ES2573787T3 - Dispositivo para la determinación de por lo menos un analito susceptible de estar contenido en una muestra líquida - Google Patents

Dispositivo para la determinación de por lo menos un analito susceptible de estar contenido en una muestra líquida Download PDF

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Abstract

Dispositivo para la determinación de la presencia y/o de la cantidad de por lo menos un analito susceptible de estar contenido en una muestra líquida, que comprende un medio de difusión capilar (2) en el cual dicha muestra líquida está destinada a migrar lateralmente según una dirección y un sentido de migración capilar, y en el cual se materializan, en dicho sentido de migración capilar de aguas arriba hacia aguas abajo, por lo menos: - una zona (3) de depósito de la muestra líquida, - una zona aguas arriba (4) de liberación que comprende por lo menos un reactivo de detección conjugado con 10 un marcador visible y/o medible, siendo dicho reactivo de detección apto para desplazarse como consecuencia de la migración de la muestra líquida en dicho medio de difusión capilar, y - por lo menos dos zonas de captura (5) que comprenden cada una por lo menos un reactivo de captura, inmovilizado en dicho medio de difusión capilar, caracterizado por que dicho dispositivo (1) comprende también por lo menos una zona aguas abajo de liberación (6) que está materializada sobre dicho medio de difusión capilar (2) y que se sitúa aguas abajo de una por lo menos de dichas zonas de captura (5), estando cada una de dicha o dichas zonas aguas abajo de liberación (6) intercaladas entre dos zonas de captura (5), comprendiendo dicha zona aguas abajo de liberación (6) también por lo menos un reactivo de detección conjugado con un marcador visible y/o medible, siendo dicho reactivo de detección apto para desplazarse como consecuencia de la migración de la muestra líquida en el medio de difusión capilar (2), y por que el reactivo de detección de una zona de liberación (4, 6) y/o el reactivo de captura de la o de las zonas de captura (5) complementarias, situadas directamente aguas abajo de dicha zona de liberación (4, 6), son aptas para unirse específicamente con dicho analito y/o unirse específicamente el uno con el otro, para formar un complejo que permite la determinación de dicho analito en dicha muestra líquida a nivel de dicha o de dichas zonas de captura (5) complementarias.

Description

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DESCRIPCION
Dispositivo para la determinacion de por lo menos un analito susceptible de estar contenido en una muestra liquida Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un dispositivo para la determinacion de por lo menos un analito susceptible de estar contenido en una muestra liquida.
La invencion se refiere en particular a los dispositivos que utilizan una tecnica inmunocromatografica mediante migracion lateral.
Tecnica anterior
La mayorfa de las tecnicas para la determinacion de analito(s) han evolucionado progresivamente hacia unos dispositivos cada vez mas faciles de usar, que permiten el desarrollo de metodos de diagnostico de rutina, rapidos y de un coste moderado.
Esta evolucion ha sido particularmente perceptible en el campo medico, con la emergencia del diagnostico por "point of care" o "home testing", en el que un diagnostico se realiza directamente cerca de la cama del paciente o en su domicilio, sin que sea necesario utilizar tecnicas automatizadas de laboratorio de analisis.
Los inmunoensayos forman parte de las tecnologfas utilizadas para este tipo de diagnostico rapido.
Estos inmunoensayos agrupan los dispositivos y metodos de diagnostico basados en reacciones de uniones por afinidad entre miembros de pares de uniones especfficas.
Globalmente, estos inmunoensayos estan divididos en dos grandes enfoques bien conocidos.
En el enfoque denominado "competicion" el analito buscado y un reactivo de deteccion marcado estan en competicion para unirse especfficamente a un reactivo de captura. La presencia o la ausencia del analito buscado en la muestra se miden, respectivamente, por la ausencia o por la presencia de una senal visible (o medible) a nivel del reactivo de captura.
En el enfoque denominado "sandwich", un reactivo de deteccion marcado se une al analito buscado, siendo este ultimo inmovilizado sobre el soporte solido por medio del reactivo de captura. La presencia o ausencia del analito en la muestra liquida se miden, respectivamente, por la presencia o por la ausencia de una senal visible (o medible) a nivel del reactivo de captura.
Entre estos inmunoensayos, se conocen unos dispositivos denominados "inmunocromatograficos" que se prestan particularmente a ciertos analitos.
La inmunocromatograffa consiste en un metodo de diagnostico en fase solida, que utiliza la qufmica seca y la migracion lateral sobre una membrana inerte.
Este tipo de imnunoensayo utiliza un soporte poroso en forma de tira, en y/o sobre el cual se integran en forma seca los reactivos necesarios para la realizacion de la prueba.
El soporte poroso se trata de manera que una reaccion de reconocimiento entre pares de union especffica (generalmente antfgeno/anticuerpo) se produzca a nivel de una zona de captura y pueda ser revelada a este nivel.
En la practica, cuando la muestra liquida a analizar se deposita sobre el soporte, esta migra a lo largo de la membrana por un fenomeno de capilaridad. El analito buscado es generalmente capturado por un reactivo de captura especffico inmovilizado sobre una zona determinada de la membrana.
La reaccion se revela mediante un reactivo de deteccion especffico marcado, segun el principio del metodo sandwich.
Es posible asimismo utilizar una reaccion de tipo competicion. Se utiliza en este caso, generalmente, un reactivo de deteccion que consiste en un analito marcado que es competidor del analito buscado para la union especffica con el reactivo de captura inmovilizado.
Estos dispositivos inmunocromatograficos estan generalmente adaptados para un uso unico y domestico. En efecto, son de uso facil y rapido, requiriendo muy poca manipulacion ya que todos los reactivos estan integrados o comprendidos en el dispositivo.
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Sin embargo, en algunas situaciones particulares, estos dispositivos inmunocromatograficos son susceptibles de dar unos resultados que no son totalmente fiables.
Por un lado, en la determinacion de un analito por un ensayo en formato "sandwich" se observa para algunos analitos un efecto denominado de "gancho" (designado tambien por "hook effect" en ingles).
El efecto de gancho es un efecto indeseable bien conocido en los ensayos inmunologicos. Se produce cuando el analito esta presente en la muestra a una concentracion muy elevada.
El efecto de gancho puede entonces conducir a falsos negativos, lo cual lleva a concluir de manera aberrante la ausencia o una baja concentracion del analito en la muestra.
Los analitos que presentan un efecto de gancho en dosificaciones inmunologicas de tipo sandwich generan unas curvas senal/concentracion de tipo curva de Gauss.
Para una senal dada, son posibles entonces dos concentraciones para el analito buscado, una baja y la otra elevada, cuando tiene lugar la lectura del resultado en un tiempo definido.
Un ensayo por competicion permite la obtencion de dos senales diferentes para dos concentraciones respectivamente diferentes del analito a ensayar.
Sin embargo, los ensayos por competicion muestran tambien muy rapidamente sus lfmites, ya que existe una extincion de la senal a concentraciones relativamente poco elevadas del analito de interes.
Una solucion comunmente adoptada para remediar los inconvenientes de estos ensayos de sandwich y de competicion consiste en analizar el analito a partir de un intervalo de dilucion de la muestra lfquida.
Sin embargo, la utilizacion de un intervalo de dilucion de este tipo no es conveniente para un uso domestico. Ademas, la utilizacion de un intervalo de dilucion de la muestra necesita unas manipulaciones suplementarias y un consumo incrementado de dispositivos de ensayo de uso unico, ya que cada muestra se ensaya a diferentes diluciones.
Una solucion para este efecto esta, por ejemplo, descrita en el documento WO 2007/023372, que se refiere a un dispositivo de determinacion de un analito en una muestra lfquida, que comprende un medio de difusion capilar en el que se materializan:
a) una zona de deposito o recepcion de la muestra;
b) una zona aguas arriba de liberacion que comprende un reactivo de deteccion especffico del analito conjugado con un marcador visible y/o medible, libre de migrar por difusion capilar en estado humedo en el medio de difusion capilar; y
c) dos zonas aguas abajo de captura que comprenden, sucesivamente en la direccion de difusion capilar, por un lado, un reactivo de captura especffico del analito y, por otro lado, el analito, o un analogo del analito, inmovilizado.
El reactivo de deteccion y el reactivo de captura, especfficos del analito, permiten la determinacion del analito en la muestra lfquida mediante un ensayo sandwich; este mismo reactivo de deteccion especffico del analito y el analito, o el analogo del analito, inmovilizado, permiten a continuacion la determinacion del analito de interes en la muestra lfquida mediante un ensayo de competicion.
En un dispositivo de este tipo, el reactivo de deteccion se deposita en exceso a nivel de una unica zona de liberacion que esta dispuesta aguas arriba de las zonas de captura complementarias.
A pesar de su interes, los inventores han constatado que este exceso de reactivo de deteccion aguas arriba de las zonas de captura no es satisfactorio, en el sentido en el que es frecuente observar unas reacciones no especfficas, un ruido de fondo pronunciado y unos problemas de migracion.
Por otro lado, ciertos dispositivos inmunocromatograficos estan estructurados para la determinacion simultanea de varios analitos.
Un dispositivo inmunocromatografico de este tipo, por ejemplo descrito en el documento EP 1 657 550, comprende ventajosamente un medio de difusion capilar en el que estan materializados:
a) una zona de deposito o recepcion de la muestra;
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b) una zona aguas arriba de liberacion que comprende una mezcla de reactivos de deteccion especfficos, cada uno de uno de los analitos, conjugados con un marcador visible y/o medible, libres de migrar por difusion capilar en estado humedo en el medio de difusion capilar; y
c) unas zonas aguas abajo de captura que comprenden cada una un reactivo de captura que es especffico de uno de los analitos, estando dichas zonas de captura aguas abajo repartidas sucesivamente segun el sentido de migracion.
De nuevo, los reactivos de deteccion se depositan a nivel de la zona de liberacion unica que esta materializada aguas arriba de las zonas de captura, teniendo en cuenta el sentido de migracion capilar.
Ahora bien, los inventores han constatado de nuevo que esta mezcla de los reactivos de deteccion, aguas arriba de las diferentes zonas de captura, no es satisfactoria debido a reacciones cruzadas entre los diferentes reactivos de deteccion, y tambien de inhibicion de la actividad especffica mutua entre los reactivos.
Los dispositivos inmunocromatograficos que comprenden una zona de liberacion del o de los reactivos de deteccion, que esta dispuesta aguas arriba de una pluralidad de zonas de captura, no son asf satisfactorios.
Existe por lo tanto una necesidad de nuevos dispositivos de determinacion de difusion capilar, tanto para la determinacion de un unico analito como para la determinacion de varios analitos, que permiten paliar los problemas generados en particular por el exceso y/o la mezcla de reactivo(s) de deteccion anadido(s) aguas arriba de una pluralidad de zonas de captura sucesivas.
Descripcion de la invencion
La presente invencion se refiere asf a un dispositivo para la determinacion de la presencia y/o de la cantidad de por lo menos un analito susceptible de estar contenido en una muestra lfquida, que comprende un medio de difusion capilar en el cual dicha muestra lfquida esta destinada a migrar lateralmente segun una direccion y un sentido de migracion capilar, tal como se define en las reivindicaciones.
Se materializan diferentes zonas en este medio de difusion capilar, en dicho sentido de migracion capilar de aguas arriba hacia aguas abajo, a saber por lo menos:
- una zona de deposito de la muestra lfquida,
- una zona aguas arriba de liberacion que comprende por lo menos un reactivo de deteccion conjugado con un marcador visible y/o medible, siendo dicho reactivo de deteccion apto para desplazarse como consecuencia de la migracion de la muestra lfquida en dicho medio de difusion capilar, y
- por lo menos dos zonas de captura que comprenden cada una por lo menos un reactivo de captura, inmovilizado sobre dicho medio de difusion capilar.
Este dispositivo comprende tambien por lo menos una zona aguas abajo de liberacion que esta materializada sobre dicho medio de difusion capilar y que se situa aguas abajo de una por lo menos de dichas zonas de captura.
Esta zona aguas abajo de liberacion comprende tambien por lo menos un reactivo de deteccion conjugado con un marcador visible y/o medible, siendo dicho reactivo de deteccion apto para desplazarse como consecuencia de la migracion de la muestra lfquida en el medio de difusion capilar.
El reactivo de deteccion de una zona de liberacion y/o el reactivo de captura de la o de las zonas de captura complementarias, situadas directamente aguas abajo de dicha zona de liberacion, son entonces aptos para unirse especfficamente con dicho analito y/o unirse especfficamente el uno con el otro, para formar un complejo que permita la determinacion de dicho analito en dicha muestra lfquida a nivel de dicha o de dichas zonas de captura complementarias.
La o las zonas aguas abajo de liberacion estan cada una intercalada entre dos zonas de captura.
De manera general, dicha disposicion tiene en particular el interes de permitir una adaptacion del reactivo de deteccion de una zona de liberacion, en cantidad y/o en especificidad, en funcion del reactivo de captura que constituye la o las zonas de captura situadas directamente aguas abajo de dicha zona de liberacion.
Otras caracterfsticas ventajosas, que pueden ser tomadas en combinacion o independientemente las unas de las otras, se desarrollan a continuacion:
- un grupo aguas arriba de zonas comprende una zona de captura aguas arriba situada directamente aguas abajo de la zona de liberacion aguas arriba, ventajosamente adaptada para un ensayo en formato sandwich,
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estando dicho grupo aguas arriba de zonas seguido a su vez de uno o varios grupos de zonas que comprenden cada uno una zona de liberacion y una o varias zonas de captura complementarias; esta caracterfstica permite optimizar la concentracion y la especificidad del o de los grupos de zonas aguas abajo en funcion de los umbrales de deteccion del o de los analitos a determinar.
Para la determinacion de un unico analito, el o los reactivos de deteccion de las zonas de liberacion y/o el o los reactivos de captura de las zonas de captura son ventajosamente aptos para unirse especfficamente con dicho analito.
En este caso, las zonas de liberacion comprenden preferentemente uno o unos reactivos de deteccion identicos entre si, y las zonas de capturas comprenden preferentemente uno o unos reactivos de captura identicos entre si.
Incluso en este caso, el medio de difusion capilar comprende ventajosamente:
- la zona aguas arriba de liberacion,
- una primera zona de captura o dos primeras zonas de captura, complementaria(s) de dicha zona aguas arriba de liberacion, y despues o bien
- una zona aguas abajo de liberacion, y
- por lo menos dos segundas zonas de captura, complementarias de dicha zona aguas abajo de liberacion, o bien por lo menos dos pares sucesivos de zonas que comprenden cada una:
- una zona de liberacion, y
- por lo menos una zona de captura, complementaria de dicha zona de liberacion asociada.
Para la deteccion de por lo menos dos analitos, los reactivos de deteccion de una zona de liberacion y/o el reactivo de captura de la o de las zonas de captura complementarias, inmediatamente aguas abajo de dicha zona de liberacion, son ventajosamente aptos para unirse especfficamente con uno de dichos analitos.
Segun tambien otras caracterfsticas ventajosas, que pueden ser tomadas en combinacion o independientemente las unas de las otras:
- la o las zonas aguas abajo de liberacion materializadas sobre el medio de difusion capilar, cada una
intercalada entre dos zonas de captura, estan en numero de 1 a 4, por ejemplo en numero de 2 para un
formato de soporte capilar estandar de 25 mm;
- la o las zonas de captura materializadas sobre el medio de difusion capilar, complementarias de una de las zonas de liberacion situada directamente aguas arriba, estan en numero de 1 a 10, preferentemente en numero de 5 para un formato de soporte capilar estandar de 25 mm;
- el reactivo de deteccion de una por lo menos de las zonas de liberacion y el reactivo de captura de la o de
una de zonas de captura complementarias son aptos para unirse especfficamente con el analito o uno por lo
menos de los analitos, para constituir un ensayo en formato sandwich;
- el reactivo de deteccion de una por lo menos de las zonas de liberacion y el reactivo de captura de la o de una por lo menos de las zonas de captura complementarias consisten, uno, en un analogo del analito a determinar y, el otro, en un reactivo apto para unirse especfficamente con dicho analito o con dicho analogo del analito, para constituir un ensayo en formato competicion;
- la zona de deposito de la muestra lfquida (i) se fusiona con la zona aguas arriba de liberacion o (ii) se situa aguas arriba de la zona aguas arriba de liberacion.
La presente invencion se refiere asimismo a un procedimiento para la determinacion cuantitativa de un analito en una muestra lfquida depositada en un dispositivo de determinacion; este procedimiento comprende las etapas sucesivas siguientes:
- una etapa de medicion de la intensidad de la senal a nivel de cada zona de captura,
- en cada grupo de zonas, una etapa de adicion de dichas intensidades medidas,
- una etapa de calculo de una relacion de intensidad que corresponde a las intensidades anadidas para un grupo de zonas con respecto a las intensidades anadidas para otro grupo de zonas, y
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- una etapa de asociacion de dicha relacion de intensidad calculada a un valor cuantitativo del analito en dicha muestra lfquida teniendo en cuenta una curva patron que corresponde a la relacion de intensidad calculada en funcion de una cantidad de analito en dicha muestra lfquida.
Figuras
La presente invencion se ilustrara tambien, sin estar de ninguna manera limitada, por la descripcion siguiente de diferentes dispositivos de acuerdo con la invencion, en relacion con los dibujos adjuntos, en los que:
- la figura 1 representa, de manera esquematica, un primer dispositivo segun la invencion para la determinacion de un unico analito, que comprende dos grupos de zonas compuestos cada uno por una zona de liberacion y por una zona de captura;
- la figura 2 representa, tambien de manera esquematica, un segundo dispositivo segun la invencion, para la determinacion de un unico analito que comprende un primer grupo de zonas compuesto por una zona de liberacion y por una zona de captura, y despues un segundo grupo de zonas compuesto por una zona de liberacion seguida de varias zonas de captura;
- la figura 3 ilustra, tambien de manera esquematica, un tercer dispositivo segun la invencion para la determinacion de un unico analito, que comprende varios grupos de zonas compuestos por una zona de liberacion y por una zona de captura;
- la figura 4 muestra, tambien de manera esquematica, un cuarto dispositivo segun la invencion para la determinacion de dos analitos, que comprende dos grupos de zonas compuestos cada uno por una zona de liberacion y por una zona de captura, dedicadas cada una a uno de dichos analitos;
- la figura 5 representa, todavfa de manera esquematica, un quinto dispositivo segun la invencion para la determinacion de varios analitos, que comprende varios grupos de zonas compuestos cada uno por una zona de liberacion y por dos zonas de captura, dedicadas cada una a uno de los analitos.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere asf a un dispositivo para la determinacion de por lo menos un analito susceptible de estar contenido en una muestra lfquida.
La estructura general de este dispositivo segun la invencion se ilustra muy esquematicamente a traves de los diversos modos de realizacion representados en las figuras 1 a 5 antes citadas.
De manera general, las referencias numericas empleadas se conservan para designar los elementos estructurales identicos o similares durante la descripcion de los diferentes modos de realizacion.
Tal como se representa en las figuras 1 a 5, cada dispositivo 1 comprende un medio de difusion capilar 2 en el que dicha muestra lfquida (no representada) esta destinada a ser depositada y despues a migrar lateralmente segun una direccion y un sentido de migracion capilar aguas arriba hacia aguas abajo.
La direccion y el sentido de migracion se ilustran esquematicamente mediante la flecha designada por la referencia A en la figura 1.
De manera general, los conceptos de "aguas arriba y "aguas abajo" se refieren a esta direccion y a este sentido de migracion de la muestra lfquida en la longitud del medio de difusion capilar 2.
Se materializan diferentes zonas sucesivas en este medio de difusion capilar 2, en dicho sentido de migracion capilar aguas arriba hacia aguas abajo A, a saber por lo menos:
- una zona 3 para el deposito de la muestra lfquida,
- una zona aguas arriba de liberacion 4 que comprende por lo menos un reactivo de deteccion conjugado con un marcador visible y/o medible, siendo dicho reactivo de deteccion apto para desplazarse como consecuencia de la migracion de la muestra lfquida en dicho medio de difusion capilar 2, y
- por lo menos dos zonas de captura 5 que comprenden cada una por lo menos un reactivo de captura, inmovilizado sobre dicho medio de difusion capilar.
Segun la invencion, este dispositivo 1 comprende tambien por lo menos una zona suplementaria de liberacion 6, que se materializa sobre dicho medio de difusion capilar 2 y que se situa aguas abajo de una por lo menos de dichas zonas de captura 5.
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Esta zona suplementaria de liberacion 6, aguas abajo, comprende tambien por lo menos un reactivo de deteccion conjugado con un marcador visible y/o medible, siendo dicho reactivo de deteccion apto para desplazarse como consecuencia de la migracion de la muestra lfquida en el medio de difusion capilar.
El medio de difusion capilar 2 comprende asf varios grupos sucesivos de zonas 7 que se componen cada uno por lo menos por dos zonas sucesivas:
- una zona de liberacion 4 o 6, aguas arriba, y
- una o varias zonas de captura 5, denominada "complementaria" situadas directamente aguas abajo de dicha zona de liberacion 4, 6 asociada.
El reactivo de deteccion de una zona de liberacion 4, 6 y/o el reactivo de captura de la o de las zonas de captura complementarias 5 se seleccionan para unirse especfficamente con dicho analito y/o unirse especfficamente el uno con el otro.
Este enfoque asegura la formacion de complejo(s) que permite(n) la determinacion de dicho analito en dicha muestra lfquida a nivel de dicha o dichas zonas de captura complementarias 5.
Los reactivos de deteccion y de captura de cada grupo de zonas 7 se seleccionan en particular mediante la realizacion de ensayos inmunologicos en formato sandwich y/o en formato competicion.
La presencia de zona(s) adicional(es) de liberacion 6 permite asf una distribucion optima del o de los reactivos de deteccion dentro de cada grupo de zonas 7, que pueden entonces estar dispuestas con respecto a las diferentes zonas de captura 5 asociadas.
El reactivo de deteccion dentro de cada zona de liberacion 4, 6 se puede ajustar asf, en cantidad y en especificidad, con respecto a la o a las zonas de captura 5 complementarias, situadas directamente aguas abajo.
De manera general, el dispositivo segun la presente invencion permite la determinacion de analito(s) tanto muy poco concentrado(s) como muy altamente concentrado(s), en una muestra lfquida sin obtener resultados falsos positivos o falsos negativos.
Ademas, el dispositivo segun la presente invencion puede estar estructurado para la dosificacion semi-cuantitativa de un analito o de varios analitos en una muestra lfquida.
El dispositivo segun la invencion esta particularmente adaptado para el analisis de analitos que presentan un efecto de gancho importante, como la hormona del embarazo (hCG), el antfgeno prostatico especffico (PSA o "Prostate- Specific Antigen") y la hemoglobina (por ejemplo para una deteccion de hemoglobina en las heces, denominado tambien ensayo "FOB" por "Fecal Occult Blood").
Las otras ventajas de la invencion, relacionadas con la presencia de varias zonas de liberacion, son en particular:
- una optimizacion de los reactivos de deteccion y de los reactivos de captura en funcion de las concentraciones diana a detectar,
- un grado de precision mas elevado.
Como consecuencia de los dos puntos anteriores, se obtiene un aumento de la sensibilidad y de la especificidad del dispositivo de determinacion, asf como del valor de interpretacion de la senal visible y medible.
Los diferentes aspectos de la presente invencion se presentan mas en detalle a continuacion.
Analito(s) y muestra lfquida
Por "analito" se entiende cualquier entidad qufmica, bioqufmica o biologica, que se desea detectar en una muestra.
Esta unidad qufmica consiste ventajosamente en una entidad procedente del mundo vivo, preferentemente del mundo vegetal o del mundo animal, preferentemente tambien presente en el ser humano.
Entre los analitos detectados por los dispositivos y los procedimientos segun la presente invencion, se citaran en particular las protefnas, los peptidos, los anticuerpos, las hormonas, los esteroides, los antfgenos derivados de agentes infecciosos o de celulas tumorales, los agentes infecciosos tales como las bacterias, los virus, o los parasitos, los acidos nucleicos (ADN o ARN), los compuestos terapeuticos, los profarmacos o tambien los antibioticos.
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El analito se selecciona en particular de entre los conocidos por generar un efecto de gancho durante su deteccion mediante tecnica inmunocromatografica.
Por "efecto de gancho" (o "Hook effect" en ingles), se entiende en particular un resultado falso negativo obtenido mediante la tecnica inmunocromatografica, que concluye de manera aberrante en la ausencia del analito en la muestra, que aparece cuando el analito esta presente en la muestra a una concentracion muy elevada.
Generalmente, el efecto de gancho produce un debilitamiento de la senal de respuesta, visible y medible, inversa al aumento de la concentracion de analito a determinar, que conduce (i) a una senal identica (de misma intensidad) para dos concentraciones diferentes, una baja y la otra alta, y (ii) una inhibicion de la senal para una concentracion de analito extremadamente alta.
Por ejemplo, en la mayorfa de los ensayos inmunocromatograficos dedicados a la hormona hCG, el efecto de gancho empieza alrededor de 5000 mlU/ml y seguira hasta aproximadamente 250000 mlU/ml, lo que implica una intensidad de la senal identica, en particular para una concentracion baja (25 mlU/ml) y alta (200000 mlU/ml).
A este respecto, el analito se selecciona asf ventajosamente de entre la hormona corionica gonadotropica (o "hCG"), el antfgeno prostatico especffico (PSA o "Prostate-Specific Antigen"), la hemoglobina, el FOB ("Fecal occult blood"), los marcadores oncogenicos (tales como ferritina, AFP (alfa feto-protefna), CA15-3/CA27.29 (cancer de mama), CA19-9 (cancer pancreatico), CA-125 (cancer de ovarios)), la protefna C-reactiva ("CRP" o "C Reactive Protein"), la troponina I ("TNI" o "Troponin I"), unos marcadores cardiacos (tales como troponina T, CK-MB, mioglobina, peptido natriuretico de tipo B (t-BNP)), los DOA (por "drugs of abuse"), los biomarcadores para el seguimiento de terapia ("Therapy monitoring biomarkers") (TnF-alfa (factor de necrosis tumoral), otras terapias asociadas a biomarcadores oncogenicos circulantes, otros biomarcadores celulares, intracelulares o tejidos especfficos, etc), la hormona luteinizante ("LH") o la hormona foliculoestimulante ("FSH").
En funcion de su estructura, los dispositivos segun la presente invencion permiten la determinacion de un analito unico (mono-analito) o la determinacion de varios analitos (poli-, o multi- o pluri-analitos).
Por "varios analitos" se entiende por lo menos dos analitos, mas preferentemente 2, 3, 4 o 5 analitos.
Este enfoque multi-analitos puede ser interesante para el estudio de las enfermedades autoinmunes ("Auto immune disease panel") para el estudio de las alergias ("Allergies panel"), para el seguimiento de las terapias ("therapy monitoring") en el campo del medicamento, de la toxicologfa, de la respuesta del paciente a un tratamiento o marcadores inflamatorios, para los ensayos de diagnostico de infeccion multiple (por ejemplo virus de la inmunodeficiencia humana o VIH/hepatitis C/hepatitis B).
Por ejemplo, el dispositivo segun la invencion se puede adaptar para la determinacion de diferentes anticuerpos en una misma muestra lfquida, a saber por ejemplo anti-VIH (virus de la inmunodeficiencia humana o VIH), anti-HCV (virus de la hepatitis C), anti-HB (marcador de la hepatitis viral cronica), anti-TB (tuberculosis).
Por "muestra lfquida" se entiende cualquier muestra en la que el analito buscado esta en solucion o en suspension.
Esta muestra lfquida puede ser en particular cualquier fluido biologico o corporal.
La muestra lfquida puede tambien ser obtenida directa o indirectamente a partir de un fluido biologico o corporal.
La muestra puede tambien ser un extracto lfquido de una muestra solida.
Tfpicamente, la muestra lfquida es orina, sangre total, plasma o suero.
En algunos procedimientos segun la presente invencion, se utiliza un diluyente cuando la muestra lfquida es plasma, suero o sangre total por ejemplo.
El diluyente se deposita sobre el soporte solido poroso con la muestra. Alternativamente, el diluyente se deposita sobre el soporte solido poroso antes o despues de la muestra.
Este diluyente migra en el soporte solido, conllevando, o facilitando la migracion de la muestra en el soporte poroso, con el reactivo de deteccion marcado.
Tfpicamente, este diluyente esta compuesto por una solucion salina tamponada, puede tambien comprender un detergente o cualquier otro componente necesario para la reaccion.
El dispositivo segun la invencion es interesante por que puede ser adecuado tanto para la determinacion de la presencia de por lo menos un analito como para la determinacion de su cantidad.
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Por "detectar" o "determinar" se entiende asf la determinacion cualitativa (ventajosamente la presencia o la ausencia) de uno o varios analitos en una muestra lfquida.
Por "detectar" o "determinar" se entiende tambien la medicion y la cuantificacion de uno o varios analitos en una muestra.
En efecto, los rendimientos de los dispositivos y procedimientos segun la invencion permiten tambien unos modos de realizacion para la realizacion de mediciones cuantitativas o semi-cuantitativas de un analito o de por lo menos dos analitos diferentes en una muestra lfquida.
Medio de difusion capilar
Segun la presente invencion, se entiende por "medio de difusion capilar 2", cualquier medio que constituye o que actua como unidad de difusion capilar continua, por migracion lateral (es decir perpendicularmente al grosor del o de los materiales capilares utilizados para la difusion capilar).
Este medio de difusion capilar consiste ventajosamente en un soporte solido poroso que permite la migracion de un lfquido por simple difusion capilar.
La porosidad de este soporte permite la difusion capilar (o migracion lateral) de la muestra y/o de los reactivos en estado lfquido o humedo.
Unos medios de difusion capilar de este tipo se utilizan ampliamente en todas las tecnicas de inmunocromatograffa de migracion lateral en particular.
Un medio de difusion capilar de este tipo es, por ejemplo, un soporte alargado segun la direccion y/o el sentido de la difusion capilar (migracion lateral).
Este medio de difusion capilar esta constituido por:
- un solo y unico material capilar o poroso, o
- varios elementos o materiales capilares o porosos diferentes, convenientemente dispuestos los unos con respecto a los otros (por ejemplo por superposicion), para obtener una continuidad de flujo capilar de un elemento o de un material a otro, segun la direccion de difusion capilar.
Un medio de difusion capilar de este tipo determina una direccion y sentido de difusion capilar de cualquier lfquido que es recibido o depositado en un extremo aguas arriba, y que se desplaza entonces hacia un extremo aguas abajo de dicho medio.
La difusion capilar considerada segun la presente invencion, tambien denominada "inmunocromoatograffa por migracion lateral" se debe distinguir de la utilizada en las tecnicas de inmunofiltracion, segun las cuales los lfquidos pasan por el grosor del o de los materiales de filtracion, porosos.
A tftulo de ejemplo, estos medios de difusion capilar pueden estar constituidos por diversos soportes inmunocromatograficos, por ejemplo de celulosa, de nylon, de nitrocelulosa, de polietileno o de fibra de vidrio.
El medio de difusion capilar puede estar constituido por una o varias partes distintas. Las diferentes partes del soporte pueden estar constituidas por materiales diferentes. Cuando el medio de difusion capilar esta constituido por diferentes partes o por diferentes materiales, estos elementos estan dispuestos de tal manera que permitan la continuidad del flujo capilar en el medio de difusion capilar.
Tfpicamente, el medio de difusion capilar esta constituido por un soporte solido poroso alargado segun la direccion de difusion capilar. Preferentemente, el medio de difusion capilar de los dispositivos segun la invencion comprende un soporte solido poroso en forma de tira inmunocromatografica.
El medio de difusion capilar se presenta por ejemplo en forma de una tira inmunocromatografica constituida por varias tiras superpuestas o solapadas.
El dispositivo segun la invencion puede estar, por ejemplo, constituido por una tira cromatografica fijada sobre un soporte rfgido.
El soporte rfgido puede estar constituido por materiales diversos tales como carton, carton plastificado o mas preferentemente por materiales plasticos. Preferentemente, el soporte rfgido esta constituido por poliestireno.
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Ventajosamente, el medio de difusion capilar puede estar incorporado en un soporte de agarre. Este soporte de agarre facilita la manipulacion del medio de difusion capilar, y puede tambien proteger este, en particular de la humedad.
El soporte de agarre puede recubrir parcial o totalmente el medio de difusion capilar.
El soporte de agarre puede estar constituido por materiales diversos tales como carton, carton plastificado o, mas preferentemente, materiales plasticos. De manera ventajosa, el soporte de agarre esta constituido por un material rfgido e impermeable.
Estos soportes de agarre o cajas estan descritos en particular en las patentes WO-2007/023372, EP-0 291 194, EP 0 560 411, EP-0 560 410 y EP-1 091 808.
Habitualmente, el soporte de agarre esta en forma de caja.
Este soporte de agarre esta ventajosamente provisto de por lo menos una ventana de observacion que permite observar las zonas de captura.
Estas ventanas de observacion estan ventajosamente dispuestas de manera que ofrezcan un acceso visual directo unicamente a las zonas de captura a analizar para la determinacion de un analito, o, llegado el caso, para la determinacion de por lo menos dos analitos.
Zona de deposito
La zona de deposito 3 corresponde a una zona aguas arriba del medio de difusion capilar 2 sobre la cual se anade la muestra lfquida.
Esta zona de deposito puede cooperar con un elemento de captacion realizado en un material absorbente.
Este elemento de captacion puede ser puesto directamente en contacto con un flujo de orina, por ejemplo.
Como se describe en el documento WO-00/00288, el elemento de captacion puede ser movil entre dos posiciones, una de recogida de la muestra lfquida, separada del medio de difusion capilar, y la otra en continuidad o en contacto capilar con la zona de deposito del medio de difusion capilar.
En un modo de realizacion de la invencion, el medio de difusion capilar puede comprender una zona de deposito o de recogida de la muestra, sobresaliente con respecto al soporte de agarre, para la recepcion de la muestra lfquida.
En otro modo de realizacion de la invencion, el soporte de agarre o la caja comprenden por lo menos una abertura para el deposito de la muestra lfquida.
Reactivo de deteccion y reactivo de captura
En su longitud, el medio de difusion capilar 2 comprende, por un lado, por lo menos un reactivo de deteccion distribuido para materializar las zonas de liberacion 4, 6 y, por otro lado, por lo menos un reactivo de captura para materializar las zonas de captura 5.
Por "zona de liberacion" o "zona de captura", descritas mas en detalle a continuacion, se entiende una parte localizada y delimitada del medio de difusion capilar 2 en la que se ha depositado una cantidad de por lo menos un reactivo de deteccion o de por lo menos un reactivo de captura, respectivamente.
Cada una de las zonas de liberacion 4, 6 y zonas de captura 5 consiste ventajosamente en una lfnea o banda transversal (que se extiende perpendicularmente a la direccion de migracion), que presenta por ejemplo una anchura comprendida entre 1 y 2 mm, y una superficie comprendida entre 3 y 5 mm2.
De manera general, el "reactivo de deteccion" o el "reactivo de captura" consiste en cualquier entidad qufmica, bioqufmica o biologica, capaz de unirse especfficamente para formar un complejo que permite la determinacion de dicho analito en la muestra lfquida.
El reactivo de deteccion y/o el reactivo de captura constituyen tambien unos reactivos denominados de "union".
Unos reactivos de union de este tipo, que permiten la determinacion del analito o de varios analitos en la muestra lfquida, son bien conocidos y se pueden seleccionar para la realizacion de la invencion.
Estos reactivos de union se seleccionan ventajosamente de entre los que son capaces de unirse especfficamente con dicho analito y/o unirse especfficamente el uno con el otro.
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Segun el formato de ensayo utilizado, los reactivos de union complementarios estan destinados a formar unos complejos diferentes:
- los reactivos de union son capaces de fijarse concomitantemente al analito, para formar un ensayo en formato sandwich,
- uno de los reactivos de union (deteccion o captura) es capaz de fijarse al analito pero tambien al otro reactivo de union (respectivamente captura o deteccion), para formar un ensayo en formato competicion.
En este ambito, uno por lo menos de los reactivos de union se selecciona ventajosamente de entre las entidades qufmicas, bioqufmicas o biologicas, capaces de unirse especfficamente con el analito y/o unirse especfficamente con un analogo del analito.
Por "unir" o "union" se entiende cualquier enlace fuerte, por ejemplo covalente, pero tambien cualquier enlace debil, por ejemplo de tipo antfgeno/anticuerpo o analito/anti-analito.
Por "anti-analito" se entiende cualquier entidad qufmica, bioqufmica o biologica, susceptible de unirse especfficamente con el analito, o con el reactivo de captura en competicion con el analito, por ejemplo un anticuerpo, un antfgeno o un acido nucleico.
Por "analogo adecuado del analito" se entiende ventajosamente cualquier entidad qufmica, bioqufmica o biologica, capaz de unirse de manera especffica al reactivo de captura o al reactivo de deteccion, segun el caso, en competicion con el analito.
Los reactivos de union se seleccionan ventajosamente de entre los anticuerpos, los antfgenos o los acidos nucleicos.
El analito y el reactivo de union forman asf tfpicamente un par capaz de unirse especfficamente el uno con el otro, como por ejemplo un par ligando/anti-ligando, un par antfgeno/anticuerpo, un par ADN/ARN o un par ADN/ADN.
Asf, si el analito es un antfgeno o un hapteno, uno por lo menos de los reactivos de union (el reactivo de deteccion y/o el reactivo de captura) es ventajosamente un anticuerpo especffico del analito.
Por "anticuerpo especffico del analito" se entiende un anticuerpo capaz de unirse especfficamente con el analito en una union de tipo antfgeno/anticuerpo.
Se trata tfpicamente de un anticuerpo policlonal o de un anticuerpo monoclonal, que tiene una fuerte afinidad para el analito. Preferentemente, se trata de un anticuerpo monoclonal.
Si el analito es un anticuerpo, uno por lo menos de los reactivos de union es ventajosamente el antfgeno reconocido por el anticuerpo.
Si el analito es un acido nucleico, uno por lo menos de los reactivos de union es ventajosamente una sonda ADN complementaria.
El o los reactivos de deteccion se conjugan ventajosamente con un marcador visible y/o medible, ventajosamente un marcador particular.
Por "marcador visible y/o medible" se entiende cualquier marcado que permite una deteccion directa o indirecta a simple vista, o con la ayuda de un aparato, debido a la emision de una senal a nivel de las zonas de captura.
La senal es, por ejemplo, una fluorescencia, una coloracion, una presencia de isotopo o una senal magnetica.
Se citaran, por ejemplo, los marcadores particulares coloreados como el oro coloidal, o fluorescentes, las partfculas de latex coloreadas, las partfculas de latex fluorescentes y las partfculas conjugadas con la avidina y la estreptavidina.
Los marcadores particulares, coloreados o fluorescentes, consisten asf en partfculas de pequeno tamano insolubles en agua y que forman por lo tanto suspensiones, dispersiones o soluciones, en fase lfquida.
Entre los marcadores que permiten una observacion directa a simple vista, se citaran tambien los marcadores de tipo dextrano (Hansen T.M., IVD Technology 4, 35-40, 2003). El reactivo de union se conjuga entonces con una cadena de dextrano (derivado de polisacarido) que lleva fluoroforos.
Los marcadores pueden tambien consistir en unas enzimas (la fosfatasa alcalina o AP, la peroxidasa de rabano
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picante o HRP, en particular), en colorantes (o "dyes") o en compuestos quimioluminiscentes (en particular isotiocianato de fluorescema o FITC).
Para aumentar la sensibilidad, se puede haber recurrido, por ejemplo, a un anticuerpo marcado segun unas tecnicas conocidas por el experto en la materia para una deteccion indirecta, como por ejemplo un anticuerpo biotinilado, que permite indirectamente una deteccion mediante la formacion de las entidades avidina-biotina y estreptavidina-biotina.
Este anticuerpo marcado y biotinilado puede tambien o bien ser directamente ya depositado sobre una lmea de ensayo, en la zona de captura, para aumentar la sensibilidad, o bien ser depositado con el anticuerpo de deteccion espedfico, para aumentar el tiempo de contacto y tambien la sensibilidad, en particular, por ejemplo, debido al numero de sitios de fijacion.
Por su parte, el reactivo de captura espedfico del analito se inmoviliza sobre el soporte solido segun unas tecnicas conocidas por el experto en la materia.
Este reactivo de captura se inmoviliza de tal manera que no sea movil en estado humedo.
Esta inmovilizacion puede efectuarse, por ejemplo, por absorcion o por un acoplamiento covalente.
Composicion de los grupos de zonas sucesivas
El medio de difusion capilar 2 comprende asf una o varias zonas de captura 5 que son complementarias de una zona de liberacion 4, 6 situada directamente aguas arriba (teniendo en cuenta el sentido de migracion capilar).
Por "directamente aguas arriba" se entiende en particular la primera zona de liberacion 4, 6 que se situa aguas arriba de la zona de captura 5.
Por "complementaria" se entienden las zonas de liberacion y de captura, constitutivas de un grupo de zonas, cuyos reactivos de union constitutivos se seleccionan de manera que permitan la realizacion de un ensayo para la determinacion del analito de interes, ventajosamente un ensayo en formato competicion y/o un ensayo en formato sandwich.
Cada grupo de zonas comprende asf una zona de liberacion seguida de por lo menos una zona de captura complementaria (llegado el caso, antes de la zona de liberacion de un nuevo grupo de zonas).
Tal como se ha mencionado anteriormente, esta disposicion tiene en particular el interes de permitir una adaptacion lo mejor posible y lo mas justa posible, en cantidad y/o en especificidad, del reactivo de deteccion de una zona de liberacion en funcion del reactivo de captura que constituye la o las zonas de captura situadas directamente aguas abajo.
De manera general, el medio de difusion capilar 2 puede comprender:
- exclusivamente unos grupos de zonas cuyos reactivos de union constitutivos se seleccionan de manera que permitan la realizacion del ensayo en formato competicion; o
- exclusivamente unos grupos de zonas cuyos reactivos de union constitutivos se seleccionan de manera que permitan la realizacion del ensayo en formato sandwich; o
- por lo menos un grupo de zonas cuyos reactivos de union constitutivos se seleccionan de manera que permitan la realizacion del ensayo en formato competicion, y por lo menos un grupo de zonas cuyos reactivos de union constitutivos se seleccionan de manera que permitan la realizacion del ensayo en formato sandwich; o
- por lo menos un grupo de zonas cuyos reactivos de union constitutivos se seleccionan de manera que permitan la realizacion de ensayos en formato competicion y en formato sandwich, y por lo menos un grupo de zonas cuyos reactivos de union constitutivos se seleccionan de manera que permitan la realizacion del ensayo en formato competicion y/o en formato sandwich.
En cada grupo de zonas, la zona de liberacion y la zona de captura, o la primera zona de captura de una serie, pueden estar fusionadas.
De manera alternativa, la zona de captura, o la primera zona de captura de una serie, esta separada de la zona de liberacion segun una distancia ventajosamente de algunos milfmetros, por ejemplo comprendida entre 2 y 4 mm.
Las zonas de captura de una serie estan ademas separadas las unas de las otras segun una distancia ventajosamente de algunos milfmetros, por ejemplo comprendida entre 1 y 4 mm.
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Sin embargo, esta zona aguas arriba de liberacion puede tambien ser depositada en estado seco, aguas abajo de la zona de deposito o recepcion de la muestra, para evitar cualquier perdida de reactivo de deteccion por un efecto de lavado durante el deposito de la muestra.
Tambien de manera general, las zonas de captura materializadas sobre el medio de difusion capilar, complementarias de una zona de liberacion situada directamente aguas arriba, estan ventajosamente en numero de 1 a 10, preferentemente en numero de 2 a 5 (es decir tambien un numero seleccionado de entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).
Un enfoque de este tipo es particularmente util para la obtencion de resultados de tipo semi-cuantitativo o cuantitativo.
En efecto, tal como se ilustra en los Ejemplos, el perfil de la senal obtenida en las zonas de captura sucesivas puede ser atribuido a un rango de concentracion de analito en la muestra lfquida. Tal como se ilustra en los Ejemplos, el perfil de la senal obtenida en las zonas de captura sucesivas puede ser atribuido tambien a un valor preciso de concentracion de analito en la muestra lfquida.
Asimismo, la parte Ejemplo muestra tambien que, de manera sorprendente, el efecto de gancho puede ser significativamente reducido con una disposicion particular de las zonas de liberacion y de captura adaptadas para la realizacion de un ensayo sandwich.
A este respecto, se demuestra que una forma de realizacion interesante comprende:
- un grupo aguas arriba de zonas que comprende el par zona de liberacion/zona de captura o dos zonas de captura, y despues
- un grupo aguas abajo de zonas que comprenden por lo menos una nueva zona de liberacion seguida de una serie de zonas de captura.
Este grupo aguas arriba esta ventajosamente basado en un formato sandwich, de manera que se garantice la captura aguas arriba de analito(s):
- o bien una parte significativa de analito(s),
- o bien una parte que corresponde a un umbral de deteccion que tiene un valor de diagnostico (el "valor de diagnostico" se refiere a cualquier concentracion de analito (o biomarcador) cientfficamente reconocida como umbral que permite una interpretacion medica).
Esta captura aguas arriba programada permite en particular controlar la concentracion en la muestra lfquida que avanza dentro del o de los grupos de zonas posteriores.
La presencia de este grupo aguas arriba de zonas presentarfa el interes de controlar el efecto de gancho en el o los grupos de zonas aguas abajo.
Todavfa de manera general, la concentracion de reactivo de deteccion dentro de la zona de liberacion y de reactivo de captura dentro de las zonas de captura complementarias se ajusta ventajosamente en particular en funcion de los intervalos de concentracion de valor diagnostico buscados, segun la nomenclatura de concentracion expresada en ng por ml o en unidad internacional (IU o UI) por ml.
Esta concentracion esta por ejemplo comprendida entre 0,1 y 1 ng/cm lineal del soporte poroso, en funcion de las especificidades de los reactivos de union.
Por otro lado, las zonas de liberacion, y por lo tanto los grupos de zonas correspondientes, estan en numero de 1 a 4 (es decir tambien un numero seleccionado de entre 1, 2, 3 o 4). El intervalo preferido serfa por ejemplo de dos grupos para una longitud de soporte capilar de 25 mm.
La eleccion de los reactivos de union para las zonas asociadas se efectua de manera clasica en sf misma.
En un ensayo por competicion, las zonas de liberacion 4, 6 y de captura 5 complementarias comprenden ventajosamente:
(i) un reactivo de deteccion marcado en forma de analito en sf mismo, o un analogo adecuado del analito,
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(ii) un reactivo de captura inmovilizado, ventajosamente un anti-analito del tipo anticuerpo, capaz de unirse de manera especffica al analito presente en la muestra y al reactivo de deteccion antes citado.
Este modo de realizacion permite la deteccion del analito de la muestra lfquida mediante un ensayo en el se efectua una competicion a nivel de la o de las zonas de captura complementarias entre, por un lado, el analito de la muestra y, por otro lado, el analito marcado o el analogo de analito marcado.
De manera alternativa, siempre en un ensayo por competicion, las zonas de liberacion 4, 6 y de captura 5 complementarias comprenden ventajosamente:
(i) un reactivo de deteccion marcado en forma de un anti-analito, por ejemplo un anticuerpo especffico del analito o del analogo del analito, conjugado con un marcador visible y/o medible, y
(ii) un reactivo de captura en forma del analito en si mismo, o un analogo del analito, inmovilizado en una por lo menos de las zonas de captura 5 del medio de difusion capilar 2.
Este modo de realizacion permite la deteccion del analito de la muestra lfquida mediante un ensayo de competicion en el que el reactivo de deteccion es apto para fijarse, en competicion, o bien con el analito de la muestra o bien con el reactivo de captura.
En estos diferentes ensayos por competicion, el complejo reactivo de deteccion marcado/reactivo de captura, inmovilizado, se forma en ausencia del analito de interes en la muestra. Estos complejos inmovilizados generan asf una senal visible y/o medible tal como se ha definido anteriormente, en ausencia de analito.
En presencia de analito, no hay inmovilizacion del reactivo de deteccion marcado a nivel del reactivo de captura. La ausencia de senal a nivel de la zona de captura corresponde asf a la presencia del analito en la muestra.
En un ensayo de tipo sandwich, las zonas de liberacion 4, 6 y de captura 5 complementarias comprenden ventajosamente:
(i) un reactivo de deteccion marcado en forma de un anti-analito conjugado con un marcador visible y/o medible, que se une de manera especffica al analito, y
(ii) un reactivo de captura inmovilizado que se une de manera especffica al analito, ventajosamente tambien un anti-analito.
Segun una forma de realizacion preferida de este modo de realizacion en formato sandwich, una por lo menos de las zonas de liberacion 4, 6 de un grupo de zonas 7 comprende uno o varios anticuerpos especfficos del analito o por lo menos un analito, conjugados con un marcador visible y/o medible, que se depositan en estado seco en o sobre el medio de difusion capilar, pero que son libres de migrar por difusion capilar en estado humedo.
En este caso, la o las zonas de captura 5 complementarias de este grupo de zonas 7 comprenden uno o unos anticuerpos especfficos del analito que son inmovilizados segun unas tecnicas conocidas. Estos anticuerpos se inmovilizan de tal manera que no sean moviles en estado humedo.
Los anticuerpos de una zona de liberacion 4, 6 y de la o de las zonas de captura complementarias 5 se unen respectiva y especfficamente con el analito, por ejemplo sobre dos sitios epitopicos, identicos o diferentes del analito.
Los complejos analito/anticuerpo obtenidos se inmovilizan a nivel de la o de las zonas de captura 5 del grupo de zonas 7. Estos complejos inmovilizados generan asf una senal visible y/o medible tal como se ha definido anteriormente.
Para la deteccion de un unico analito, el o los reactivos de deteccion de las zonas de liberacion y/o el o los reactivos de captura de las zonas de captura son ventajosamente aptos para unirse especfficamente con dicho analito.
Los grupos de zonas sucesivos estan asf ventajosamente dedicados a un mismo analito.
En este caso, las zonas de liberacion comprenden ventajosamente uno o unos reactivos de deteccion identicos entre sf, y las zonas de captura comprenden uno o unos reactivos de captura identicos entre sf.
Los diferentes grupos de zonas sucesivos son asf todos adecuados para la realizacion de un ensayo en el mismo formato, a saber de competicion o sandwich.
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De manera alternativa, las zonas de liberacion comprenden ventajosamente cada una un reactivo de deteccion especffico, y las zonas de captura complementarias comprenden un reactivo de captura complementario.
En este caso, los diferentes grupos de zonas sucesivos pueden ser adecuados para la realizacion de ensayos identicos o diferentes los unos de los otros, a saber de competicion o sandwich.
Para la deteccion de por lo menos dos analitos, el reactivo de deteccion de una zona de liberacion y/o el reactivo de captura de la o de las zonas de captura complementarias, inmediatamente aguas abajo de dicha zona de liberacion y que forman juntos un grupo de zonas, son ventajosamente capaces de unirse especfficamente con uno de dichos analitos a determinar.
En este caso, cada grupo de zonas esta ventajosamente dedicado a uno de los analitos.
Los diferentes grupos de zonas sucesivos pueden ser adecuados para la realizacion de ensayos identicos (de competicion o sandwich) o diferentes los unos de los otros (de competicion y sandwich).
Segun una forma interesante de realizacion, cada grupo de zonas comprende una zona de captura final, situada aguas abajo de las zonas de captura de dicho grupo de zonas.
Esta zona de captura final comprende un reactivo inmovilizado que es apto para unirse de manera especffica al reactivo de deteccion marcado que proviene de la zona de liberacion de dicho grupo de zona.
Esta forma de realizacion puede servir de zona de control; tiene asimismo el interes de permitir una captura del reactivo de deteccion marcado al final de este grupo de zonas, de manera que no alcanza un grupo de zonas situado aguas abajo y con el fin de prevenir los eventuales fenomenos de interferencia.
Tambien de manera general, las zonas de liberacion 4, 6 y de captura 5 complementarias de un grupo de zonas 7 comprenden ventajosamente:
(i) un reactivo de deteccion marcado en forma de un anti-analito, por ejemplo un anticuerpo especffico del analito o del analogo del analito, conjugado con un marcador visible y/o medible,
(ii) un reactivo de captura en forma del analito en si mismo, o un analogo del analito, inmovilizado en una por lo menos de las zonas de captura 5 del medio de difusion capilar 2, y
(iii) un reactivo de captura inmovilizado que se une de manera especffica al analito, ventajosamente tambien un anti-analito, inmovilizado en otra de las zonas de captura 5 del medio de difusion capilar 2.
Esta ultima forma de realizacion permite la realizacion simultanea de un ensayo en formato sandwich y de un ensayo en formato competicion, dentro de un mismo grupo de zonas 7.
Modos de realizacion particulares
Un primer modo de realizacion de acuerdo con la invencion se ilustra en la figura 1.
Este dispositivo es adecuado para la determinacion cualitativa de un analito de interes susceptible de estar presente en la muestra lfquida.
El medio de difusion capilar 2 comprende dos grupos de zonas 7:
- un grupo aguas arriba 71, que esta compuesto por la zona aguas arriba de liberacion 4 y por una zona de captura aguas abajo 51, complementarias la una de la otra, y
- un grupo aguas abajo 72, que esta compuesto por la zona aguas abajo de liberacion 6 y por una zona de captura aguas abajo 52, complementarias la una de la otra.
En cada grupo de zonas 7, los reactivos de union respectivos se seleccionan para la realizacion de una deteccion del analito de interes mediante un ensayo de competicion o mediante un ensayo sandwich, tal como se ha desarrollado anteriormente.
Estos dos grupos de zonas 7 son asf adecuados para realizar:
- un mismo ensayo de competicion o un mismo ensayo sandwich,
- un ensayo de competicion para uno, y un ensayo sandwich para el otro.
En todos los casos, la presencia de una zona de liberacion 4, 6 aguas arriba de cada zona de captura 5 permite
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La determinacion de un unico analito puede todavfa ser llevada a cabo mediante diferentes dispositivos de acuerdo con la invencion, que tienen sus ventajas especfficas.
Las figuras 2 y 3 presentan estos otros dispositivos, de los cuales el medio de difusion capilar 2 comprende un grupo de zonas aguas arriba 71 que comprende:
- la zona aguas arriba de liberacion 4, y
- una primera zona de captura 51, complementaria de dicha zona aguas arriba de liberacion 4.
Segun el caso, se pueden considerar dos variantes para el o los grupos de zonas 72 situados directamente aguas abajo.
En una primera variante segun la figura 2, el medio de difusion 2 comprende tambien un grupo de zonas aguas abajo 72 que comprende:
- una zona aguas abajo de liberacion 6, y despues
- varias segundas zonas de captura 52 sucesivas, en este caso en numero de tres, complementarias de dicha zona aguas abajo de liberacion 6.
Esta forma de realizacion presenta el interes de ofrecer un resultado semi-cuantitativo particularmente fiable, que se libra del efecto de gancho.
Segun esta forma de realizacion, para la determinacion de la hormona hCG, se puede considerar un grupo de zonas aguas arriba 71 cuya concentracion y especificidad de los reactivos se ajustan para detectar unicamente la concentracion de la hormona hCG, que corresponde al primer dfa de ausencia de menstruacion ("missed period"), es decir alrededor de 20 mlU/ml.
La zona aguas abajo de liberacion 6 contiene un reactivo de deteccion cuya concentracion es mas elevada que la presente a nivel de la zona aguas arriba de liberacion 4, que permite la deteccion y la distincion de diferentes concentraciones del analito a nivel de las segundas zonas de captura 52 sucesivas aguas abajo.
En este formato, para una concentracion de la hormona hCG que corresponde al primer dfa de ausencia de menstruacion ("missed period"), se muestra asf una senal visual y medible de deteccion unicamente a nivel de la primera zona de captura 51.
Para una concentracion de la hormona hCG que corresponde a una o varias semanas de embarazo, la senal visual y medible aparecera sucesivamente a nivel de las segundas zonas de captura 52 aguas abajo de la zona aguas abajo de liberacion 6, que ofrece un analisis semi-cuantitativo de la concentracion de la hormona hCG de la muestra estudiada.
Segun el mismo formato de realizacion, partiendo de reactivos adecuados para la determinacion del antfgeno prostatico especffico (o PSA), se puede detectar y distinguir la "concentracion umbral de valor diagnostico" (4 ng/ml), con respecto a otras concentraciones mas elevadas del mismo analito (hasta 200 ng/ml), que permiten de nuevo un enfoque semi-cuantitativo.
Aun segun el mismo formato, mediante reactivos adecuados para la determinacion de sangre (hemoglobina) en las heces (ensayo FOB por "Fecal Occult blood"), se puede detectar y distinguir la "concentracion umbral de valor diagnostico" (40 ng/ml), con respecto a concentraciones mas elevadas del mismo analito (hasta 1000 ng/ml y mas), ofreciendo asf un resultado semi-cuantitativo.
Segun una alternativa no representada de la primera variante segun la figura 2, el grupo de zonas aguas arriba 71 comprende una segunda zona de captura, tambien complementaria de la zona aguas arriba de liberacion 4.
Esta segunda zona de captura esta situada aguas abajo de la zona aguas arriba de liberacion 4 y de la primera zona de captura 51, pero tambien aguas arriba del grupo de zonas aguas abajo 72.
En este caso, el medio de difusion capilar 2 comprende un primer grupo de zonas 7, aguas arriba, que comprende:
- la zona aguas arriba de liberacion 4,
- dos zonas de captura aguas arriba 51 sucesivas, complementarias de dicha zona aguas arriba de liberacion 4,
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y despues un segundo grupo de zonas 7, aguas abajo, que comprende:
- la zona aguas abajo de liberacion 6, y
- varias segundas zonas de captura 52 sucesivas, en este caso en numero de tres, complementarias de dicha zona aguas abajo de liberacion 6.
En una segunda variante, segun la figura 3, el medio de difusion 2 comprende tambien unos grupos de zonas aguas abajo 72 sucesivos, en este caso en numero de tres, que comprenden cada uno:
- una zona de liberacion 6, y
- una zona de captura 52, complementaria de dicha zona de liberacion 6 asociada.
En el caso de una determinacion de un solo analito, esta forma de realizacion presenta el interes de optimizar el umbral de deteccion en las zonas de liberacion y de captura sucesivas.
En esta variante, puede ser interesante aumentar progresivamente la concentracion de reactivo de deteccion dentro de zonas de liberacion 4, 6 sucesivas de aguas arriba a aguas abajo, manteniendo al mismo tiempo una concentracion de reactivo de captura en cada una de la zonas de captura 52.
Este enfoque tiene un interes en el ambito de una deteccion de analito que tiene un valor de diagnostico de diferentes valores (umbrales) de concentracion (por ejemplo hCG, PSA o hemoglobina).
Segun otro enfoque de la invencion, las zonas de liberacion y las zonas de captura pueden ser adecuadas para la determinacion de varios analitos.
A este respecto, segun un modo de realizacion representado en la figura 4, el medio de difusion capilar 2 comprende varios grupos de zonas 7 sucesivos, en este caso en numero de dos, compuestos cada uno por una zona de liberacion 4, 6 y por una zona de captura complementaria 5.
En este caso, el grupo de zonas aguas arriba 71 es adecuado para la determinacion de un primer analito mediante un ensayo adecuado (de competicion o sandwich); el grupo de zonas aguas abajo 72 es adecuado para la determinacion de un segundo analito mediante un ensayo adecuado (de competicion o sandwich).
Un dispositivo de este tipo podrfa comprender tambien uno o varios otros grupos de zonas 7 suplementarias, adecuados cada uno para un analito a determinar.
De manera alternativa, segun un modo de realizacion representado en la figura 5, el medio de difusion capilar 2 comprende unos grupos de zonas 7, en este caso en numero de tres, compuestos cada uno por una zona de liberacion 4, 6 seguida de varias zonas de captura complementarias 5 (en este caso en numero de dos).
De nuevo, cada grupo de zonas 7 es adecuado para la determinacion de uno de los analitos mediante un ensayo adecuado (de competicion y/o sandwich).
La presencia de varias zonas de captura 5 dentro de cada grupo de zonas 7 permite la obtencion de un valor semi- cuantitativo para cada uno de estos analitos.
Estas diferentes formas de realizacion no son de ninguna manera limitativas. Pueden ser adecuados los diferentes grupos de zonas 7, y sus composiciones respectivas.
Zona control
En un modo de realizacion preferido de la invencion y tal como se ilustra en las figuras 1 a 5, el dispositivo 1 comprende tambien una zona control 10 que esta dispuesta aguas abajo y que comprende un reactivo de captura de control.
Esta zona control 10 permite disponer de un control con el fin de asegurar la difusion capilar efectiva de la muestra lfquida desde la zona de deposito 3 hasta las zonas de captura 5 del medio de difusion capilar 2.
Esta zona control 10 esta constituida por un reactivo de captura que se inmoviliza de manera permanente aguas abajo del medio de difusion capilar 2.
Puede tratarse, por ejemplo, de un anticuerpo que se une al (o a los) reactivo(s) de deteccion constitutivos de las zonas de liberacion 4, 6. En este caso, este reactivo de captura de control permite verificar la migracion del o de los reactivos de deteccion a traves de las zonas de captura 5.
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Alternativamente, este reactivo de captura de control es independiente del analito y permite simplemente verificar la difusion de la muestra lfquida a lo largo del medio de difusion capilar 2.
Realizacion
Un dispositivo de este tipo se puede llevar a cabo mediante el procedimiento o modo de uso definido a continuacion:
a) se deposita la muestra lfquida en la zona de deposito 3 del medio de difusion capilar 2,
b) se espera un tiempo suficiente para la migracion por difusion capilar de la muestra lfquida hasta las zonas de captura 5, llegado el caso hasta la zona control l0,
c) se observa a nivel de las zonas de captura 5, en cuya medida:
c.1) el reactivo de deteccion, complejado con el analito, se fija al reactivo de captura complementario de su grupo de zonas 7 (formato sandwich), y/o
c.2.) el reactivo de deteccion se fija al reactivo de captura de su grupo de zonas 7 (en formato competicion), y despues
d) se determina cualitativamente y/o semi-cuantitativamente y/o cuantitativamente el analito o los analitos a partir de los resultados obtenidos.
En la practica, durante la migracion capilar segun la etapa c), la muestra lfquida atraviesa sucesivamente cada uno de los grupos de zonas 7 dispuestos en serie.
En cada grupo de zonas 7 que utiliza un ensayo en formato sandwich, los eventuales analitos presentes forman un complejo con los reactivos de deteccion procedentes de su zona de liberacion 4 o 6.
Los complejos asf formados avanzan hasta la zona de captura complementaria 5 en la que son inmovilizados por los reactivos de captura correspondientes.
Los complejos asf retenidos crean una senal visible y/o medible a nivel de esta zona de captura, que permite la determinacion de la presencia del analito de interes en dicha muestra lfquida.
Llegado el caso, la intensidad de la senal aumenta a nivel de las zonas de captura sucesivas, repartidas sobre el o los grupos de zonas, hasta el agotamiento progresivo de los complejos marcados.
La intensidad de la senal se mide ventajosamente mediante un lector optico adaptado. Esta intensidad de la senal esta, por ejemplo, expresada en numero de pfxeles, detectado en todo o parte de la zona de captura 5.
En este ambito, el dispositivo segun la invencion es en particular interesante cuando comprende varias zonas de captura sucesivas para un mismo analito, destinado a paliar el efecto de gancho y para la obtencion de un resultado semi-cuantitativo.
A este respecto, la intensidad de la senal a nivel de cada zona de captura se compara con respecto a la de las otras zonas de captura sucesivas.
Una parte de los complejos formados entre los reactivos de deteccion de la zona de liberacion y el analito se captura por cada zona de captura sucesiva, hasta el agotamiento progresivo del analito en la muestra lfquida durante la migracion.
La intensidad de la senal a nivel de cada zona de captura aumenta asf con respecto a la zona de captura anterior, hasta una zona de captura en la que esta intensidad es maxima.
Esta zona de captura va seguida despues de zonas de captura en las que la intensidad de la senal disminuye.
Se utilizan previamente unas soluciones patrones en un dispositivo identico de manera que se pueda atribuir un perfil de resultado con un resultado semi-cuantitativo de analito en la muestra lfquida.
Es posible entonces transformar este resultado en un valor semi-cuantitativo, mediante una atribucion previa de cada zona de captura a un intervalo de concentracion del analito en una muestra lfquida.
En un grupo de zonas 7 que utiliza un ensayo en formato competicion, los eventuales analitos presentes impiden la formacion de complejos entre el reactivo de deteccion procedente de su zona de liberacion 4 o 6, y el reactivo de captura de la o de las zonas de capturas complementarias 5.
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En ausencia de analito, los complejos se forman y crean una senal visible y/o medible a nivel de la zona de captura correspondiente.
De nuevo, el dispositivo segun la invencion es en particular interesante cuando comprende varias zonas de captura sucesivas para un mismo analito, destinado a paliar al efecto de gancho y para la obtencion de un resultado semi- cuantitativo.
Los resultados pueden ser interpretados semi-cuantitativamente en funcion de la concentracion de analito, como por ejemplo baja, media, alta y muy alta.
Se utilizan previamente unas soluciones patrones en un dispositivo identico de manera que se pueda atribuir tambien un perfil de resultado con un resultado semi-cuantitativo de analito en la muestra lfquida.
Es entonces posible transformar este resultado en un valor semi-cuantitativo, mediante una atribucion previa de cada zona de captura a un dominio de concentracion del analito en la muestra. De manera general, el dispositivo de determinacion puede tambien permitir la determinacion cuantitativa de un analito.
El resultado visual obtenido se puede asf transformar por ejemplo en una concentracion, expresada por ejemplo en ng por ml o en mUI por ml. del analito en la muestra lfquida a analizar.
Para ello, se utilizan unas soluciones patrones en el dispositivo de determinacion de manera que se pueda atribuir un perfil de intensidad con un valor cuantitativo de analito en la muestra lfquida.
Por ejemplo, la intensidad de la senal (numero de pfxeles) se mide a nivel de cada zona de captura.
Para cada grupo de zonas, se anaden despues las intensidades de la senal medidas en estas zonas de captura.
Las intensidades anadidas respectivamente de los diferentes grupos de zonas se transforman en una relacion que corresponde a las intensidades anadidas de un grupo de zona con respecto a las intensidades anadidas de otro grupo de zonas.
Si es necesario, estas relaciones son despues objeto de interpolacion, por ejemplo una interpolacion lineal, asociada ventajosamente a un coeficiente de proporcionalidad para cada intervalo predeterminado de la concentracion de analito, para la obtencion de una curva patron que corresponde a la relacion de intensidad (en las abscisas) en funcion de la concentracion de analito en la muestra lfquida (en las ordenadas).
Es posible entonces asociar una relacion de intensidad obtenida para una muestra analizada a un valor cuantitativo del analito en dicha muestra lfquida, teniendo en cuenta la curva patron antes citada.
En una forma de realizacion particular, los reactivos de deteccion y de captura se aplican sobre el soporte, de manera que se obtenga:
- un grupo de zonas aguas arriba que comprende dos zonas de captura T1 y T2, y despues de una 1a zona de liberacion L1, y
- un grupo de zonas aguas abajo que comprende tres zonas de captura T3, T4 y T5, despues de la 2a zona de liberacion L2.
En este caso, la relacion de intensidad acumulativa se aprecia ventajosamente segun la formula (I) siguiente:
Relacion de intensidad acumulativa = (Suma de la intensidad de las tres zonas de captura T3, T4 y T5 aguas abajo) / (suma de la intensidad de las dos zonas de captura T1 y T2 aguas arriba)
La relacion de intensidad acumulativa permite construir una curva de senal (intensidad) en funcion de la concentracion de analito en una muestra lfquida a analizar.
Un analito cuantitativo de este tipo se ilustra tambien en el Ejemplo 2 siguiente.
Ejemplos
Ejemplo 1: Dispositivo inmunocromatografico por flujo lateral para la determinacion de un analito que presenta un efecto de gancho
Una evaluacion del efecto de gancho se ha realiza a traves de ensayos de determinacion de valores de concentracion semi-cuantitativa de hCG por inmunocromatograffa por flujo lateral.
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Se recuerda que, con el fin de combatir el efecto de gancho, los dispositivos de determinacion se dotan habitualmente de un exceso de anticuerpos marcados a nivel de la zona de liberacion unica.
Por exceso de anticuerpos, se entiende una concentracion de anticuerpos significativamente superior a la concentracion necesaria para determinar el umbral de interes diagnostico.
Se han construido diferentes dispositivos a partir de anticuerpos "hCG matched pairs antibodies" propuestos por ejemplo por la companfa Fitzerald (anticuerpos mono/policlonal).
Los anticuerpos anti-hCG se han marcado con oro coloidal (Aldirch Sigma) segun la metodologfa estandar (por ejemplo la tecnica desarrollada por la companfa Organon Teknika).
Los anticuerpos anti-hCG se han impreso en la membrana de nitrocelulosa (NC) de la companfa Millipore segun diferentes disposiciones desarrolladas a continuacion (Ensayos 1 a 5).
La concentracion depositada de estos anticuerpos se ajusta de manera que se obtenga una concentracion de 0,5 a 1 pg/ml.
Las tiras de 4 mm de ensayaron con diferentes concentraciones de hormonas hCG (Sigma) diluidas en orina hCG negativa. Las diluciones ensayadas son 0, 25, 50, 100, 1000, 5000, 50000, 100000, 250000 y 500000 mlU/ml.
Estas diferentes concentraciones corresponden cada una a un estado avanzado de un embarazo en condiciones normales (respectivamente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 a 12, 13 a 16 semanas de embarazo).
El protocolo de ensayo consiste en la aplicacion de 150 pl de cada dilucion en la zona despues de 3 a 5 minutos, se realiza una observacion de la presencia y la intensidad de zonas de captura de cada tira.
Los resultados se registran e interpretan segun los criterios generalmente adaptados para ensayos cualitativos, a saber:
0: ausencia de coloracion
±: ligera coloracion, dudosa, "border-line", "ghost-line", diffcilmente visible
+: coloracion palida pero claramente visible
++: lfnea claramente visible
+++: coloracion de lfnea intensa ++++: coloracion de lfnea muy intensa
Ensayo 1: Dispositivo con una zona de liberacion unica y una zona de captura unica (lfnea de ensayo 1)
Los resultados obtenidos se presentan en la tabla n° 1 siguiente.
de deposito de la tira; y coloracion sobre la o las
la lectura de este tipo de
Tabla 1
Intensidad de coloracion
Lfnea de ensayo 1
Semana de embarazo
Concentracion HCG mlU/ml 0 ± + ++ +++ ++++
0
0
X
1
25 X
2
50 X
3
100 X
4
1000 X
5
5000 X
6
50000 X
9-12
100000 X
13-16
250000 X
500000 X
El ensayo rapido mediante inmunocromatograffa por flujo lateral muestra una linealidad de la curva dosis/respuesta situada entre 1000 y 5000 mlU/ml de hCG.
A partir de esta concentracion maxima, la perdida de intensidad de la senal empieza a manifestarse a causa del efecto de gancho («high dose hook effect»).
En consecuencia, este tipo de ensayo no permite diferenciar, en ciertas intensidades de coloracion del resultado, si la concentracion en hCG serfa de 50 mlU/ml o de 100000 mlU/ml.
Ensayo 2: Dispositivo con una zona de liberacion unica y dos zonas de capturas sucesivas (linea de ensayo 1 y 5 linea de ensayo 2)
Se han producido unas tiras que contienen una segunda linea de captura (linea de ensayo 2), y despues se han ensayado con el mismo panel de concentracion de hCG.
10 Los resultados obtenidos se presentan en la tabla n° 2 siguiente.
Tabla 2
Intensidad de coloracion
Linea de ensayo 1 Linea de ensayo 2
Concentracion HCG mlU/ml
0 ± + ++ +++ ++++ 0 ± + ++ +++ ++++
0
X X
25
X X
50
X X
100
X X
1000
X X
5000
X X
50000
X X
100000
X X
250000
X X
500000
X X
15 El efecto de gancho se detalla a una concentracion superior. En efecto, parece que la introduccion de una segunda linea de captura desplaza el umbral de concentracion del efecto de gancho a una zona de concentracion superior.
Ensayo 3: Dispositivo con una zona de liberacion unica y tres zonas de captura sucesivas (linea de ensayo 1, linea de ensayo 2 y linea de ensayo 3)
20
Se han producido unas tiras que contienen una tercera linea de captura (linea de ensayo 3), despues se han aislado con el mismo panel de concentracion de hCG.
Los resultados obtenidos se presentan en la tabla n° 3 siguiente.
25
Tabla 3
Intensidad de coloracion
Linea de ensayo 1 Linea de ensayo 2 Linea de ensayo 3
Semana de embarazo
Concentracion HCG mlU/ml 0 ± + ++ +++ ++ ++ 0 ± + ++ +++ ++ ++ 0 ± + ++ +++ ++ ++
0
0
X X X
1
25 X X X
2
50 X X X
3
100 X X X
4
1000 X X X
5
5000 X X X
6
50000 X X X
9-12
100000 X X X
13-16
250000 X X X
500000 X X X
La tercera linea de captura (linea de ensayo 3) ya no desplaza el efecto de gancho. Esto se debe probablemente a 30 un agotamiento de los anticuerpos marcados de la zona de liberacion.
Ensayo 4: Dispositivo con una zona de liberacion unica y tres zonas de captura sucesivas
Segun la conclusion del ensayo n° 3, se han mantenido las tres zonas de captura duplicando al mismo tiempo la 35 concentracion de los anticuerpos marcados de la zona de liberacion unica.
Esta configuracion se mostro sujeta a un fuerte ruido de fondo, haciendo el ensayo ilegible e inexplotable.
Ensayo 5: Dispositivo con dos zonas de liberacion y cuatro zonas de captura
Se ha introducido una segunda zona de liberacion despues de la primera linea de captura (linea de ensayo 1), 5 sucedida por 3 lfneas complementarias de anticuerpos de captura. Esta configuracion corresponde a la forma de realizacion tal como se ha descrito anteriormente en relacion con la figura 2.
Esta nueva plataforma se ensayo con el mismo panel de concentraciones de hCG. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla n° 4 siguiente.
10
La introduccion de una segunda zona de liberacion, complementada con 3 lfneas de captura sucesivas, permite afirmar en que intervalo de concentracion se situa la senal obtenida en la primera linea de captura (linea de ensayo 1) y, por lo tanto, pronunciarse en el intervalo de concentracion que se refiere al estado de avance del embarazo de manera semi-cuantitativa.
15
Este enfoque aporta una solucion al problema de efecto de gancho.
Tabla 4
Intensidad de coloracion
ZONA DE ENSAYO 1 ZONA DE ENSAYO 2: lineas de captura dispuestas despues de la sequnda zona de liberacion
Linea de ensayo 1 Linea de ensayo 2 Linea de ensayo 3 Linea de ensayo 4
Semana de embarazo
Concentracion HCG mlU/ml 0 + + ++ +++ ++++ 0 + + ++ +++ ++++ 0 + + ++ +++ ++++ 0 + + ++ +++ ++++
0
0
X X X X
1
25 X X X X
2
50 X X X X
3
100 X X X X
4
1000 X X X X
5
5000 X X X X
6
50000 X X X X
9-12
100000 X X X X
13-16
250000 X X X X
500000 X X X X
5
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Ejemplo 2: Dispositivo inmunocromatografico por flujo lateral para la determinacion cuantitativa de un analito que presenta un efecto de gancho
Material
El dispositivo inmunocromatografico comprende un soporte poroso en forma de una membrana nitrocelulosa, preferentemente con un tamano de poro de entre 8 y 15 micrometros, y entre 2 y 3 cm de anchura.
Los materiales porosos para tira de muestra ("sample pad"), para cinta conjugada ("conjugate pad) y para cinta absorbente ("absorbent pad") se seleccionaron de entre una multiple seleccion de proveedores de papeles de celulosa y de fibra de vidrio, con un grosor de entre 0,2 y 1,0 mm segun la aplicacion y una porosidad de entre 100 y 200 micrometros.
Los anticuerpos se construyeron a partir de "hCG matched pairs antibodies", propuestos por la companfa BiosPacific (anticuerpo mono/policlonal).
Los anticuerpos monoclonales y policlonales anti-hCG y anti-beta-hCG estan preferentemente a una concentracion de 1 mg/ml en una solucion tampon PBS.
Los anticuerpos anti-hCG se marcaron con oro coloidal (Aldrich Sigma) segun la metodologfa estandar (por ejemplo la tecnica desarrollada por la companfa Organon Teknika).
Los anticuerpos anti-hCG se han impreso en la membrana de nitrocelulosa (NC) de la companfa Millipore.
La concentracion depositada de estos anticuerpos se ajusta de manera que se obtenga una concentracion de 0,5 a 1 pg/ml.
El oro coloidal para la preparacion de los reactivos de liberacion (marcador) esta preferentemente a una concentracion de 10 a 15 OD/ml, y de tamano de partfcula de entre 20 y 60 micrometros.
Se ha preparado y calibrado una gama de controles hCG (Sigma) (segun el estandar internacional NIBSC), de manera que se obtengan unas concentraciones de hCG comprendidas entre 0 mlU/ml y 1000000 mlU/ml, necesarias para la evaluacion de rendimientos del ensayo y su control calidad.
Las diluciones ensayadas son 0, 25, 250, 2500, 25000, 250000, 500000 y 1000000 mlU/ml.
Metodo
Los reactivos de deteccion y de captura se aplican sobre el soporte en nitrocelulosa de manera que se obtenga:
- una 1a zona de liberacion L1, ventajosamente sobre una tira conjugada ("conjugate pad") interpuesta entre una tira de muestra ("sample pad") y una membrana impresa en soporte en PVC,
- dos zonas aguas arriba de captura T1 y T2, despues de la 1a zona de liberacion L1,
- una 2a zona de liberacion L2, y
- tres zonas aguas abajo de captura T3, T4 y T5, despues de la 2a zona de liberacion L2.
La segunda zona de liberacion L2 esta dispuesta entre la segunda zona aguas arriba de captura T2 y la primera zona aguas abajo de captura T3, de manera que se asegure ventajosamente una distancia de como mfnimo dos milfmetros entre ellas.
Las concentraciones de los reactivos de las zonas de liberacion y de las zonas de captura se ajustan de manera que se asegure la deteccion del analito hCG buscado a las concentraciones determinadas (0 a 1000000 mlU/ml).
Despues de la aplicacion de los reactivos, el soporte de nitrocelulosa se seca en condiciones de temperatura y de humedad programadas (generalmente 1h a 37°C).
Despues del secado, el soporte de nitrocelulosa impreso con reactivos se utiliza para la construccion de un ensayo en formato "banda a ensayar a cortar en la tira" ("mastersheet"), que comprende un soporte PVC, la membrana de nitrocelulosa impresa, una "conjugate pad" (1a zona de liberacion), una "sample pad" y "absorbent pad".
La tira de muestra ("sample pad"), la tira conjugada (conjugate pad") y la tira absorbente (absorbent pad") son unos materiales porosos que estan dispuestos sobre el soporte de PVC con una membrana de nitrocelulosa impresa,
5
10
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40
45
50
adaptada y eventualmente tratada inmunoqufmicamente, de manera que se recoja efectivamente la muestra ("sample pad") , se filtre, se garantice su reaccion con reactivos en la 1a zona de liberacion ("conjugated pad"), se garantice la migracion uniforme en la membrana y finalmente se absorba el exceso de reactivos y se detenga la migracion ("absorbent pad").
La banda de ensayo "mastersheet" se corta despues para obtener unas tiras de 2 a 6 mm de anchura, preferentemente de 4 mm o 5 mm de anchura.
Las tiras se alojan despues en una caja de plastico de forma rectangular (dispositivo en formato casete), listas para ser utilizadas.
Procedimiento de ensayo
Se preparan diferentes concentraciones de hCG para obtener una gama de controles que cubren unas concentraciones de entre 0 y 1 millon mlU/ml de hormona hCG.
Cada concentracion se ensaya por duplicado.
Generalmente, se aplican entre 100 y 200 microlitros de muestra de cada concentracion de hCG sobre las diferentes unidades de ensayo.
La reaccion se observa durante un periodo maximo de 10 minutos.
Los resultados obtenidos son evaluados a simple vista (intervalo de concentracion).
Despues, los resultados obtenidos se registran mediante unos medios de lectura optica (instrumento o lector) que permiten medir la intensidad de cada lfnea de captura (expresada en pfxeles).
El resultado cuantitativo (cifrado) proporcionado por el lector se calcula a partir de un algoritmo cuyo calculo de base tiene en cuenta la relacion de intensidad acumulativa segun la formula siguiente (I):
Relacion de intensidad acumulativa (RIC) = (suma de la intensidad de las tres zonas de captura aguas abajo T3, T4 y T5) / (Suma de la intensidad de las dos zonas de captura aguas arriba T1 y T2)
Formula (I)
Los resultados obtenidos en las presentes condiciones experimentales se presentan en la tabla 5 siguiente.
La relacion de intensidad acumulativa aumenta con el aumento de la concentracion del analito en la muestra lfquida.
Por interpolacion, la relacion de intensidad acumulativa permite construir una curva de la senal (intensidad) en funcion de la concentracion de analito en la muestra lfquida.
Despues, es posible determinar la concentracion de hCG en una muestra lfquida en un intervalo comprendido entre 0 y 1000000 mlU/ml, teniendo en cuenta esta curva de senal y la relacion de intensidad acumulativa medida en dicho dispositivo de determinacion en presencia de dicha muestra lfquida.
Tabla 5
INTENSIDAD EN PIXELES / LINEA DE CAPTURA
Concentracion de analito hCG en mlU/mL
0 25 250 2500 25000 250000 500000 1000000
Lfnea de captura T1
18886 108928 234085 278087 176567 29346 16915 10131
Lfnea de captura T2
17316 81398 173706 246662 146653 41915 24346 10415
Total 2 lfneas
36202 190326 407791 524749 323220 71261 41261 20546
Lfnea de captura T3
6295 33339 113129 229576 142516 45046 28946 13308
Lfnea de captura T4
1965 28398 111021 164484 164342 42531 34208 15331
Lfnea de captura T5
3502 30833 61406 99659 121671 36346 38123 22162
Total 3 lfneas
11762 92570 285556 493719 428529 123923 101277 50801
Relacion Total Pixel (T3+T4+T5)/(T1 +T2)
0,325 0,486 0,700 0,941 1,326 1,739 2,455 2,473

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Dispositivo para la determinacion de la presencia y/o de la cantidad de por lo menos un analito susceptible de estar contenido en una muestra lfquida, que comprende un medio de difusion capilar (2) en el cual dicha muestra lfquida esta destinada a migrar lateralmente segun una direccion y un sentido de migracion capilar, y en el cual se materializan, en dicho sentido de migracion capilar de aguas arriba hacia aguas abajo, por lo menos:
    - una zona (3) de deposito de la muestra lfquida,
    - una zona aguas arriba (4) de liberacion que comprende por lo menos un reactivo de deteccion conjugado con un marcador visible y/o medible, siendo dicho reactivo de deteccion apto para desplazarse como consecuencia de la migracion de la muestra lfquida en dicho medio de difusion capilar, y
    - por lo menos dos zonas de captura (5) que comprenden cada una por lo menos un reactivo de captura, inmovilizado en dicho medio de difusion capilar,
    caracterizado por que dicho dispositivo (1) comprende tambien por lo menos una zona aguas abajo de liberacion (6) que esta materializada sobre dicho medio de difusion capilar (2) y que se situa aguas abajo de una por lo menos de dichas zonas de captura (5),
    estando cada una de dicha o dichas zonas aguas abajo de liberacion (6) intercaladas entre dos zonas de captura
    (5),
    comprendiendo dicha zona aguas abajo de liberacion (6) tambien por lo menos un reactivo de deteccion conjugado con un marcador visible y/o medible, siendo dicho reactivo de deteccion apto para desplazarse como consecuencia de la migracion de la muestra lfquida en el medio de difusion capilar (2), y
    por que el reactivo de deteccion de una zona de liberacion (4, 6) y/o el reactivo de captura de la o de las zonas de captura (5) complementarias, situadas directamente aguas abajo de dicha zona de liberacion (4, 6), son aptas para unirse espedficamente con dicho analito y/o unirse espedficamente el uno con el otro, para formar un complejo que permite la determinacion de dicho analito en dicha muestra lfquida a nivel de dicha o de dichas zonas de captura (5) complementarias.
  2. 2. Dispositivo de determinacion segun la reivindicacion 1, caracterizado por que comprende un grupo aguas arriba de zonas (71) que comprende una zona de captura aguas arriba (51) situada directamente aguas abajo de la zona de liberacion aguas arriba (4), estando dicho grupo aguas arriba de zonas (71) seguido a su vez de uno o varios grupos de zonas (72) que comprenden cada uno una zona de liberacion (6) y una o varias zonas de captura (5) complementarias.
  3. 3. Dispositivo de determinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para la determinacion de un unico analito, caracterizado por que el o los reactivos de deteccion de las zonas de liberacion (4, 6) y/o el o los reactivos de captura de las zonas de captura (5) son aptas para unirse espedficamente con dicho analito.
  4. 4. Dispositivo de determinacion segun la reivindicacion 3, caracterizado por que las zonas de liberacion (4, 6) comprenden uno o varios reactivos de deteccion identicos entre sf, y por que las zonas de captura (5) comprenden uno o unos reactivos de captura identicos entre sf
  5. 5. Dispositivo de determinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado por que el medio de difusion capilar (2) comprende:
    - la zona aguas arriba de liberacion (4),
    - una o dos zonas de captura aguas arriba (51), complementarias de dicha zona aguas arriba de liberacion (4), y despues
    - una zona aguas abajo de liberacion (6), y
    - por lo menos dos segundas zonas de captura (52), complementarias de dicha zona aguas abajo de liberacion (6).
  6. 6. Dispositivo de determinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado por que el medio de difusion capilar (2) comprende:
    - la zona aguas arriba de liberacion (4),
    - una o dos zonas de captura aguas arriba (51), complementarias de dicha zona aguas arriba de liberacion (4),
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    y despues
    - por lo menos dos grupos de zonas (72) sucesivas que comprenden cada uno:
    - una zona de liberacion (6), y
    - por lo menos una zona de captura (52), complementaria de dicha zona de liberacion (6) asociada.
  7. 7. Dispositivo de determinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para la deteccion de por lo menos dos analitos, caracterizado por que el reactivo de deteccion de una zona de liberacion (4, 6) y/o el reactivo de captura de la o de las zonas de captura (5) complementarias, inmediatamente aguas abajo de dicha zona de liberacion (4, 6) son aptos para unirse especfficamente con uno de dichos analitos.
  8. 8. Dispositivo de determinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la o las zonas aguas abajo de liberacion (6) materializadas sobre el medio de difusion capilar (2), cada una intercalada entre dos zonas de captura (5), estan en numero de 1 a 4.
  9. 9. Dispositivo de determinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la o las zonas de captura (5) materializadas sobre el medio de difusion capilar (2), complementarias de una de las zonas de liberacion (4, 6) situada directamente aguas arriba, estan en numero de 1 a 10.
  10. 10. Dispositivo de determinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que el reactivo de deteccion de una zona de liberacion (4, 6) y el reactivo de captura de la o de una por lo menos de las zonas de captura complementarias (5) son aptos para unirse especfficamente con el analito o uno por lo menos de los analitos, para constituir un ensayo en formato sandwich.
  11. 11. Dispositivo de determinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que el reactivo de deteccion de una por lo menos de las zonas de liberacion (4, 6) y el reactivo de captura de la o de una por lo menos de las zonas de captura (5) complementarias consisten, uno, en un analogo del analito a determinar y, el otro, en un reactivo apto para unirse especfficamente con dicho analito o con dicho analogo del analito, para constituir un ensayo en formato competicion.
  12. 12. Procedimiento para la determinacion cuantitativa de un analito en una muestra lfquida depositada sobre un dispositivo de determinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado por que comprende las etapas sucesivas siguientes:
    - una etapa de medicion de la intensidad de la senal a nivel de cada zona de captura (51, 52),
    - en cada grupo de zonas (7), una etapa de adicion de dichas intensidades medidas,
    - una etapa de calculo de una relacion de intensidad que corresponde a las intensidades anadidas para un grupo de zonas con respecto a las intensidades anadidas para otro grupo de zonas, y
    - una etapa de asociacion de dicha relacion de intensidad calculada a un valor cuantitativo del analito en dicha muestra lfquida partiendo de una curva patron que corresponde a la relacion de intensidad calculada en funcion de una cantidad de analito en dicha muestra lfquida.
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