリドン類、p−アミノフェノ−ル類、p−フェニレンジアミン類、ヒンダ−ドフェノ−ル類、アミドキシム類、アジン類、カテコ−ル類、ピロガロ−ル類、アスコルビン酸(またはその誘導体)、およびロイコ色素類)、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料は、たとえば米国特許第6,020,117号(バウア−ほか)で記述されるように、本発明において用いることができる。
銀イオンのための還元剤は、銀(I)イオンを銀に還元することができるいかなる材料でも用いることができる。
湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬(例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、3−ピラゾリドン類、p−アミノフェノ−ル類、p−フェニレンジアミン類、ヒンダ−ドフェノ−ル類、アミドキシム類、アジン類、カテコ−ル類、ピロガロ−ル類、アスコルビン酸(またはその誘導体)、およびロイコ色素類)、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料は、たとえば米国特許第6,020,117号(バウア−ほか)で記述されるように、本発明において用いることができる。
「アスコルビン酸還元剤」はアスコルビン酸、及びその誘導体を意味する。アスコルビン酸還元剤は下記のように多くの文献において記載されており、例えば米国特許第5,236,816号(Purolほか)とその中で引用されている文献が挙げられる。
本発明における還元剤として、アスコルビン酸還元剤が好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含む。そのような化合物は以下にあげるものを含むが、これらに限定されるわけではない。
D−またはL−アスコルビン酸とその糖誘導体(例えばsorboascorbic酸、gamma.−lactoascorbic酸、6−desoxy−Lアスコルビン酸、L−rhamnoascorbic酸、imino−6−desoxy−Lアスコルビン酸、glucoascorbic酸、fucoascorbic酸、glucoheptoascorbic酸、maltoascorbic酸、L−arabosascorbic酸)、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸(またはL−エリスロアスコルビン酸)、その塩(例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩)、endiolタイプのアスコルビン酸、enaminolタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸、たとえば米国特許第5,498,511、EP−A−0585,792、EP−A−0573700、EP−A−0588408、米国特許第5,089,819、米国特許第5,278,035、米国特許第5,384,232、米国特許第5,376,510、JP7−56286、米国特許第2,688,549、およびReseach Disclosure37152(1995年3月)に記載されているような化合物。
D−またはL−アスコルビン酸とその糖誘導体(例えばsorboascorbic酸、gamma.−lactoascorbic酸、6−desoxy−Lアスコルビン酸、L−rhamnoascorbic酸、imino−6−desoxy−Lアスコルビン酸、glucoascorbic酸、fucoascorbic酸、glucoheptoascorbic酸、maltoascorbic酸、L−arabosascorbic酸)、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸(またはL−エリスロアスコルビン酸)、その塩(例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩)、endiolタイプのアスコルビン酸、enaminolタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸、たとえば米国特許第5,498,511、EP−A−0585,792、EP−A−0573700、EP−A−0588408、米国特許第5,089,819、米国特許第5,278,035、米国特許第5,384,232、米国特許第5,376,510、JP7−56286、米国特許第2,688,549、およびReseach Disclosure37152(1995年3月)に記載されているような化合物。
これらの化合物のうち、好ましくは、D、LまたはD,L−アスコルビン酸(そして、そのアルカリ金属塩)かイソアスコルビン酸(またはそのアルカリ金属塩)であり、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
ヒンダ−ドフェノ−ル類も単独で、または一つ以上の硬調化還元剤とコントラスト強化剤と組み合わせて好ましく用いられる。
ヒンダ−ドフェノ−ルは、ベンゼン環上に一つだけの水酸基を有し、少なくとも一つの置換基を水酸基に対してオルト位に有する化合物である。ヒンダ−ドフェノ−ル還元剤は複数の水酸基を別々のベンゼン環に持っていれば、複数の水酸基を有していて構わない。
ヒンダ−ドフェノ−ル還元剤は、たとえば、ビナフト−ル類(すなわちジヒドロキシビナフト−ル類)、ビフェノ−ル類(すなわちジヒドロキシビフェノ−ル類)、ビス(ヒドロキシナフチル)メタン類、ビス(ヒドロキシフェニル)メタン類(すなわちビスフェノ−ル類)、ヒンダ−ドフェノ−ル類、およびヒンダ−ドナフト−ル類が挙げられ、これらは置換されていて構わない。
ヒンダ−ドフェノ−ルは、ベンゼン環上に一つだけの水酸基を有し、少なくとも一つの置換基を水酸基に対してオルト位に有する化合物である。ヒンダ−ドフェノ−ル還元剤は複数の水酸基を別々のベンゼン環に持っていれば、複数の水酸基を有していて構わない。
ヒンダ−ドフェノ−ル還元剤は、たとえば、ビナフト−ル類(すなわちジヒドロキシビナフト−ル類)、ビフェノ−ル類(すなわちジヒドロキシビフェノ−ル類)、ビス(ヒドロキシナフチル)メタン類、ビス(ヒドロキシフェニル)メタン類(すなわちビスフェノ−ル類)、ヒンダ−ドフェノ−ル類、およびヒンダ−ドナフト−ル類が挙げられ、これらは置換されていて構わない。
代表的なビナフト−ル類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
1,1’−bi−2−ナフト−ル、1,1’−bi−4−メチル−2−ナフト−ル、6,6’−ジブロモ−bi−2−ナフト−ル、および米国特許第3,094,417号と米国特許第5,262,295号に記載されている化合物。
1,1’−bi−2−ナフト−ル、1,1’−bi−4−メチル−2−ナフト−ル、6,6’−ジブロモ−bi−2−ナフト−ル、および米国特許第3,094,417号と米国特許第5,262,295号に記載されている化合物。
代表的なビフェノ−ル類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
2,2’−ジヒドロキシ−3,3’−di−t−ブチル−5,5’−ジメチルビフェニル、2,2’−ジヒドロキシ−3,3’,5,5’−テトラ−t−ブチルビフェニル、2,2’−ジヒドロキシ−3,3’−di−t−ブチル−5,5’−ジクロロビフェニル、2−(2−ヒドロキシ−3−t−ブチル−5−メチルフェニル)−4−メチル−6−n−ヘキシルフェノ−ル、4,4’−ジヒドロキシ−3,3’,5,5’−テトラ−t−ブチルビフェニル、4,4’−ジヒドロキシ−3,3’,5,5’−テトラメチルビフェニル、および米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
2,2’−ジヒドロキシ−3,3’−di−t−ブチル−5,5’−ジメチルビフェニル、2,2’−ジヒドロキシ−3,3’,5,5’−テトラ−t−ブチルビフェニル、2,2’−ジヒドロキシ−3,3’−di−t−ブチル−5,5’−ジクロロビフェニル、2−(2−ヒドロキシ−3−t−ブチル−5−メチルフェニル)−4−メチル−6−n−ヘキシルフェノ−ル、4,4’−ジヒドロキシ−3,3’,5,5’−テトラ−t−ブチルビフェニル、4,4’−ジヒドロキシ−3,3’,5,5’−テトラメチルビフェニル、および米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
代表的なビス(ヒドロキシナフチル)メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
4,4’−メチレンビス(2−メチル−1−ナフト−ル)、米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
4,4’−メチレンビス(2−メチル−1−ナフト−ル)、米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
代表的なビス(ヒドロキシフェニル)メタン類は以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
ビス(2−ヒドロキシ−3−t−ブチル−5−メチルフェニル)メタン(CAO−5)、1,1’−ビス(2−ヒドロキシ−3,5−ジメチルフェニル)−3,5,5−トリメチルヘキサン(NONOXまたはPERMANAX WSO)、1,1’−ビス(3,5−di−t−ブチル−4−ヒドロキシフェニル)メタン、2,2’−ビス(4−ヒドロキシ−3−メチルフェニル)プロパン、4,4’−エチリデン−ビス(2−t−ブチル−6−メチルフェノ−ル)、2,2’−イソブチリデン−ビス(4,6−ジメチルフェノ−ル)(LOWINOX 221B46)、2,2’−ビス(3,5−ジメチル−4−ヒドロキシフェニル)プロパン、および米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
ビス(2−ヒドロキシ−3−t−ブチル−5−メチルフェニル)メタン(CAO−5)、1,1’−ビス(2−ヒドロキシ−3,5−ジメチルフェニル)−3,5,5−トリメチルヘキサン(NONOXまたはPERMANAX WSO)、1,1’−ビス(3,5−di−t−ブチル−4−ヒドロキシフェニル)メタン、2,2’−ビス(4−ヒドロキシ−3−メチルフェニル)プロパン、4,4’−エチリデン−ビス(2−t−ブチル−6−メチルフェノ−ル)、2,2’−イソブチリデン−ビス(4,6−ジメチルフェノ−ル)(LOWINOX 221B46)、2,2’−ビス(3,5−ジメチル−4−ヒドロキシフェニル)プロパン、および米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
代表的なヒンダ−ドフェノ−ルは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
2,6−ジ−t−ブチルフェノ−ル、2,6−ジ−t−ブチル−4−メチルフェノ−ル、2,4−ジ−t−ブチルフェノ−ル、2,6−ジクロロフェノ−ル、2,6−ジメチルフェノ−ル、および2−t−ブチル−6−メチルフェノ−ル。
2,6−ジ−t−ブチルフェノ−ル、2,6−ジ−t−ブチル−4−メチルフェノ−ル、2,4−ジ−t−ブチルフェノ−ル、2,6−ジクロロフェノ−ル、2,6−ジメチルフェノ−ル、および2−t−ブチル−6−メチルフェノ−ル。
代表的なヒンダ−ドナフト−ルは以下に挙げられる化合物であるが、これらに制限されることはない。
1−ナフト−ル、4−メチル1−ナフト−ル、4−メトキシ1−ナフト−ル、4−クロロ1−ナフト−ル、2−メチル1−ナフト−ル、および米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
1−ナフト−ル、4−メチル1−ナフト−ル、4−メトキシ1−ナフト−ル、4−クロロ1−ナフト−ル、2−メチル1−ナフト−ル、および米国特許第5,262,295号に記載の化合物。
その他、下記の化合物も還元剤として開示されている。
アミドキシム類(例えばフェニルアミドキシム)、2−チエニルアミドキシム、p−フェノキシフェニルアミドキシム、アジン類(たとえば4−ヒドロキシ−3,5−dimethoxybenzaldehydrazine)、脂肪族カルボン酸アリルヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ(例えば2,2’−bis(hydroxymethyl)−propionyl−β−phenylヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ)、ポリヒドロキシベンゼンとヒドロキシルアミン、レダクトンおよびヒドラジンの少なくとも一方の組合せ(たとえばヒドロキノンとビス(エトキシエチル)ヒドロキシルアミンの組合せ)、ピペリジ−4−メチルフェニルヒドラジン、ヒドロキサム酸(例えばフェニルヒドロキサム酸、p−ヒドロキシフェニルヒドロキサム酸、およびo−アラニンヒドロキサム酸)、アジンとスルホンアミドフェノ−ル類の組合せ(たとえばフェノチアジンと2,6−ジクロロ−4−ベンゼンスルホンアミドフェノ−ル)、α−シアノフェニル酢酸誘導体(例えばエチル−α−シアノ−2−メチルフェニル酢酸、エチル−α−シアノフェニル酢酸)、ビス−o−ナフト−ル(例えば2,2’−ジヒドロキシ−1−ビナフチル、6,6’−ジブロモ−2,2’−ジヒドロキシ−1,1’−ビナフチル、ビス(2−ヒドロキシ−1−ナフチル)メタン]、
アミドキシム類(例えばフェニルアミドキシム)、2−チエニルアミドキシム、p−フェノキシフェニルアミドキシム、アジン類(たとえば4−ヒドロキシ−3,5−dimethoxybenzaldehydrazine)、脂肪族カルボン酸アリルヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ(例えば2,2’−bis(hydroxymethyl)−propionyl−β−phenylヒドラジドとアスコルビン酸の組み合わせ)、ポリヒドロキシベンゼンとヒドロキシルアミン、レダクトンおよびヒドラジンの少なくとも一方の組合せ(たとえばヒドロキノンとビス(エトキシエチル)ヒドロキシルアミンの組合せ)、ピペリジ−4−メチルフェニルヒドラジン、ヒドロキサム酸(例えばフェニルヒドロキサム酸、p−ヒドロキシフェニルヒドロキサム酸、およびo−アラニンヒドロキサム酸)、アジンとスルホンアミドフェノ−ル類の組合せ(たとえばフェノチアジンと2,6−ジクロロ−4−ベンゼンスルホンアミドフェノ−ル)、α−シアノフェニル酢酸誘導体(例えばエチル−α−シアノ−2−メチルフェニル酢酸、エチル−α−シアノフェニル酢酸)、ビス−o−ナフト−ル(例えば2,2’−ジヒドロキシ−1−ビナフチル、6,6’−ジブロモ−2,2’−ジヒドロキシ−1,1’−ビナフチル、ビス(2−ヒドロキシ−1−ナフチル)メタン]、
ビス−o−ナフト−ルと1,3−ジヒドロキシベンゼン誘導体の組み合わせ(例えば2,4−ジヒドロキシベンゾフェノン、2,4−ジヒドロキシアセトフェノン)、5−ピラゾロン(例えば3−メチル−1−フェニル−5−ピラゾロン)、レダクトン類(例えばジメチルアミノヘキソ−スレダクトン、アンヒドロジヒドロ−アミノヘキソ−スレダクトン、またはアンヒドロジヒドロ−ピペリドン−ヘキソ−スレダクトン)、スルホンアミドフェノ−ル還元剤(例えば2,6−ジクロロ−4−ベンゼンスルホンアミドフェノ−ル、p−ベンゼンスルホンアミドフェノ−ル)、インダン−1,3−ジオン類(例えば2−フェニルインダン−1,3−ジオン)、クロマン類(例えば2,2−ジメチル−7−t−ブチル−6−ヒドロキシクロマン)、1,4−ジヒドロキシピリジン類(例えば2,6−ジメトキシ−3,5−ジカルベトキシ−1,4−ジヒドロピリジン)、アスコルビン酸誘導体(1−アスコルビン酸パルミテ−ト、アスコルビン酸ステアレ−ト)、不飽和アルデヒド(ケトン)、3−ピラゾリドン類。
本発明に用いることのできる還元剤として、米国特許第5,464,738に記載されるようなスルホニルヒドラジンを含む置換ヒドラジンがある。この他の有用な還元剤は、例えば、米国特許第3,074,809、米国特許第3,094,417、米国特許第3,080,254および米国特許第3,887,417に記載されている。米国特許第5,981,151に記載の補助還元剤もまた有用である。
還元剤として、ヒンダ−ドフェノ−ル還元剤とその他以下に挙げるような様々な補助還元剤から選ばれる化合物と組み合わせて用いられる場合もある。さらにコントラスト強化剤を加えた3成分の還元剤の混合物もまた有用である。補助還元剤としては米国特許第5,496,695に記載のトリチルヒドラジド、ホルミル−フェニルヒドラジドを用いることができる。
コントラスト強化剤を還元剤とともに用いることができる。コントラスト強化剤としては例えば、下記の化合物が有用であるが、これらに限定されるわけではない。
ヒドロキシルアミン(ヒドロキシルアミンとalkyl−とアリ−ル置換誘導体を含む)、米国特許第5,545,505に記載のalkanolaminesとフタル酸アンモニウム、米国特許第5,545,507に記載のヒドロキサム酸化合物、米国特許第5,558,983に記載のN−アシルヒドラジン化合物、米国特許第5,637,449に記載の水素原子ドナ−化合物。
ヒドロキシルアミン(ヒドロキシルアミンとalkyl−とアリ−ル置換誘導体を含む)、米国特許第5,545,505に記載のalkanolaminesとフタル酸アンモニウム、米国特許第5,545,507に記載のヒドロキサム酸化合物、米国特許第5,558,983に記載のN−アシルヒドラジン化合物、米国特許第5,637,449に記載の水素原子ドナ−化合物。
全ての還元剤と有機銀塩の組み合わせが等しく効果があるわけではない。好ましい組合せの一つは、有機銀塩としてベントリアゾ−ルの銀塩又はその置換化合物、又はその混合物と、還元剤としてアスコルビン酸型還元剤である。
本発明における還元剤は、有機銀中の銀に対して1質量%〜10質量%(乾燥質量)含まれる。多層構造において、還元剤が有機銀塩を含む層以外の層に加えられるならば、わずかに割合は高く、およそ2質量%〜15質量%がより望ましい。補助還元剤は、およそ0.001質量%〜1.5質量%(乾燥重)含まれる。
本発明のキットは被検試料の展開後に加熱することが好ましい。好ましい加熱温度は40℃〜90℃であり、好ましい加熱時間は1秒〜120秒である。
実施例1
実施例1では、hCG検出系で本発明のイムノクロマトグラフキットが高感度であることを以下に実証する。
実施例1では、hCG検出系で本発明のイムノクロマトグラフキットが高感度であることを以下に実証する。
1.検出用標識物である抗hCG抗体修飾金コロイドの作製
直径50nm金コロイド溶液(EM.GC50、BBI社)9mLに50mMのKH2PO4バッファ−(pH=7.0)1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、50μg/mLの抗hCG抗体(Anti−hCG 5008 SP−5、Medix Biochemica社)溶液1mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1質量%ポリエチレングリコ−ル(PEG、Mw.20000、品番168−11285、和光純薬)水溶液を550μL加え攪拌し、続いて10質量%牛血清アルブミン(BSA FractionV、品番A−7906、SIGMA)水溶液を1.1mL加え攪拌した。この溶液を8000G、4℃、30分間遠心(himacCF16RX、日立(株))した後、1mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20mLの金コロイド保存液(20mM、Tris−HClバッファ−(pH=8.2),0.05質量%PEG(Mw.20000),150mMNaCl,1質量%BSA,0.1質量%NaN3)に分散し、再び8000G、4℃、30分間遠心した後、1mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド(平均粒径50nm)溶液を得た。
直径50nm金コロイド溶液(EM.GC50、BBI社)9mLに50mMのKH2PO4バッファ−(pH=7.0)1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、50μg/mLの抗hCG抗体(Anti−hCG 5008 SP−5、Medix Biochemica社)溶液1mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1質量%ポリエチレングリコ−ル(PEG、Mw.20000、品番168−11285、和光純薬)水溶液を550μL加え攪拌し、続いて10質量%牛血清アルブミン(BSA FractionV、品番A−7906、SIGMA)水溶液を1.1mL加え攪拌した。この溶液を8000G、4℃、30分間遠心(himacCF16RX、日立(株))した後、1mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20mLの金コロイド保存液(20mM、Tris−HClバッファ−(pH=8.2),0.05質量%PEG(Mw.20000),150mMNaCl,1質量%BSA,0.1質量%NaN3)に分散し、再び8000G、4℃、30分間遠心した後、1mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド(平均粒径50nm)溶液を得た。
2.金コロイド抗体保持パットの作製
1で作製した各抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液(20mM、Tris−Hclバッファ−(pH=8.2),0.05質量%PEG(Mw.20000),5質量%スクロ−ス)及び水により希釈し、520nmのODが1.5となるように希釈した。この溶液を、8mm×150mmに切ったグラスファイバ−パッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社)1枚あたり0.8mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
1で作製した各抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液(20mM、Tris−Hclバッファ−(pH=8.2),0.05質量%PEG(Mw.20000),5質量%スクロ−ス)及び水により希釈し、520nmのODが1.5となるように希釈した。この溶液を、8mm×150mmに切ったグラスファイバ−パッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社)1枚あたり0.8mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
3.抗体固定化メンブレン(クロマトグラフ担体)の作製
25mm×200mmに切断したニトロセルロ−スメンブレン(プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120ミリポア社)に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作製した。メンブレンの長辺を下にし、下から8mmの位置に、0.5mg/mLとなるように調製した固定化用抗hCGモノクロ−ナル抗体(Anti−Alpha subunit 6601 SPR−5、Medix Biochemica社)溶液をインクジェット方式の塗布機(BioDot社)を用いて幅1mm程度のライン状に塗布した(「検出部」を形成する。)。同様に、下から12mmの位置に、0.5mg/mLとなるように調製したコントロ−ル用抗マウスIgG抗体(抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab’)2,品番566−70621、和光純薬)溶液をライン状に塗布した(「コントロール部」を形成する。)。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液(0.5質量%カゼイン(乳由来、品番030−01505、和光純薬)含有50mMホウ酸Buffer(pH=8.5))500mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液(0.5質量%スクロ−ス、0.05質量%コ−ル酸ナトリウム、50mMのTris−Hcl(pH=7.5))500mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンを得た。
25mm×200mmに切断したニトロセルロ−スメンブレン(プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120ミリポア社)に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作製した。メンブレンの長辺を下にし、下から8mmの位置に、0.5mg/mLとなるように調製した固定化用抗hCGモノクロ−ナル抗体(Anti−Alpha subunit 6601 SPR−5、Medix Biochemica社)溶液をインクジェット方式の塗布機(BioDot社)を用いて幅1mm程度のライン状に塗布した(「検出部」を形成する。)。同様に、下から12mmの位置に、0.5mg/mLとなるように調製したコントロ−ル用抗マウスIgG抗体(抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab’)2,品番566−70621、和光純薬)溶液をライン状に塗布した(「コントロール部」を形成する。)。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液(0.5質量%カゼイン(乳由来、品番030−01505、和光純薬)含有50mMホウ酸Buffer(pH=8.5))500mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液(0.5質量%スクロ−ス、0.05質量%コ−ル酸ナトリウム、50mMのTris−Hcl(pH=7.5))500mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンを得た。
4.有機銀塩含有シ−トの作製
4−1.塗布用材料の準備
4−1.塗布用材料の準備
1)脂肪酸銀分散物の調製
<脂肪酸銀分散物の調製>
ラウリン酸150g、蒸留水422mL、5mol/L濃度のNaOH水溶液49.2mL、t−ブチルアルコ−ル120mLを混合し、75℃にて1時間攪拌し反応させ、ラウリン酸ナトリウム溶液を得た。別に、硝酸銀40.4gの水溶液206.2mL(pH4.0)を用意し、10℃にて保温した。635mLの蒸留水と30mLのt−ブチルアルコ−ルを入れた反応容器を30℃に保温し、十分に撹拌しながら先のラウリン酸ナトリウム溶液の全量と硝酸銀水溶液の全量を流量一定でそれぞれ93分15秒と90分かけて添加した。このとき、硝酸銀水溶液添加開始後11分間は硝酸銀水溶液のみが添加されるようにし、そのあとラウリン酸ナトリウム溶液を添加開始し、硝酸銀水溶液の添加終了後14分15秒間はラウリン酸ナトリウム溶液のみが添加されるようにした。このとき、反応容器内の温度は30℃とし、液温度が一定になるように外温コントロ−ルした。また、ラウリン酸ナトリウム溶液の添加系の配管は、2重管の外側に温水を循環させる事により保温し、添加ノズル先端の出口の液温度が75℃になるよう調製した。また、硝酸銀水溶液の添加系の配管は、2重管の外側に冷水を循環させることにより保温した。ラウリン酸ナトリウム溶液の添加位置と硝酸銀水溶液の添加位置は撹拌軸を中心として対称的な配置とし、また反応液に接触しないような高さに調製した。
<脂肪酸銀分散物の調製>
ラウリン酸150g、蒸留水422mL、5mol/L濃度のNaOH水溶液49.2mL、t−ブチルアルコ−ル120mLを混合し、75℃にて1時間攪拌し反応させ、ラウリン酸ナトリウム溶液を得た。別に、硝酸銀40.4gの水溶液206.2mL(pH4.0)を用意し、10℃にて保温した。635mLの蒸留水と30mLのt−ブチルアルコ−ルを入れた反応容器を30℃に保温し、十分に撹拌しながら先のラウリン酸ナトリウム溶液の全量と硝酸銀水溶液の全量を流量一定でそれぞれ93分15秒と90分かけて添加した。このとき、硝酸銀水溶液添加開始後11分間は硝酸銀水溶液のみが添加されるようにし、そのあとラウリン酸ナトリウム溶液を添加開始し、硝酸銀水溶液の添加終了後14分15秒間はラウリン酸ナトリウム溶液のみが添加されるようにした。このとき、反応容器内の温度は30℃とし、液温度が一定になるように外温コントロ−ルした。また、ラウリン酸ナトリウム溶液の添加系の配管は、2重管の外側に温水を循環させる事により保温し、添加ノズル先端の出口の液温度が75℃になるよう調製した。また、硝酸銀水溶液の添加系の配管は、2重管の外側に冷水を循環させることにより保温した。ラウリン酸ナトリウム溶液の添加位置と硝酸銀水溶液の添加位置は撹拌軸を中心として対称的な配置とし、また反応液に接触しないような高さに調製した。
ラウリン酸ナトリウム溶液を添加終了後、そのままの温度で20分間撹拌放置し、30分かけて35℃に昇温し、その後210分熟成を行った。熟成終了後直ちに、遠心濾過で固形分を濾別し、固形分を濾過水の伝導度が30μS/cmになるまで水洗した。こうして脂肪酸銀塩を得た。得られた固形分は、乾燥させないでウエットケ−キとして保管した。
得られたラウリン酸銀粒子の形態を電子顕微鏡撮影により評価したところ、平均値で厚さ=0.1μm、縦=0.2μm、横=0.2μm、平均アスペクト比1.9球相当径の変動係数11%の結晶であった。
得られたラウリン酸銀粒子の形態を電子顕微鏡撮影により評価したところ、平均値で厚さ=0.1μm、縦=0.2μm、横=0.2μm、平均アスペクト比1.9球相当径の変動係数11%の結晶であった。
乾燥固形分260kg相当のウエットケ−キに対し、ポリビニルアルコ−ル(商品名:PVA−217)19.3kg及び水を添加し、全体量を1000kgとしてからディゾルバ−羽根でスラリ−化し、更にパイプラインミキサ−(みづほ工業製:PM−10型)で予備分散した。
次に予備分散済みの原液を分散機(商品名:マイクロフルイダイザ−M−610、マイクロフルイデックス・インタ−ナショナル・コ−ポレ−ション製、Z型インタラクションチャンバ−使用)の圧力を1150kg/cm2に調節して、三回処理し、ベヘン酸銀分散物を得た。冷却操作は蛇管式熱交換器をインタラクションチャンバ−の前後に各々装着し、冷媒の温度を調節することで18℃の分散温度に設定した。
2)還元剤分散物の調製
《還元剤−2分散物の調製》
還元剤−2(6,6’−ジ−t−ブチル−4,4’−ジメチル−2,2’−ブチリデンジフェノ−ル)10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製、ポバ−ルMP203)の10質量%水溶液16kgに、水10kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて3時間30分分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて還元剤の濃度が25質量%になるように調製した。この分散液を40℃で1時間加熱した後、引き続いてさらに80℃で1時間加熱処理し、還元剤−2分散物を得た。こうして得た還元剤分散物に含まれる還元剤粒子はメジアン径0.50μm、最大粒子径1.6μm以下であった。得られた還元剤分散物は孔径3.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
《還元剤−2分散物の調製》
還元剤−2(6,6’−ジ−t−ブチル−4,4’−ジメチル−2,2’−ブチリデンジフェノ−ル)10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製、ポバ−ルMP203)の10質量%水溶液16kgに、水10kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて3時間30分分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて還元剤の濃度が25質量%になるように調製した。この分散液を40℃で1時間加熱した後、引き続いてさらに80℃で1時間加熱処理し、還元剤−2分散物を得た。こうして得た還元剤分散物に含まれる還元剤粒子はメジアン径0.50μm、最大粒子径1.6μm以下であった。得られた還元剤分散物は孔径3.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
3)水素結合性化合物−1分散物の調製
水素結合性化合物−1(トリ(4−t−ブチルフェニル)ホスフィンオキシド)10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製、ポバ−ルMP203)の10質量%水溶液16kgに、水10kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて4時間分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて水素結合性化合物の濃度が25質量%になるように調製した。この分散液を40℃で1時間加熱した後、引き続いてさらに80℃で1時間加温し、水素結合性化合物−1分散物を得た。こうして得た水素結合性化合物分散物に含まれる水素結合性化合物粒子はメジアン径0.45μm、最大粒子径1.3μm以下であった。得られた水素結合性化合物分散物は孔径3.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
水素結合性化合物−1(トリ(4−t−ブチルフェニル)ホスフィンオキシド)10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製、ポバ−ルMP203)の10質量%水溶液16kgに、水10kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて4時間分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて水素結合性化合物の濃度が25質量%になるように調製した。この分散液を40℃で1時間加熱した後、引き続いてさらに80℃で1時間加温し、水素結合性化合物−1分散物を得た。こうして得た水素結合性化合物分散物に含まれる水素結合性化合物粒子はメジアン径0.45μm、最大粒子径1.3μm以下であった。得られた水素結合性化合物分散物は孔径3.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
4)還元促進剤−1分散物の調製
還元促進剤−1を10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製、ポバ−ルMP203)の10質量%水溶液20kgに、水10kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて3時間30分分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて現像促進剤の濃度が20質量%になるように調製し、現像促進剤−1分散物を得た。こうして得た還元促進剤分散物に含まれる還元促進剤粒子はメジアン径0.48μm、最大粒子径1.4μm以下であった。得られた還元促進剤分散物は孔径3.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
5)還元促進剤−2の分散物調製
還元促進剤−2の固体分散物についても還元促進剤−1と同様の方法により分散し、20質量%の分散液を得た。
還元促進剤−1を10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製、ポバ−ルMP203)の10質量%水溶液20kgに、水10kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて3時間30分分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて現像促進剤の濃度が20質量%になるように調製し、現像促進剤−1分散物を得た。こうして得た還元促進剤分散物に含まれる還元促進剤粒子はメジアン径0.48μm、最大粒子径1.4μm以下であった。得られた還元促進剤分散物は孔径3.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
5)還元促進剤−2の分散物調製
還元促進剤−2の固体分散物についても還元促進剤−1と同様の方法により分散し、20質量%の分散液を得た。
6)ポリハロゲン化合物の調製
《有機ポリハロゲン化合物−1分散物の調製》
有機ポリハロゲン化合物−1(トリブロモメタンスルホニルベンゼン)10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製ポバ−ルMP203)の20質量%水溶液10kgと、トリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムの20質量%水溶液0.4kgと、水14kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて5時間分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて有機ポリハロゲン化合物の濃度が26質量%になるように調製し、有機ポリハロゲン化合物−1分散物を得た。こうして得たポリハロゲン化合物分散物に含まれる有機ポリハロゲン化合物粒子はメジアン径0.41μm、最大粒子径2.0μm以下であった。得られた有機ポリハロゲン化合物分散物は孔径10.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
《有機ポリハロゲン化合物−1分散物の調製》
有機ポリハロゲン化合物−1(トリブロモメタンスルホニルベンゼン)10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製ポバ−ルMP203)の20質量%水溶液10kgと、トリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムの20質量%水溶液0.4kgと、水14kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて5時間分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて有機ポリハロゲン化合物の濃度が26質量%になるように調製し、有機ポリハロゲン化合物−1分散物を得た。こうして得たポリハロゲン化合物分散物に含まれる有機ポリハロゲン化合物粒子はメジアン径0.41μm、最大粒子径2.0μm以下であった。得られた有機ポリハロゲン化合物分散物は孔径10.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
《有機ポリハロゲン化合物−2分散物の調製》
有機ポリハロゲン化合物−2(N−ブチル−3−トリブロモメタンスルホニルベンゾアミド)10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製ポバ−ルMP203)の10質量%水溶液20kgと、トリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムの20質量%水溶液0.4kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて5時間分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて有機ポリハロゲン化合物の濃度が30質量%になるように調製した。この分散液を40℃で5時間加温し、有機ポリハロゲン化合物−2分散物を得た。こうして得たポリハロゲン化合物分散物に含まれる有機ポリハロゲン化合物粒子はメジアン径0.40μm、最大粒子径1.3μm以下であった。得られた有機ポリハロゲン化合物分散物は孔径3.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
有機ポリハロゲン化合物−2(N−ブチル−3−トリブロモメタンスルホニルベンゾアミド)10kgと変性ポリビニルアルコ−ル(クラレ(株)製ポバ−ルMP203)の10質量%水溶液20kgと、トリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムの20質量%水溶液0.4kgを添加して、良く混合してスラリ−とした。このスラリ−をダイアフラムポンプで送液し、平均直径0.5mmのジルコニアビ−ズを充填した横型サンドミル(UVM−2:アイメックス(株)製)にて5時間分散したのち、ベンゾイソチアゾリノンナトリウム塩0.2gと水を加えて有機ポリハロゲン化合物の濃度が30質量%になるように調製した。この分散液を40℃で5時間加温し、有機ポリハロゲン化合物−2分散物を得た。こうして得たポリハロゲン化合物分散物に含まれる有機ポリハロゲン化合物粒子はメジアン径0.40μm、最大粒子径1.3μm以下であった。得られた有機ポリハロゲン化合物分散物は孔径3.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納した。
7)フタラジン化合物−1溶液の調製
8kgのクラレ(株)製変性ポリビニルアルコ−ルMP203を水174.57kgに溶解し、次いでトリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムの20質量%水溶液3.15kgとフタラジン化合物−1(6−イソプロピルフタラジン)の70質量%水溶液14.28kgを添加し、フタラジン化合物−1の5質量%溶液を調製した。
8kgのクラレ(株)製変性ポリビニルアルコ−ルMP203を水174.57kgに溶解し、次いでトリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムの20質量%水溶液3.15kgとフタラジン化合物−1(6−イソプロピルフタラジン)の70質量%水溶液14.28kgを添加し、フタラジン化合物−1の5質量%溶液を調製した。
8)メルカプト化合物の調製
《メルカプト化合物−1水溶液の調製》
メルカプト化合物−1(1−(3−スルホフェニル)−5−メルカプトテトラゾ−ルナトリウム塩)7gを水993gに溶解し、0.7質量%の水溶液とした。
《メルカプト化合物−1水溶液の調製》
メルカプト化合物−1(1−(3−スルホフェニル)−5−メルカプトテトラゾ−ルナトリウム塩)7gを水993gに溶解し、0.7質量%の水溶液とした。
《メルカプト化合物−2水溶液の調製》
メルカプト化合物−2(1−(3−メチルウレイドフェニル)−5−メルカプトテトラゾ−ル)20gを水980gに溶解し、2.0質量%の水溶液とした。
メルカプト化合物−2(1−(3−メチルウレイドフェニル)−5−メルカプトテトラゾ−ル)20gを水980gに溶解し、2.0質量%の水溶液とした。
9)SBRラテックス液の調製
ガスモノマ−反応装置(耐圧硝子工業(株)製TAS−2J型)の重合釜に、蒸留水287g、界面活性剤(パイオニンA−43−S(竹本油脂(株)製):固形分48.5質量%)7.73g、1mol/L、NaOH14.06ml、エチレンジアミン4酢酸4ナトリウム塩0.15g、スチレン255g、アクリル酸11.25g、tert−ドデシルメルカプタン3.0gを入れ、反応容器を密閉し撹拌速度200rpmで撹拌した。真空ポンプで脱気し窒素ガス置換を数回繰返した後に、1,3−ブタジエン108.75gを圧入して内温60℃まで昇温した。ここに過硫酸アンモニウム1.875gを水50mlに溶解した液を添加し、そのまま5時間撹拌した。さらに90℃に昇温して3時間撹拌し、反応終了後内温が室温になるまで下げた後、1mol/LのNaOHとNH4OHを用いてNa+イオン:NH4 +イオン=1:5.3(モル比)になるように添加処理し、pH8.4に調整した。その後、孔径1.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納し、SBRラテックスTP−1を774.7g得た。
イオンクロマトグラフィ−によりハロゲンイオンを測定したところ、塩化物イオン濃度3ppmであった。高速液体クロマトグラフィ−によりキレ−ト剤の濃度を測定した結果、145ppmであった。
ガスモノマ−反応装置(耐圧硝子工業(株)製TAS−2J型)の重合釜に、蒸留水287g、界面活性剤(パイオニンA−43−S(竹本油脂(株)製):固形分48.5質量%)7.73g、1mol/L、NaOH14.06ml、エチレンジアミン4酢酸4ナトリウム塩0.15g、スチレン255g、アクリル酸11.25g、tert−ドデシルメルカプタン3.0gを入れ、反応容器を密閉し撹拌速度200rpmで撹拌した。真空ポンプで脱気し窒素ガス置換を数回繰返した後に、1,3−ブタジエン108.75gを圧入して内温60℃まで昇温した。ここに過硫酸アンモニウム1.875gを水50mlに溶解した液を添加し、そのまま5時間撹拌した。さらに90℃に昇温して3時間撹拌し、反応終了後内温が室温になるまで下げた後、1mol/LのNaOHとNH4OHを用いてNa+イオン:NH4 +イオン=1:5.3(モル比)になるように添加処理し、pH8.4に調整した。その後、孔径1.0μmのポリプロピレン製フィルタ−にてろ過を行い、ゴミ等の異物を除去して収納し、SBRラテックスTP−1を774.7g得た。
イオンクロマトグラフィ−によりハロゲンイオンを測定したところ、塩化物イオン濃度3ppmであった。高速液体クロマトグラフィ−によりキレ−ト剤の濃度を測定した結果、145ppmであった。
上記ラテックスは、ゲル化率73質量%、平均粒径90nm、Tg=17℃、固形分濃度44質量%、25℃60%RHにおける平衡含水率0.6質量%、イオン伝導度4.80mS/cm(イオン伝導度の測定は東亜電波工業(株)製伝導度計CM−30S使用し25℃にて測定)であった。
4−2.塗布液の調製
1)有機銀塩含有層塗布液の調製
上記で得た脂肪酸銀分散物1000g、水135mL、有機ポリハロゲン化合物−1分散物25g、有機ポリハロゲン化合物−2分散物39g、フタラジン化合物−1溶液171g、SBRラテックス液1060g、還元剤−2分散物153g、水素結合性化合物−1分散物22g、還元促進剤−1分散物4.8g、還元促進剤−2分散物5.2g、およびメルカプト化合物−2水溶液8mLを順次添加し、そのままコ−ティングダイへ送液し、塗布した。
上記で得た脂肪酸銀分散物1000g、水135mL、有機ポリハロゲン化合物−1分散物25g、有機ポリハロゲン化合物−2分散物39g、フタラジン化合物−1溶液171g、SBRラテックス液1060g、還元剤−2分散物153g、水素結合性化合物−1分散物22g、還元促進剤−1分散物4.8g、還元促進剤−2分散物5.2g、およびメルカプト化合物−2水溶液8mLを順次添加し、そのままコ−ティングダイへ送液し、塗布した。
2)中間層塗布液の調製
ポリビニルアルコ−ルPVA−205(クラレ(株)製)1000g、スルホコハク酸ジ(2−エチルヘキシル)ナトリウム塩5質量%水溶液27ml、メチルメタクリレ−ト/スチレン/ブチルアクリレ−ト/ヒドロキシエチルメタクリレ−ト/アクリル酸共重合体(共重合質量比57/8/28/5/2)ラテックス19質量%液4200mLにエアロゾ−ルOT(アメリカンサイアナミド社製)の5質量%水溶液を27mL、フタル酸二アンモニウム塩の20質量%水溶液を135ml、総量10000gになるように水を加え、pHが7.5になるようにNaOHで調整して中間層塗布液とし、8.9mL/m2になるようにコ−ティングダイへ送液した。
ポリビニルアルコ−ルPVA−205(クラレ(株)製)1000g、スルホコハク酸ジ(2−エチルヘキシル)ナトリウム塩5質量%水溶液27ml、メチルメタクリレ−ト/スチレン/ブチルアクリレ−ト/ヒドロキシエチルメタクリレ−ト/アクリル酸共重合体(共重合質量比57/8/28/5/2)ラテックス19質量%液4200mLにエアロゾ−ルOT(アメリカンサイアナミド社製)の5質量%水溶液を27mL、フタル酸二アンモニウム塩の20質量%水溶液を135ml、総量10000gになるように水を加え、pHが7.5になるようにNaOHで調整して中間層塗布液とし、8.9mL/m2になるようにコ−ティングダイへ送液した。
3)第2の保護層塗布液の調製
イナ−トゼラチン100g、ベンゾイソチアゾリノン10mgを水840mLに溶解し、メチルメタクリレ−ト/スチレン/ブチルアクリレ−ト/ヒドロキシエチルメタクリレ−ト/アクリル酸共重合体(共重合質量比57/8/28/5/2)ラテックス19質量%液180g、フタル酸の15質量%メタノ−ル溶液を46mL、スルホコハク酸ジ(2−エチルヘキシル)ナトリウム塩の5質量%水溶液を5.4mLを加えて混合し、塗布直前に4質量%のクロムみょうばん40mLをスタチックミキサ−で混合したものを塗布液量が26.1mL/m2になるようにコ−ティングダイへ送液した。
イナ−トゼラチン100g、ベンゾイソチアゾリノン10mgを水840mLに溶解し、メチルメタクリレ−ト/スチレン/ブチルアクリレ−ト/ヒドロキシエチルメタクリレ−ト/アクリル酸共重合体(共重合質量比57/8/28/5/2)ラテックス19質量%液180g、フタル酸の15質量%メタノ−ル溶液を46mL、スルホコハク酸ジ(2−エチルヘキシル)ナトリウム塩の5質量%水溶液を5.4mLを加えて混合し、塗布直前に4質量%のクロムみょうばん40mLをスタチックミキサ−で混合したものを塗布液量が26.1mL/m2になるようにコ−ティングダイへ送液した。
4)第1の保護層塗布液の調製
イナ−トゼラチン100g、ベンゾイソチアゾリノン10mgを水800mLに溶解し、流動パラフィンの10質量%乳化物を10g、ヘキサイソステアリン酸ジペンタエリスリットの10質量%乳化物を30g、メチルメタクリレ−ト/スチレン/ブチルアクリレ−ト/ヒドロキシエチルメタクリレ−ト/アクリル酸共重合体(共重合質「量比57/8/28/5/2)ラテックス19質量%液180g、フタル酸15質量%メタノ−ル溶液40mL、フッ素系界面活性剤(F−1)の1質量%溶液を5.5mL、フッ素系界面活性剤(F−2)の1質量%水溶液を5.5mL、スルホコハク酸ジ(2−エチルヘキシル)ナトリウム塩の5質量%水溶液を28mL、ポリメチルメタクリレ−ト微粒子(平均粒径0.7μm、体積加重平均の分布30%)4g、ポリメチルメタクリレ−ト微粒子(平均粒径3.6μm、体積加重平均の分布60%)21gを混合したものを最外層塗布液とし、8.3mL/m2になるようにコ−ティングダイへ送液した。
イナ−トゼラチン100g、ベンゾイソチアゾリノン10mgを水800mLに溶解し、流動パラフィンの10質量%乳化物を10g、ヘキサイソステアリン酸ジペンタエリスリットの10質量%乳化物を30g、メチルメタクリレ−ト/スチレン/ブチルアクリレ−ト/ヒドロキシエチルメタクリレ−ト/アクリル酸共重合体(共重合質「量比57/8/28/5/2)ラテックス19質量%液180g、フタル酸15質量%メタノ−ル溶液40mL、フッ素系界面活性剤(F−1)の1質量%溶液を5.5mL、フッ素系界面活性剤(F−2)の1質量%水溶液を5.5mL、スルホコハク酸ジ(2−エチルヘキシル)ナトリウム塩の5質量%水溶液を28mL、ポリメチルメタクリレ−ト微粒子(平均粒径0.7μm、体積加重平均の分布30%)4g、ポリメチルメタクリレ−ト微粒子(平均粒径3.6μm、体積加重平均の分布60%)21gを混合したものを最外層塗布液とし、8.3mL/m2になるようにコ−ティングダイへ送液した。
4−3.有機銀塩含有シ−トの塗布
仮支持体(厚み100μmのPET)上に有機銀塩層、中間層、第2保護層、および第1保護層の順番でスライドビ−ド塗布方式にて同時重層塗布し、熱現像感光材料の試料を作製した。このとき、有機銀塩層と中間層の塗布液は31℃に、第2の保護層塗布液は36℃に、第1保護層塗布液は37℃に温度調整した。
有機銀塩層の各化合物の塗布量(g/m2)は以下の通りである。
仮支持体(厚み100μmのPET)上に有機銀塩層、中間層、第2保護層、および第1保護層の順番でスライドビ−ド塗布方式にて同時重層塗布し、熱現像感光材料の試料を作製した。このとき、有機銀塩層と中間層の塗布液は31℃に、第2の保護層塗布液は36℃に、第1保護層塗布液は37℃に温度調整した。
有機銀塩層の各化合物の塗布量(g/m2)は以下の通りである。
・脂肪酸銀 3.09
・ポリハロゲン化合物−1 0.14
・ポリハロゲン化合物−2 0.28
・フタラジン化合物−1 0.18
・SBRラテックス 9.43
・還元剤−2 0.77
・水素結合性化合物−1 0.112
・還元促進剤−1 0.019
・還元促進剤−2 0.016
・メルカプト化合物−2 0.003
・ポリハロゲン化合物−1 0.14
・ポリハロゲン化合物−2 0.28
・フタラジン化合物−1 0.18
・SBRラテックス 9.43
・還元剤−2 0.77
・水素結合性化合物−1 0.112
・還元促進剤−1 0.019
・還元促進剤−2 0.016
・メルカプト化合物−2 0.003
塗布乾燥条件は以下のとおりである。
塗布はスピ−ド160m/minで行い、コ−ティングダイ先端と支持体との間隙を0.10mm〜0.30mmとし、減圧室の圧力を大気圧に対して196Pa〜882Pa低く設定した。支持体は塗布前にイオン風にて除電した。
引き続くチリングゾ−ンにて、乾球温度10℃〜20℃の風にて塗布液を冷却した後、無接触型搬送して、つるまき式無接触型乾燥装置にて、乾球温度23℃〜45℃、湿球温度15℃〜21℃の乾燥風で乾燥させた。
乾燥後、25℃で湿度40%RH〜60%RHで調湿した後、膜面を70℃〜90℃になるように加熱した。加熱後、膜面を25℃まで冷却した。
塗布はスピ−ド160m/minで行い、コ−ティングダイ先端と支持体との間隙を0.10mm〜0.30mmとし、減圧室の圧力を大気圧に対して196Pa〜882Pa低く設定した。支持体は塗布前にイオン風にて除電した。
引き続くチリングゾ−ンにて、乾球温度10℃〜20℃の風にて塗布液を冷却した後、無接触型搬送して、つるまき式無接触型乾燥装置にて、乾球温度23℃〜45℃、湿球温度15℃〜21℃の乾燥風で乾燥させた。
乾燥後、25℃で湿度40%RH〜60%RHで調湿した後、膜面を70℃〜90℃になるように加熱した。加熱後、膜面を25℃まで冷却した。
4−4.増感シートの作製
得られた塗布試料を200mm×70mmに裁断し、その保護層表面にポリエステル粘着テ−プ(日東電工(株)製 No31B 71ハイ)を貼り付け、仮支持体より有機銀塩層を含む塗布層を粘着テープに貼り付けて剥離し、増感シートを得た。
得られた塗布試料を200mm×70mmに裁断し、その保護層表面にポリエステル粘着テ−プ(日東電工(株)製 No31B 71ハイ)を貼り付け、仮支持体より有機銀塩層を含む塗布層を粘着テープに貼り付けて剥離し、増感シートを得た。
5.イムノクロマトグラフキットの作製
5−1.キットA(比較例)の組み立て
図1に示すように、バック粘着シ−ト1(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)に、抗体固定化メンブレン3を貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗hCG抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約2mm重なるように金コロイド抗体保持パッド2を貼り付け、約4mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド5(18mm×150mmに切ったグラスファイバ−パッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5mm重なるように吸収パッド4(20mm×150mmに切ったセルロ−ス膜(Cellulose Fiber Sample Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を5mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッタ−(CM4000、ニップンテクノクラスタ社)切断していくことで、5mm×55mmのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。これらをプラスチックケ−ス(ニップンテクノクラスタ社)に入れ、試験用イムノクロマトグラフキットAとした。捕捉部位3aは、検体の抗体を検出する検出部31とプロセスのノイズを示すコントロール部32よりなり、これらの部の発色(黒化)濃度の差から判定を下すことができる。抗体固定化メンブレン3の固定化用抗hCGモノクロ−ナル抗体をライン状に塗布した箇所が検出部31であり、コントロ−ル用抗マウスIgG抗体をライン状に塗布した箇所がコントロール部32である。
5−1.キットA(比較例)の組み立て
図1に示すように、バック粘着シ−ト1(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)に、抗体固定化メンブレン3を貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗hCG抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約2mm重なるように金コロイド抗体保持パッド2を貼り付け、約4mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド5(18mm×150mmに切ったグラスファイバ−パッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5mm重なるように吸収パッド4(20mm×150mmに切ったセルロ−ス膜(Cellulose Fiber Sample Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を5mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッタ−(CM4000、ニップンテクノクラスタ社)切断していくことで、5mm×55mmのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。これらをプラスチックケ−ス(ニップンテクノクラスタ社)に入れ、試験用イムノクロマトグラフキットAとした。捕捉部位3aは、検体の抗体を検出する検出部31とプロセスのノイズを示すコントロール部32よりなり、これらの部の発色(黒化)濃度の差から判定を下すことができる。抗体固定化メンブレン3の固定化用抗hCGモノクロ−ナル抗体をライン状に塗布した箇所が検出部31であり、コントロ−ル用抗マウスIgG抗体をライン状に塗布した箇所がコントロール部32である。
5−2.キットB(本発明)の組み立て
バック粘着シ−ト1(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)に、3で作製した抗体固定化メンブレン3を貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗hCG抗体ライン側を下側とする。その上に増感シ−ト6を有機銀塩層面を抗体固定化メンブレン面に対面するように貼り付けた。抗体固定化メンブレンの下側に約2mm重なるように2で作製した金コロイド抗体保持パッド2を貼り付け、約4mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド5(18mm×150mmに切ったグラスファイバ−パッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5mm重なるように吸収パッド4(20mm×150mmに切ったセルロ−ス膜(Cellulose Fiber Sample Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を5mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッタ−(CM4000、ニップンテクノクラスタ社)切断していくことで、5mm×55mmのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。これらをプラスチックケ−ス(ニップンテクノクラスタ社)に入れ、試験用イムノクロマトグラフキットBとした。
バック粘着シ−ト1(ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社)に、3で作製した抗体固定化メンブレン3を貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗hCG抗体ライン側を下側とする。その上に増感シ−ト6を有機銀塩層面を抗体固定化メンブレン面に対面するように貼り付けた。抗体固定化メンブレンの下側に約2mm重なるように2で作製した金コロイド抗体保持パッド2を貼り付け、約4mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド5(18mm×150mmに切ったグラスファイバ−パッド(Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5mm重なるように吸収パッド4(20mm×150mmに切ったセルロ−ス膜(Cellulose Fiber Sample Pad、ミリポア社))を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を5mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッタ−(CM4000、ニップンテクノクラスタ社)切断していくことで、5mm×55mmのイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。これらをプラスチックケ−ス(ニップンテクノクラスタ社)に入れ、試験用イムノクロマトグラフキットBとした。
6.性能評価
1)最小検出感度試験法
1質量%BSAを含むPBSバッファ−にhCG(リコンビナントhCG R−506、ロ−ト製薬(株)製)を溶解し、各濃度の試験用hCG溶液を作製した。
各試験用イムノクロマトグラフキットに、各濃度の試験用hCG溶液を100μL滴下し、15分後に抗体固定メンブレンの抗hCG抗体を塗布した部位(捕捉部位)を目視した際の着色度合いを、着色が濃い「+++」、着色がある「++」、薄い着色がある「+」、着色がない「−」、の4段階で判別した。
最も薄い濃度で判別できた濃度をそのキットでの最小検出感度とした。
尚、キットBは滴下13分後に、キットの表面温度が60℃になる様にホットプレートで30秒間熱をかけた。
1)最小検出感度試験法
1質量%BSAを含むPBSバッファ−にhCG(リコンビナントhCG R−506、ロ−ト製薬(株)製)を溶解し、各濃度の試験用hCG溶液を作製した。
各試験用イムノクロマトグラフキットに、各濃度の試験用hCG溶液を100μL滴下し、15分後に抗体固定メンブレンの抗hCG抗体を塗布した部位(捕捉部位)を目視した際の着色度合いを、着色が濃い「+++」、着色がある「++」、薄い着色がある「+」、着色がない「−」、の4段階で判別した。
最も薄い濃度で判別できた濃度をそのキットでの最小検出感度とした。
尚、キットBは滴下13分後に、キットの表面温度が60℃になる様にホットプレートで30秒間熱をかけた。
2)結果
表1から明らかなように、本発明によるキットBは比較のキットAに比較して、極めて高感度にhCGを検出できる。
1:バック粘着シート
2:金コロイド抗体保持パッド
3:抗体固定化メンブレン
3a: 捕捉部位
31:検出部
32:コントロール部
4:吸収パッド
5:試料添加パッド
6:増感シート
10:イムノクロマトグラフキット
2:金コロイド抗体保持パッド
3:抗体固定化メンブレン
3a: 捕捉部位
31:検出部
32:コントロール部
4:吸収パッド
5:試料添加パッド
6:増感シート
10:イムノクロマトグラフキット
Claims (8)
- 分析対象物及びそれと特異的に結合する抗体又は抗原による免疫反応を利用し、固定化された免疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマトグラフキットであって、有機銀塩粒子、銀イオンの為の還元剤、および金属コロイド標識または金属硫化物標識を含有することを特徴とするイムノクロマトグラフキット。
- 前記有機銀塩粒子の溶剤を含むことを特徴とする請求項1に記載のイムノクロマトグラフキット。
- 前記有機銀塩粒子が、カルボン酸銀もしくは含窒素複素環銀塩を含有することを特徴とする請求項1又は請求項2に記載のイムノクロマトグラフキット。
- 前記有機銀塩の相転位温度が40℃以上100℃以下である事を特徴とする請求項1〜請求項3記載のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット。
- 前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を同一のキット内に含有する事を特徴とする請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット。
- 前記有機銀塩粒子および前記銀イオンの為の還元剤を含有する層、および前記金属コロイド標識または前記金属硫化物標識を含有する層を、同一のキット内に含む事を特徴とする請求項5に記載のイムノクロマトグラフキット。
- 前記金属コロイドが金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、もしくはこれらの複合コロイドである事を特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット。
- 前記金属コロイドの平均粒径が5nm以上100nm以下である事を特徴とする請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のイムノクロマトグラフキット。
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- 2007-11-07 JP JP2007290095A patent/JP2008139297A/ja not_active Abandoned
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