WO2020002251A1 - Verfahren für die 3d pathologie - Google Patents

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Hans-Ulrich Dodt
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Definitions

  • the present invention relates to devices and methods for the quick, safe and complete diagnosis of human surgical specimens, in particular in tumor surgery for cancer.
  • the complete three-dimensional, high-resolution recording of tumor pieces after cancer surgery is possible. This is achieved by a clarification process that makes the tumor transparent and the cells visible through autofluorescence or fluorescent staining, followed by one
  • Diagnostics after surgery today mainly takes place by examining histological sections of the surgical material in pathology.
  • the tissue e.g. a tumor
  • the tissue first cut into slices 0.5 to 1 cm thick.
  • a histological section a few micrometers thick is made from each slice, which is examined under the microscope after staining of the tissue in order to determine the cells contained in the tissue and their distribution. This is how a diagnosis is made as to whether there is between the tumor tissue and the edge of the excised area
  • This The safety distance in breast cancer surgery is, for example, 0.5 to 1 cm, and is partly due to the fact that the pathologists can only make and assess a histological section every 'L cm because of the size of the removed tissue.
  • These sections are then first stained with hematoxylin and eosin (HE).
  • This selective examination of the tissue can be done due to the size of the tissue
  • the invention provides a novel chemical optical method for solving the technical problem. This is based essentially on the combination of the Making tumor tissue transparent and the three-dimensional registration of the tissue volume using a special light-sheet microscope.
  • the invention relates to a method for the diagnosis of pieces of tissue, in particular human surgical preparations in cancer surgery, characterized by the combination of methods of cellular fluorescent labeling, the
  • the fluorescent labeling of the tissue is preferably carried out by adding a fluorescent stain, by autofluorescence due to the fixative or by immunohistological staining.
  • the tissue is made transparent by dehydration using an ascending series of a dehydrating agent (e.g. alcohol or tetrahydrofuran) or a chemical reaction, followed by insertion in an agent such as e.g. Dibenz ether or a mixture of benzyl alcohol / benzyl benzoate, to adjust the optical refractive indices in the sample.
  • a dehydrating agent e.g. alcohol or tetrahydrofuran
  • an agent such as e.g. Dibenz ether or a mixture of benzyl alcohol / benzyl benzoate
  • known methods such as CUBIC or CLARITY are used for tissue clarification and staining.
  • the sample is rehydrated again and conventionally histological sections are made in the planes of interest using histological stains such as HE or IHC.
  • histological stains such as HE or IHC.
  • a library of the findings corresponding to the optical images is created on the basis of adjacent optical and histological sections.
  • a computer is preferably used, which is a machine learning
  • the sample treatment is significantly accelerated by using microwave energy and / or ultrasound.
  • the method is used during the operation to quickly diagnose the removed tissue.
  • the tissue removed during the operation is placed in a conventional fixation solution, e.g. 4% paraformaldehyde.
  • a agent for fluorescent staining of the tissue or for enhancing its autofluorescence can be added simultaneously or thereafter.
  • Methods for immunohistological staining of the tissue can also be used.
  • the tissue is then dewatered, e.g. by placing in an ascending series of organic solvents such as Alcohol or tetrahydrofuran or by a chemical reaction.
  • the tissue is then made transparent by adjusting the optical refractive index in the sample by placing it in a suitable clarifying agent such as e.g. Dibenzyl ether (DBE) or a mixture of benzyl alcohol and benzlybenzoate (BABB), possibly with heating.
  • a suitable clarifying agent such as e.g. Dibenzyl ether (DBE) or a mixture of benzyl alcohol and benzlybenzoate (BABB), possibly with heating.
  • tissue clarification methods such as CLARITY (“clear lipid-exchanged anatomically rigid immunostaining-compatible tissue hydrogel", Stanford University) or CUBIC ("clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis", RIKEN Quantitative Biology Center, Kobe) can be used .
  • CLARITY clear lipid-exchanged anatomically rigid immunostaining-compatible tissue hydrogel
  • CUBIC clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis
  • RIKEN Quantitative Biology Center Kobe
  • the image is taken in a light sheet microscope.
  • the use of a light sheet with the smallest possible thickness and the greatest possible Rayleigh length is advantageous for the three-dimensional resolution.
  • the light can either be generated statically via cylindrical lenses in combination with other static optical elements. In a preferred embodiment, it is generated by parallel displacement of a thin laser beam in the sample (scanning), which results in individual optical sections.
  • stray light generated in the sample can be eliminated by generating a readout slot by means of a confocal microscopic effect.
  • optical sections are recorded by a microscope objective, the optical axis of which is preferably perpendicular or approximately perpendicular to the optical section.
  • a stack of optical sections of the tissue can be recorded by consecutively shifting the tissue piece in the direction of the optical axis of the microscope.
  • 3D images can be taken one after the other with lenses in ascending magnification. This allows subsequent recordings of e.g. Tissue parts suspected of malignancy with higher magnification.
  • the light sheet microscope is advantageously constructed in such a way that the microscope objectives are immersed in the clarifying solution from above, so that they can be quickly pulled out and replaced.
  • the sample can be positioned in x, y and z under the control of a computer, so that series of optical cut stacks can also be recorded with high magnification and resolution, which can then be put together in the computer to form an overall image of the sample.
  • the sample is first rehydrated again, for example over a descending series of alcohols with ethanol or methanol, then transferred back into an aqueous medium such as paraformaldehyde and then embedded in paraffin using the usual method.
  • the usual histological sections are then made, the exact section plane being set for the optical sections by precisely measuring and positioning the sample.
  • the pathologists can thus create a kind of "library" which pattern in the optical section corresponds to which known image in the histological section.
  • the patterns in the optical section can be cataloged that correspond to malignant degeneration, i.e. cancer.
  • the computer can also display all optical sections in a familiar histological color. On the basis of this change, the computer can finally make a diagnosis regarding the type and
  • histological sections can still be made from the suspect area after rehydration and paraffin embedding, which can then be assessed conventionally after HE or immunohistological staining.
  • the process of 3D microscopy of cleared tumors can also be used during surgery as a replacement for the so-called rapid section if the Speed of tumor staining and clarification is increased by 2 orders of magnitude.
  • Microwaves and / or ultrasound energy are applied.
  • the steps of sample treatment described above are performed in a histological
  • Microwave carried out which leads to a greatly accelerated flow of chemical processes.
  • the storage of the sample in an ultrasonic field which is generated by a piezoelectric actuator, also leads to an acceleration of the chemical reactions.
  • the sample can be clarified and taken up within 0.5 to 1 hour instead of in 1 to 2 days. This enables the surgeon to know during the operation whether the tumor removal was actually complete or whether he needs to remove more tissue.

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Abstract

Verfahren, mit dem es möglich ist, ganze Gewebsstücke nach Operationen mit zellulärer Auflösung dreidimensional darzustellen. Insbesondere ist so die komplette dreidimensionale hochaufgelöste Aufnahme von Tumorstücken nach Krebsoperationen möglich. Erreicht wird das durch ein Klärverfahren, das den Tumor durchsichtig und die Zellen durch Autofluoreszenz oder Fluoreszenzfärbung sichtbar macht, gefolgt von einer anschließenden schichtweisen Aufnahme mit einem Lichtblatt-Mikroskop. Hierdurch wird eine dreidimensionale Aufnahme des Gewebes mit hoher Auflösung möglich, so dass sämtliche Krebszellen im Gewebestück erkannt werden können. Durch die komplette Aufnahme des Gewebeblocks wird eine genauere und sicherere Krebsdiagnostik möglich als mit der herkömmlichen Untersuchung dünner histologischer Schnitte. Da mit dieser Methode auch Informationen über die dreidimensionale Struktur des Tumors erhalten werden, können so zusätzliche Informationen über dessen Bösartigkeit gewonnen werden.

Description

Verfahren für die 3D Pathologie
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur schnellen, sicheren und vollständigen Diagnostik von menschlichen Operationspräparaten, insbesondere in der Tumorchirurgie bei Krebserkrankungen. Besonders ein Verfahren, mit dem es möglich ist, ganze Gewebsstücke nach Operationen mit zellulärer Auflösung dreidimensional darzustellen. Insbesondere ist so die komplette dreidimensionale hochaufgelöste Aufnahme von Tumorstücken nach Krebsoperationen möglich. Erreicht wird das durch ein Klärverfahren, das den Tumor durchsichtig und die Zellen durch Autofluoreszenz oder Fluoreszenzfärbung sichtbar macht, gefolgt von einer
anschließenden schichtweisen Aufnahme mit einem Lichtblatt-Mikroskop. Hierdurch wird eine dreidimensionale Aufnahme des Gewebes mit hoher Auflösung möglich, so dass sämtliche Krebszellen im Gewebestück erkannt werden können. Durch die komplette Aufnahme des Gewebeblocks wird eine genauere und sicherere Krebs- diagnostik möglich als mit der herkömmlichen Untersuchung dünner histologischer Schnitte. Da mit dieser Methode auch Informationen über die dreidimensionale Struktur des Tumors erhalten werden, können so zusätzliche Informationen über dessen
Bösartigkeit gewonnen werden.
Stand der Technik
Die Diagnostik nach Operationen findet heute im Wesentlichen durch die Untersuchung histologischer Schnitte des Operationsmaterials in der Pathologie statt. Dabei wird das Gewebe, z.B. ein Tumor, zunächst in 0,5 bis 1 cm dicke Scheiben geschnitten. Von jeder Scheibe wird ein wenige Mikrometer dicker histologischer Schnitt hergestellt, der nach Färbung des Gewebes unter dem Mikroskop untersucht wird, um die im Gewebe enthaltenen Zellen sowie deren Verteilung zu bestimmen. So wird eine Diagnose erstellt, ob sich zwischen Tumorgewebe und dem Rand des ausgeschnittenen
Gewebeblocks ein ausreichend breiter Streifen gesunden Gewebes befindet. Dieser Sicherheitsabstand beträgt bei Brustkrebsoperationen z.B. 0,5 bis 1 cm, und ist unter anderem dadurch bedingt, dass die Pathologen wegen der Größe des entfernten Gewebestücks nur alle 'L cm einen histologischen Schnitt herstellen und beurteilen können. Diese Schnitte werden dann zunächst mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (HE
Färbung), worauf sich bei Bedarf noch weitere Immunologische Färbungen (IHC) von benachbarten Schnitten anschließen.
Diese selektive Untersuchung des Gewebes lässt sich infolge der Größe des
Gewebsstücks nicht umgehen, es wäre in der klinischen Routine nicht praktikabel tausende von histologischen Schnitten herzustellen und zu beurteilen. Allerdings wird der Tumor damit letztendlich nur stichprobenartig beurteilt. Aufgrund dieser
Beurteilung wird dann entschieden, ob der Tumor im Gesunden entfernt wurde. Diese Beurteilung ist entscheidend dafür, ob sich an die Operation noch adjuvante Therapien wie Bestrahlung oder Chemotherapie anschließen. Wird fälschlich angenommen, dass der gesamte Tumor entfernt wurde, sich in Wirklichkeit aber in den nicht beurteilten Schichten noch randständige Tumoranteile befinden, so kommt es zu den gefürchteten Tumorrezidiven.
Desweiteren kann bei der herkömmlichen Histologie fast keine Aussage über die 3D Tumorstruktur gemacht werden, die auch eine Aussage über die Malignität der Tumors machen könnte und für die Frage der adjuvanten Therapie von Bedeutung wäre.
Diese Nachteile der herkömmlichen pathologischen Diagnostik können nun durch die hier beschriebene 3D Mikroskopie geklärter Tumore mit Fichtblatt-Mikroskopie vermieden werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Für die Fösung des technischen Problems stellt die Erfindung ein neuartiges chemisch optisches Verfahren bereit. Dieses beruht im Wesentlichen auf der Kombination des Durchsichtigmachens von Tumorgewebe und der dreidimensionalen Registrierung des Gewebevolumens mit einem speziellen Lichtblattmikroskop.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnostik von Gewebestücken, insbesondere von humanen Operationspräparaten in der Krebschirurgie, gekennzeichnet durch die Kombination von Verfahren der zellulären Fluoreszenzmarkierung, dem
Durchsichtigmachen des Gewebes und der 3D-Aufnahme des Gewebes mit Lichtblatt- Mikroskopie.
Bevorzugt erfolgt die Fluoreszenzmarkierung des Gewebes durch Zugabe eines fluoreszierenden Färbemittels, durch Autofluoreszenz aufgrund des Fixationsmittels oder durch immunhistologische Färbung.
Das Durchsichtigmachen des Gewebes erfolgt durch Dehydration mittels aufsteigender Reihe eines Dehydrationsmittels (z.B. Alkohol oder Tetrahydrofuran) oder einer chemischen Reaktion, mit anschließendem Einlegen in ein Mittel wie z.B. Dibenzläther oder einer Mischung aus Benzylalkohol/Benzylbenzoat, zur Angleichung der optischen Brechungsindices in der Probe. In einer anderen Variante werden bekannte Verfahren wie CUBIC oder CLARITY zur Gewebeklärung und Färbung verwendet.
In einer bevorzugten Variante wird die Probe wieder rehydriert, und es werden konventionell histologische Schnitte in interessierenden Ebenen der Probe hergestellt, unter Verwendung histologischer Färbungen wie HE oder IHC. In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens wird aufgrund benachbarter optischer und histologischer Schnitte eine Bibliothek der den optischen Bildern entsprechenden Befunde erstellt.
Bevorzugt wird ein Rechner eingesetzt, welcher über maschinelles Lernen eine
Software-gestützte Bibliothek zur pathologischen Diagnostik von Gewebeblöcken verwendet.
In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens wird die Probenbehandlung durch Einsatz von Mikrowellenenergie und/oder Ultraschall wesentlich beschleunigt. In einer bevorzugten Ausführung wird das Verfahren während der Operation zur Schnelldiagnostik des entfernten Gewebes verwendet.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Zunächst wird das bei der Operation entnommene Gewebe zur Fixierung in eine herkömmliche Fixierlösung gegeben, wie z.B. 4 % Paraformaldehyd. Fakultativ kann gleichzeitig oder danach ein Mittel zur Fluoreszenzfärbung des Gewebes oder zur Verstärkung seiner Autofluoreszenz zugegeben werden. Es können auch Verfahren zur immunhistologischen Färbung des Gewebes verwendet werden. Danach wird das Gewebe entwässert, z.B. durch Einlegen in eine aufsteigende Reihe organischer Lösungsmittel wie z.B. Alkohol oder Tetrahydrofuran oder durch eine chemische Reaktion.
Danach wird das Gewebe durchsichtig gemacht durch Angleichung des optischen Brechungsindex in der Probe durch Einlegen in ein geeignetes Klärmittel wie z.B. Dibenzyl äther (DBE) oder ein Gemisch von Benzylalkokol und Benzlybenzoat (BABB), eventuell unter Erwärmung.
Alternativ können auch andere bekannte Gewebeklärverfahren wie CLARITY („clear lipid-exchanged anatomically rigid immunostaining-compatible tissue hydrogel“, Stanford University) oder CUBIC („clear, unobstructed brain imaging Cocktails and computational analysis“, RIKEN Quantitative Biology Center, Kobe) verwendet werden. Hierbei muss allerdings mit einem wochenlangen Klärprozess gerechnet werden, wohingegen der hier beschriebene Klärprozess in einem bis wenigen Tagen erfolgen kann.
Nach der Gewebeklärung erfolgt die Aufnahme im Lichtblattmikroskop. Vorteilhaft für die dreimensionale Auflösung ist hierbei die Verwendung eines Lichtblattes mit möglichst geringer Dicke und möglichst großer Rayleighlänge.
Das Licht kann entweder statisch über Zylinderlinsen in Kombination mit weiteren statischen optischen Elementen erzeugt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird es durch Parallelverschiebung eines dünnen Laserstrahls in der Probe (Scannen) erzeugt wodurch einzelne optische Schnitte entstehen. Bei Verwendung des„rolling shutter“- Verfahrens in der Kamera kann durch Generierung eines Ausleseschlitzes in der Probe entstehendes Streulicht durch einen konfokal-mikroskopischen Effekt eliminiert werden.
Die Aufnahme der optischen Schnitte erfolgt durch ein Mikroskopobjektiv, dessen optische Achse bevorzugt senkrecht oder annähernd senkrecht zum optischen Schnitt steht.
Durch konsekutives Verschieben des Gewebestückes in Richtung der optischen Achse des Mikroskops kann ein Stapel von optischen Schnitten des Gewebes aufgenommen werden.
Diese 3D-Aufnahmen können dabei nacheinander mit Objektiven aufsteigender Vergrößerung gemacht werden. Dies erlaubt nach einer Übersichtsaufhahme anschließende Aufnahmen von z.B. auf Malignität verdächtigen Gewebeteilen mit höherer Vergrößerung.
Dafür ist das Lichtblattmikroskop vorteilhaft so aufgebaut, dass die Mikroskopobjektive von oben in die Klärlösung eintauchen, so dass sie schnell nach oben herausgezogen und gewechselt werden können.
Die Probe kann über einen Rechner gesteuert in x, y und z positioniert werden, so dass auch Serien von optischen Schnittstapeln mit hoher Vergrößerung und Auflösung aufgenommen werden können, die dann nachher im Rechner zu einer Gesamtaufhahme der Probe zusammen gesetzt werden können.
Wenn das Lichtblatt dünn genug ist, können so große Tumorvolumen mit isotroper zellulärer Auflösung aufgenommen werden Da sich der Eindruck der erhaltenen Aufnahmen von dem der üblichen histologischen Schnitte stark unterscheidet wird es nötig sein, histologische und optische Schnitte von genau der gleichen Gewebeebene zu vergleichen. Dazu wird die Probe nach Klärung und Aufnahme des Fluoreszenzbildes zunächst wieder rehydriert, z.B. über eine absteigende Alkoholreihe mit Ethanol oder Methanol, dann wieder in wässriges Medium wie z.B. Paraformaldehyd überführt und dann mit dem üblichen Verfahren in Paraffin eingebettet. Anschließend werden die üblichen histologischen Schnitte hergestellt, wobei durch genaues Ausmessen und Positionieren der Probe die gleiche Schnittebene wie für die optischen Schnitte eingestellt wird. Bei der Berechnung der Höhe der Schnittebene in der Probe ist Schrumpfung und Ausdehnung der Probe beim Dehydrieren und
Rehydrieren zu berücksichtigen. Von den mechanisch hergestellten histologischen Schnitten werden dann diejenigen identifiziert, die am perfektesten den optischen Schnitten entsprechen. So kann von den Pathologen eine Art„Bibliothek“ erstellt werden, welches Muster im optischen Schnitt welchem bekannten Bild im histologischen Schnitt entspricht. Insbesondere können so die Muster im optischen Schnitt katalogisiert werden, die maligner Entartung, also Krebs, entsprechen.
Die verschiedenen Bildmuster mit ihren jeweiligen pathologischen Korrelaten werden im Rechner abgespeichert. Mit geeigneten Algorithmen des maschinellen Lernens (deep leaming) baut sich zunächst im Rechner eine umfangreiche Software-basierte
Bibliothek pathologischer Veränderungen im optischen Schnittbild auf. Als Hilfe für den Pathologen kann der Rechner auch alle optischen Schnitte in einer vertrauten histologischen Färbung darstellen. Anhand dieser Veränderung kann der Rechner schließlich für den gesamten Tumorblock eine Diagnose in Bezug auf Art und
Malignität histologischer Veränderungen geben.
Bei unklarem Befund können immer noch nach Rehydrierung und Paraffineinbettung von dem suspekten Bereich histologische Schnitte erstellt werden, die dann nach HE- oder immunhistologischer Färbung herkömmlich beurteilt werden können.
Das Verfahren der 3D Mikroskopie geklärter Tumore kann auch schon während der Operation als Ersatz für den sogenannten Schnellschnitt eingesetzt werden, wenn die Geschwindigkeit von Tumorfärbung- und Klärung um 2 Größenordnungen gesteigert wird.
Eine solche wesentliche Steigerung um den Faktor 50x-l00x kann durch die
Applikation von Mikrowellen und/oder Ultraschallenergie erfolgen. Hierbei werden die vorgehend beschriebenen Schritte der Probenbehandlung in einer histologischen
Mikrowelle durchgefuhrt, was zu einem stark beschleunigten Ablauf der chemischen Prozesse fuhrt. Die Lagerung der Probe in einem Ultraschallfeld, das von einem piezoelektrischen Aktuator erzeugt wird, fuhrt ebenfalls zu Beschleunigung der chemischen Reaktionen. So kann Klärung und Aufnahme der Probe statt in 1 bis 2 Tagen innerhalb von 0,5 bis 1 Stunde erfolgen. So kann der Operateur schon während der Operation wissen, ob die Tumorentfemung tatsächlich vollständig war oder ob er noch mehr Gewebe entfernen muss.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Diagnostik von Gewebestücken, insbesondere von humanen
Operationspräparaten in der Krebschirurgie, gekennzeichnet durch die Kombination von Verfahren zur zellulären Fluoreszenzmarkierung,
- dem Durchsichtigmachen des Gewebes und
- der 3D Aufnahme des Gewebes mit Lichtblatt-Mikroskopie.
2. Verfahren nach Anspruch 1 wobei die Fluoreszenzmarkierung des Gewebes durch Zugabe eines fluoreszierenden Färbemittels, durch Autofluoreszenz aufgrund des Fixationsmittels oder durch immunhistologische Färbung erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 wobei das Durchsichtigmachen des Gewebes durch Dehydration mittels aufsteigender Reihe eines Dehydrationsmittels (z.B. Alkohol oder Tetrahydrofuran) oder einer chemischen Reaktion erfolgt mit anschließendem Einlegen in ein Mittel wie z.B. Dibenzläther oder einer Mischung aus Benzylalkohol/Benzylbenzoat, zur Angleichung der optischen
Brechungsindices in der Probe.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei die Probe durch Lichtblattmikroskopie in 3D aufgenommen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 wobei die Probe wieder rehydriert wird und
konventionell histologische Schnitte in interessierenden Ebenen der Probe hergestellt werden unter Verwendung histologischer Färbungen wie HE oder IHC.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei aufgrund
benachbarter optischer und histologischer Schnitte eine Bibliothek der den optischen Bildern entsprechenden Befunden erstellt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Rechner über maschinelles Lernen eine Software-gestützte Bibliothek zur pathologischen Diagnostik von Gewebeblöcken verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die
Probenbehandlung durch Einsatz von Mikrowellenenergie und/oder Ultraschall wesentlich beschleunigt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren
während der Operation zur Schnelldiagnostik des entfernten Gewebes verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei andere bekannte
Verfahren wie CUBIC oder CLARITY zur Gewebeklärung und Färbung verwendet werden.
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