ES2306626B1 - Sistema para la deteccion de antibioticos en alimentos. - Google Patents
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Abstract
Sistema para la detección de antibióticos en
alimentos.
La presente invención hace referencia a un
sistema para la detección de antibióticos en alimentos que comprende
una carcasa (1) que a su vez comprende al menos 1 hendidura para la
adición de la muestra a analizar (3) y al menos 1 ventana de
visualización de resultados (4) y una tira reactiva (2). Además la
invención se refiere a un procedimiento para la detección de
antibióticos en alimentos mediante el sistema anterior, que
comprende las etapas de preparación del sistema de detección de
antibióticos en alimentos, preparación de la muestra a analizar y
detección de antibióticos.
Description
Sistema para la detección de antibióticos en
alimentos.
La presente invención hace referencia a un nuevo
sistema para la detección de antibióticos en alimentos y al
procedimiento para poder llevar a cabo dicha detección.
Particularmente la detección se lleva a cabo en alimentos tales como
la miel.
En los últimos años, la confianza de los
consumidores europeos en los sistemas de vigilancia alimentaria se
ha visto seriamente dañada, suscitando una inquietud general en
relación a la calidad y seguridad de los alimentos destinados al
consumo. La situación se agrava para algunos productos como la miel
y derivados, para los que no se han fijado los límites máximos de
residuos (LMRs), porque se trata de productos con la etiqueta de
"natural" y no pueden contener residuos, o porque su consumo
es en volumen más reducido que otros alimentos, pero muy frecuente y
apreciado en la dieta.
El aseguramiento de la calidad de los alimentos
de origen animal, requiere un análisis pormenorizado de los riesgos
asociados a la presencia de residuos de sustancias con actividad
farmacológica y, el establecimiento de directrices que regulen
adecuadamente el empleo de estos compuestos en zootecnia. Además, se
evidencia la necesidad de evaluar las repercusiones
medioambientales de estos fármacos, incluyendo en las directrices
mencionadas, criterios de evaluación del riesgo medioambiental.
En el curso de los últimos años, la problemática
de los residuos de antibióticos de uso veterinario en los alimentos
ha ido evolucionando. En un principio se tenía el concepto de
"residuo cero" pero, gracias al perfeccionamiento de los
métodos de análisis, la Comisión Europea (Directiva 96/23/CE),
basándose en datos toxicológicos, estableció la lista de sustancias
autorizadas y prohibidas que deben detectarse en alimentos, fijando
los límites máximos de residuos (LMRs) para alguna de ellas y los
provisionales para otras. Los residuos que deben controlarse en
animales vivos y en sus productos alimenticios se pueden clasificar,
de acuerdo con la directiva 96/23/CE, en dos grandes
grupos:
grupos:
Grupo A: Sustancias con efecto
anabolizante y sustancias no autorizadas (e.g. estilbenos, agentes
antitiroideos, esteroides, zeranol,
\beta-agonistas,...).
Grupo B: Medicamentos veterinarios
(incluidas las sustancias no registradas que podrían utilizarse a
efectos veterinarios) y contaminantes. En este grupo se encuentran
las sustancias antibacterianas y otras sustancias y contaminantes
medioambientales como los compuestos organoclorados, las micotoxinas
y los elementos químicos, como son los metales pesados.
La producción animal en cría intensiva requiere
el control de potenciales enfermedades mediante la utilización de
medicamentos veterinarios de uso metafiláctico, profiláctico y
terapéutico (antimicrobianos, antiparasitarios), así como también
la utilización de aditivos para la alimentación animal
(antibióticos, coccidiostáticos y otras sustancias medicamentosas y
factores de crecimiento) con fines de mejora del rendimiento.
Dentro de este grupo de sustancias se, incluyen
los antibióticos, agentes antimicrobianos que desde su introducción
en el campo de la medicina veterinaria en los años 40 se han
empleado extensamente en el tratamiento de enfermedades infecciosas
que afectan tanto a los animales de compañía como a los destinados
al consumo humano. En los animales productores de alimentos, los
antibióticos comenzaron a utilizarse como agentes promotores del
crecimiento, añadiéndolos al pienso en dosis subterapeúticas
durante periodos de tiempo prolongados. Esta práctica está muy
extendida desde que en 1950 Stokstad y Jukes observaron que la
administración de pequeñas dosis de clortetraciclina aumentaba el
ritmo de crecimiento animal.
Tras la administración de antibióticos en
veterinaria es necesario respetar un plazo de espera o periodo de
supresión antes de utilizar la carne, leche, huevos, o cualquier
producto animal, a fin de que el antibiótico haya sido eliminado
totalmente y no queden residuos, o que éstos se encuentren por
debajo del LMR fijado en cada caso. Sin embargo, los tiempos de
espera no se han armonizado en los países de la Unión Europea y no
es raro que una misma especialidad farmacéutica tenga tiempos de
espera diferentes de unos países a otros. Existe además la
posibilidad de que los residuos de estos compuestos o sus
metabolitos, persistan en el animal y, por tanto, pasen a la cadena
de alimentación humana. Además, estos compuestos antimicrobianos
pueden ser vertidos incontroladamente como sustancias de desecho,
pudiendo ocasionar problemas de contaminación.
La situación se agrava para algunos productos
(mieles, huevos, especies menores) para los que no se han fijado
LMRs por ejemplo, porque se trata de productos con la etiqueta de
"natural" y no pueden contener residuos, o porque su consumo es
reducido.
\newpage
La miel es un producto natural cuyo consumo se
ha extendido desde la antigüedad hasta nuestros días. De hecho, ya
se utilizaba en el Antiguo Egipto (2.000 a.c.) para el tratamiento
de heridas, quemaduras y ulceras. Presenta excelentes propiedades
nutritivas, ya que contiene tiamina, riboflavina, niacina, Fe, Mg,
Mn, P y Na, además de un número de enzimas y antioxidantes
considerable. Estudios recientes han revelado sus propiedades
antibacterianas y antimicrobianas, lo que aconseja su empleo como
conservante y cosmético. No obstante, y al igual que ocurre con
otros muchos alimentos, los casos de contaminación en miel por
residuos químicos de compuestos organoclorados, organofosforados,
carbamatos, antibióticos y quimioterápicos, entre otros, son
bastante frecuentes y representan un riesgo evidente para la salud
de los consumidores.
La contaminación de la miel por residuos de
antibióticos es debida a: i) los tratamientos realizados
para combatir enfermedades bacterianas en las colmenas tales como
la toque americana y la Toque europea, causadas por la bacteria
Melissococcus pluton ii) aplicaciones para combatir
infecciones bacterianas en frutales y hortalizas tales como la
Erwinia amylovora, que ha causado importantes pérdidas en
ciertas regiones de Alemania dedicadas a la producción de manzanas y
peras, o el tratamiento dado a las pseudomonas durante el período
de floración, lo que ocasiona una elevada contaminación de las
flores con agentes antimicrobianos implicando la aparición de
residuos de estos compuestos en la miel; iii) para el
tratamiento de la nosemiasis (enfermedad causada por protozoos), un
número significativo de apicultores argentinos utiliza un producto
veterinario cuyo principio activo es la Fumagilina, antibiótico
autorizado en Argentina y prohibido en Europa.
El sector de la miel es la principal actividad y
fuente de ingresos de un gran número de ciudadanos europeos
-existen 460.071 apicultores censados-. Las cifras aportadas se
incrementan considerablemente si consideramos los envasadores y
distribuidores de miel y derivados.
En 1999, la UE fue el tercer productor mundial
de miel -con 116.000 toneladas- ocupando la primera posición del
ranking en el número de importaciones, absorbiendo el 47% del
total, ya que consume 270.000 toneladas, aproximadamente el doble
de su producción.
A pesar de que la mayoría de compuestos no están
autorizados para su empleo en productos destinados a la
alimentación humana, generación de superbacterias, están
apareciendo diferentes compuestos -nitrofuranos, estreptomicina,
cloranfenicol, sulfamidas o tetraciclinas, entre otros-,
dependiendo de la procedencia ya que Europa importa la mitad de la
miel que consume.
Con el fin de satisfacer las necesidades del
mercado europeo es necesario importar miel de otros países. En este
sentido, los envasadores de miel están verdaderamente preocupados
ya que en la mayoría de miel importada se detectan residuos de
antibióticos (a diferentes concentraciones), hecho que repercute
directamente en su calidad y precio, ya que esa miel no es apta
para su puesta en el mercado.
Para hacerse una idea de la problemática, en el
año 2002 (7 de Febrero), el comité científico veterinario de la UE
recomienda suspender la importación de productos procedentes de
China ya que detectaron estreptomicina en siete muestras de miel y
cloranfenicol en gambas. Desde el 2003 hasta la fecha, la red de
alertas alimentarias de la UE (Food Alert System) con
periodicidad semanal, informa de la aparición de diferentes
antibióticos en miel y derivados, metabolitos de nitrofurano,
cloranfenicol, estreptomicina, sulfamidas, tetraciclinas y otros,
no detectados con anterioridad como tilosina, dapson o eritromicina
en mieles de distinto origen.
Si nos acogemos a la legislación vigente, el
anexo IV del Reglamento 2377/90/EC incluye al cloranfenicol,
estableciendo tolerancia cero para este analito en alimentos
destinados al consumo, ya que su ingesta puede estimular el
desarrollo de anemia aplásica en humanos. A pesar de ello, en la
práctica la acción correctora no seria tomada a no ser que el nivel
encontrado en miel excediese, en una cantidad suficiente, el límite
de detección del método de análisis empleado.
El empleo de tretraciclinas y sulfonamidas
(mayoritariamente sulfatiazol sódico, STZ) para combatir
enfermedades bacterianas en las colmenas está generalizado y de
hecho se vienen utilizando desde hace más de treinta años. Por ello,
es conveniente la determinación de estos compuestos, sobre todo en
el caso de materia prima de diferente localización geográfica, para
su posterior envasado, ya que presentan gran heterogeneidad en
cuanto a composición, tipo y número de residuos.
En el caso de estreptomicina, si bien la Unión
Europea ha establecido límites máximos de residuos (LMRs) en carne
y leche, no existe legislación al respecto para miel, a pesar de
que la, exposición continuada a niveles residuales de este compuesto
puede provocar alergias, alteraciones de la flora intestinal y
aparición de resistencias en microorganismos patógenos.
En Europa, la administración de nitrofuranos
para el tratamiento de animales destinados al consumo no está
autorizada, debido a sus efectos carcinogénicos y mutagénicos. Los
metabolitos de nitrofurano aparecen tras el empleo de furazolidona
(AOZ), furaltadona (AMOZ), nitrofurantoina (AHD) y nitrofurazona
(SEM), mostrando mayor incidencia el AOZ.
\newpage
Como se puede observar, la situación es
verdaderamente preocupante, ya que:
- 1.
- Dado que el consumo en los países europeos es superior a su producción, es necesario importar alimentos de países en los que los controles sanitarios no son tan estrictos, e incluso se utilizan sustancias ya prohibidas en la UE.
- 2.
- Ciertos apicultores no siguen unas buenas prácticas de producción, recurriendo a la picaresca (utilización de antibióticos no buscados como tilosina, fumagilina, dapson o eritromicina).
- 3.
- Se introducen mieles en Europa por países terceros ya que, cuando se prohibieron las importaciones de miel china, las importaciones de miel turca pasaron del 15% al 55% (obviamente, la miel procedía de China, ya que los antibióticos encontrados así lo confirmaban).
- 4.
- Así, se generan distintos problemas sanitarios, tecnológicos, analíticos, y medioambientales que pueden originar un grave perjuicio a los consumidores, productores y a la administración y que deben evitarse en la medida de lo posible.
- 5.
- En las pequeñas y medianas empresas (PYMES), empresas familiares y/o tradicionales, como es el caso del colectivo de la miel y derivados, las dificultades para implantar sus propios programas de seguridad y control son enormes, ya que la mayoría carece de los recursos técnicos y económicos necesarios para llevarlos a cabo. A pesar de ello, consideran que en el sistema actual de mercado invertir en calidad es absolutamente necesario y consideran prioritario poder garantizar la inocuidad de la miel.
- 6.
- Es necesario desarrollar Programas de Vigilancia que garanticen la calidad de los alimentos. Para ello se requiere un incremento del número de controles a lo largo de todo el proceso productivo que aseguren la trazabilidad. Esto implicaría, entre otros aspectos, un aumento del número de análisis, lo que repercute significativamente en el precio del producto acabado.
Tradicionalmente, para la determinación de
antibióticos en miel o en otras sustancias alimenticias como la
leche, se utilizan técnicas microbiológicas y cromatográficas como
la descrita en J. Food Protect., 62:632-636 o M.
EAAP Publ. (1999), 95 (Milking and Milk Production of Dairy Sheep
and Goats), 164-167, o Analyst 123,
2759-2762, o J. AOAC Int. 75,
786-789, o Journal of Apicultural Research, 1990,
29, 2, 112-117 0 J. Agric. Food. Chem. 43,
931-934. Los métodos microbiológicos o de inhibición
bacteriana se han desarrollado y utilizado tradicionalmente para la
detección de residuos de antibióticos o sustancias antimicrobianas
en productos alimenticios, especialmente en leche y tejidos
animales. Estos métodos se basan en el grado de inhibición del
crecimiento microbiano producido por los fluidos o extractos
tisulares, incubados en un medio inoculado. Pueden resultar útiles
para el screening previo pero su sensibilidad es baja, la precisión
variable y son poco específicos. Además, la presencia de sustancias
inhibidoras puede afectar a la exactitud del análisis, por lo que
la etapa de preparación de muestra puede ser problemática,
especialmente en la miel, ya que este tipo de matriz presenta
propiedades antimicrobianas y antibacterianas per se. Esto,
encarecería sin duda el coste del análisis y demoraría la
presentación de resultados. Por su parte, los métodos
físico-químicos requieren, por lo general, personal
cualificado, la presentación de resultados es lenta (7 días a un
mes), caros (300 Euros/análisis, aproximadamente) y su utilización
en programas de vigilancia es limitada, ya que requieren en
general, una etapa previa de preconcentración y limpieza de
muestra, seguido de identificación y cuantificación de los analitos
mediante herramientas sofisticadas tales como cromatografía y
espectrometría. De ahí que su empleo en análisis de rutina para
garantizar la calidad y seguridad de la miel durante la producción
y procesado sea limitado. D'Haese, E., Nelis, H.J., Reybroeck, W.,
and De Ruyck, H. 1999. Evaluation of a modified enzymatic test for
the detection of tetracyclines in milk.
Así, se hace necesario el desarrollo de métodos
inmunoquímicos, en formato de tira reactiva, como herramientas
analíticas de alerta, agilizando tiempos de ensayo (15 minutos) y
reduciendo costes (4 Euros/ensayo). La portabilidad, simplicidad de
manejo e interpretación de resultados permitirá a los usuarios
llevara cabo análisis de antibióticos en tiempo real y en el sitio
donde pueda presentarse el problema, pudiendo tomar acciones
correctoras con agilidad y fiabilidad.
Los riesgos asociados al consumo de alimentos
contaminados con antibióticos; la importancia de un control
riguroso para cumplir con los objetivos reguladores y
proteccionistas "no residuos"; y los inconvenientes (personal
entrenado, equipamiento sofisticado y caro) para el análisis de
antibióticos por métodos cromatográficos, hacen necesario el
desarrollo de métodos analíticos sensibles, fiables, económicos
(< 6 Euros/ensayo) y rápidos (15
minutos).
minutos).
Además los sistemas actualmente desarrollados
coma. el "Honey Tetrasensor Kit" de la empresa Unisensor,
conllevan un tiempo de resolución alto y el proceso es
laborioso.
El desarrollo de sistemas de screening
(tiras reactivas, preferentemente) permitirá a los empresarios
realizar sus propios controles de antibióticos "in situ"
y a tiempo real. Así, podrán tomar medidas correctoras cuando sea
necesario -aceptación o rechazo de la mercancía, en función de la
concentración de antibiótico encontrada-, lo que agilizará la toma
de decisiones, asegurando la inocuidad del producto.
El desarrollo de nuevos métodos analíticos,
especialmente rápidos, para el control de sustancias tóxicas en
alimentos, que respalden el cumplimiento de la legislación vigente,
conllevará a la consecución de alimentos saludables, seguros y de
alta calidad, con objeto de satisfacer las necesidades del
consumidor y potenciar la competitividad de la industria
alimentaria española. Además, aumentará el grado de confianza de
los consumidores hacia los productos comercializados puesto que
éstos habrán sido objeto de un control exhaustivo a lo largo de
todo el proceso productivo (trazabilidad), garantizando de este
modo la inocuidad de la miel.
La presente invención se refiere a un sistema de
detección de antibióticos en alimentos y el procedimiento para la
determinación de los mismos.
Mediante el sistema y procedimiento descritos a
continuación, se consigue que el proceso de detección sea más
higiénico, con menor contaminación, más rápido, más sensible y más
barato que con los sistemas y procedimientos conocidos hasta la
actualidad.
Por lo tanto según un primer aspecto de la
presente invención se refiere a un sistema para la detección de
antibióticos en alimentos (figura 1) que comprende las siguientes
partes:
- -
- Carcasa (1) que es el medio en el cual se encuentran en el interior los componentes de detección de antibióticos en alimentos.
- -
- Tira reactiva (2) que es el medio por el cual la muestra a analizar fluye y reacciona hasta determinar si el ensayo es positivo o negativo. Se encuentra dentro de la carcasa (1). Ver figura 3.
La carcasa (1) es preferentemente de plástico y
comprende al menos una hendidura (3) para añadir la muestra a
estudiar y al menos una ventana (4) por la que se puede visualizar
el resultado para la detección de antibióticos. En ese mismo sentido
la ventana (4) muestra en su interior parte de la tira reactiva (2)
de tal manera que cuando el resultado de la detección de
antibióticos en alimentos es negativo, se pueden visualizar dos
bandas, una control (C) y otra banda de ensayo (T). Si por el
contrario, el ensayo es positivo se podrá visualizar en el interior
de la ventana (4) la aparición de una sola banda correspondiente al
control (C).
La tira reactiva (2) comprende al menos los
siguientes elementos:
- -
- Capa de muestra (5) en la cual se deposita la muestra. Actúa como prefiltro, reteniendo partículas de la muestra que pueden inhibir el flujo o provocar interferencias en el ensayo.
- -
- Capa para el anticuerpo primario específico (6), cuya función es la de reaccionar con la muestra si contiene sustancias específicas frente a ese anticuerpo, uniéndose por los sitios de reconocimiento (fracción variable) de dicho anticuerpo.
- -
- Membrana (7) en la cual aparecen la banda de control (C) y la banda de ensayo (T), pudiéndose visualizar las mismas a través de la ventana (4) incorporada en la carcasa. En la membrana (7) se encuentran inmovilizados un conjugado análogo a la sustancia a determinar (8) y un control o anticuerpo secundario (9) el cual se unirá al anticuerpo específico por su fracción constante.
- -
- Capa de absorbente o de parada (10), la cual impide que la muestra siga fluyendo. Además tiene la función de actuar como bomba/depósito, facilitando el flujo del reactivo o muestra y asegurando el movimiento completo de la muestra a través de la membrana.
- -
- Soporte (11) sobre el cual se superponen el resto de las zonas anteriormente descritas, como se muestra en la Figura 1. El material es preferentemente de poliestireno, impregnado con una sustancia adhesiva donde se colocan la membrana y las diferentes capas. El adhesivo empleado debe ser compatible con la membrana, ya que éste puede migrar dentro de los poros causando problemas de flujo. El soporte tiene un espesor entre 5 a 30 mm, preferentemente entre 10-15 mm y una longitud de 10 a 50 cm, preferentemente de 25 a 35 cm.
La capa de muestra (5) o zona donde se deposita
la muestra a analizar, a través de la hendidura (3), debe ser de un
material que no interfiera con el analito, seleccionado del grupo
formado por fibra de vidrio y algodón.
La capa para el anticuerpo específico (6) se
selecciona entre los materiales del grupo formado por poliéster,
vidrio, material sintético y de nitrato de celulosa y tiene
inmovilizado dicho anticuerpo de tal manera que es liberado,
solubilizándose al entrar en contacto con la muestra a analizar.
Dicho anticuerpo específico tiene acoplado un trazador o lo que es
lo mismo, una sustancia que se introduce en el sistema con el fin
de estudiar la evolución temporal y/o espacial del proceso a través
de su detección o medición. Dichos trazadores pueden ser coloides
metálicos, preferentemente de oro, plata, selenio, cobre, platino o
hierro y más preferentemente de oro, o también pueden ser de
partículas de latex derivatizadas con diferentes reactivos
coloreados, trazadores fluorescentes o enzimas de la familia de la
fosfatasas o de las peroxidasas. Además dichos trazadores presentan
alta capacidad de tinción, aumentando la visualización con el
tamaño de partícula, usualmente entre 10-60 nm.
La membrana (7) es preferentemente de
nitrocelulosa y en ella se encuentran inmovilizados una sustancia
conjugada (8) o conjugado hapteno-proteína [un
hapteno es una sustancia química de pequeño peso molecular (menos
de 10.000 Da) que no induce por sí misma la formación de
anticuerpos, pero al unirse a una proteína (proteína trasportadora)
estimula una respuesta inmunitaria en el organismo productor de
anticuerpos, o lo que es lo mismo, sería una proteína unida a un
compuesto de poco peso molecular el cual es similar al compuesto a
detectar (antibiótico)] y la sustancia control o anticuerpo
secundario específico (9), el cual reaccionará siempre con el
anticuerpo primario específico uniéndose por la fracción
constante.
La capa absorbente o de parada (10) es
preferentemente de algodón.
Los antibióticos a detectar en alimentos son
preferentemente el sulfatiazol y la oxitetraciclina, y el alimento
sobre el cual se mide la presencia de antibióticos es la miel.
Un segundo aspecto fundamental de la presente
invención sería un procedimiento para la detección de antibióticos
en alimentos mediante el sistema, anteriormente descrito.
Dicho procedimiento-constaría de
las siguientes etapas:
Sobre un soporte (11) preferentemente de
poliestireno se superpone una membrana (7) de nitrocelulosa que
contiene inmovilizados un conjugado de la muestra a analizar que
está en una concentración desde 0,05 a 2 microlitros por centímetro,
preferentemente a una concentración desde 0,5 a 1,5 microlitros por
centímetro y más preferentemente a 1 microlitro por centímetro y un
anticuerpo secundario específico, frente a la fracción constante
del anticuerpo primario, el cual está a una concentración desde
0,05 a 2. microlitros por centímetro, preferentemente a una
concentración desde 0,5 a 1,5 microlitros por centímetro y más
preferentemente a 1 microlitro y sobre el mismo soporte se
superpone una capa de poliéster que equivale a la zona donde se
encuentra depositado el anticuerpo primario específico contra el
antibiótico presente en la muestra a analizar (6) el cual se
encuentra en una concentración desde 0,1 a 2,5 miligramos por
mililitro, preferentemente desde 0,25 a 1,5 miligramos por
mililitro y más preferentemente a 0,50 miligramo por mililitro. A
continuación sobre el soporte de poliestireno, se deposita una capa
de fibra de vidrio o zona de depósito de muestra (5). Por el
extremo libre del soporte (7) se superpone la capa de absorbente o
de parada (10), de algodón.
Los inmunorreactivos (suero/conjugado) a
utilizar son: suero S12-II/conjugado
OVA-S8 y el suero
OTC3-I/conju-
gado OVA-OTC3, teniendo cada uno de ellos una sensibilidad entre 10 y 20 ng/g. La combinación S12-II/OVA-S8 se usará preferentemente para cuando se quiera detectar el antibiótico sulfatiazol y el par OTC3-I/OVA-OTC3 para cuando se quiera detectar la oxitetraciclina.
gado OVA-OTC3, teniendo cada uno de ellos una sensibilidad entre 10 y 20 ng/g. La combinación S12-II/OVA-S8 se usará preferentemente para cuando se quiera detectar el antibiótico sulfatiazol y el par OTC3-I/OVA-OTC3 para cuando se quiera detectar la oxitetraciclina.
El anticuerpo secundario a utilizar será un
anticuerpo de cabra anti-conejo, que reconoce a la
fracción constante de cualquier anticuerpo de conejo.
Una vez montada la tira reactiva (2), se encaja
la misma sobre la carcasa (1) tal cual se puede observar en la
figura 2.
Se disuelve la muestra a analizar en un
disolvente apropiado en función del antibiótico a detectar
(sulfatiazol u oxitetraciclina). Dicha disolución comprende las
etapas de:
- \circ
- Tomar una muestra del alimento, de una cantidad dentro del rango desde 0,5 a 3 gramos, preferentemente desde 1 a 2 gramos y más preferentemente de 1,25 gramos.
- \circ
- Añadir preferentemente entre 5 y 20 mL, preferentemente entre 10 y 15 mL, y más preferentemente 12,5 mL, de una solución salina, preferentemente de tampón fosfato o de tampón acetato sódico. Siendo preferente la solución salina de acetato sódico 0.1 M en el rango de pH 2 a 7, preferentemente a pH 5 para la detección del sulfatiazol y 100 mM, en el rango de pH 4 a 9, preferentemente a pH 7,5 para la detección del oxitetraciclina.
- \circ
- Agitar durante 5 minutos para que se disuelva la muestra a analizar.
- \circ
- Tomar una cantidad de disolución dentro del rango desde 80 a 150 microlitros, preferentemente tomando una cantidad del extracto de 100 microlitros.
Añadir la disolución resultante de la etapa 2 al
sistema descrito en la etapa 1 mediante la hendidura (3).
Preferentemente se añaden desde 80 a 150 microlitros y más
preferentemente se añaden 100 microlitros.
Esperar 5 minutos para que fluya el extracto a
lo largo del sistema.
Visualizar si el ensayo es positivo o negativo,
mediante la aparición de 1 o 2 bandas.
De tal manera que el sistema y procedimiento
descritos anteriormente funcionarían de la siguiente manera:
A) Si el resultado del ensayo fuese positivo
frente al antibiótico, tal cual se muestra en la figura 4:
Al añadir la disolución del alimento (miel) a
analizar disuelto previamente, se deposita dejando que fluya a lo
largo de las distintas partes del sistema, de tal manera que en un
primer momento la muestra reacciona con el anticuerpo primario que
está marcado con el trazador, de tale manera que el anticuerpo
primario es liberado y solubilizado. Durante la migración, en
función de la concentración de analito presente en el extracto,
éste se une en mayor o menor extensión al anticuerpo primario
específico. De tal manera que si la concentración de analito es
elevada, los centros de reconocimiento del anticuerpo (molécula
bifuncional), estarán bloqueados y cuando el frente pase por la
zona en la cual se encuentra inmovilizado el conjugado, éste no
será reconocido y por lo tanto no se producirá la aparición de una
banda en ese punto. Sin embargo el anticuerpo primario específico
sigue fluyendo y reacciona con el anticuerpo secundario específico
uniéndose por la fracción constante, de tal manera que se visualiza
una banda debida a esa
unión.
unión.
B) Si el resultado del ensayo fuese negativo
frente al antibiótico, tal cual se muestra en la figura 5:
La disolución añadida no reaccionaría con el
anticuerpo primario, o lo haría si la concentración de antibiótico
es baja, de tal manera que los centros de unión –o gran parte de
ellos- quedarían libres y al solubilizarse y fluir hasta la zona
donde se encuentra el conjugado se uniría al mismo, dando cómo
resultado la aparición de una banda, mientras que el anticuerpo
primario específico, al igual que en caso anterior reaccionaría con
el anticuerpo secundario específico por la fracción constante, dando
como resultado global la aparición de dos bandas, una debida al
control y la otra debida a la zona de ensayo, y por lo tanto,
siendo el ensayo negativo frente al antibiótico a detectar.
Un tercer aspecto esencial de la presente
invención se refiere al uso del sistema descrito anteriormente para
la detección de antibióticos en alimentos, preferentemente en
alimentos tales como miel, productos lácteos, carnes, y piensos,
más preferentemente sobre la miel y para detectar antibióticos tales
como sulfatiazol u oxitetraciclina.
1) La figura 1 muestra la carcasa (1) del
sistema la cual consta de una hendidura (3) por la cual se adiciona
la muestra o disolución a analizar para detectar la presencia de
antibióticos y una ventana (4) por la que se puede visualizar el
resultado de la detección de antibióticos. Además se puede
visualizar parte una tira reactiva (2) en la cual están todos los
componentes que hacen que el sistema pueda detectar la presencia de
antibióticos. Las zonas S, T y C corresponden ala zona de adición de
muestra, zona de test o zona en la que puede aparecer la banda
correspondiente a la unión de un anticuerpo primario con un
conjugado y zona de control.
2) La figura 2 muestra la carcasa (1) abierta,
mostrando en su interior la tira reactiva (2), en la, cual se
producirían las reacciones pertinentes para observar si el ensayo es
o no positivo frente a un determinado tipo de antibiótico.
3) La figura 3 muestra la tira reactiva (2), con
cada uno de sus elementos superpuestos, unos encima de otros,
estando en primer lugar el soporte (11), sobre el cual se encuentra
la membrana (7) y sobre esta última se superponen parcialmente, la
capa de absorbente o de parada (10), y la capa para el anticuerpo
primario específico (6) y sobre está ultima capa se acopla la capa
de muestra (5). Las zonas T y C corresponden a la zona de test o
zona en la que puede aparecer la banda correspondiente a la unión
de un anticuerpo primario con un conjugado y zona de control.
4) La figura 4 muestra el resultado obtenido
cuando una muestra de miel a analizar contiene antibióticos y por
lo tanto el ensayo sería positivo para ese antibiótico.
5) La figura 5 muestra el resultado obtenido
cuando una muestra de miel a analizar no contiene antibióticos y
por lo tanto el ensayo sería negativo para ese antibiótico.
6) La figura 6 muestra un esquema de la etapa 3)
del procedimiento anteriormente descrito, cuando la muestra y el
sistema ya están preparados y se dispone a la adición del extracto
al sistema.
Los siguientes ejemplos de realización tienen
principalmente carácter ilustrativo para poder entender mejor la
presente invención, pero no tendrán en ningún caso carácter
limitativo.
Se prepararon 1000 tiras reactivas (100 de cada
combinación de concentraciones de inmunorreactivos, como aparecen
en la tabla 1) para la detección del antibiótico sulfatiazol tal
cual viene descrito en la presente invención. Para ello se añadieron
concentraciones crecientes de anticuerpo primario, secundario y
conjugado (ver tabla 1). De la misma manera el anticuerpo primario
específico S12-II tiene acoplado un trazador de
oro. La capa de muestra es de fibra de vidrio, la de anticuerpo
primario es de poliéster, la membrana es de nitrocelulosa y la de
absorbente o parada es de algodón. En la membrana el anticuerpo
secundario es de cabra anti-conejo (GAR) y el
conjugado es OVA-S8.
Una vez preparadas las distintas tiras reactivas
(2) a las distintas concentraciones de elementos reactivos
(inmunorreactivos), se procedió a la toma de 10 muestras de miel
para su identificación, como positivas o negativas, frente al
anticuerpo específico contra sulfatiazol. Las cantidades de
muestras que se tomaron, en gramos, fueron tal cual se recogen en
la tabla 2, de tal manera que cada muestra se ensayó con cada una
de las tiras (T1 a T10).
A esas 10 muestras de miel, elegidas al azar, y
de diferente procedencia apicultora, se les añadió 12,5 mL de
tampón acetato sódico 0.1 M, a pH 5. A partir de ese momento se
agita durante 5 minutos, de tal manera que se observa como cada una
de las muestras empiezan a solubilizarse, dependiendo la cantidad de
miel tomada. Esos 5 minutos, son suficientes para solubilizar
completamente las muestras de miel.
A continuación, para cada una de las muestras de
miel, se toman 10 volúmenes distintos, desde 80 hasta 150
microlitros, coma aparece en la tabla 3.
Para cada muestra de miel, se ensayaron diez
volúmenes distintos (A1-A10) con cada una de las
tiras (T1-T10) como aparece en la tabla 4. Es decir,
que para la muestra (M1), se toman en primer lugar 80 \mul de la
solución y se depositan en la tira (T1) y así sucesivamente, se van
depositando 80 \mul hasta la tira (T10). A continuación, y
siguiendo con (M1), pasaríamos al siguiente volumen 85 \mul (A2),
probando en las diez tiras, así hasta probar todos los volúmenes de
todas las muestras (M1-M10).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tras cinco minutos, tiempo en el cual la
alícuota fluye por el sistema reaccionando con las distintos
elementos reactivos (anticuerpos o conjugados), se observa la
aparición de distintas bandas coloreadas y dependiendo del número de
bandas observadas, se determinó si la muestra de miel tomada al
azar era o no positiva al antibiótico sulfatiazol. Un resumen de
los resultados obtenidos se muestra en la tabla 5. En cualquier
caso se observó que los mejores resultados, en cuanto a sensibilidad
visual se refiere, son los acaecidos para las tiras 4, 5 y 6 con
A4, A5 y A6; aunque en todos los casos se pudo ver -sin equívoco-,
la positividad o negatividad de la muestra.
Las muestras 1, 5, 7, 8 y 9 resultaron positivas
(aparición de la banda control) a dicho antibiótico por lo tanto
deben ser rechazadas.
Las muestras 2, 3, 4, 6 y 10 resultaron ser
negativas (aparición de dos bandas, test y control) a dicho
antibiótico por lo tanto son aptas para consumo humano
De la misma manera que se procedió en el ejemplo
anterior se llevó a cabo la preparación de las tiras reactivas, con
la salvedad de que el anticuerpo primario específico es
OTC3-I el secundario es el mismo (GAR) y el
conjugado es OVA-OTC3, en las mismas concentraciones
que en el caso anterior. Los mismos pasos del procedimiento se
llevaron a cabo para este estudio.
Un resumen de los resultados se reflejan en la
tabla 6:
En este estudio las muestras 4, 6 y 9,
resultaron ser positivas (aparición de solo la banda control) y por
lo tanto rechazadas para consumo humano.
Sin embargo las muestras 1 a 3, 5, 7 a 8 y 10,
resultaron ser negativas (aparición de la banda control y test) y
por lo tanto aptas para consumo humano.
Claims (34)
1. Sistema para la detección de antibióticos en
alimentos que comprende los siguientes elementos:
- a.
- una carcasa (1); y
- b.
- tira reactiva (2).
2. Sistema según la reivindicación 1,
caracterizado porque la carcasa comprende los siguientes
elementos:
- a.
- hendidura (3) para añadir la muestra a estudiar; y
- b.
- ventana (4) para la visualización del resultado obtenido del análisis.
3. Sistema según la reivindicación 2,
caracterizado porque la ventana (4) comprende los siguientes
elementos:
- a.
- zona de control (C); y
- b.
- zona de ensayo o test (T}.
4. Sistema según la reivindicación 1,
caracterizado porque la tira reactiva comprende los
siguientes elementos:
- a.
- capa de muestra (5) en la cual se deposita la muestra;
- b.
- capa para el anticuerpo primario específico (6);
- c.
- membrana (7) en la cual se aprecian los resultados;
- d.
- capa de absorbente o de parada (10); y
- e.
- soporte (11) sobre el cual se superponen el resto de los componentes.
5. Sistema según la reivindicación 4,
caracterizado porque la membrana (7), comprende los
siguientes elementos:
- a.
- sustancia conjugada (8) que coincide con la zona de ensayo (T) de la carcasa (1); y
- b.
- control o anticuerpo secundario específico (9) que coincide con la zona control (C) de la carcasa (1).
6. Sistema según la reivindicación 5,
caracterizado porque la sustancia conjugada (8) y el control
(9) están inmovilizados.
7. Sistema según la reivindicación 5,
caracterizado porque la sustancia conjugada se selecciona
del grupo formado por OVA-S8 u
OVA-OTC3.
8. Sistema según la reivindicación 5,
caracterizado porque el control se selecciona del grupo
formado por un anticuerpo de cabra anti-conejo
(GAR).
9. Sistema según la reivindicación 4,
caracterizado porque la membrana (7) es de
nitrocelulosa.
10. Sistema según la reivindicación 4,
caracterizado porque la capa de muestra (5) es de fibra de
vidrio.
11. Sistema según la reivindicación 4,
caracterizado porque la capa de anticuerpo primario
específico (6), es de poliéster o nitrato de celulosa.
12. Sistema según la reivindicación 4,
caracterizado porque la capa de anticuerpo primario
específico (6) comprende anticuerpos primarios específicos frente al
antibiótico en estudio.
13. Sistema según la reivindicación 12,
caracterizado porque el anticuerpo primario específico se
selecciona del grupo formado por S12-II u
OTC3-I.
14. Sistema según la reivindicación 13,
caracterizado porque el anticuerpo primario específico lleva
acoplado un trazador.
15. Sistema según la reivindicación 14,
caracterizado porque el trazador se selecciona del grupo
formado por coloides metálicos, partículas de látex derivatizadas,
trazadores fluorescentes o enzimas.
\newpage
16. Sistema según la reivindicación 15,
caracterizado porque los coloides metálicos se seleccionan
del grupo formado por oro, plata, selenio, cobre, platino o
hierro.
17. Sistema según la reivindicación 15,
caracterizado porque las enzimas se seleccionan del grupo
formado por fosfatasas o peroxidasas.
18. Sistema según la reivindicación 4,
caracterizado porque la capa de absorbente o de parada (10)
es de algodón.
19. Sistema según la reivindicación 4,
caracterizada porque el soporte (11) es de poliestireno,
impregnado con una sustancia adhesiva donde se colocan la membrana
y las diferentes capas.
20. Procedimiento para la detección de
antibióticos en alimentos caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- a.
- preparación del sistema de detección de antibióticos en alimentos de las reivindicaciones 1 a 19;
- b.
- preparación de la muestra a analizar; y
- c.
- detección de antibióticos.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque la preparación del sistema de detección
comprende las etapas de:
- a.
- inmovilizar una sustancia conjugada y un control sobre una membrana (7);
- b.
- adherir a un soporte (11) la membrana (7);
- c.
- adicionar un anticuerpo primario específico a la capa (6);
- d.
- adherir la capa (6) por encima de la membrana (7) y por encima del soporte (11);
- e.
- adherir una capa de muestra (5) sobre la capa de anticuerpo primario específico (6);
- f.
- adherir a la membrana (7) y al soporte (11) una capa de absorbente o de parada (10);
- g.
- encajar la tira reactiva (2) en la capa interna de una de las dos capas de la carcasa (1); y
- h.
- sellar las dos capas de la carcasa (1) con la tira reactiva (2) en su interior.
22. Procedimiento según la reivindicación 21,
caracterizado porque el conjugado y el control están a
concentración desde 0,05 a 2 \mul/cm, preferentemente desde 0,5 a
1,5 \mul/cm y más preferentemente a una concentración de 1
\mul/cm.
23. Procedimiento según la reivindicación 21,
caracterizado porque el anticuerpo primario está a una
concentración desde 0,1 a 2,5 mg/ml, preferentemente desde 0,25 a
1,5 mg/ml y más preferentemente a 0,5 mg/ml.
24. Procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque la etapa de preparación de la muestra a
analizar comprende las etapas de:
- a.
- disolver la muestra en un disolvente;
- b.
- agitar; y
- c.
- extraer alícuota.
25. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque el disolvente es una solución
salina.
26. Procedimiento según la reivindicación 25,
caracterizado porque la solución salina es de acetato sódico
o de tampón fosfato.
27. Procedimiento según la reivindicación 25,
caracterizado porque se añaden entre 5 y 20 mL,
preferentemente entre 10 y 15 mL, y más preferentemente 12,5 mL de
solución salina de concentración 0.1 M en el rango de pH 2 a 7,
preferentemente a pH 5 para la detección del sulfatiazol y 100 mM,
en el rango de pH 4 a 9, preferentemente a pH 7,5 para la detección
del oxitetraciclina.
28. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque la muestra es de miel.
\newpage
29. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque se disuelven desde 0,5 a 3 gramos de
muestra, preferentemente desde 1 a 2 gramos y más preferentemente
1,25 gramos.
30. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque se extraen desde 80 a 150 \mul de
extracto, preferentemente 100 \mul.
31. Procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque comprende las etapas de:
- a.
- adicionar el extracto de muestra por la hendidura (3);
- b.
- reaccionar durante 5 minutos; y
- c.
- visualizar el resultado a través de la ventana (4).
32. Procedimiento según la reivindicación 31,
caracterizado porque se adicionan desde 80 a 150 \mul de
extracto, preferentemente 100 \mul.
33. Uso del sistema descrito en las
reivindicaciones 1 a 19, para detectar antibióticos en la miel.
34. Uso del sistema según la reivindicación 33,
para detectar oxitetraciclina o sulfatiazol en miel.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801537A ES2306626B1 (es) | 2008-05-23 | 2008-05-23 | Sistema para la deteccion de antibioticos en alimentos. |
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|---|---|---|---|
| ES200801537A ES2306626B1 (es) | 2008-05-23 | 2008-05-23 | Sistema para la deteccion de antibioticos en alimentos. |
Publications (2)
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|---|---|
| ES2306626A1 ES2306626A1 (es) | 2008-11-01 |
| ES2306626B1 true ES2306626B1 (es) | 2009-10-15 |
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|---|---|---|---|
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| ES (1) | ES2306626B1 (es) |
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|---|---|---|---|---|
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| DE69840657D1 (de) * | 1997-07-16 | 2009-04-23 | Charm Sciences Inc | Verfahren zum Nachweis eines Restanalyts in einer Probe |
| WO2007024735A2 (en) * | 2005-08-19 | 2007-03-01 | Charm Sciences, Inc. | Method and antibodies for detecting nitrofuran |
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