DE3023849A1

DE3023849A1 - Verfahren und vorrichtung zur gewinnung und auswertung von zellpraeparaten aus fluessigen medien, insbesondere aus urin und anderen koerperfluessigkeiten fuer die pruefung auf tumorverdacht

Info

Publication number: DE3023849A1
Application number: DE19803023849
Authority: DE
Inventors: Bernhard Dr.med. 3004 Isernhagen Aseikens; Hans Dipl.-Chem. Dr. 3401 Nikolausberg Beer; Dieter Dipl.-Chem. Dr. Nußbaumer; Horst Dipl.-Chem. Dr. Perl; Günter 3400 Göttingen Pradel
Original assignee: Sartorius AG
Current assignee: Sartorius AG
Priority date: 1979-07-17
Filing date: 1980-06-25
Publication date: 1982-01-21
Also published as: DE3023849C2

Description

Beschreibung:
Das Hauptpatent (Patentanmeldung P 29 28 790.9) betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Gewinnung und Auswertung von Zellpräparaten aus flüssigen Medien, insbesondere aus Urin und anderen Körperflüssigkeiten für die Prüfung auf Tumorverdacht.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verallgemeinerung des Gegenstands des Hauptpatentes zur Zellisolierung bzw.
Zellvereinzelnung allgemein, wobei auch von festen Zellpräparaten ausgegangen werden kann, die vor Anwendung des Verfahrens des Hauptpatentes in eine (künstliche) Zellsuspension überführt werden, die dann dem Verfahren des Hauptpatentes unterzogen wird. Die Erfindung eignet sich insbesondere für Abstriche, die bisher zur Auswertung abgeklatscht werden, wobei natürlich häufig ein nicht mehr repräsentativer Teil der gesuchten Zellen auf die Untersuchungsmembran übertragen wird. Nach dem Verfahren der Erfindung wird das Abstrichmaterial gelöst und die so erhaltenen Zellsuspension, bei der es sich sozusagen um einen künstlichen Urin handelt, durch das Membranfilter filtriert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann auch hier eine Vorfiltration durch ein wesentlich gröberes Filter, z.B.
ein Haarsieb von 60 bis 80 Fm Porenweite bzw. Maschenweite, stattfinden, um störende grobteilige Bestandteile zu entfernen, bevor die eigentliche Filtration durch das Membranfilter erfolgt. Dieses Membranfilter hat, da die Zellen eine Größe von 30 bis 40 ßm haben, zweckmäßig Porengrößen bis etwa 12 iim, insbesondere 0,3 bis 10, noch zweckmäßiger 2 bis 8 und insbesondere 5 bis 8 Fm, wobei bei 8 ßm ein Maximum vorliegen sollte was bedeutet, daß die Porenverteilung eine steile Glockenkurve mit einem Maximum bei 8 m und sehr steilem Abfall über 8 tjm Porengröße haben sollte.
Da beim Auflösen des Abstrichmaterials bzw. bei der Bildung der künstlichen Suspension die Konzentration der Zellen in der Suspension durch die Wahl der Menge des Suspensionsmittels gesteuert werden kann ist es auch möglich, einen aliquoten Anteil eines Abstriches oder sonstigen festen Zellpräparates zu entnehmen, also einer großen Menge von Zellen eine gewünschte mehr oder weniger große Anzahl zu entnehmen, die dann einen echten repräsentativen Querschnitt der Zusammensetzung des als Ausgangsmaterial benutzten Gesamtpräparates darstellt.
Das Abstrichmaterial sollte in Elektrolytlösungen bzw.
in Wasser löslich sein, damit man in einfacher Weise den künstlichen Harn einfach durch Auflösen in Wasser oder einer Salzlösung erstellen kann. Zweckmäßig eignet sich als Abstrichmaterial Natriumalginat.
Es ist bekannt, bei Keimfiltern lösliche Ultrafilter aus Alginat oder Pektinat zu verwenden durch welche die Luft gesaugt wird, deren Keimgehalt bestimmt werden soll, und die anschließend gelöst werden. Von der Lösung werden dann aliquote Anteile auf verschiedene Nährböden überführt (z.B.
H. Thiele und G. Schyma "Die Naturwissenschaften" 22, 583 (1953) und M. Richards, "Nature" (London) 176, Seite 559 (1959) und "Angewandte Chemie" 1 47 (1956)).
Es ist weiterhin bekannt, bei der Isolierung und Untersuchung von Zellen eine zellenhaltige Flüssigkeitsprobe zu filtrieren und das Filter anschließend vollständig aufzulösen, die Zeilen in der Lösung anzufärben und dann die Lösung zu untersuchen (DE-OS 28 00 171). Hier findet nicht nur keine Isolierung oder Vereinzelnung der zu untersuchenden Zellen statt, sondern die Untersuchung von Lösungen bzw.
Suspensionen hat auch die im Hauptpatent angegebenen Nachteile und die so erhaltenen Präparate sind nicht direkt archivierbar.
Das Gesamtverfahren besteht demnach aus den Stufen: 1. Herstellen der künstlichen Suspension 1a. Gegebenenfalls Vorfiltration lb. Gegebenenfalls Verdünnen und Abnahme eines aliquoten Anteils 2. Transparent machen 2a. Ankleben oder Anklemmen auf Objektträger (Stufe 2a und 2 können auch vertauscht werden und sie können als "Fixieren" zusammengefaßt werden).
3. Anfärben.
Das Kit zur Durchfuhrung des Verfahrens enthält demgemäß neben den im Hauptpatent angegebenen Bestandteilen noch Abstrichmaterial in Form der üblichen und bekannten Einheiten, das aus einem wasserlöslichen oder in Elektrolytlösung löslichen Material besteht.
Ein Lösungsmittel hierfür sowie zweckmäßigerweise noch einen zweiten Filtervorsatz, der ein Haarsieb oder ein grobes Sieb für die Vorfiltration enthält.
Wie schon im Hauptpatent angegeben eignet sich jedes Membranfilter, das anschließend ohne Beschädigung der Zellen transparent gemacht-werden kann und das sich bei der Färbung der Zellen nicht oder jedenfalls nicht in der gleichen Farbe wie die Zellen anfärbt. Zu nennen sind Zellulosenitrat, Zellulosediacetat und -triacetat sowie Polyamidfilter, wobei Zellulosenitrat bevorzugt ist.
Wie erwähnt ist die Porengröße zweckmäßig etwa 0,3 bis 10, insbesondere 2 bis 8 und ganz besonders 5 bis 8 Am mit einem Maximum bei 8 µm. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Abscheideleistung des Membranfilters wichtiger ist als die Porengröße. Eine enge Porenverteilung ist bevorzugt.
Das Transparenzmittel darf die Zellen nicht angreifen und auch die Anfärbbarkeit oder die Farbe der Zellen nicht beeinflussen. Das Transparenzmittel muß an das Membranfilter angepaßt sein, das aber seinerseits wieder an das Färbeverfahren angepaßt sein muß. Wie erwähnt soll sich das Membranfilter entweder gar nicht oder jedenfalls nicht in der Anfärbungsfarbe der Zellen anfärben.
Ein besonders bevorzugtes Membranfilter ist ein solches aus 2,5-Nitrat. Hier hat sich ein Filter mit einem Stickstoffgehalt von 12%, einer nominellen Porengröße von 8 µm und einer mittleren Dicke von 140 ijm und einem mittleren Bubblepoint von 0,4. bar besonders bewährt, das eine mittlere -2 für Wasser von 750 ml -1 -1 Durchflußrate für Wasser von 750 ml.cm min .bar gemessen bei 0,38 bar Differenzdruck und eine mittlere Durchflußrate für Luft von 130 1.cm-2.min-1.bar-1, bei 0,01 bar Differenzdruck aufweist.
Selbstverständlich ist es jedoch leicht möglich, aus der großen Zahl der verfügbaren Filter ein geeignetes Membranfilter auszuwählen. Für das oben genannte Zellulosenitratfilter eignet sich als Transparentbad ein Gemisch aus 80 Vol.% n-Butylacetat und 20 Vol.% Methylacetat besonders gut.
Aus praktischen Gründen hat es sich als zweckmäßig erwiesen, mit dem Transparenzmittel, entweder in Mischung mit diesem oder getrennt davon, auch ein Konservierungsmittel zur Sterilisierung des Zellpräparates einzusetzen, beispielsweise Formalin, inbesondere wenn man archivierbare Präparate erzielen will.
Das Fixieren des Membranfilters vor oder nach dem Transparentmachen auf einem Objektträger kann durch Anklemmen oder Ankleben erfolgen. Für Nitratfilter hat sich ein Klebstoff aus PVA-Dispersion/Polyacrylat, verdünnt mit Alkohol und Butylacetat, als besonders zweckmäßig erwiesen. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht darin, das Transparenzmittel so zu wählen, daß es gleichzeitig das Verkleben der Membran mit dem Objektträger bewirkt. Die Zusammensetzung eines geeigneten Transparenzmittels kann durch einige Handversuche so abgeändert werden, daß diese Wirkung eintritt.
Bezüglich des übrigen Verfahrensablaufes sei auf das Hauptpatent (Patentanmeldung P 29 28 790.9) verwiesen, auf dessen Inhalt hier ausdrücklich hingewiesen sei. Die dort gezeigte Einwegspritze kann, bis auf das Filter in ihrem Inneren, die gleiche sein, wie sie auch hier für die Vorfiltration verwendet wird. Da ferner die Einheiten des Abstrichmaterials als solche bekannt sind und im vorliegenden Fall nur eine bestimmte Materialauswahl hinsichtlich der Löslichkeit des Materials getroffen wird, erübrigt sich eine Abbildung.

Claims

Verfahren und Vorrichtung zur Gewinnung und Auswertung von Zellpräparaten aus flüssigen Medien, insbesondere aus Urin und anderen Körperflüssigkeiten für die Prüfung auf Tumorverdacht Zusatz zu Patent . ... ... (Patentanmeldung P 29 28 790.9) Patentansprüche 3 Verfahren zur Gewinnung und Auswertung von Zellpräparaten aus flüssigen Medien, insbesondere aus Urin und anderen Körperflüssigkeiten für die Prüfung auf Tumorverdacht, bei dem die Zellen auf einen mikroskoptechnisch transparenten Objektträger aufgetragen, fixiert, zur Sichtbarmachung angefärbt, labormäßig untersucht und ausgewertet werden, wobei das flüssige Medium mit Hilfe eines porösen Membranfilters aus Kunststoff filtriert wird, wobei das Membranfilter eine die zu präparierenden Zellen zurückhaltende Porengröße aufweist, gleichzeitig bzw. anschließend die Fixierung der Zellen auf dem Membranfilter erfolgt und das Membranfilter vor oder nach dessen Festlegung auf dem Objektträger chemisch in einen transparenten Zustand überführt wird und die Zellen vor oder nach dem Festlegen des Membranfilters, jedoch nach dessen überführung in den transparenten Zustand, auf dem Objektträger in einem Färbebad bzw. mehreren Färbebädern optisch sichtbar angefärbt werden, nach Patent . ... ... (Patentanmeldung P 29 28 790.9), dadurch gekennzeichnet, daß man ausgehend von festen Zellpräparaten zuerst die zu untersuchenden Zellen in einem geeigneten flüssigen Medium suspendiert und dann durch das Membranfilter filtriert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltene Suspension einer Vorfiltration unterzieht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem Abstrich auf einem Abstrichmaterial ausgeht, das in Wasser oder Elektrolytlösungen löslich ist und das Abstrichmaterial löst und dann die Suspension filtriert.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Vereinzelnung oder Isolierung von Zellen die aus den festen Zellpräparaten erhaltene Suspension geeignet verdünnt und einen aliquoten Anteil für die Filtration durch das Membranfilter entnimmt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,3 bis 10 ßm, insbesondere 2 bis 8 ijm filtriert.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Membranfilter ein Zellulosenitratfilter, vorzugsweise aus 2,5-Nitrat verwendet das mit einer Transparenzbadzusammensetzung aus n-Butylacetat/Methylacetat 4:1 transparent gemacht wird.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vorfiltration mit einem Haarsieb mit 60 bis 80 m Maschen- bzw. Porengröße durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Abstrichmittel Natriumalginat verwendet.
9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 umfassend - eine Einwegspritze mit aufsteckbarem Filtervorsatz, dessen Membranfilter aus porösem Kunststoff gebildet ist, - ein Fixierungsmittel zur Haltbarmachung organischer Zellen, - eine chemische Flüssigkeit zum Überführen des Membranfilters in einen transparenten Zustand, - ein chemisches Färbebad zum Anfärben der organischen Zellen und - einen transparenten Objektträger zur Aufnahme des Membranfilters nach Patent . ... ... (Patentanmeldung P 29 28 790.9), weiterhin gekennzeichnet durch ein in Wasser oder Elektrolytlösungen lösliches Abstrichmaterial in üblichen geeigneten Einheiten, ein Lösungsmittel dafür und einen weiteren Filtervorsatz mit einem Haarsieb oder Kunststoffilter mit einer Porenweite bzw. Maschenweite von etwa 60 bis 80 Rm.