WO2015193469A1 - Einbettmedium für biologische proben und verfahren zum herstellen von eingebetteten biologischen proben sowie deren verwendung - Google Patents
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Definitions
- the invention is directed to the use of a UV-polymerizable composition as a biological sample embedding medium.
- the application is directed to a method of making embedded biological samples using this UV-polymerizable composition, as well as these embedded biological samples themselves. These biological samples are useful and particularly useful in a variety of fields, including diagnostics also for RNA based diagnostics. Therefore, a further aspect is directed to a method for examining biological samples comprising an imaging method, a histological method and optionally a molecular biological method of the same sample under spatial correlation.
- an examination be carried out by means of imaging methods, such as those mentioned above, and, on the other hand, that diagnostic examinations of the sample are carried out, e.g. histological examinations or examinations and diagnostics on specimen sections including examinations at the nucleic acid level. So far, samples are embedded for histopathological assessment, cut, histologically stained and then assessed.
- these sections are additionally examined by means of laser microdissection with subsequent isolation of components, including RNA isolation and RNA diagnostics.
- RNA isolation and RNA diagnostics include RNA isolation and RNA diagnostics.
- the spatial correlation is often lost since the sections can only be viewed in two dimensions and a multitude of consecutive sections must be analyzed for the three-dimensional representation. Adjacent levels remain hidden in such a histopathological assessment.
- the evaluation of a sample by means of sections is only possible on a random basis and includes the risk, possibly important features, e.g. an incipient metastasis, overlooked.
- Such impairments can be overcome by three-dimensional imaging techniques such as OPT, SLOT, SPIM, ultramicroscopy (including multiphoton microscopy and scanning confocal microscopy).
- three-dimensional imaging techniques such as OPT, SLOT, SPIM, ultramicroscopy (including multiphoton microscopy and scanning confocal microscopy).
- OPT optical photon microscopy
- SPIM ultramicroscopy
- ultramicroscopy including multiphoton microscopy and scanning confocal microscopy
- Such embedding media are also referred to as Aufklarungsmedien.
- the embedding media hitherto mainly used for histology with corresponding carbons are selected so that they are suitable for two-dimensional investigations on thin sections, but not for three-dimensional investigations of tissue samples.
- These resins do not allow the provision of clear, ie transparent embedding media. That is, the media are transparent to the extent that they allow transmitted light or fluorescence microscopy, but they are not designed to suppress scattering of the light by the media. However, this is especially important in the three-dimensional imaging methods mentioned above.
- These systems used in histopathology are usually based on chemically initiated polymerized plastics.
- a significant problem is that the initiators necessary for the polymerization of the monomers must be added to the medium before embedding and infusing, and that these initiators then initiate polymerization to a certain extent and thus make infusion difficult. Accordingly, the desired quality of embedding without air bubbles, streaks, etc. can not be achieved.
- Kellner M. et al., J. Appl Physiol, 2012, 1 13, 975-983 describes the imaging of a mouse lung by SLOT using MS / BB. For subsequent histology, it is necessary to transfer the sample from the liquid MS / BB into a synthetic resin, here Technovit 8100, with several substitution steps.
- UV-curable media have the advantage that the sample is cured by irradiation of UV light, and thus prevents heating and thus possible destruction of molecules in the sample.
- the UV-polymerizable composition described therein is one based on a polymerizable organic compound and an alkoxysilane having a polymerizable group. It is described that with the materials mentioned, the adjustment of the refractive index with respect to the application can be adjusted.
- this object is achieved by using a UV-polymerizable composition as embedding medium for biological samples reached.
- UV-polymerizable compositions permit the provision of embedded biological samples with a cuttable plastic that allows the preparation of histological to electro-microscopic sections while allowing RNA extraction from the embedded samples.
- 3D imaging techniques such as 3D tomography examinations such as laser tomography methods, can be used to examine the specimen to obtain 3D models of the specimen.
- the samples show excellent storage stability and durability as well as good cuttability and are distinguished, in particular, by refractive indices which permit a three-dimensional imaging process of the sample.
- Such three-dimensional imaging methods are, in particular, the aforementioned tomography methods including OPT, SLOT, SPIM and ultramicroscopy.
- the UV-polymerizable compositions of the invention lead to Aufklarungsmedien that allow infusion and subsequent embedding of the three-dimensional biological samples.
- the term "embedding medium” is understood as meaning a medium which completely infuses the biological sample and into which the biological sample is embedded, so that this biological sample is protected from external influences .
- This clearing medium is a medium that appears clear, ie transparent, together with the sample, and thus allows the embedding medium to be irradiated with electromagnetic radiation, in particular visible and / or non-visible light, and thereby the least possible scattering of the light caused.
- this UV-polymerizable composition has a refractive index which substantially coincides with the refractive index of the sample.
- the medium according to the invention allows a good stability and storability, at a later time cuts and thus two-dimensional investigations including diagnostic investigations of molecules present in the sample, such as nucleic acid fragments including RNA extraction. to allow.
- the present application allows the correlative application of different single-sample analysis procedures by clearing the sample in a cuttable plastic that allows for the preparation of histological to electron microscopic sections while allowing RNA extraction from the embedded samples.
- successive models of the samples can be generated by laser tomography methods, followed by histopathological examinations, including the determination of the RNA expression pattern of the sample. These studies may be spaced apart due to the good storage stability of the sample.
- Correlative application or “correlation”, as the term is used herein, means that the data from the three-dimensional imaging procedure is related to the data obtained in the histological and optionally molecular biological procedures. This makes it possible to formations from the histological and, where appropriate, molecular biological methods into the three-dimensional image.
- the UV-polymerizable composition comprises a mercaptoester compound.
- Mercaptoesters include the group
- the radicals R 1 and R 2 are organyl groups, for example acryl groups or aryl groups.
- the person skilled in the art is familiar with suitable mercaptoester compounds. In one embodiment, this mercaptoester compound or mixture of various mercaptoester compounds is present in the composition at a level of at least 40% by weight.
- the proportion of mercaptoester compound may be in a range of 40 to 70 wt .-%, such as 45 to 65 wt .-%.
- a first mercaptoester compound may be present in a proportion of 40 to 60% by weight, while the second mercaptoester compound is present in an amount of 15 to 35% by weight.
- the UV-polymerizable compound further comprises a polymerizable acrylate and / or methacrylate compound.
- the content of the mercaptoester compound may be in a range of, for example, 40 to 70% by weight, while the proportion of the acrylate and / or methacrylate compounds may be in the range of 50 to 25% by weight
- Total amount of mercaptoester compounds and acrylate and / or methacrylate compounds is in the range of 45 to 80 wt .-%, such as 50 to 75 wt .-%, for example 60 to 70 wt .-%.
- Suitable mercaptoester compounds and suitable acrylate and / or methacrylate compounds are known to the person skilled in the art.
- Suitable acrylate and / or methacrylate compounds include tetrahydrofurfuryl methacrylate.
- the term “comprising” or “including” or “containing” includes embodiments of "consisting of”.
- the biological sample is, in particular, a three-dimensional biological sample, the smallest edge length of this biological sample being at least 50 ⁇ m, such as at least 100 ⁇ m.
- the biological sample is one of an animal, in particular a human.
- the samples embedded as embedding medium can not only be used in three-dimensional imaging processes in order to be able to depict the three-dimensional structure of the sample, but they also permit permanent storage of this sample and a subsequent one Further analysis of this, including a molecular biological analysis, such as a diagnostic, for example, at the nucleic acid level, such as RNA level.
- a molecular biological analysis such as a diagnostic, for example, at the nucleic acid level, such as RNA level.
- three-dimensional models can thus be created from one and the same sample, and two-dimensional analyzes can subsequently be carried out thereon. This makes it possible to correlate the results obtained in the two-dimensional steps with the previously created three-dimensional model.
- the corresponding histological and molecular-biological examinations on the section can be displayed in three-dimensional space.
- the present invention is directed to a method of making embedded biological samples, including embedded three-dimensional biological samples, particularly those where this three-dimensional sample has a minimum edge length of at least 50 ⁇ , such as at least 100 ⁇ .
- the method according to the invention comprises the steps of dehydrating the biological sample, infusing a UV-polymerizable composition, in particular a UV-polymerizable composition as defined herein, into the biological sample and curing it with light infused with the UV-polymerizable composition with a wavelength of ⁇ 470 nm.
- dehydration may be carried out, for example, by ascending alcohol series, such as an ascending ethanol series.
- an ascending DMSO series can be made.
- dehydration can be carried out using xylene.
- Pre-dehydration of the biological sample may be preceded by the step of fixing the biological sample.
- fixation includes, for example, one with aldehyde mixtures or alcohols.
- the person skilled in the art the appropriate fixing methods, as used for biological samples known. These are general fixation methods used in microscopy.
- the infusion of the UV-polymerizable composition is carried out in one embodiment in a vacuum.
- curing may also be carried out in a vacuum.
- the infusion of the biological sample with the UV-polymerizable composition allows a distribution of this composition in the biological sample, with as few as possible impurities impeding the imaging process.
- infiltration under reduced pressure allows the formation of air bubbles or streaks to prevent.
- the curing of the UV-polymerizable composition with radiation having a wavelength of ⁇ 470 nm can be continuous or discontinuous.
- the person skilled in the appropriate conditions are known or he can easily determine this. These depend in particular on the strength of the radiation source.
- the biological sample may be cooled during and / or during irradiation and / or discontinuous irradiation during and / or between exposures to prevent damage to tissue and molecules in the biological sample.
- the application is directed to embedded biological samples, particularly embedded three-dimensional biological samples having a minimum edge length of at least 50 ⁇ , such as at least 100 ⁇ obtainable using a UV-polymerizable composition as described herein or obtainable according to a method of the invention.
- the embedded biological sample, particularly the embedded three-dimensional biological sample is one in one aspect human or animal tissue sample. However, it is also possible to examine plant or mycological samples, etc.
- the embedded biological samples of the invention are advantageous because they allow the combination of three-dimensional microscopy, e.g. tomography, such as SLOT, and subsequent molecular profiling in histopathological analyzes.
- embedded biological samples according to the invention are particularly suitable for use in diagnostics and here in molecular diagnostics.
- An advantageous embodiment encompasses the use of the embedded biological samples in RNA-based diagnostics. It was surprisingly found that the embedded biological samples allow RNA extraction and thus RNA profiling of the sample even after prolonged storage. Thereby it is possible not only to create a three-dimensional model of the biological sample, but also a molecular profiling, e.g. to allow RNA expression.
- the invention provides the use of a kit or system for embedding biological samples comprising the UV-polymerizable composition described herein, this kit or system comprising UV-polymerizable compositions as a multicomponent, discrete composition wherein the desired refractive index is achieved by suitable mixing These two components can be adjusted. Alternatively, compositions may be provided whose refractive index is pre-set to a value based on the defined proportions of the components.
- the present application is directed to a method for examining a biological sample, which sample is subjected to both an imaging method and then a histological, and optionally molecular biological, method comprising the steps:
- step c) histological, and optionally molecular biological, examination of the sections obtained in step c).
- a corresponding selection of the cutting plane can be made in order to examine objects present there histologically and optionally molecular biologically. That means, on the one hand, a pre-selection of the cutting plane can be made on the basis of the 3D data. On the other hand, the object can be examined in randomly selected sections and then these data thus obtained are projected into the 3D model.
- the step of correlating the three-dimensional imaging from step b) with the histological and, if appropriate, molecular biological investigations from step d) continues to take place. That is, the data of the three-dimensional structure of the biological sample obtained in step b) can be correlated with the two-dimensional histologically determined data of the same sample.
- These histological data may optionally include molecular biological data, including RNA profiling.
- the imaging method may be a light-microscopic or tomographic method, in particular OPT; SLOT; SPIM and ultramicroscopy.
- the histological method is one involving a microdissection of individual regions, for example, individual cells. This can be done in particular by means of a laser microdissection.
- the method according to the invention may comprise a molecular biological method, in particular a diagnosis at the nucleic acid level.
- nucleic acid-level diagnostics may be RNA-based diagnostics, for example, RNA profiling.
- the sample is removed and optionally fixed.
- the sample is then dehydrated.
- the polymerization is carried out by means of UV radiation to obtain an inventive according to embedded biological sample.
- FIG. 3 schematically shows the processing steps of the method according to the invention for the examination of biological samples.
- the processing steps shown in FIG. 1 are carried out.
- the implementation of the imaging method for example using tomography methods.
- the preparation of optionally consecutive histological sections with suitable devices is followed.
- the resulting sections are subjected to histological examination.
- This histological examination may involve a molecular biology examination.
- a correlation of the data of the three-dimensional imaging, that is of the three-dimensional model then takes place with the histological and optionally molecular biological data obtained.
- the sample is removed and analyzed by known means, e.g. Washed sodium chloride solution and then fixed.
- the fixation is carried out by known means, e.g. with aldehyde mixtures, such as 4% p-formaldehyde or 0.1% glutaraldehyde.
- xylene was mixed with the UV-polymerizable agent in a proportion of 1: 1 and the sample was incubated overnight in a vacuum oven at ⁇ 100 mbar with this 1: 1 mixture. Then, the biological sample was treated with 100% UV-polymerizable composition for 6 hours in a vacuum oven at ⁇ 100 mbar.
- the UV-polymerizable sample was prepared from a mixture of NOA (Norland Optical Adhesive 68, Norland Products Inc., Cranbury, USA and Norland Optical Adhesive 71, Norland Products Inc., Cranbury, USA). The mixing ratio of these two components was adjusted so that the refractive index of this UV-polymerizable composition prior to polymerization has a value of about 1.523.
- NOA Norland Optical Adhesive 68, Norland Products Inc., Cranbury, USA
- Norland Optical Adhesive 71 Norland Products Inc., Cranbury, USA
- a preferred mixing ratio is one of 1: 7 of NOA 68: NOA 71.
- plastic blocks are polymerized parallel to the sample embedding with identical size as the sample embedding itself. These plastic blocks are then ground flat to prepare the refractive index measurement on the refractometer (Müller Abbe refractometer AR-4) and finally with a contact medium with a higher refractive index brought to the measuring prism.
- the polymerization can be continuous or discontinuous.
- Batch polymerization :
- the sample was held in syringes (3 to 5 ml fill, depending on sample size) filled with the UV-polymerizable composition and an additional sample holder device.
- the sample was polymerized by alternating phases of 1 minute UV light (Leica EM AFS2) and 1 minute while cooling at 4 ° C. After 30 minutes, the syringe was inverted and the previously attached additional sample holder device was removed so that the sample is positioned in the center of the syringe. Subsequently, the polymerization was continued in alternating steps of UV and cooling and finally terminated by continuous irradiation with UV at room temperature.
- FIG. 2 shows the detection of RNA from a human lung sample embedded according to the invention.
- RNA from a human lung sample embedded according to the invention After embedding the sample according to the invention, it was microscopically examined by means of SLOT (A), and then sections of 4 ⁇ m thick were prepared and stained with hemalum (B). Areas of interest were excised with a laser microdissection system (B section) and incubated overnight in proteinase K buffer. This was followed by purification of the suspended RNA in the supernatant by phenol-chloroform precipitation, the synthesis of cDNA and amplification with suitable primers were carried out by known methods.
- RNA expression profile Shown is an RNA expression profile with the following markers: Polyr2a (polymerase 2alpha), BMP4 (bone morphogenic protein 4), CD34, ACTA2 (alpha-2 smooth muscle actin), COL3A1 (collagen 3A1), TIMP1 (metallopeptidase inhibitor 1), MMP2 (Matix Metalloprotease 2), CD14.
- RNA extraction, transcription and amplification of the cDNA was carried out by known methods.
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Abstract
In einem ersten Aspekt richtet sich die Erfindung auf die Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung als Einbettmedium für biologische Proben. Diese UV-polymerisierbare Zusammensetzung ist eine mit einem Brechungsindex nach Polymerisation im Bereich von n = 1,45bis n = 1,6. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf ein Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben unter Verwendung dieser UV-polymerisierbaren Zusammensetzung sowie um diese eingebetteten biologischen Proben selbst. Diese biologischen Proben sind in verschiedensten Bereichen, unter anderem der Diagnostik, einsetzbar und eignen sich insbesondere auch zur RNA basierten Diagnostik.
Description
Einbettmedium für biologische Proben und Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben sowie deren Verwendung
In einem ersten Aspekt richtet sich die Erfindung auf die Verwendung einer UV- polymerisierbaren Zusammensetzung als Einbettmedium für biologische Proben. Diese UV-polymerisierbare Zusammensetzung ist eine mit einem Brechungsindex nach Polymerisation im Bereich von n = 1 ,45 bis n = 1 ,6. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf ein Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben unter Verwendung dieser UV-polymerisierbaren Zusammensetzung sowie um diese eingebetteten biologischen Proben selbst. Diese biologischen Proben sind in verschiedensten Bereichen, unter anderem der Diagnostik, einsetzbar und eignen sich insbesondere auch zur RNA basierten Diagnostik. Daher richtet sich ein weiterer Aspekt auf ein Verfahren zur Untersuchung biologischer Proben umfassend ein bildgebendes Verfahren, ein his- tologisches Verfahren und gegebenenfalls ein molekularbiologisches Verfahren derselben Probe unter räumlicher Korrelation.
Stand der Technik Bei lichtmikroskopischen Bildgebungsverfahren wie OPT (Optical Projection To- mography), SLOT (Scanning Laser Optical Tomography), SPIM (Lichtscheiben- fluoreszenzmikroskopie) oder UM (Ultramikroskopie), bei dem die fixierte Probe
im Licht (üblicherweise Laserlicht) kontrolliert bewegt wird, kommt es häufig zu ungewünschten Bewegungen der Probe oder innerhalb der Probe, wodurch die Rekonstruktion der Datensätze erschwert wird. Es kommt zu Bewegungsartefakten und/oder die Zuordnung der einzelnen Bildebenen zueinander (z.B. bei SPIM) ist erschwert. Gerade bei biologischen Proben ist es weiterhin gewünscht, dass einerseits eine Untersuchung durch Bildgebungsmethoden, wie den oben genannten, erfolgt, und andererseits diagnostische Untersuchungen der Probe durchgeführt werden, z.B. histologische Untersuchungen oder Untersuchungen und Diagnostik an Proben-Schnitten einschließlich Untersuchungen auf Nuklein- säureebene. Bisher werden Proben zur histopathologischen Beurteilung eingebettet, geschnitten, histologisch gefärbt und anschließend beurteilt. Teilweise werden diese Schnitte zusätzlich mittels Lasermikrodissektion mit anschließender Isolierung von Bestandteilen, einschließlich RNA-Isolierung und RNA- Diagnostik, untersucht. Bei solchen Untersuchungen geht aber häufig die räum- liehe Korrelation verloren, da auf den Schnitten ausschließlich eine zweidimensionale Betrachtung erfolgen kann und zur dreidimensionalen Darstellung eine Vielzahl von konsekutiven Schnitten analysiert werden müssten. Benachbarte Ebenen bleiben bei einer solchen histopathologischen Beurteilung verborgen. Darüber hinaus ist die Beurteilung einer Probe anhand von Schnitten immer nur stichprobenartig möglich und beinhaltet das Risiko, möglicherweise wichtige Besonderheiten, z.B. eine beginnende Metastasierung, zu übersehen.
Solche Beeinträchtigungen können durch dreidimensionale Bildgebungsverfah- ren wie die oben genannten OPT, SLOT, SPIM, Ultramikroskopie (einschließlich Multiphotonenmikroskopie und scannende Konfokalmikroskopie) überwunden werden. Zu einer solchen Untersuchung mit den oben genannten Bildgebungs- verfahren ist es aber notwendig, dass die Probe in einer transparenten, d.h. durchsichtigen und die Bildgebungsmethode möglichst nicht beeinflussenden Art und Weise, eingebettet ist. Eine solche Anpassung bedeutet insbesondere, dass die Brechungsindizes der Probe und des Einbettmediums möglichst übereinstimmen, so dass eine möglichst geringe Streuung des Lichts während des Durchleuchtens auftritt.
Es sind optimierte Einbettmedien bekannt, die eine optische Untersuchung mit dreidimensionalen Bildgebungsverfahren erlauben. Diese sind in ihrem Brechungsindex an die zu untersuchende Probe angepasst, um Brechungsartefakte aufheben, sodass elektromagnetische Wellen, wie Licht (sichtbares und nichtsichtbares Licht), möglichst unbeeinflusst durchgeführt werden können. Solche Einbettmedien werden auch als Aufklarungsmedien bezeichnet.
Nachteil dieser Aufklarungsmedien ist, dass sie ausschließlich im flüssigen Zu- stand vorliegen. Als Flüssigkeit mit aufklarender Wirkung, d.h. geeignet für dreidimensionale Bildgebungsmethoden, sind Stoffe wie MS/BB (Methylsalicylsäu- re/Benzylbenzoat), BABB (Benzylbenzoat/Benzylalkohol), Glycerin, Scale, und Xylol beschrieben. Diese flüssigen Aufklarungsmedien erlauben zwar die Anpassung des Brechungsindex dieser Medien an für das Licht notwendige Brechungsindices und erlauben eine optimierte Lichtausbeute bei entsprechenden Untersuchungen (d.h. eine„Aufklarung der Probe"), eine dauerhafte Immobilisierung der zu untersuchenden Probe, d.h. eine Dauerhaftigkeit und Färbbarkeit sowie Schneid- barkeit ist allerdings nicht gegeben. Dies hat zur Folge, dass lasertomographi- sche Ansätze, wie OPT und SLOT, mit Proben, die anschließend weiteren histo- pathologischen Untersuchungen unterworfen werden sollen, nur bedingt bis gar nicht durchgeführt werden können. Zu möglichen Einbettungsverfahren und Einbettungsmedien gibt es vor allem auf dem Gebiet der Histologie umfangreiche Untersuchungen. So werden unter anderem für die Histologie Kunstharze eingesetzt, die in Bezug auf Schneidbarkeit, Dauerhaftigkeit und Färbbarkeit optimiert sind, der Aspekt der Transparenz, also einer Unterdrückung von Licht-Streuung innerhalb der Probe wurde aber bisher vernachlässigt. Das heißt, die Anpassung des Einbettmediums an die Probe, um eine optische Aufklarung der Probe zu ermöglichen, wurde bisher nicht berücksichtigt. Die bisher überwiegend für die Histologie eingesetzten Einbettmedien
mit entsprechenden Kohlenstoffen sind derart ausgewählt, dass sie für zweidimensionale Untersuchungen an Dünnschnitten geeignet sind, nicht aber für dreidimensionale Untersuchungen von Gewebeproben. Diese Kunstharze erlauben keine Bereitstellung von klaren, d.h. durchsichtigen Einbettmedien. D.h., die Medien sind zwar insoweit transparent, dass sie Durchlicht- oder Fluoreszenzmikroskopie erlauben, sie sind allerdings nicht darauf abgestimmt, eine Streuung des Lichts durch die Medien zu unterdrücken. Dieses ist aber gerade in den oben genannten dreidimensionalen Bildgebungsverfahren wichtig. Diese in der Histopathologie verwendeten Systeme beruhen üblicherweise auf chemisch gestarteten polymerisierten Kunststoffen. Es gibt hierzu verschiedene Kunststoffe üblicherweise auf Basis von Epoxiden, Acrylen oder Acrylaten bzw. Methacrylaten. Meist ist weiterhin eine thermische Polymerisierung des Mediums notwendig. Eine solche Polymerisierung über Wärmezufuhr ist aber für die zu untersuchende Struktur selbst schädlich. Insbesondere werden durch diese Wärmezufuhr empfindliche Moleküle, z.B. Nukleinsäuremoleküle, wie RNA- Moleküle, zerstört.
Ein wesentliches Problem ist weiterhin, dass die zur Polymerisation der Mono- mere notwendigen Starter vor dem Einbetten und Infundieren zu dem Medium hinzugegeben werden müssen und dass diese Starter dann bereits in einem gewissen Umfang die Polymerisation initiieren und somit das infundieren erschweren. Entsprechend kann die gewünschte Qualität des Einbettens ohne Luftblasen, Schlieren, etc. nicht erreicht werden.
Kellner M. et al ., J. Appl Physiol, 2012, 1 13, 975-983 beschreibt die Darstellung einer Mäuselunge mittels SLOT unter Verwendung von MS/BB. Für die anschließend erfolgte Histologie ist das Umbetten der Probe aus dem flüssigen MS/BB in ein Kunstharz, hier Technovit 8100, mit mehreren Substitutionsschrit- ten notwendig.
Zur Lösung des Problems der Einbettung einer biologischen Probe bei gleichzei-
tiger Aufklarung wurde von Chung K. et al ., Nature, 201 3, 497, 332 ein als„Cla- rity" bezeichnetes Verfahren beschrieben. Dieses Verfahren basiert auf der Verwendung von Acrylamid und Bisacrylamid sowie Formaldehydkohlenstoffen, die erst infundiert und anschließend bei Wärme hybridisiert werden. Diesem schließt sich ein elektrophoretisches Verfahren an, um ein Aufklaren der immobilisierten Probe zu erreichen. Die so hergestellten Proben sind allerdings als Hydrogele tendenziell zu weich zur weiteren Verarbeitung, insbesondere einem Schneiden. Eine Langzeitlagerung bzw. ein Aufbereiten für eine anschließende Histologie ist zudem bei dieser Methodik ohne zusätzliche Arbeitsschritte nicht möglich.
Aus der DE 10 2012 210 185 ist ein UV-härtbares Einbettmedium für die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie bekannt. UV-härtbare Medien haben den Vorteil, dass die Probe durch Einstrahlung von UV-Licht ausgehärtet wird, und somit ein Erwärmen und somit mögliches Zerstören von Molekülen in der Probe verhindert wird. Die dort beschriebene UV-polymerisierbare Zusammensetzung ist eine auf Basis einer polymerisierbaren organischen Verbindung und eines Alkoxysilans mit einer polymerisierbaren Gruppe. Dabei wird beschrieben, dass mit den genannten Werkstoffen die Einstellung des Brechungsindex im Hinblick auf den Anwendungszweck angepasst werden kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von neuen zum Infundieren von Proben geeigneten Einbettmedien, die eine Probenaufklarung für sowohl dreidimensionale Bildgebungsverfahren als auch für ein molekulares Profi- ling z.B. von entsprechend hergestellten histologischen Schnitten, an ein und derselben Probe erlaubt. Das heißt, die Erfindung richtet sich auf ein Einbettmedium, dass sowohl für die genannten Bildgebungsverfahren geeignet ist, als auch für histologische Untersuchungen an derselben Probe geeignet ist, einschließlich guter Schneidbarkeit und guter Lagerfähigkeit der Probe, sowie molekularbiologischen Untersuchungen hieran auch zu einem späteren Zeitpunkt.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch Verwendung einer UV- polymerisierbaren Zusammensetzung als Einbettmedium für biologische Proben
erreicht. Diese UV-polymerisierbaren Zusammensetzungen erlauben die Bereitstellung von eingebetteten biologischen Proben mit einem schneidbaren Kunststoff, der die Anfertigung von histologischen bis hin zu elektromikroskopischen Schnittpräparaten ermöglicht und gleichzeitig eine RNA-Extraktion aus den ein- gebetteten Proben erlaubt. Vorab können 3D-Bildgebungsverfahren, wie 3D- Tomographieuntersuchungen z.B. Lasertomographiemethoden zur Untersuchung der Probe eingesetzt werden, um 3D-Modelle der Probe zu erhalten.
Erfindungsgemäß ist es somit unter Verwendung der beschriebenen UV- polymerisierbaren Zusammensetzung möglich, sowohl 3D-Modelle der Probe zu erzeugen, als auch nachfolgend diagnostische Verfahren einschließlich Untersuchungen der RNA-Expression zu erlauben.
Die Proben zeigen dabei eine hervorragende Lagerbeständigkeit und Dauerhaf- tigkeit sowie gute Schneidbarkeit auf und zeichnen sich insbesondere durch solche Brechungsindices aus, die ein dreidimensionales Bildgebungsverfahren der Probe erlauben. Solche dreidimensionalen Bildgebungsverfahren sind insbesondere die genannten Tomographieverfahren einschließlich OPT, SLOT, SPIM und Ultramikroskopie. Die erfindungsgemäßen UV-polymerisierbaren Zusammenset- zungen führen zu Aufklarungsmedien, die ein Infundieren und anschließendes Einbetten der dreidimensionalen biologischen Proben erlauben.
Vorliegend wird unter dem Begriff„Einbettungsmedium" ein Medium verstanden, das die biologische Probe vollständig infundiert und in das die biologische Probe eingebettet wird, sodass diese biologische Probe vor äußeren Einwirkungen geschützt wird. Ein solches Einbettungsmedium wird vorliegend auch als„Aufkla- rungsmedium" bezeichnet. Dieses Aufklarungsmedium ist ein Medium, das mit der Probe zusammen klar, d.h. transparent, erscheint und somit dem Einbettmedium eine Durchstrahlung der Probe mit elektromagnetischer Strahlung, insbe- sondere sichtbarem und/oder nicht-sichtbarem Licht, erlaubt und dabei eine möglichst geringe Streuung des Lichtes verursacht. Erfindungsgemäß weist diese UV-polymerisierbare Zusammensetzung daher einen Brechungsindex auf, der
mit dem Brechungsindex der Probe im Wesentlichen übereinstimmt.
Erfindungsgemäß ist daher der Brechungsindex der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung nach Polymerisation im Bereich von n = 1 ,45 bis n = 1 ,6. Be- vorzugt ist dieser Bereich in einem Bereich von n = 1 ,550 bis n = 1 ,565. In einer Ausführungsform ist der Brechungsindex dabei einer im Bereich von 1 ,552 bis 1 ,559.
Es zeigte sich, dass für eine Vielzahl von biologischen Proben ein solcher Bre- chungsindex geeignet ist, diese biologische Probe sowohl in bildgebenden dreidimensionalen Verfahren wie den genannten lichtmikroskopischen Bildgebungs- verfahren einzusetzen. Weiterhin erlaubt das erfindungsgemäße Medium eine gute Beständigkeit und Lagerfähigkeit, um zu einem späteren Zeitpunkt Schnitte und somit zweidimensionale Untersuchungen einschließlich diagnostischen Un- tersuchungen zu in der Probe vorliegenden Molekülen, wie Nukleinsäurefrag- menten einschließlich einer RNA-Extraktion. zu erlauben.
Die vorliegende Verwendung ermöglicht die korrelative Anwendung unterschiedlicher Analyseverfahren mit einer einzigen Probe durch Aufklarung der Probe im einen schneidbaren Kunststoff, der die Anfertigung von histologischen bis hin zu elektronenmikroskopischen Schnittpräparaten erlaubt und gleichzeitig RNA- Extraktion aus den eingebetteten Proben erlaubt. Somit können nacheinander durch Lasertomographie-Methoden Modelle der Proben erzeugt werden und anschließend histopathologische Untersuchungen einschließlich der Bestimmung der RNA-Expressionsmuster der Probe durchgeführt werden. Diese Untersuchungen können aufgrund der guten Lagerbeständigkeit der Probe zeitlich auseinander liegen.
„Korrelative Anwendung" oder „Korrelation", wie der Ausdruck hierin benutzt wird, bedeutet, dass die Daten aus dem dreidimensionalen bildgebenden Verfahren in Bezug gesetzt werden mit den Daten erhalten in den histologischen und gegebenenfalls molekularbiologischen Verfahren. Damit ist es möglich, die In-
formationen aus dem histologischen und gegebenenfalls molekularbiologischen Verfahren in das dreidimensionale Bild zu projizieren.
In einer Ausführungsform umfasst die UV-polymerisierbare Zusammensetzung eine Mercaptoester-Verbindung. Mercaptoester umfassen die Gruppe
R1 -(C=O)-S-R2 und werden auch als Thioester oder Thiolester bezeichnet. Dabei sind die Reste R1 und R2 Organylgruppen z.B. Acrylgruppen oder Arylgrup- pen. Bei den Mercaptoestern kann es sich gegebenenfalls auch um Thionester handeln, d.h. Verbindungen mit der Gruppe R1 -(C=S-O)-R2. Dem Fachmann sind geeignete Mercaptoester-Verbindungen bekannt. In einer Ausführungsform liegt diese Mercaptoester-Verbindung oder Mischung verschiedener Mercaptoester-Verbindungen in der Zusammensetzung mit einem Anteil von mindestens 40 Gew.-% vor. Der Anteil der Mercaptoester-Verbindung kann dabei in einem Bereich von 40 bis 70 Gew.-%, wie 45 bis 65 Gew.-% liegen. In einer weiteren Aus- führungsform können die Mercaptoester-Anteile einer Mercaptoester-Verbindung oder einer Mischung von Mercaptoester-Verbindungen in einer Menge von 40 bis 85 Gew.-%, wie 50 bis 80 Gew.-% z.B. 55 bis 75 Gew.-% vorliegen. Dabei kann eine erste Mercaptoester-Verbindung mit einem Anteil von 40 bis 60 Gew.- % vorliegen, während die zweite Mercaptoester-Verbindung mit einem Anteil von 15 bis 35 Gew.-% vorliegt. Diese beiden Mercaptoester-Verbindungen werden dabei derart in ihren Anteilen zugegeben, dass der Gesamtanteil an Mercaptoester-Verbindungen im oben genannten Bereich liegt, z.B. im Bereich von 50 bis 80 Gew.-%, wie 55 bis 75 Gew.-%. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die UV-polymerisierbare Verbindung weiterhin eine polymerisierbare Acrylat- und/oder Methacrylat-Verbindung. In dieser Verbindung kann der Anteil an der Mercaptoester-Verbindung in einem Bereich von z.B. 40 bis 70 Gew.-% liegen, während der Anteil der Acrylat- und/oder Methacrylat-Verbindungen im Bereich von 50 bis 25 Gew.-% liegt, der Gesamtanteil an Mercaptoester-Verbindungen und Acrylat- und/oder Methacrylat-Verbindungen liegt dabei im Bereich von 45 bis 80 Gew.-%, wie 50 bis 75 Gew.-% z.B. 60 bis 70 Gew.-%.
Geeignete Mercaptoester-Verbindungen und geeignete Acrylat- und/oder Me- thacrylat-Verbindungen sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Acrylat- und/oder Methacrylat-Verbindungen umfasst Tetrahydrofurfurylmethacrylat.
In einer Ausführungsform ist die UV-polymerisierbare Zusammensetzung dabei eine, die vor Polymerisation einen Brechungsindex im Bereich von n = 1 ,45 bis 1 ,6, wie n = 1 ,50 bis 1 ,55 aufweist. Soweit nicht anders ausgeführt umfasst der Ausdruck„umfassend" oder„beinhaltend" oder„enthaltend" Ausführungsformen von„bestehend aus".
Soweit nicht anders angegeben umfassen die unbestimmten Artikel„ein" und die bestimmten Artikel „der" sowohl einen als auch mehrere dieser bezeichneten Gegenstände.
Bei der biologischen Probe handelt es sich insbesondere um eine dreidimensionale biologische Probe, wobei die kleinste Kantenlänge dieser biologischen Probe mindestens 50 μιτι, wie mindestens 100 μιτι ist.
In einer Ausführungsform ist die biologische Probe eine aus einem Tier, insbesondere aus einem Menschen.
Es zeigte sich, dass unter der erfindungsgemäßen Verwendung der UV- polymerisierbaren Zusammensetzung die als Einbettmedium eingebetteten Proben nicht nur in dreidimensionalen Bildgebungsverfahren eingesetzt werden können, um die dreidimensionale Struktur der Probe darstellen zu können, sondern sie erlaubt auch eine dauerhafte Lagerung dieser Probe und eine spätere weitere Analyse hiervon einschließlich einer molekularbiologischen Analyse, wie einer Diagnostik z.B. auf Nukleinsäureebene, wie RNA-Ebene. Überraschenderweise zeigte sich, dass unter Verwendung der erfindungsgemäßen UV- polymerisierbaren Zusammensetzung in dieser so eingebetteten Probe auch
nach einem längeren Lagern von einigen Monaten, z.B. von über sechs Monaten, molekularbiologische Untersuchungen einschließlich Isolierung und Bestimmung des Expressionsprofils von RNA. D.h., aus diesen erfindungsgemäß eingebetteten Proben war nach einem Zeitraum von über sechs Monaten die Herstellung von RNA-Profilen und Untersuchung von RNA-Expressionsmustern möglich.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können somit von ein und derselben Probe sowohl dreidimensionale Modelle erstellt als auch daran anschließend zweidimensionale Analysen durchgeführt werden. Dadurch ist eine Korrelation der in den zweidimensionalen Schritten erhaltenen Ergebnisse mit dem vorher erstellten dreidimensionalen Modell möglich. Die entsprechenden histologischen und molekularbiologischen Untersuchungen am Schnitt sind im dreidimensionalen Raum darstellbar.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben einschließlich eingebetteten dreidimensionalen biologischen Proben, insbesondere solche, wo diese dreidimensionale Probe eine kleinste Kantenlänge von mindestens 50 μιτι, wie mindestens 100 μιτι aufweist. Hierzu umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte des Entwässerns der biologischen Probe, des Infundierens einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung, insbesondere einer UV- polymerisierbaren Zusammensetzung wie vorliegend definiert, in die biologische Probe und ein Härten hiervon mit der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung infundierten biologischen Probe mit Licht mit einer Wellenlänge von <470 nm.
Dem Fachmann sind geeignete Verfahren zum Entwässern von biologischen Proben bekannt. Ein solches Entwässern kann z.B. mittels aufsteigender Alkoholreihe, wie einer aufsteigenden Ethanol-Reihe durchgeführt werden. Alternativ hierzu kann eine aufsteigende DMSO-Reihe erfolgen. Gegebenenfalls daran anschließend kann ein Entwässern mittels Xylol durchgeführt werden.
Dem Entwässern der biologischen Probe voran kann der Schritt des Fixierens der biologischen Probe stehen. Ein solches Fixieren umfasst z.B. eines mit Aldehydgemischen oder Alkoholen. Dem Fachmann sind die geeigneten Fixierverfahren, wie sie für biologische Proben eingesetzt werden, bekannt. Es handelt sich hierbei um allgemeine Fixierverfahren wie sie in der Mikroskopie verwendet werden.
Das Infundieren der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung erfolgt in einer Ausführungsform im Unterdruck. Gegebenenfalls kann auch das Härten im Un- terdruck erfolgen. Das Infundieren der biologischen Probe mit der UV- polymerisierbaren Zusammensetzung erlaubt eine Verteilung dieser Zusammensetzung in der biologischen Probe, wobei möglichst wenige das Bildgebungsver- fahren beeinträchtigende Verunreinigungen vorliegen. Insbesondere erlaubt das Infundieren im Unterdruck die Bildung von Luftblasen oder Schlieren zu verhin- dem.
Das Härten der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung mit einer Strahlung mit einer Wellenlänge von < 470 nm kann kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Dem Fachmann sind die geeigneten Bedingungen bekannt bzw. er kann diese einfach bestimmen. Diese hängen insbesondere auch von der Stärke der Strahlungsquelle ab. Gegebenenfalls kann die biologische Probe während des Einstrahlens und Härtens oder/und bei diskontinuierlicher Bestrahlung während und/oder zwischen den Einstrahlungen gekühlt werden, um Schädigungen von Gewebe und Molekülen in der biologischen Probe zu verhindern.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf eingebettete biologische Proben, insbesondere eingebettete dreidimensionale biologische Proben mit einer kleinsten Kantenlänge von mindestens 50 μιτι, wie mindestens 100 μιτι erhältlich unter Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung wie hierin beschrieben oder erhältlich gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren. Bei der eingebetteten biologischen Probe, insbesondere der eingebetteten dreidimensionalen biologischen Probe, handelt es sich in einem Aspekt um eine
humane oder tierische Gewebeprobe. Es können aber auch pflanzliche oder my- kologische Proben etc. untersucht werden.
Die erfindungsgemäßen eingebetteten biologischen Proben sind vorteilhaft, da sie die Kombination einer dreidimensionalen Mikroskopie, z.B. einer Tomographie, wie SLOT, und ein nachfolgendes molekulares Profiling im Rahmen von histopathologischen Analysen erlauben.
Diese erfindungsgemäßen eingebetteten biologischen Proben sind dabei insbe- sondere zur Verwendung in der Diagnostik und hier in der molekularen Diagnostik geeignet. Eine vorteilhafte Ausführungsform umfasst dabei die Verwendung der eingebetteten biologischen Proben in der RNA basierten Diagnostik. Es zeigte sich überraschend, dass die eingebetteten biologischen Proben auch nach längerer Lagerung eine RNA-Extraktion und somit ein RNA-Profiling der Probe erlauben. Dadurch ist es möglich, nicht nur ein dreidimensionales Modell der biologischen Probe zu erstellen, sondern auch ein molekulares Profiling z.B. der RNA-Expression zu ermöglichen.
Aufgrund der transparenten Eigenschaften des Einbettmediums ist es weiterhin möglich, mit geeignetem Verfahren auch in der noch nicht geschnittenen dreidimensionalen Probe vorliegende Markermoleküle, z.B. Farbstoffe, Antikörper etc. nachzuweisen.
Die Verwendung solcher eingebetteten biologischen Proben ist vielfältig. Wie ausgeführt kann die mikroskopische Diagnostik um die dritte Dimension erweitert werden. Histopathologische Veränderungen können im räumlichen Kontext beurteilt werden. Weiterhin ist es möglich diese Proben aus der embryonalen Entwicklungsforschung im Bereich der Regenerationsmedizin und der Stammzellbiologie einzusetzen, aber auch in der Diagnostik von Tumorerkrankungen und möglicher Metastasierung von Geweben.
Erfindungsgemäß können somit unterschiedlichste Gewebetypen, wie Gehirn,
Knochen und Knorpel z.B. Arthritismodelle, aber auch Lymphknoten bei Krebserkrankungen (z.B. zur Untersuchung von Metastasierung) aber auch Entzündungen und Fibrosen sowie Emphyseme untersucht werden. Die Erfindung stellt schließlich die Verwendung eines Kits oder eines Systems zum Einbetten von biologischen Proben umfassend die vorliegend beschriebene UV-polymerisierbare Zusammensetzung bereit, dieses Kit oder System umfasst dabei UV-polymerisierbare Zusammensetzungen als mehrkomponentige, getrennt vorliegende Zusammensetzung, wobei der gewünschte Brechungsindex durch geeignetes Mischen dieser beiden Komponenten eingestellt werden kann. Alternativ können Zusammensetzungen bereitgestellt werden, deren Brechungsindex aufgrund der definierten Anteile der Komponenten vorab auf einen Wert eingestellt ist.
Schließlich richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe, wobei diese Probe sowohl einem bildgebendem Verfahren und anschließend einem histologischen, und gegebenenfalls molekularbiologischen, Verfahren unterworfen wird, umfassend die Schritte:
a) Herstellen von eingebetteten biologischen Proben, mit einem erfindungsgemäßen Verfahren;
b) Durchführen eines dreidimensionalen Bildgebungsverfahrens;
c) Herstellung von gegebenenfalls konsekutiven histologischen Schnitten der in a) hergestellten und in b) einem dreidimensionalen Bildgebungsverfah- ren unterworfenen biologischen Probe;
d) histologische, und gegebenenfalls molekularbiologische, Untersuchung der in Schritt c) erhaltenen Schnitte.
Wie bereits oben ausgeführt kann aufgrund der 3D Daten eine entsprechende Auswahl der Schnittebene erfolgen, um dort vorliegende Objekte histologisch und gegebenenfalls molekularbiologisch zu untersuchen. Das heißt, einerseits kann auf Basis der 3D Daten eine Vorauswahl der Schnittebene erfolgen. Andererseits kann das Objekt in zufällig ausgewählten Schnitten untersucht und dann
diese so erhaltenen Daten in das 3D Modell projiziert werden.
In einer Ausführungsform findet dabei weiterhin der Schritt der Korrelation der dreidimensionalen Bildgebung aus Schritt b) mit den histologischen und den ge- gebenenfalls molekularbiologischen Untersuchungen aus Schritt d) statt. Das heißt, die im Schritt b) erhaltenen Daten der dreidimensionalen Struktur der biologischen Probe können korreliert werden mit den zweidimensionalen histologisch bestimmten Daten derselben Probe. Diese histologischen Daten können dabei gegebenenfalls molekularbiologische Daten, einschließlich RNA-Profiling, enthalten.
Das bildgebende Verfahren kann dabei ein lichtmikroskopisches oder Tomographieverfahren sein, insbesondere OPT; SLOT; SPIM und Ultramikroskopie.
In einem Aspekt ist dabei das histologische Verfahren eines umfassend eine Mikrodissektion von einzelnen Bereichen, zum Beispiel einzelnen Zellen . Dieses kann insbesondere mithilfe einer Laser-Mikrodissektion erfolgen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dabei ein molekularbiologisches Verfahren umfassen, insbesondere eine Diagnostik auf Nukleinsäureebene. Eine sol- che Diagnostik auf Nukleinsäureebene kann eine RNA basierte Diagnostik sein, zum Beispiel ein RNA-Profiling.
Die Erfindung wird unter Bezug auf die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Dabei werden in der Figur 1 schematisch die Bearbeitungsschritte dargestellt:
In einem ersten Schritt wird die Probe entnommen und gegebenenfalls fixiert. Die Probe wird anschließend entwässert. Daran anschließend erfolgt das Infun- dieren des erfindungsgemäßen Einbettmediums mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung nachdem diese entsprechend hergestellt wurde. Anschließend erfolgt die Polymerisation mittels UV-Einstrahlung zum Erhalt einer erfindungs-
gemäß eingebetteten biologischen Probe.
In der Figur 3 sind schematisch die Bearbeitungsschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Untersuchung von biologischen Proben dargestellt. Dabei werden die in der Figur 1 dargestellten Bearbeitungsschritte durchgeführt. Hieran schließt sich die Durchführung des Bildgebungsverfahrens an, zum Beispiel mithilfe von Tomographieverfahren. Darauf folgt in einem weiteren Schritt die Herstellung von gegebenenfalls konsekutiven histologischen Schnitten mit geeigneten Vorrichtungen.
Daran anschließend werden die so erhaltenen Schnitte einer histologischen Untersuchung unterworfen. Diese histologischen Untersuchung kann eine molekularbiologische Untersuchung beinhalten . In einer Ausführungsform findet anschließend eine Korrelation der Daten der dreidimensionalen Bildgebung, das heißt des dreidimensionalen Modells, mit den histologischen und gegebenenfalls molekularbiologischen erhaltenen Daten statt. Beispiel 1
Die Probe wird entnommen und mit bekannten Mitteln, z.B. Natriumchloridlösung gewaschen und anschließend fixiert. Die Fixierung erfolgt mit bekannten Mitteln, z.B. mit Aldehydgemischen, wie 4% p-Formaledhyd oder 0,1 % Glutaraldehyd.
Die so fixierten Proben werden anschließend in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und anschließend in Xylol überführt. Die Schritte waren dabei wie folgt: 30% Ethanol in destilliertem Wasser, 2-4 Stunden,
50% Ethanol in destilliertem Wasser, 2-4 Stunden,
70% Ethanol in destilliertem Wasser, 2-4 Stunden,
90% Ethanol in destilliertem Wasser, über Nacht,
99,8% Ethanol, 4 Stunden,
100% Ethanol, 4 Stunden,
50% Ethanol/50% Xylol, über Nacht,
100% Xylol, 4 Stunden,
100% Xylol, 4 Stunden.
Anschließend wurde Xylol mit dem UV-polymerisierbaren Mittel in einem Anteil von 1 :1 vermischt und die Probe wurde über Nacht im Vakuumschrank bei < 100 mbar mit dieser 1 :1 Mischung inkubiert. Dann wurde die biologische Probe mit 100% UV-polymerisierbarer Zusammensetzung 6 Stunden im Vakuumschrank bei < 100 mbar behandelt.
Herstellung der UV-polymerisierbaren Probe:
Die UV-polymerisierbare Probe wurde aus einer Mischung von NOA (Norland Optical Adhesive 68, Norland Products Inc., Cranbury, USA und Norland Optical Adhesive 71 , Norland Products Inc., Cranbury, USA) hergestellt. Das Mischungsverhältnis dieser beiden Bestandteile wurde dabei so eingestellt, dass der Brechungsindex dieser UV-polymerisierbaren Zusammensetzung vor Polymerisation einen Wert von ca. 1 ,523 aufweist.
Ein bevorzugtes Mischungsverhältnis ist dabei eines von 1 :7 von NOA 68:NOA 71 .
Erfindungsgemäß erfolgt eine 24-stündige Polymerisation als Aushärtung dieses Kunststoffes, die zu einem Brechungsindex von ca. 1 ,556 führte. Zur Messung des Brechungsindex im Polymer werden parallel zu den Probeneinbettungen Kunststoffblöcke polymerisiert mit identischer Größe wie die Probeneinbettungen selbst. Diese Kunststoffblöcke werden dann zur Vorbereitung der Brechungsindexmessung am Refraktometer (Müller Abbe Refraktometer AR-4) plan geschliffen und schlussendlich mit einem Kontaktmedium mit höherem Brechungsindex
auf das Messprisma gebracht.
Die Polymerisation kann kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Diskontinuierliche Polymerisation:
Die Probe wurde für die Aushärtung in Spritzen (Füllmenge 3 bis 5 ml, je nach Probengröße) gefüllt mit der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung und einer zusätzlichen Probenhalterungsvorrichtung gehaltert. Hierzu wurde die Probe durch alternierende Phasen von je 1 Minute UV-Licht (Leica EM AFS2) und 1 Minute unter Kühlung bei 4°C anpolymerisiert. Nach 30 Minuten wurde die Spritze umgedreht und die zuvor angebrachte zusätzliche Probenhalterungsvorrichtung wurde entfernt, sodass die Probe in der Mitte der Spritze positioniert vorliegt. Anschließend wurde in alternierenden Schritten von UV und Kühlung die Polymerisierung fortgesetzt und schließlich durch Dauerbestrahlung mit UV bei Raumtemperatur beendet.
Die Figur 2 zeigt den Nachweis von RNA aus einer erfindungsgemäß eingebetteten humanen Lungenprobe. Nach der erfindungsgemäßen Einbettung der Probe wurde diese mittels SLOT (A) mikroskopiert und anschließend wurden 4μηη dicke Schnitte angefertigt und mit Hemalaun gefärbt (B). Areale von Interesse wurden mit einem Laser Mikrodissektionssystem ausgeschnitten (B Ausschnitt) und über Nacht in Proteinase K Puffer inkubiert. Es folgte eine Aufreinigung der im Überstand suspendierten RNA durch Phenol-Chloroform-Fällung, die Synthese von cDNA und eine Amplifikation mit geeigneten Primern erfolgten nach bekannten Verfahren. Dargestellt ist ein RNA-Expressionsprofil mit den folgenden Markern: Polyr2a (Polymerase 2alpha), BMP4 ( Bone morphogenic Protein 4), CD34, ACTA2 (alpha-2 Glattmuskulatur-Aktin), COL3A1 (Collagen 3A1 ), TIMP1 (Metallopeptidase Inhibitor 1 ), MMP2 (Matix Metalloprotease 2), CD14.
RNA Extraktion, Transkription und Amplification der cDNA erfolgte mit bekannten Verfahren.
Claims
Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben, umfassend die Schritte:
a) Entwässern der biologischen Probe,
b) Infundieren einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung, wobei diese UV-polymerisierbare Zusammensetzung einen Brechungsindex nach Polymerisation im Bereich von n = 1 ,45 bis n = 1 ,6, wie n = 1 ,550 bis n = 1 ,565 aufweist, in die biologische Probe,
c) Härten der mit der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung infundierten biologischen Probe mit Licht mit einer Wellenlänge von < 470 nm.
Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben nach Anspruch 1 , wobei die Polymerisierung zu Beginn nicht kontinuierlich erfolgt und die biologische Probe gegebenenfalls zwischen den Einstrahlungen des Lichts mit einer Wellenlänge von < 470 nm einem Kühlen unterworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die biologische Probe vor dem Entwässern fixiert wurde, insbesondere mit Aldehydgemischen oder Alkoholen fixiert wurde.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei zumindest das Infundieren der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung unter Vakuum durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Entwässern der Probe mittels aufsteigender Alkoholreihe, insbesondere aufsteigender Ethanolreihe, oder mittels aufsteigender DMSO-Reihe erfolgt, und daran gegebenenfalls anschließend eine Entwässerung in Xylol.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die UV- polymerisierbare Zusammensetzung eine Mercaptoester-Verbindung um- fasst.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei diese Mercaptoester-Verbindung in der Zusammensetzung mit mindestens 40 Gew. -% vorliegt.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Brechungsindex der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung vor Polymerisation in einem Bereich von n = 1 ,4 bis 1 ,6, wie n = 1 ,50 bis 1 ,55 liegt.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die UV- polymerisierbare Zusammensetzung weiterhin eine polymerisierbare Ac- rylat- und/oder Methacrylat-Verbindung aufweist.
10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die biologische Probe eine dreidimensionale biologische Probe ist und wobei diese dreidimensionale Probe eine kleinste Kantenlänge von 50 μιτι, wie mindestens 100 μιτι aufweist.
1 1 . Verfahren zur Untersuchung von biologischen Proben, wobei diese Probe sowohl einem dreidimensionalen Bildgebungsverfahren und anschließend einem histologischen, und gegebenenfalls molekularbiologischen Verfahren unterworfen wird, umfassend die Schritte:
a) Herstellen von eingebetteten biologischen Proben, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert;
b) Durchführung eines dreidimensionalen Bildgebungsverfahrens;
c) Herstellung von gegebenenfalls konsekutiven histologischen Schnitten der in a) hergestellten und in b) einem dreidimensionalen Bildgebungsverfahren unterworfenen biologischen Probe;
d) histologische und gegebenenfalls molekularbiologische Untersuchung
der in Schritt c) erhaltenen Schnitte.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , weiterhin umfassend den Schritt
e) Korrelation der dreidimensionalen Bildgebung aus Schritt b) mit den histologischen und gegebenenfalls molekularbiologischen Untersuchungen aus Schritt d).
13. Verfahren nach Anspruch 1 1 oder 12, wobei das bildgebende Verfahren ein lichtmikroskopisches oder Tomographieverfahren ist, insbesondere OPT; SLOT, SPIM und Ultramikroskopie.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13, wobei das histologische Verfahren eine Mikrodissektion, insbesondere Laser-Mikrodissektion um- fasst.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, wobei dieses ein molekularbiologisches Verfahren umfasst, insbesondere eine Diagnostik auf Nukleinsaureebene.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Diagnostik auf Nukleinsaureebene eine RNA basierte Diagnostik ist.
17. Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 und 6 bis 10 definiert, als Einbettmedium für biologische Proben.
18. Eingebettete biologische Probe erhältlich unter Verwendung einer UV- polymerisierbaren Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder erhältlich gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Eingebettete biologische Probe nach Anspruch 18, insbesondere eingebet tete tierische Gewebeprobe, wobei diese Probe eine dreidimensionale Pro be mit einer kleinsten Kantenlänge von mindestens 50 μιτι ist.
20. Verwendung eines Kits oder eines Systems zum Einbetten von biologischen Proben umfassend eine UV-polymerisierbare Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 oder 6 bis 10 definiert, insbesondere wobei die UV- polymerisierbare Zusammensetzung als mehrkomponentige, getrennt vorliegende Zusammensetzung vorliegt und wobei der gewünschte Brechungs- index durch geeignetes Mischen dieser beiden Komponenten eingestellt werden kann.
21 . Verwendung einer eingebetteten biologischen Probe nach Anspruch 18 o- der 19 in der Diagnostik.
22. Verwendung nach Anspruch 21 in der RNA basierten Diagnostik.
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